DE69427232T2

DE69427232T2 - Verfahren zur herstellung von disacchariden und sacchariden

Info

Publication number: DE69427232T2
Application number: DE69427232T
Authority: DE
Inventors: Kazuo Aisaka; Yutaka Saitoh; Youichi Uosaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1994-12-08
Publication date: 2001-08-30
Anticipated expiration: 2014-12-09
Also published as: ATE201211T1; EP0717047B1; US5776739A; DE69427232D1; PT717047E; GR3036186T3; EP0717047A1; EP0717047A4; DK0717047T3; WO1995034570A1; ES2156163T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Disacchariden. Die Disaccharide sind als Bestandteile von Medikamenten, Nahrungsmitteln, Kosmetika, usw. und als Enzym- Stabilisatoren in diagnostischen Reagenzien, usw. einsetzbar.

Hintergrund der Erfindung

Ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose [Glucosyl(α,1-1)D-Glucose] unter Einsatz eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Nocardia (japanische offengelegte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 154485/75) und ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose duch Behandlung von Maltose [Glucosyl(α,1-4)D-Glucose] mit Maltose-Phosphorylase (hier als MP bezeichnet) und Trehalose-Phosphorylase (hier als TP bezeichnet) (japanische offengelegte geprüfte Patentanmeldung Nr. 60998/88) sind bekannte Verfahren zur Herstellung von Disacchariden mit α,1-1-glycosidischen Bindungen. Ein Verfahren zur Herstellung von Maltosederivaten unter Einsatz eines von Neisseria perflava abgeleiteten Extrakts [J. Biol. Chem. 236: 2183-2185 (1961)] ist ein bekanntes Verfahren zur Herstellung von Disacchariden mit einer α,1-4-giycosidischen Bindung.
Jedoch wird in dem Verfahren, bei dem der zu der Gattung Nocardia gehörende Mikroorganismus verwendet wird, nur eine geringe Menge Trehalose in dem Kulturmedium produziert und in dem Verfahren zur Herstellung von Disacchariden durch die Behandlung von Maltose mit MP und TP können keine anderen Disaccharide als Trehalose produziert werden. In dem Verfahren unter Einsatz eines von Neisseria perflava abgeleiteten Extrakts wird das Substrat β-Glucose-1-phosphat durch die Phosphorolyse von Maltose erhalten. Jedoch ist für das Verfahren ein Schritt nötig, bei dem die als Nebenprodukt gebildete Glucose entfernt wird.
Disaccharide wie Trehalose und Maltose verstärken bekanntlich die Stabilität von Biopolymeren wie Enzym-Proteinen [C. Colaco et al., Bio/Technology 10: 1007-1011 (1992)].
Die EP-A-0 423 768 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Cellobiose. Dabei wird Sucrose mit Sucrose-Phosphorylase behandelt, wodurch Glucose-1-phosphat und Fructose entstehen. Fructose wird weiter zu Glucose durch die Aktivität von Glucose-lsomerase umgesetzt. Schließlich werden die in dem vorhergehenden Schritt erhaltene Glucose und das in dem ersten Schritt erhaltene Glucose-1-phosphat mit Cellobiose-Phosphorylase zu Cellobiose umgesetzt.

Offenbarung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von Disacchariden bereitgestellt, umfassend: Kondensation von beta-Glucose-1-phosphat in einem wässrigen Medium mit
a) einem Monosaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Fucose und D- Xylose in Gegenwart von Trehalose-Phosphorylase, die auf das ausgewählte Monosaccharid einwirkt, oder
b) einem Monosaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Mannose, D- Allose, D-Tagatose, D-Sorbose und L-Fucose in Gegenwart von Maltose-Phosphorylase, die auf das ausgewählte Monosaccharid einwirkt, und Gewinnen des in dem wässrigen Medium gebildeten Disaccharids, wobei die Trehalose- Phosphorylase von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Catellatospora gehört, und die Maltose-Phosphorylase von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Propionibacterium gehört.
Erfindungsgemäß werden ferner Disaccharide bereitgestellt, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen werden.
Die Erfindung wird nachstehend detailliert beschrieben.
Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymquelle umfasst eine Kultur, Zellen oder behandelte Zellen eines Mikroorganismus mit Zucker-Phosphorylase-Aktivität oder ein Enzym mit Zucker-Rhosphorylase-Aktivität.
Beispiele von Mikroorganismen umfassen TP-produzierende Mikroorganismen wie Catellatospora ferruginea KY2039 und Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 und MP-produzierende Mikroorganismen wie Propionibacterium freudenreichii KY4002 und Enterococcus faecium ATCC 10541.
Die bakteriologischen Eigenschaften der vorstehend aufgeführten Mikroorganismus-Spezies finden sich in Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 512-517 (1986) für Catellatospora ferruginea, in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 4, 2504-2506 (1989) für Kineosporia aurantiaca, in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 2, 1346-1350 (1986) für Propionibacterium freudenreichil und in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 2, 1063- 1065 (1986) für Enterococcus faecium.
Catellatospora ferruginea KY2039 und Propionibacterium freudenreichil KY4002 wurden beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 11. Juni 1993 gemäß dem Budapester Abkommen unter den Zugangsnummern FERM BP-4329 bzw. FERM BP-4330 hinterlegt.
Jedes natürliche oder synthetische Medium kann als Medium verwendet werden, um die Enzymquelle mit Zucker-Phosphorylase-Aktivität zu erhalten, insofern es geeignete Mengen von Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien und anderen Nährstoffen enthält. Als Kohlenstoffquelle können Kohlenhydrate wie Glucose, Sucrose, Trehalose, Maltose, Stärke und Molassen, Alkohole wie Glycerin, Sorbitol und Mannit und organische Säuren wie Essigsäure, Milchsäure, Pyruvat und Citronensäure verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können anorganische und organische Ammoniumsalze wie Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Stickstoffverbindungen wie Harnstoff und Aminosäuren und Stickstoff-enthaltende organische Substanzen wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Maisstengelflüssigkeit und Kasein-Hydrolysat verwendet werden.
Als Mineralien können Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Magnesiumphosphat und Eisensulfat verwendet werden.
Eine Kultivierung kann durch eine Steh- oder Schüttelkultur mit Belüftung erfolgen. Die Temperatur wird in einem Bereich von 25-37ºC und der pH des Kulturmediums in einem Bereich von 6,0 bis 8,0 gehalten. Die Kultivierung ist gewöhnlich nach 1 bis 7 Tagen abgeschlossen.
Nach Abschluss der Kultivierung können für die Herstellung der Disaccharide eine Kultur, Zellen oder behandelte Zellen des erhaltenen Mikroorganismus verwendet werden, der zu Roh- oder gereinigtem Enzym verarbeitet wird oder verarbeitet werden kann.
Beispiele behandelter Zellen des Mikroorganismus sind getrocknete Zellen, gefriergetrocknete Zellen, mit einem Tensid behandelte Zellen, enzymatisch behandelte Zellen, mit Ultraschall behandelte Zellen, mechanisch zerriebene Zellen, mechanisch unter Druck gesetzte Zellen, Protein-enthaltende Fraktionen der Zellen und immobilisierte Produkte von Zellen oder behandelten Zellen.
Roh- oder gereinigtes Enzym kann als Enzym verwendet werden und das Enzym wird dadurch erhalten, dass die behandelten Zellen des Mikroorganismus einem Verfahren ausgesetzt werden, das gewöhnlich für die Reinigung der Enzyme eingesetzt wird, wie Aussalzung, Sedimentierung mit organischen Lösungsmitteln, Dialyse, Ionenaustausch, Säulenchromatographie, Gelfiltration und Gefriertrocknung.
Jedes Enzym kann als Enzym mit Zuckerphosphorylase-Aktivität eingesetzt werden, soweit es die Kondensation von β-Glucose-1-phosphat mit einem Monosaccharid zu einem Disaccharid katalysiert wie TP und MP.
Die Enzymquelle mit der Zuckerphosphorylase-Aktivität wird in einem wässrigen Medium als nasse Zellen in einem Bereich von 1 bis 100 g/l, vorzugsweise 10 bis 50 g/l oder als Enzymaktivität in einem Bereich von 0,1 bis 100 Einheiten/ml, vorzugsweise 1 bis 10 Einheiten/ml eingesetzt.
Die enzymatische Aktivität des Enzyms mit Zuckerphosphorylase-Aktivität ist in Einheiten wiedergegeben, wobei eine Einheit als die Aktivität definiert ist, die zur Produktion von 1 umol Glucose fähig ist, falls z. B. TP und MP in 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) bei 37ºC 1 Minute in Gegenwart von Trehalose bzw. Maltose als Substrat zur Reaktion gebracht werden.
Das wässrige Medium umfasst Wasser, Puffer wie Phosphat-, Carbonat-, Acetat-, Borat-, Citronensäure- und Tris-Puffer, Alkohole wie Methanol und Ethanol, Ester wie Ethylacetat, Ketone wie Aceton, Amide wie Acetamid und natürliche oder synthetische Medien mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Salzen, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können. Falls erforderlich, wird ein Tensid wie Cetylpyridiniumchlorid und Cetyltrimethylammoniumbromid in einer Konzentration von 0,05 bis 1,0% (w/v) und ein organisches Lösungsmittel wie Toluol und Xylol in einer Konzentration von 1 bis 20% (v/v) hinzugegeben.
Als Monosaccharid kann jedes Roh- oder gereinigte Material eingesetzt werden. Zum Beispiel werden D-Glucose, D-Fucose, D-Xylose, D-Mannose, D-Allose, D-Tagatose, D-Sorbose, D-Glucosamin, 2-Desoxy-D-glucose, N-Acetyl-D-glucosamin oder L-Fucose in einem Bereich von 1 bis 100 g/l, vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 50 g/l eingesetzt.
β-Glucose-1-phosphat wird in einem Bereich von 1 bis 100 g/l, vorzugsweise 10 bis 50 g/l eingesetzt. Obwohl käuflich verfügbares β-Glucose-1-phosphat verwendet werden kann, kann auch β-Glucose-1-phosphat verwendet werden, das durch Umwandlung von Maltose in Glucose und β-Glucose-1-phosphat in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle mit MP-Aktivität und einer Enzymquelle mit Glucose-Abbauaktivität und darauffolgender Abbau der in dem wässrigen Medium produzierten Glucose in Gegenwart einer Enzymquelle mit Glucose-Abbauaktivität erhalten wird.
Die Enzymquelle mit MP-Aktivität kann in dem wässrigen Medium als nasse Zellen in einem Bereich von 10 bis 100 g/l, vorzugsweise 20 bis 50 g/l oder als Enzymaktivität in einem Bereich von 1 bis 100 Einheiten/ml, vorzugsweise 10 bis 50 Einheiten/ml pro 1 mol Maltose enthalten sein.
Die Menge der Enzymquelle mit Glucose-Abbauaktivität in dem wässrigen Medium ist so hoch, dass die durch Umwandlung von Maltose durch die Enzymquelle mit MP-Aktivität produzierte Glucose vollständig abgebaut werden kann.
Die Enzymquelle mit Glucose-Abbauaktivität umfasst einen Mikroorganismus mit Glucose- Abbauaktivität, eine Kultur, Zellen oder behandelte Zellen eines derartigen Mikroorganismus und ein Enzym mit Glucose-Abbauaktivität.
Jeder Mikroorganismus kann als Mikroorganismus mit Glucose-Abbauaktivität verwendet werden, soweit er zur Produktion eines Enzyms mit Glucose-Abbauaktivität fähig ist. Hefe wird vorzugsweise verwendet.
Das Enzym mit Glucose-Abbauaktivität umfasst Glucoseoxidase, Katalase, Pyranoseoxidase, Glucose-Dehydrogenase, Glucokinase und Hexokinase. Glucoseoxidase oder Katalase wird vorzugsweise verwendet.
Bei der Herstellung von β-Glucose-1-phosphat wird Maltose in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle mit Maltosephosphorylase-Aktivität und einer Enzymquelle mit Glucose-Abbauaktivität gewöhnlich bei 20 bis 60ºC, vorzugsweise 30 bis 50ºC und bei einem pH von 5,0 bis 9,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,5 1 bis 72 Stunden zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wird das in dem wässrigen Medium gebildete β-Glucose-1-phosphat mit einem Monosaccharid in Gegenwart einer Enzymquelle mit Zuckerphosphorylase-Aktivität kondensiert. β-Glucose-1-phosphat kann für die Reaktion verwendet werden, nachdem es durch Entfernen von Feststoffen wie Zellen aus dem wässrigen Medium durch Zentrifugation und Behandeln des Überstands in einem gewöhnlichen Verfahren wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie und Konzentrierung isoliert wurde. Alternativ kann β-Glucose-1-phosphat direkt gelöst in dem wässrigen Medium zur Reaktion gebracht werden.
Bei der Herstellung des Disaccharids erfolgt die Reaktion von β-Glucose-1-phosphat mit einem Monosaccharid in einem wässrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle mit Zuckerphosphorylase-Aktivität gewöhnlich bei 20 bis 60ºC, vorzugsweise 30 bis 50ºC und bei einem pH von 5,0 bis 9,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,5 für 1 bis 72 Stunden.
Nach Vervollständigung der Reaktion kann das Disaccharid durch Entfernung der Feststoffe wie Zellen aus dem wässrigen Medium durch Zentrifugation und Behandeln des Überstands in einem gewöhnlichen Verfahren wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie und Konzentrierung erhalten werden.
Abhängig von dem in der Reaktion eingesetzten Monosaccharid werden erfindungsgemäß bekannte Disaccharide wie Trehalose und Maltose und neue Disaccharide wie Glucosyl(α,1- 1)D-fucose, Glucosyl(α,1-4)D-mannose, Glucosyl(α,1-4)D-allose, Glucosyl(α,1-4)D-tagatose, Glucosyl(α,1-4)L-fucose und Glucosyl(α,1-4)D-sorbose bereitgestellt. Unter den vorstehend aufgeführten Disacchariden wurden Trehalose, Maltose, Glucosyl(α,1-1)D-fucose und Glucosyl(α,1-4)L-fucose in den nachstehenden Test-Beispielen in Bezug auf ihre Wirkungen auf die Stabilität eines Enzyms wie alkalischer Phosphatase unter folgenden Bedingungen getestet:
(1) als Lösung gelagert, (2) in einem gefrorenen Zustand gelagert, (3) wiederholt eingefroren und aufgetaut und (4) als getrocknetes Pulver gelagert.

Test-Beispiel 1

Eine Probenlösung (nicht supplementiert) wurde durch Verdünnung von alkalischer Phosphatase (aus Kälberdünndarm, Boehringer Mannheim Biochemica) mit destilliertem Wasser hergestellt. Weitere Probenlösungen wurden durch Zugabe von Trehalose, Maltose, Glucosyl(α,1-1)D-fucose oder Glucosyl(α,1-4)L-fucose in einer Konzentration von 50 mM zu der vorstehenden Lösung hergestellt. Die Probenlösungen wurden bei Raumtemperatur (25ºC) 24 Stunden stehen gelassen und die Aktivität der alkalischen Phosphatase in jeder Probenlösung bestimmt.
Die Aktivität von alkalischer Phosphatase wurde wie folgt bestimmt:
Jede Probenlösung (10 ul) wurde bei 37ºC in 2,0 ml des Reaktionsgemisches inkubiert, das aus 1 M Diethanolamin-Puffer (pH 10,2), 0,2 mM Magnesiumchlorid und 5 mM p-Nitrophenylphosphorsäure bestand. Sodann wurde die Enzymaktivität durch die Menge des darin produzierten p-Nitrophenols bestimmt, die aufgrund der Absorptionsänderung bei 405 nm berechnet wurde. Die Aktivität jeder Probenlösung wurde sofort nach der Herstellung als 100% definiert und die restliche Aktivität in der gelagerten Probenlösung wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Zucker (50 mM) Restliche Aktivität (%)
nicht supplementiert 0
Trehalose 9,4
Maltose 3,3
Glucosyl(α,1-1)D-fucose 21,8
Glucosyl(α,1-4)L-fucose 93,7

Test-Beispiel 2

Eine Probenlösung (nicht supplementiert) wurde durch Verdünnung von alkalischer Phosphatase mit destilliertem Wasser hergestellt. Andere Probenlösungen wurden durch Zugabe von Trehalose, Maltose, Glucosyl(α,1-1)D-fucose oder Glucosyl(α,1-4)L-fucose in einer Konzentration von 50 mM zu der vorstehenden Lösung hergestellt. Die Probenlösungen wurden gefroren bei -20ºC 6 Tage gelagert. Nach Auftauen bei Raumtemperatur wurde die Aktivität von alkalischer Phosphatase in jeder Probenlösung ähnlich wie im Test-Beispiel 1 bestimmt. Die Aktivität jeder Probenlösung unmittelbar nach der Herstellung wurde als 100% definiert und die restliche Aktivität in der gelagerten Probenlösung wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Zucker (50 mM) Restliche Aktivität (%)
nicht supplementiert 2,0
Trehalose 26,0
Maltose 20,0
Glucosyl(α,1-1)D-fucose 36,3
Glucosyl(α,1-4)L-fucose 76,0

Test-Beispiel 3

Eine Probenlösung (nicht supplementiert) wurde durch Verdünnung von alkalischer Phosphatase mit destilliertem Wasser hergestellt. Andere Probenlösungen wurden durch Zugabe von Trehalose, Maltose, Glucosyl(α,1-1)D-fucose oder Glucosyl(α,1-4)L-fucose in einer Konzentration von 50 mM zu der vorstehenden Lösung hergestellt. Jede Probenlösung wurde auf Trockeneis/Ethanol eingefroren und insgesamt 10 mal wiederholt bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Aktivität von alkalischer Phosphatase in jeder Probenlösung wurde ähnlich zu Test-Beispiel 1 bestimmt. Die Aktivität jeder Probenlösung unmittelbar nach der Herstellung wurde als 100% definiert und die restliche Aktivität in der gefrorenen und aufgetauten Probenlösung wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Zucker (50 mM) Restliche Aktivität (%)
nicht supplementiert 10,3
Trehalose 21,6
Maltose 16,3
Glucosyl(α,1-1)D-fucose 65,0
Glucosyl(α,1-4)L-fucose 106,0

Test-Beispiel 4

Eine Probenlösung (nicht supplementiert) wurde durch Verdünnung von alkalischer Phosphatase mit destilliertem Wasser hergestellt. Andere Probenlösungen wurden durch Zugabe von Trehalose, Maltose, Glucosyl(α,1-1)D-fucose oder Glucosyl(α,1-4)L-fucose in einer Konzentration von 50 mM zu der vorstehenden Lösung hergestellt. Jede Probenlösung wurde bei Raumtemperatur zur Trockne mit Hilfe einer Vakuumpumpe eingedampft, um ein trockenes Pulver zu erhalten, und das trockene Pulver wurde 24 Stunden bei 50ºC gelagert. Die Aktivität von alkalischer Phosphatase in jeder Probenlösung wurde ähnlich zu Test-Beispiel 1 bestimmt. Die Aktivität jeder Probenlösung unmittelbar nach der Herstellung wurde als 100% definiert und die restliche Aktivität in der gelagerten Probenlösung wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Zucker (50 mM) Restliche Aktivität (%)
nicht supplementiert 12,6
Trehalose 55,0
Maltose 41,0
Glucosyl(α,1-1)D-fucose 62,5
Glucosyl(α,1-4)L-fucose 83,0
Aus den vorstehend gezeigten Ergebnissen wird deutlich, dass Trehalose, Maltose, Glucosyl(α,1-1)D-fucose und Glucosyl(α,1-4)L-fucose, insbesondere Glucosyl(α,1-1)D-fucose und Glucosyl(α,1-4)L-fucose wirksam alkalische Phosphatase stabilisieren.
Bevorzugte Ausführungsform für die Erfindung

Beispiel 1

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM fmidazoi-HOI-Puffer (pH 7,0), 50 mM β-Glucose-1-phosphat, 50 mM Monosaccharid (D-Glucose, D-Fucose oder D-Xylose) und 2 Einheiten/ml gereinigtem TP-Enzym, das von Catellatospora ferruginea abgeleitet war, oder ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,0), 50 mM β-Glucose- 1-phosphat, 50 mM Monosaccharid (D-Glucose, 2-Desoxy-D-glucose, D-Glucosamin, N- Acetyl-D-glucosamin, D-Mannose, D-Allose, D-Tagatose, D-Sorbose, L-Fucose oder D- Xylose) und 2 Einheiten/ml gereinigtem MP-Enzym, das von Propionibacterium freudenreichil abgeleitet war, wurde 4 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und der Überstand einer HPLC unterzogen, um das Disaccharid zu isolieren. Das isolierte Disaccharid wurde sodann identifiziert und direkt mit Hilfe der jeweiligen Standards im Fall einer bekannten Substanz quantifiziert. Im Fall einer neuen Substanz wurde das isolierte Disaccharid entweder einer sauren Hydrolyse durch Aufkochen in 1 N Schwefelsäure bei 100ºC für 1 Stunde oder einem enzymatischen Abbau durch α-Glucosidase ausgesetzt, um den Monosaccharid-Bestandteil des Disaccharids zu erhalten, der mit Hilfe von HPLC identifiziert und quantifiziert wurde. Eine HPLC erfolgte unter den nachstehenden Bedingungen.
Säule: Shim-pack CLC-NH&sub2; (6 mm · 15 cm) (Shimadzu Corporation)
Mobile Phase: 80% Acetonitril - 20% Wasser
Flussrate: 1 ml/mm
Detektor: Differentialrefraktometer (Shimadzu Corporation)
Die zu den Reaktionsgemischen hinzugegebenen Monosaccharide, die Reaktionsprodukte und Ausbeuten sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

Beispiel 2

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 50 mM Maltose, 100 mg nasse Zellen/ml von Catellatospora ferruginea KY2039, 10 mg nasse Zellen/ml von Propionibacterium freudenreichii KY4002 und 0,1% Cetylpyridiniumchlorid wurde 18 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und der Überstand durch HPLC untersucht. Trehaiose wurde bei einer Ausbeute von 52% hergestellt.

Beispiel 3

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 50 mM Maltose, 1 Einheit/ml gereinigtes MP-Enzym aus Propionibacterium freudenreichii KY4002 und 2 Einheiten/ml gereinigtes TP-Enzym aus Catellatospora ferruginea KY2039 wurde 18 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und der Überstand durch HPLC untersucht Trehalose wurde bei einer Ausbeute von 78% hergestellt.

Beispiel 4

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 50 mM Maltose, 1 Einheit/ml gereinigtes MP-Enzym aus Enterococcus faecium ATCC 10541 und 2 Einheiten/ml gereinigtes TP-Enzym aus Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 wurde 18 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und der Überstand durch HPLC untersucht. Trehalose wurde bei einer Ausbeute von 75% hergestellt.

Beispiel 5

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 50 mM Maltose, 1 Einheit/ml gereinigtes MP-Enzym aus Propionibacterium freudenreichil KY4002, 2 Einheiten/ml Glucoseoxidase (Toyobo Co., Ltd.) und 3000 Einheiten/ml Katalase (Sigma Chemical Company), wurde 6 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht, wodurch β-Glucose-1-phosphat und Glucose aus Maltose hergestellt wurde und die produzierte Glucose mit Glucoseoxidase und Katalase abgebaut wurde. Gereinigtes TP-Enzym aus Catellatospora ferruginea KY2039 in einer Konzentration von 2 Einheiten/ml bzw. D-Fucose in einer Konzentration von 200 mM wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und dieses weitere 18 Stunden zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und der Überstand durch HPLC untersucht. Glucosyl(α,1-1)D-fucose wurde in einer Konzentration von 29 mM hergestellt.

Beispiel 6

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), 50 mM Maltose, 2 Einheiten/ml gereinigtes MP-Enzym aus Propionibacterium freudenreichil KY4002, 2 Einheiten/ml Glucoseoxidase und 3000 Einheiten/rül Katalase, wurde 6 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht, wodurch β-Glucose-1-phosphat und Glucose aus Maltose hergestellt wurde und die produzierte Glucose mit Glucoseoxidase und Katalase abgebaut wurde. L- Fucose in einer Konzentration von 200 mM wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und dieses weitere 18 Stunden zur Reaktion gebracht.
Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und der Überstand durch HPLC untersucht. Glucosyl(α,1-4)L-fucose wurde in einer Konzentration von 38 mM hergestellt.

Beispiel 7

Aktivkohle (500 g, Nacalai Tesque, Inc.) und eine Filterhilfe, HI-FLO Supercell (500 g, Nacalai Tesque, Inc.) wurden vorsichtig in destilliertem Wasser dispergiert und die Mikropartikel abgegossen. Die Dispersion wurde sodann in eine 50 cm lange Säule mit einem inneren Durchmesser von 5 cm gepackt, die sodann mit etwa 3 l 3% Butanol und darauf mit 3 l Wasser gewaschen wurde. Sodann wurden 200 ml der in Beispiel 5 erhaltenen Glucosyl(α,1-1)D-fucose-Lösung auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit etwa 2 l destilliertem Wasser und etwa 2 l 0,2% Propanol-Lösung gewaschen und sodann mit 5% Propanol eluiert, um die Zielsubstanz zu erhalten. Nach Gefriertrocknung des Eluats wurde etwa 1 g Glucosyl(α,1-1)D-fucose als weißes Pulver erhalten.
Die physikalischen Eigenschaften von Glucosyl(α,1-1)D-fucose sind nachstehend gezeigt. Aussehen: farbloses Pulver
Spezifische Rotation: [α]D²&sup0; = +189º (c = 0,309, H&sub2;O),
keine Veränderung während des zeitlichen Verlaufs (keine Mutarotation) FAB-MS-Spektrum
(Negativ-Modus, Matrix: Glycerin): m/z amu (325 M-H)&supmin;
Hochauflösungs-FAB-MS-Spektrum
(Negativ-Modus, Matrix: Glycerin): m/z amu
gemessen: 325,1121 (M-H)
berechnet als C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub1;O&sub1;&sub0;: 325,1135
IR-Spektrum (KBr): νmaxcm&supmin;¹:
- 3410, 2935, 1653, 1419, 1385, 1080, 1005, 966
¹³C-NMR-Spektrum (125 MHz, D&sub2;O): δppm bzgl. TMS
94,40, 94,24, 73,41, 72,95, 72,67, 71,94, 70,54, 69,99, 68,54, 67,94, 61,37, 16,09
¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, D&sub2;O): δppm bzgl. TMS
5,19 (2H, d, J = 3,9 Hz), 4,23 (1H, q, J = 6,5 Hz), 4,05 (1H, dd, J = 10,4, 3,4 Hz), 3,91 (1H, dd, J = 10,4, 3,9 Hz), 3,89 (1 H, m), 3,88 (2H, m), 3,86 (1 H, m), 3,80 (1 H, dd, J = 11,6, 4,β Hz), 3,68 (1 H, dd, J = 9, 9, 3,9 Hz), 3,48 (1 H, t, J = 9,4 Hz), 1,26 (3H, d, J = 6,5 Hz)

Beispiel 8

Es erfolgte eine Reinigung ähnlich zu der in Beispiel 7 beschriebenen, mit der Ausnahme, dass die in Beispiel 6 erhaltene Glucosyl(α,1-4)L-fucose anstelle der in Beispiel 5 erhaltenen Glucosyl(α,1-1)D-fucose-Lösung verwendet wurde. Es wurden etwa 2 g Glucosyl(α,1-4)Lfucose als weißes Pulver erhalten.
Die physikalischen Eigenschaften von Glucosyl(α,1-4)L-fucose sind nachstehend gezeigt.
Aussehen: farbloses Pulver
Schmelzpunkt: 117,0 bis 120,5ºC
Spezifische Rotation: [α]D²&sup0;+39,2º (c = 0,335, H&sub2;O),
Endwert (nach 24 Stunden)
FAB-MS-Spektrum
(Negativ-Modus, Matrix: Glycerin): m/z amu 325 (M-H)&spplus;
Hochauflösendes FAB-MS-Spektrum
(Negativ-Modus, Matrix: Glycerin): m/z amu
gemessen: 325,1112 (M-H)&supmin;
berechnet als C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub1;O&sub1;&sub0; 325,1135
IR-Spektrum (KBr): νmaxcm&supmin;¹:
3396, 2931, 1635, 1456, 1417, 1362, 1134, 1080, 1022
¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, D&sub2;O): δppm bzgl. TMS
102,04, 102,00, 97,31, 93,45, 83,17, 82,46, 74,97, 74,15, 73,77, 73, 74, 73,34, 73,30, 71,61, 71,37, 70,57, 70,54, 69,85, 67,40, 61,67, 17,45, 17,40
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, D&sub2;O): δppm bzgl. TMS
5,27 (d, J = 3,9 Hz), 5,26 (d, J = 4,9 Hz), 4,63 (d, J = 7,8 Hz), 4,30 (q, J = 6,6 Hz), 3,99(m), 3,98(m), 3,93(m), 3,93(m), 3,92(m), 3,89(m), 3,88 (q, J = 6,6 Hz), 3,82(m), 3,81 (dd, J = 11,8, 4,5 Hz), 3,75 (dd, J = 10,0, 3,2 Hz), 3,65 (dd, J = 9, 9, 3,9 Hz), 3,59 (dd, J = 10,0, 7,8 Hz), 3,46 (t, J = 9,4 Hz), 1,33 (d, J = 6,6 Hz), 1,30 (d, J = 6,6 Hz)

Bezugsbeispiel 1 Herstellung von Rohenzym

(1) 300 ml Medium (pH 7,0) mit 3 g/dl Sucrose, 0,5 g/dl NZ-Amin, 0,2 g/dl Pepton, 0,1 g/dl Hefeextrakt und 0,1 g/dl Fleischextrakt in einem 2 l-Erlenmeyer-Kolben wurden mit Cafellatospora ferruginea KY2039A beimpft und unter Schütteln 48 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die Kultur (600 ml) wurde in 15 l des vorstehend beschriebenen Mediums in einem 30 l-Fermenter überführt und unter Rühren und Belüften 3 Tage bei 30ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 15 l der Kultur abzentrifugiert (12 000 · g, 20 Minuten) und die erhaltenen Zellen in 1000 ml 200 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Glasmühle (Dynomill, W. A. Bachofen AB) zerrieben und der Überstand durch Zentrifugation (12 000 · g, 20 Minuten) als TP-Rohenzym erhalten.
Die Aktivität des TP-Rohenzyms aus Catellatospora ferruginea KY2039 betrug 5,0 Einheiten/g nasse Zellen. Der Wert war etwa 30-fach höher als der des Rohenzyms aus Euglena gracilis (0,17 Einheiten/g nasse Zellen, japanische offengelegte geprüfte Patentanmeldung Nr. 60998/88).
(2) TP-Rohenzym wurde mit Hilfe von zu den in Abschnitt (1) eingesetzten ähnlichen Inkubations- und Extraktionsverfahren erhalten, mit der Ausnahme, dass anstelle von Catellatospora ferruginea KY2039 Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 eingesetzt wurde.
Die Aktivität des TP-Rohenzyms aus Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 betrug 5,4 Einheiten/g nasse Zellen.
(3) 600 ml Medium (pH 7,5) mit 2 g/dl Sucrose, 1 g/dl Trypton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Dikaliumphosphat, 0,04 g/dl Magnesiumsulfat (Heptahydrat), 0,001 g/dl Mangansulfat (Tetrahydrat) und 0,005 g/dl Vitamin C in einer konischen Flasche wurden mit Propionibacterium freudenreichii KY4002 beimpft und 2 Tage bei 30ºC stehen gelassen.
Nach der Inkubation wurden die Kulturen in 1,2 l gepoolt und die Zellen abzentrifugiert (12 000 · g, 20 Minuten). Die Zellen wurden in 300 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Glasmühle (Dynomill) zerrieben und abzentrifugiert (12 000 · g, 20 Minuten), um den Überstand als MP-Rohenzym zu erhalten.
Die Aktivität des MP-Rohenzyms aus Propionibacterium freudenreichil KY4002 betrug 55,0 Einheiten/g nasse Zellen. Der Wert war etwa 1,8-fach höher als der des Rohenzyms aus Lactobacillus brevis (29,9 Einheitenlg nasse Zellen, japanische offengelegte geprüfte Patentanmeldung Nr. 60998/88).
(4) MP-Rohenzym wurde mit Hilfe von zu den in Abschnitt (3) eingesetzten ähnlichen Inkubations- und Extraktionsverfahren gewonnen, mit der Ausnahme, dass anstelle von Propionibacterium freudenreichil KY4002 Enterococcus faecium ATCC 10541 eingesetzt wurde. Die Aktivität des MP-Rohenzyms aus Enterococcus faecium ATCC 10541 betrug 50,0 Einheitenlg nasse Zellen.

Bezugsbeispiel 2: Herstellung von gereinigtem Enzym

(1) Ammoniumsulfat wurde bis 50% Sättigung zu dem in Abschnitt (1) des Bezugsbeispiels 1 erhaltenen TP-Rohenzym aus Catellatospora ferruginea KY2039 hinzugegeben und der Niederschlag gewonnen. Der Niederschlag wurde in einer kleinen Menge (etwa 200 ml) 200. mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Lösung wurde gegen 5 l desselben Puffers 24 Stunden dialysiert, 15 Minuten auf 65ºC erhitzt und zentrifugiert (12 000 · g, 20 Minuten), um den Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine zuvor mit demselben Puffer equilibrierte Säule (1 l, Durchmesser: 5 cm), die mit der Gelfiltrationsmatrix Toyopearl HW65F (Tosoh Corporation) gepackt worden war, geladen. Die eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und Ammoniumsulfat bis zu 50% Sättigung hinzugegeben. Die Niederschläge wurden durch Zentrifugation gewonnen (12 000 · g, 20 Minuten) und in 20 ml 200 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Lösung wurde gegen 2 l desselben Puffers 24 Stunden dialysiert, um gereinigtes TP-Enzym (spezifische Aktivität: 100 mE/mg) zu gewinnen.
Die spezifische Aktivität des gereinigten TP-Enzyms war 102-fach höher als die des Rohenzyms und die Ausbeute der enzymatischen Aktivität betrug 62%.
(2) Gereinigtes TP-Enzym (spezifische Aktivität: 90 mE/mg) wurde durch ein zu dem in Abschnitt (1) des Bezugsbeispiels 2 eingesetzten ähnlichen Reinigungsverfahren gewonnen, mit der Ausnahme, dass anstelle des TP-Rohenzyms aus Catellatospora ferruginea KY2039 das TP-Rohenzym aus Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 aus Abschnitt (2) des Bezugsbeispiels 1 eingesetzt wurde.
Die spezifische Aktivität des gereinigten TP-Enzyms war 90-fach höher als die des Rohenzyms und die Ausbeute der enzymatischen Aktivität betrug 50%.
(3) Zu dem MP-Rohenzym aus Propionibacterium freudenreichii KY4002 aus Abschnitt (3) des Bezugsbeispiels 1 wurde Ammoniumsulfat bis 80% Sättigung hinzugegeben und der Niederschlag gewonnen. Der Niederschlag wurde in einer kleinen Menge (etwa 20 ml) 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Lösung wurde gegen 2 l desselben Puffers 24 Stunden dialysiert, 15 Minuten auf 50ºC erhitzt und abzentrifugiert (12 000 · g, 20 Minuten). Der Überstand wurde für eine Adsorption auf eine zuvor mit demselben Puffer vorequilibrierte Säule (1 l, Durchmesser: 5 cm) geladen, die mit dem Ionenaustauschharz DEAE- Sephadex (Pharmacia LKB Biotechnology) gepackt worden war. Kontaminierende Proteine wurden mit demselben Puffer weggewaschen und es wurde mit einem Gradienten von 0 bis 1,0 M Natriumchlorid (10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) eluiert. Die bei einer Natriumchloridkonzentration von etwa 0,5 bis 0,8 M eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und Ammoniumsulfat bis 80% Sättigung hinzugegeben, um den Niederschlag zu gewinnen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen (12 000 · g, 20 Minuten) und in 10 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Lösung wurde gegen 2 l desselben Puffers 24 Stunden dialysiert, um gereinigtes MP-Enzym zu erhalten (spezifische Aktivität: 50 mE/mg).
Die spezifische Aktivität des gereinigten MP-Enzyms war 48-fach höher als die des Rohenzyms und die Ausbeute der enzymatischen Aktivität betrug 79%.
(4) Gereinigtes MP-Enzym (spezifische Aktivität: 45 mE/mg) wurde durch ein zu dem in Abschnitt (3) des Bezugsbeispiels 2 eingesetzten ähnlichen Reinigungsverfahren gewonnen, mit der Ausnahme, dass anstelle des MP-Enzyms aus Propionibacterium freudenreichil KY4002 das MP-Rohenzym aus Enterococcus faecium ATCC 10541 aus Abschnitt (4) des Bezugsbeispiels 1 eingesetzt wurde. Die spezifische Aktivität des gereinigten MP-Enzyms war 45-fach höher als die des Rohenzyms und die Ausbeute der enzymatischen Aktivität betrug 75%.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Erfindungsgemäß werden effektive und kostengünstige Verfahren zur Herstellung von Disacchariden und die damit erhaltenen neuen Disaccharide bereitgestellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Disaccharids, umfassend:

Kondensation von beta-Glucose-1-phosphat in einem wässrigen Medium mit

a) einem Monosaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Fucose und D- Xylose in Gegenwart von Trehalose-Phosphorylase, die auf das ausgewählte Monosaccharid einwirkt, oder

b) einem Monosaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Mannose, D- Allose, D-Tagatose, D-Sorbose und L-Fucose in Gegenwart von Maltose-Phosphorylase, die auf das ausgewählte Monosaccharid einwirkt, und

Gewinnen des in dem wässrigen Medium gebildeten Disaccharids,

wobei die Trehalose-Phosphorylase von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Cateilatospora gehört, und die Maltose-Phosphorylase von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Propionibacterium gehört.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das beta-Glucose-1-phosphat in einem wässrigen Medium durch eine Reaktion von Maltose in Gegenwart von Maltose-Phosphorylase und eines Enzyms mit Glucose-Abbauaktivität erhältlich ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das beta-Glucose-1-phosphat in einem wässrigen Medium durch Reaktion von Maitose in Gegenwart von Maltose-Phosphorylase, die auf das ausgewählte Monosaccharid einwirkt, und eines Enzyms mit Glucose-Abbauaktivität erhältlich ist und die Maltose-Phosphorylase von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Propionibacterium gehört.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Enzym mit Glucose-Abbauaktivität Glucose-Oxidase, Katalase, Pyranose-Oxidase, Glucose-Dehydrogenase, Glucokinase oder Hexokinase ist.

5. Glucosyl(alpha,1-1)D-fucose.

6. Glucosyl(alpha,1-4)L-fucose.

7. Glucosyl(alpha,1-1)D-xylose.

8. Glucosyl(alpha,1-4)D-mannose.

9. Glucosyl(alpha,1-4)D-allose.

10. Glucosyl(alpha,1-4)D-tagatose.

11. Glucosyl(alpha,1-4)D-sorbose.

12. Gereinigtes Trehalose-Phosphorylase-Enzym, das auf ein Monosaccharid einwirkt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Fucose und D-Xylose, und von einem Mikroorganismus erhältlich ist, der zu der Gattung Catellatospora ferruginea gehört.

13. Gereinigtes Maltose-Phosphorylase-Enzym, das auf ein Monosaccharid einwirkt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Mannose, D-Allose, D-Tagatose, D-Sorbose und L-Fucose, und von einem Mikroorganismus erhältlich ist, der zu der Gattung Propionibacterium freudenreichil gehört.