DE69434590T2 - Maltose-Trehalose-konvertierendes Enzym, dessen Herstellung und Verwendung - Google Patents

Maltose-Trehalose-konvertierendes Enzym, dessen Herstellung und Verwendung Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym und die Herstellung und Verwendungen davon. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Enzym, welches Maltose in Trehalose umwandelt oder Trehalose in Maltose umwandelt (hier nachstehend als „Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym" bezeichnet), sowie die Herstellung davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Mikroorganismus, der zur Herstellung des Enzyms fähig ist, Trehalose, welche mit dem Enzym hergestellt wurde, Saccharid-Zusammensetzungen, die die Trehalose enthalten, und Zusammensetzungen, welche die Trehalose oder die Saccharid-Zusammensetzung enthalten.
  • Trehalose oder α,α-Trehalose war als ein nicht reduzierendes Saccharid, das aus Glucosen besteht, bekannt. Wie in Advances in Carbohydrate Chemistry, Bd. 18, S. 201-225 (1963), veröffentlicht von Academic Press, USA und Applied and Environmental Microbiology, Bd. 56, S. 3.213-3.215 (1990) beschrieben wird, liegt Trehalose verbreitet in Mikroorganismen, Pilzen, Insekten, usw. vor, obwohl der Gehalt relativ niedrig ist. Trehalose ist ein nicht reduzierendes Saccharid, so dass sie sich weder mit Substanzen umsetzt, die Aminogruppen enthalten, wie Aminosäuren und Proteine, die Aminocarbonyl-Reaktion auslöst, noch Aminosäuren enthaltende Substanzen verschlechtert. Folglich kann Trehalose ohne Bedenken verwendet werden, die dahingehen, dass ein unbefriedigendes Braunfärben und Verschlechtern verursacht wird. Deshalb bestand für das Etablieren eines Herstellungsverfahrens für Trehalose im Industriemaßstab ein großer Bedarf.
  • Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Trehalose sind zum Beispiel im Japanischen Patent mit der Offenlegungsnr. 154,485/75, wobei Mikroorganismen verwendet werden, und im Japanischen Patent mit der Offenlegungsnr. 216,695/83, wobei Maltose in Trehalose durch die kombinierte Ver wendung von Maltose- und Trehalose-Phosphorylasen umgewandelt wird, offenbart. Erstere ist jedoch nicht für die Herstellung im Industriemaßstab geeignet, da der Gehalt an Trehalose, welcher in Mikroorganismen als ein Ausgangsmaterial vorliegt, normalerweise niedriger als 15 w/w % (die Formulierung „w/w %" ist in der Beschreibung als „%" abgekürzt, wenn nichts anderes angegeben ist) auf einer Trockenfeststoffbasis (Tfb.) ist und die Extraktions- und Reinigungsschritte kompliziert sind. Letztere weist die folgenden Nachteile auf: (i) Da Trehalose über Glucose-1-phosphat gebildet wird, konnte die Konzentration von Maltose als ein Substrat nicht auf einen zufriedenstellend hohen Level gebracht werden; (ii) die enzymatischen Reaktionssysteme der Phosphorylasen sind reversible Umsetzungen und die entsprechenden Ausbeuten der beabsichtigten Trehalose sind relativ niedrig; und (iii) es ist äußerst schwierig, ihre Reaktionssysteme stabil zu erhalten und ihre enzymatischen Umsetzungen gleichmäßig verlaufen zu lassen. Deshalb können die vorstehenden herkömmlichen Herstellungen nicht als Verfahren zur Herstellung im Industriemaßstab verwendet werden.
  • Es ist bekannt, dass Stärketeilhydrolysate, welche aus einem Stärkematerial wie verflüssigte Stärke, Dextrine und Maltooligosaccharide hergestellt werden, normalerweise wegen ihren reduzierenden Endgruppen eine Reduktionskraft zeigen. Die Reduktionskraft wird im Allgemeinen durch den „Dextrose-Äquivalent-(DÄ)-Wert" basierend auf dem Trockengewicht ausgedrückt. Es ist bekannt, dass unter den reduzierenden Stärketeilhydrolysaten jene mit einem relativ hohen DÄ-Wert im Allgemeinen ein beträchtlich niedriges Molekulargewicht und Viskosität sowie einen relativ hohen Level an Süße und Reaktivität aufweisen und sich einfach mit Substanzen mit Aminogruppen wie Aminosäuren und Proteinen umsetzen, wobei ein nicht zufriedenstellendes Braunfärben, Geruch und Verschlechterung deren Qualität verursacht wird. Da die Eigenschaften von reduzierenden Stärketeilhydrolysaten abhängig von ihren DÄ-Werten variieren, ist die Beziehung zwischen den reduzierenden Stärketeil hydrolysaten und ihren DÄ-Werten wesentlich. Man nahm sogar an, dass es unmöglich ist, einen Zusammenhang auf diesem Gebiet zu umgehen.
  • Bezüglich der Herstellung von Trehalose wird in der Spalte mit dem Titel „Oligosaccharides" im Kapitel „Current Status of Starch Application Development and Related Problems" in „Food Chemicals", Nr. 88, S. 67-72 (August, 1992) berichtet, dass „berichtet wurde, dass trotz einer verbreiteten Verwendung von Trehalose, die enzymatische Herstellung über eine direkte Saccharid-Transferreaktion oder eine hydrolytische Umsetzung auf diesem Gebiet wissenschaftlich nahezu unmöglich sei." Folglich wurde die Herstellung von Trehalose durch eine enzymatische Umsetzung, die Stärke als ein Material benutzt, wissenschaftlich als sehr schwierig angesehen.
  • Die Erfinder haben jedoch entgegen allen allgemeinen Annahmen erfolgreich ein Herstellungsverfahren für Trehalose etabliert, wie in der Japanischen Patentanmeldung mit der Nr. 362,131/92 offenbart, wobei Trehalose direkt aus nicht reduzierenden Stärketeilhydrolysaten hergestellt wird, indem Glucoamylase zusammen mit einem nicht reduzierenden Saccharid-bildenden Enzym, das zur Bildung von nicht reduzierenden Sacchariden fähig ist, die eine Trehalose-Struktur als eine Endeinheit und einen Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder höher aufweisen, auf reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder höher, welche aus einem Stärkematerial hergestellt werden, einwirken. Die Methode erfordert jedoch 2 oder mehr Arten von Enzymen und verwendet als ein Material ein stärkehaltiges Saccharid mit einem relativ hohen Molekulargewicht und mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder höher sowie einer relativ hohen Viskosität. Zusätzlich ist die Saccharid-Zusammensetzung des resultierenden Produkts äußerst kompliziert und dies kann in hohen Herstellungskosten resultieren. Deshalb ist es die Etablierung eines neuen Herstellungsverfahrens für Trehalose, bei welcher Trehalose aus Maltose und Stärketeilhydrolysaten mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 2 gebildet wird, wobei beide industriell hergestellt, stabil bereitgestellt werden können und kommerziell erhältlich sind, wünschenswert.
  • Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Maltose-Trehaloseumwandelndes Enzym bereitzustellen, welches eine industriell herstellbare und stabil bereitstellbare Maltose in Trehalose umwandelt, sowie die Bereitstellung eines neuen Herstellungsverfahrens für Trehalose und Verwendungen von Trehalose und ferner die Bereitstellung einer Saccharid-Zusammensetzung, die die mit dem Enzym hergestellte Trehalose enthält.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym bereitgestellt, das Maltose in Trehalose umwandelt und umgekehrt, wobei das Enzym von einem Mikroorganismus erhältlich ist und ein Molekulargewicht von ca. 57.000 bis 120.000 Dalton nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hat,
    wobei der Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, Pseudomonas oder Thermus angehört,
    wobei das Enzym die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
    • (1) Isoelektrischer Punkt (pl) Ca. 3.8-5.1 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt; und
    • (2) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein mM Cu++, 50 mM Tris-HCl Puffer,
    und wobei das Enzym eine Aminosäureteilsequenz hat aus der Gruppe bestehend aus:
    • (1) Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe (wobei „X1" bedeutet „Phe" oder „Pro"; „X2", „Thr" oder „Pro"; und „X3", „Val" oder „Ala"); und
    • (2) Ala-Val-X4-Tyr (wobei „Xa" bedeutet „Phe" oder „Ile").
  • Die Erfinder durchmusterten umfangreich Mikroorganismen, die zur Herstellung eines neuen Saccharid-umwandelnden Enzyms, das Trehalose aus Maltose bildet, fähig sind. Als ein Ergebnis fanden wir, dass ein Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, d.h. Pimelobacter sp. R48, welcher aus einer Erde in Okayama-Stadt, Okayama, Japan isoliert wurde; ein Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, d.h. Pseudomonas putida H262, welcher aus einer Erde in Nishinomiya-Stadt, Hyogo, Japan isoliert wurde; und ein Mikroorganismus der Gattung Thermus ein neues Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym bilden, das Maltose in Trehalose umwandelt, und etablierten wir eine Herstellung von Trehalose und einer Saccharid-Zusammensetzung, die die Trehalose enthält, sowie Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika und Arzneimitteln, die die Trehalose oder die Saccharid-Zusammensetzung enthalten. So konnte die Aufgabe dieses Erfindung gelöst werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter nur durch Beispiele mit Bezug auf die angefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
  • 1 den Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pimelobacter sp. R48 abgeleitet ist, zeigt.
  • 2 den Einfluss des pH-Werts auf die Enzymaktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pimelobacter sp. R48 abgeleitet ist, zeigt.
  • 3 den Einfluss der Temperatur auf die Stabilität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pimelobacter sp. R48 abgeleitet ist, zeigt.
  • 4 den Einfluss des pH-Werts auf die Stabilität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pimelobacter sp. R48 abgeleitet ist, zeigt.
  • 5 den Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pseudomonas putida H262 abgeleitet ist, zeigt.
  • 6 den Einfluss des pH-Werts auf die Enzymaktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pseudomonas putida H262 abgeleitet ist, zeigt.
  • 7 den Einfluss der Temperatur auf die Stabilität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pseudomonas putida H262 abgeleitet ist, zeigt.
  • 8 den Einfluss des pH-Werts auf die Stabilität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Pseudomonas putida H262 abgeleitet ist, zeigt.
  • 9 den Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet ist, zeigt.
  • 10 den Einfluss des pH-Werts auf die Enzymaktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet ist, zeigt.
  • 11 den Einfluss der Temperatur auf die Stabilität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet ist, zeigt.
  • 12 den Einfluss des pH-Werts auf die Stabilität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet ist, zeigt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym und die Herstellung und Verwendungen davon. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym, das Maltose in Trehalose umwandelt und/oder Trehalose in Maltose umwandelt, sowie die Herstellung davon. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, der zur Herstellung des Enzyms fähig ist, eine Trehalose, die mit dem Enzym hergestellt wurde, eine Saccharid-Zusammensetzung, die die Trehalose enthält, und eine Zusammensetzung, die die Trehalose oder die Saccharid-Zusammensetzung enthält.
  • Der Identifizierungstest eines Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, d.h. „Pimelobacter sp. R48" und eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, d.h. Pseudomonas putida H262, gemäß der vorliegenden Erfindung ergab die folgenden Ergebnisse. Der Test wurde gemäß der Methode, wie in „Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei" (Classification and Identification of Microorganisms), herausgegeben von Takeji Hasegawa, veröffentlicht von Japan Scientific Societies Press, Tokio, Japan (1985) beschrieben, durchgeführt.
  • Die Ergebnisse für Pimelobacter sp. R48 waren wie folgt:
  • A. Morphologie
  • (1) Charakteristika von Zellen, wenn sie bei 27°C in Nähragar inkubiert werden:
    Liegen normalerweise in der Form von Stäbchen mit 0,5 bis 0,9 × 1,5 bis 4,0 μm vor;
    Liegen einzeln vor, liegen aber weniger häufig in einer paarweisen V-Form oder in einer verbundenen Form vor;
    Besitzen kein Bewegungsvermögen und sind nicht sporenbildend;
    Nicht säurefest; und
    Gram-Färbung: Positiv.
  • (2) Charakteristika von Zellen, wenn sie bei 27°C in Agarmedium, das mit Hefe- und Maltoextrakten ergänzt wurde, inkubiert werden:
    Weisen eine Größe von 0,6 bis 1,0 × 1,3 bis 4,2 μm nach einer Kultivierung für einen Tag auf und liegen in der Form von nahezu Kokken mit einer Größe von 0,6 bis 1,0 × 1,0 bis 2,5 μm nach einer Kultivierung für drei Tage vor;
    Weisen Polymorphie auf; und
    Liegen einzeln vor, liegen aber weniger häufig in einer paarweisen V-Form oder in einer verbundenen Form vor.
  • B. Kultureigenschaft
    • (1) Charakteristika einer Kolonie, die gebildet wurde, als bei 27°C auf einer Nähragarplatte inkubiert wurde:
      Gestalt: Kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von 0,5 mm nach einer Inkubation für 24 Stunden und 1,5 bis 2 mm nach einer Inkubation für 3 Tage;
      Rand: Ohrähnlich;
      Projektion: Gestalt einer Halbkugel;
      Glanz: Nein;
      Oberfläche: Faltig;
      Farbe: Cremefarbene und undurchsichtige Kolonie;
    • (2) Charakteristika einer Kolonie, die gebildet wurde, als bei 27°C auf einer Agarplatte, welche mit Hefe- und Maltoextrakten ergänzt worden war, inkubiert wurde
      Gestalt: Kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von ca. 1 bis 1,5 mm nach einer Inkubation für 3 Tage;
      Rand: Ohrähnlich;
      Projektion: Gestalt einer Halbkugel;
      Glanz: Nein;
      Oberfläche: Faltig;
      Farbe: Cremefarbene und undurchsichtige Kolonie;
    • (3) Charakteristika einer Kolonie, die gebildet wurde, als bei 27°C auf Schräg-Nähragar inkubiert wurde
      Wachstum: Zufriedenstellend;
      Gestalt: Fadenförmig; und
    • (4) Nicht verflüssigende Gelatine, als bei 27°C auf Nährgelatine stichkultiviert wurde.
  • C. Physiologische Eigenschaften
    • (1) Reduktion von Nitrat: Positiv;
    • (2) Denitrifizierungsreaktion: Negativ;
    • (3) Methylrot-Test: Negativ;
    • (4) VP-Test: Negativ;
    • (5) Bildung von Indol: Negativ;
    • (6) Bildung von Hydrogensulfid: Positiv;
    • (7) Hydrolyse von Stärke: Negativ;
    • (3) Verwendung von Zitronensäure: Positiv;
    • (9) Verwendung einer anorganischen Stickstoffquelle: Verwendung von Ammoniumsalzen und Nitraten;
    • (10) Bildung von Pigment: Negativ;
    • (11) Urease: Negativ;
    • (12) Oxidase: Negativ;
    • (13) Catalase: Negativ;
    • (14) Wachstumsbedingungen: Wachsen bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 und bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 40°C;
    • (15) Sauerstoffanforderungen: Aerob;
    • (16) Verwendung einer Kohlenstoffquelle und Säurebildung
      Figure 00100001
    • (17) Decarboxylase-Test auf Aminosäure: Negativ gegen L-Lysin, L-Arginin und L-Ornithin;
    • (18) Verwendung von Aminosäure: Verwendung von Natrium-L-glutamat und Natrium-L-aspartat;
    • (19) DNase: Negativ;
    • (20) Bildung von 3-Ketolactose: Negativ;
    • (21) Mol-% Guanin (G) plus Cytosin (C) von DNA: 72 %; und
    • (22) Hauptdiaminosäure der Zellwand: LL-Diaminopimelinsäure.
  • Eine Hinterlegung von Pimelobacter sp. R48 wurde am 3. Juni 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki, Japan vorgenommen. Die Hinterlegung wurde an diesem Tag akzeptiert und wird von dem Institut unter der Zugangsnummer FERM BP-4315 unterhalten.
  • Die Ergebnisse von Pseudomonas putida H262 waren wie folgt:
  • A. Morphologie
    • (1) Charakteristika von Zellen, wenn sie bei 27°C in Nähragar inkubiert werden Liegen normalerweise in der Form von Stäbchen mit 0,5 bis 0,7 × 1,0 bis 2,0 μm vor und weisen keine Sporenbildung auf; Besitzen Bewegungsvermögen durch Flagelle; Nicht säurefest; und Gram-Färbung: Negativ.
    • (2) Charakteristika von Zellen, wenn sie bei 27°C in Agarmedium, das mit Hefe- und Maltoextrakten ergänzt wurde, inkubiert werden Weisen eine Größe von 0,6 bis 0,8 × 2,0 bis 4,0 μm nach einer Kultivierung für einen Tag auf.
  • B. Kultureigenschaft
    • (1) Charakteristika einer Kolonie, die gebildet wurde, als bei 27°C auf einer Nähragarplatte inkubiert wurde:
      Gestalt: Kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm nach einer Inkubation für 24 Stunden und 3,5 bis 4 mm nach einer Inkubation für 3 Tage;
      Rand: Vollständig;
      Projektion: Gestalt einer Halbkugel;
      Glanz: Feuchter Glanz;
      Oberfläche: Glatt;
      Farbe: Cremefarbene oder weiße undurchsichtige Kolonie;
    • (2) Charakteristika einer Kolonie, die gebildet wurde, als bei 27°C auf einer Agarplatte, welche mit Hefe- und Maltoextrakten ergänzt worden war, inkubiert wurde
      Gestalt: Kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von ca. 4 bis 5 mm nach einer Inkubation für 3 Tage;
      Rand: Vollständig;
      Projektion: Gestalt einer Halbkugel;
      Glanz: Feuchter Glanz;
      Oberfläche: Glatt;
      Farbe: Cremefarbene oder weiße undurchsichtige Kolonie;
    • (3) Charakteristika einer Kolonie, die gebildet wurde, als bei 27°C auf Schräg-Nähragar inkubiert wurde
      Wachstum: Zufriedenstellend;
      Gestalt: Fadenförmig. Bildung einer relativ dünnen Projektion mit einer glatten Oberfläche, einem feuchten Glanz, einer undurchsichtigen und gelbstichigen Cremefarbe; und
    • (4) Nicht verflüssigende Gelatine, als bei 27°C auf Nährgelatine stichkultiviert wurde.
  • C. Physiologische Eigenschaften
    • (1) Reduktion von Nitrat in einem Bernsteinsäure-Medium: Positiv;
    • (2) Denitrifizierungsreaktion: Negativ;
    • (3) Methylrot-Test: Negativ;
    • (4) VP-Test: Negativ;
    • (5) Bildung von Indol: Negativ;
    • (6) Bildung von Hydrogensulfid: Negativ;
    • (7) Hydrolyse von Stärke: Negativ;
    • (8) Akkumulation von Poly-β-hydroxybutylat: Negativ;
    • (9) Zersetzung von Prokatechuat: Orth-Typ;
    • (10) Verwendung von Zitronensäure: Positiv;
    • (11) Verwendung einer anorganischen Stickstoffquelle: Verwendung von Ammoniumsalzen und Nitraten;
    • (12) Bildung von Pigment: Blass gelbstichiges Pigment;
    • (13) Bildung eines Fluoreszenzpigments: Positiv;
    • (14) Unease: Positiv;
    • (15) Oxidase: Positiv;
    • (16) Catalase: Positiv;
    • (17) Wachstumsbedingungen: Wachsen bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 und bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 37°C;
    • (18) Sauerstoffanforderungen: Aerob;
    • (19) Verwendung einer Kohlenstoffquelle und Säurebildung
      Figure 00140001
    • (20) Decarboxylase-Test auf Aminosäure: Negativ gegen L-Lysin und L-Ornithin und positiv gegen L-Arginin;
    • (21) Verwendung von Aminosäure: Verwendung von Natrium-L-glutamat, Natrium-L-aspartat, Natrium-L-arginin, L-Histidin, L-Valin und D-Alanin, aber nicht L-Tryptophan;
    • (22) DNase: Negativ;
    • (23) Bildung von 3-Ketolactose: Negativ; und
    • (24) Mol-% Guanin (G) plus Cytosin (C) von DNA: 63 %.
  • Basierend auf den Ergebnissen wurden die bakteriologischen Eigenschaften mit jenen von bekannten Mikroorganismen mit Bezug auf Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1. Ausgabe (1984) verglichen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass der Mikroorganismus als ein Mikroorganismus der Spezies Pseudomonas putida identifiziert wurde.
  • Die Erfinder nannten diesen Mikroorganismus „Pseudomonas putida H262" und hinterlegten ihn am 23. Februar 1994 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki, Japan. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde am selben Tag akzeptiert und wird von dem Institut unter der Zugangsnummer FERM BP-4579 unterhalten.
  • Zusätzlich zu den vorstehend angegebenen Mikroorganismen können andere Stämme der Gattung Pseudomonas und ihre Mutanten gemäß der Erfindung geeigneterweise verwendet werden, solange sie das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym herstellen.
  • Darüber hinaus können in der Erfindung geeigneterweise Mikroorganismen der Gattung Thermus, zum Beispiel jene der Spezies Thermus aquaticus (ATCC 25104), Thermus aquaticus (ATCC 33923), Thermus filiformis (ATCC 43280), Thermus ruber (ATCC 35948), Thermus sp. (ATCC 43814) und Thermus sp. (ATCC 43815), verwendet werden.
  • Jedwedes Nährkulturmedium kann gemäß der Erfindung verwendet werden, solange die Mikroorganismen darin wachsen können und das vorliegende Enzym herstellen können: Zum Beispiel können synthetische und natürliche Nährkulturmedien beliebig verwendet werden. Jede Kohlenstoff-enthaltende Substanz kann in der Erfindung als eine Kohlenstoffquelle verwendet werden, solange sie von den Mikroorganismen verwendet wird: Beispiele einer solchen Kohlenstoffquelle sind Saccharide wie Glucose, Fructose, Melassen, Trehalose, Lactose, Saccharose, Mannitol, Sorbit, Stärketeilhydrolysate; und organische Säuren wie Zitronensäure und Bernsteinsäure sowie ihre Salze. Die Konzentrationen dieser Kohlenstoffquellen in Nährkulturmedien werden geeignet gewählt. Zum Beispiel im Fall der Verwendung von Glucose beträgt angesichts des Wachstums und der Proliferation der Mikroorganismen eine bevorzugte Konzentration normalerweise 40 w/v % oder weniger, bevorzugt 10 w/v % oder weniger, Tfb. Die Stickstoffquellen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel anorganische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsalze und Nitrate; und organische Stickstoff-enthaltende Verbindungen wie Harnstoff, Cornsteep-Lösung, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Die anorganischen Bestandteile, die in der Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate und andere Salze von Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybdän und Cobalt.
  • Die Kulturbedingungen, die in der Erfindung verwendet werden, sind jene, bei welchen die Mikroorganismen wachsen können und das vorliegende Enzym herstellen können, zum Beispiel aerobe Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von ca. 4 bis 80°C, bevorzugt einer Temperatur im Bereich von ca. 20 bis 75°C; und bei einem pH-Wert im Bereich von ca. 5 bis 9, bevorzugt einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8,5. Die Kultivierungszeit, welche in der Erfindung geeigneterweise verwendet wird, wird auf eine Zeit festgesetzt, wel che länger ist als die, die zur Wachstumsinitiierung der Mikroorganismen erforderlich ist, bevorzugt 10 bis 100 Stunden. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff (GS) in Nährkulturmedien ist nicht speziell eingeschränkt und normalerweise ist ein GS im Bereich von ca. 0,5 bis 20 ppm zufriedenstellend. Der GS-Level kann durch Kontrollieren der Belüftungsrate, Rühren der Nährkulturmedien, Ergänzen der Belüftung mit Sauerstoff und Erhöhen des Innendrucks der Fermenter innerhalb des Bereichs gehalten werden. Die Kultur kann chargenweise oder in einer kontinuierlichen Weise durchgeführt werden.
  • Nach der Vervollständigung der Kultur wurde das vorliegende Enzym daraus gewonnen. Soweit die Aktivität des vorliegenden Enzyms in sowohl Zellen als auch zellfreien Überständen gefunden wird, können sie gewonnen und als ein Rohenzym verwendet werden. Die resultierende Kultur kann intakt als ein Rohenzym verwendet werden. Herkömmliche flüssig-fest-Trennmethoden können in der Erfindung verwendet werden, um Zellen von der Kultur zu entfernen. Zum Beispiel können geeigneterweise Methoden zur direkten Zentrifugation der resultierenden Kultur und jene zur Filtration der Zellen mit Anschwemmfiltern oder zur Filtration der Zellen durch die Zugabe von Filterhilfsmitteln, sowie zur Abtrennung der Zellen durch Membranfiltration mit Plattenfiltern oder Hohlfasern verwendet werden. So erhaltene zellenfreie Filtrate können intakt als eine Enzymlösung verwendet werden oder können vor ihrer Verwendung in einer herkömmlichen Weise konzentriert werden. Die Konzentrationsmethoden, die in der Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Abscheiden mit Aceton und Alkohol und Membranfiltrieren mit Plattenfiltern, Hohlfasern, usw.
  • Im Falle des vorliegenden Enzyms handelt es sich um ein intrazelluläres Enzym, es kann von Zellen durch herkömmliche Techniken extrahiert werden und der resultierende Extrakt kann als ein Rohenzym verwendet werden. Um einen solchen Extrakt zu erhalten, werden Zellen durch ein Ultraschallaufbre chen, ein mechanisches Aufbrechen mit Glasbeads (Glaskügelchen) oder Aluminiumoxid, ein Aufbrechen mit Nadelwalzenpressen, usw. aufgebrochen, gefolgt von Unterwerfen des resultierenden Materials einer Zentrifugation oder Membranfiltration, um eine klare Rohenzymlösung zu erhalten.
  • Zellenfreie Filtrate und ihre Konzentrate sowie Zellextrakte können durch herkömmliche Techniken immobilisiert werden. Beispiele einer solchen Immobilisierungstechnik sind Konjugationsmethoden mit Ionenaustauschern, kovalente Verknüpfungen und Absorptionen mit Harzen und Membranen und Einschlussmethoden mit Substanzen mit hohem Molekulargewicht. Intakte Zellen, die von der resultierenden Kultur abgetrennt wurden, können als Rohenzym verwendet werden oder können vor ihrer Verwendung immobilisiert werden. Zum Beispiel werden die Zellen immobilisiert, indem sie mit Natriumalginat gemischt werden und die Suspension in Calciumchlorid-Lösung getropft wird, um die Tropfen zu Granula zu gelieren. Das resultierende Granula kann vor seiner Verwendung mit Polyethylenimin oder Glutaraldehyd fixiert werden.
  • Die so erhaltenen Rohenzymlösungen können intakt verwendet werden oder vor ihrer Verwendung durch herkömmliche Methoden gereinigt werden. Zum Beispiel kann eine gereinigte Enzymzubereitung, die elektrophoretisch eine einzelne Bande zeigt, durch Dialysieren einer Rohenzymzubereitung, die durch Aussalzen eines Extrakts von aufgebrochenen Zellen mit Ammoniumsulfat und Konzentrieren des resultierenden Materials hergestellt wurde, und darauffolgend Reinigen der dialysierten Lösung durch Anionenaustausch-Säulenchromatographie mit „DEAE-TOYOPEARL®", ein Anionenaustauscher; hydrophobe Säulenchromatographie mit „BUTYL-TOYOPEARL®", ein hydrophobes Harz, wobei alle Produkte von Tosoh Corporation, Tokio, Japan sind; Anionenaustausch-Säulenchromatographie mit „MONO Q HR5/5", ein Anionenaustauscher, der kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird; und Gelfiltrations-Säulenchromatographie mit „TOYOPEARL® HW-55", ein Harz, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, hergestellt werden. Diese Verfahren stellen ein Enzym bereit, das elektrophoretisch eine einzelne Bande zeigt.
  • Das so erhaltene vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym weist die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:
    • (1) Wirkung Wandelt Maltose in Trehalose um und umgekehrt;
    • (2) Molekulargewicht Ca. 57.000 bis 120.000 Dalton nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pl) Ca. 3.8-5.1 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein mM Cu++, Hg++ und Tris-HCl Puffer; und
    • (5) Abstammung/Herkunft Abstammend von Mikroorganismen.
  • Genauer unterscheidet sich die physikochemische Eigenschaft des vorliegenden Enzyms in Abhängigkeit von seiner Abstammung, wie nachstehend gezeigt wird.
  • Ein Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym, das von Pimelobacter sp. R48 ableitet ist, weist die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:
    • (1) Wirkung Wandelt Maltose in Trehalose um und umgekehrt; Bildet ca. ein Mol Trehalose aus einem Mol Maltose oder bildet ca. ein Mol Maltose aus einem Mol Trehalose;
    • (2) Molekulargewicht Ca. 57.000 bis 67.000 Dalton nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pl) Ca. 4.1-5.1 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein (1) mM Cu++, Hg++ und Tris-HCl Puffer; und
    • (5) Optimale Temperatur Ca. 20°C, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird;
    • (6) Optimaler pH-Wert Ca. 7,0 bis 8,0, wenn bei 25°C für 60 min inkubiert wird;
    • (7) Thermische Stabilität Stabil bis zu ca. 30°C, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird; und
    • (8) pH-Wert-Stabilität Stabil bei einem pH-Wert von ca. 6,0 bis 9,0, wenn bei 20°C für 60 min inkubiert wird.
  • Ein Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym, das von Pseudomonas putida H262 ableitet ist, weist die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:
    • (1) Wirkung Wandelt Maltose in Trehalose um und umgekehrt; Bildet ca. ein Mol Trehalose aus einem Mol Maltose oder bildet ca. ein Mol Maltose aus einem Mol Trehalose;
    • (2) Molekulargewicht Ca. 110.000 bis 120.000 Dalton nach SDS-PAGE;
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pl) Ca. 4.1-5.1 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein (1) mM Cu++, Hg++ und 50 mM Tris-HCl Puffer;
    • (5) Optimale Temperatur Ca. 37°C, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird;
    • (6) Optimaler pH-Wert Stabil bei einem pH-Wert von ca. 7,3 bis 8,3, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird; und
    • (7) Thermische Stabilität Stabil bis zu 40°C, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird; und
    • (8) pH-Wert-Stabilität Stabil bei einem pH-Wert von ca. 6,0 bis 9,5, wenn bei 35°C für 60 min inkubiert wird.
  • Das Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) ableitet ist, weist die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:
    • (1) Wirkung Wandelt Maltose in Trehalose um und umgekehrt; Bildet ca. ein Mol Trehalose aus einem Mol Maltose oder bildet ca. ein Mol Maltose aus einem Mol Trehalose;
    • (2) Molekulargewicht Ca. 100.000 bis 110.000 Dalton nach SDS-PAGE;
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pl) Ca. 3.8-4.8 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein (1) mM Cu++, Hg++ und 50 mM Tris-HCl Puffer;
    • (5) Optimale Temperatur Ca. 65°C, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird;
    • (6) Optimaler pH-Wert Stabil bei einem pH-Wert von ca. 6,0 bis 6,7, wenn bei 60°C für 60 min inkubiert wird;
    • (7) Thermische Stabilität Stabil bis zu einer Temperatur von 80°C, wenn bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wird; und
    • (8) pH-Wert-Stabilität Stabil bei einem pH-Wert von ca. 5,5 bis 9,5, wenn bei 60°C für 60 min inkubiert wird.
  • Die Aktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms wird wie folgt getestet: Ein ml einer Enzymlösung wird zu einem ml 20 w/v % Maltose als ein Substrat in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) gegeben und das Lösungsgemisch wird bei 25°C, 35°C oder 60°C für 60 min inkubiert, gefolgt vom Erwärmen der Lösung bei 100°C für 10 min, um die enzymatische Umsetzung abzustoppen. Das resultierende Reaktionsgemisch wird genau um das 11-fache mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,5) verdünnt und 0,4 ml der verdünnten Lösung werden mit 0,1 ml einer Trehalase-Lösung mit einer Einheit/ml Trehalase gemischt. Die resultierende Lösung wird bei 45°C für 120 min inkubiert, gefolgt von Bestimmen der Menge an Glucose durch die Glucose-Oxidase-Methode. Als eine Kontrolle wird durch Verwenden von Trehalase und einer Enzymlösung, welche bei 100°C für 10 min vorgewärmt wurde, um das Enzym zu inaktivieren, die Aktivität der Enzymlösung in einer ähnlichen Weise wie vorstehend getestet. Mit dem vorstehenden Test wird der Gehalt an Trehalose, die durch das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym gebildet wird, bezogen auf die Menge der gebildeten Glucose bestimmt und eine Aktivitätseinheit des Enzyms wird als die Menge des Enzyms definiert, die ein μMol Trehalose pro Minute bildet. Hinsichtlich der Reaktionstemperatur wird sie für das Enzym eines Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter auf 25°C; für das der Gattung Pseudomonas auf 35°C; und für das der Gattung Thermus auf 60°C gesetzt.
  • Da das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym Maltose in Trehalose umwandelt und umgekehrt, können Maltose oder Trehalose als ein Substrat verwendet werden, um seine Endverwendung zu erreichen. Maltose wird als ein Substrat zur Herstellung von Trehalose verwendet.
  • In der Erfindung kann jedwede Maltose verwendet werden, solange sie in Trehalose umgewandelt wird, wenn sie mit der Wirkung des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms erhalten wird, und im Allgemeinen können geeigneterweise Produkte mit hohem Maltose-Gehalt mit der höchst möglichen Reinheit, bevorzugt jene mit einer Reinheit von 70 % oder höher, Tfb., verwendet werden. Kommerziell erhältliche Maltose-Produkte und jene, welche durch herkömmliche Stärke-Saccharifikations-Techniken hergestellt werden, werden auch verwendet.
  • Beispiele von Maltose-Herstellung aus Stärke sind jene, welche in den Japanischen Patentveröffentlichungen mit den Nr. 11,437/81 und 17,078/81 offenbart werden, wobei ermöglicht wird, dass β-Amylase auf gelierte und verflüssigte Stärke einwirkt, um Maltose zu bilden, die dann von Dextrin mit hohem Molekulargewicht abgetrennt wird und in einem Produkt mit hohem Maltose-Gehalt rückgewonnen wird. Andere Beispiele sind jene, welche in den Japanischen Patentveröffentlichungen mit den Nr. 13,089/72 und 3,938/79 offenbart werden, wobei ermöglicht wird, dass β-Amylase auf gelierte und verflüssigte Stärke zusammen mit einem stärkespaltenden Enzym wie Isoamylase und Pullulanase einwirkt, um Maltose zu bilden, die dann in einem Produkt mit hohem Maltose-Gehalt rückgewonnen wird.
  • Zu den begleitenden Sacchariden wie Maltotriose, die in den resultierenden Produkten mit hohem Maltose-Gehalt vorhanden sind, welche durch die vorstehenden Herstellungen hergestellt wurden, werden die Enzyme gegeben, wie in den Japanischen Patentveröffentlichungen mit den Nr. 28,153/81, 3,356/82 und 28,154/81 offenbart, um den Maltose-Gehalt zu erhöhen. Der Maltose-Gehalt in den Produkten mit hohem Maltose-Gehalt kann zufriedenstellend stärker erhöht werden, indem die begleitenden Saccharide durch Säulenchromatographie mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz entfernt werden, wie im Japanischen Patent mit der Offenlegungsnr. 23,799/83 offenbart.
  • Die Konzentration der Substrate, die in der Erfindung verwendet wird, ist nicht speziell eingeschränkt. Die enzymatische Umsetzung des vorliegenden Enzyms verläuft sogar in einer Lösung von 0,1 % oder 50 % eines Maltose-Materials und resultiert in der Bildung von Trehalose. Suspensionen, die unlösliche Substrate enthalten, können in der Erfindung verwendet werden. Die Temperatur, die bei der vorliegenden enzymatischen Umsetzung verwendet wird, kann auf eine Temperatur gesetzt werden, bei welcher das Enzym nicht inaktiviert ist, d.h. eine Temperatur von bis zu ca. 80°C, bevorzugt eine Temperatur im Bereich von ca. 0 bis 70°C. Der Reaktions-pH-Wert, der bei der vorliegenden enzymatischen Umsetzung verwendet wird, wird auf einen pH-Wert im Bereich von ca. 5,5 bis 9,0, bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von ca. 6,0 bis 8,5 gesetzt. Die Reaktionszeit, die bei der vorliegenden enzymatischen Umsetzung verwendet wird, wird geeigneterweise abhängig von den Reaktionsbedingungen gewählt und liegt normalerweise im Bereich von ca. 0,1 bis 100 Stunden, wenn das Enzym in einer Menge von ca. 0,1 bis 100 Einheiten/g Substrat, Tfb., verwendet wird.
  • Die vorliegende enzymatische Umsetzung ermöglicht die Umwandlung von Trehalose aus einem Maltose-Material in einer relativ hohen Umwandlungsrate, d.h. das Maximum beträgt ca. 70 bis 85 %.
  • Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird in einer herkömmlichen Weise einer Filtration und Zentrifugation unterworfen, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und mit einer Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt und zu sirupartigen Produkten konzentriert. Falls notwendig, können die sirupartigen Produkte beliebig zu pulverförmigen Produkten getrocknet oder zu kristallinen Produkten zubereitet werden.
  • Darüber hinaus können die pulverförmigen Produkte einfach zu hochreinen Trehalose-Produkten verarbeitet werden, indem sie mit einer oder mehreren Methoden, zum Beispiel Fraktionierungen durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie und Säulenchromatographie mit einer Aktivkohle oder einem Kieselgel; und alkalischen Behandlungen, um die restlichen reduzierenden Saccharide zu zersetzen und zu entfernen, gereinigt werden. Maltose, die durch eine solche Säulenchromatographie abgetrennt werden kann, kann geeigneterweise als ein Substrat zur Umwandlung von Maltose in Trehalose durch das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym verwendet werden.
  • Falls notwendig, kann die vorliegende Saccharid-Zusammensetzung, die Trehalose enthält, durch Glucoamylase und α-Glucosidase hydrolysiert werden oder einer Saccharid-Transferreaktion unterworfen werden, wobei Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase und/oder -Glucosyltransferase zur Kontrolle ihrer Süße, Reduktionskraft und Viskosität verwendet werden. Darüber hinaus können reduzierende Saccharide in den resultierenden Trehalose-Produkten beliebig entfernt werden, indem sie mit alkalischen Behandlungen zersetzt werden und indem sie mit Hefen fermentiert oder zu Zuckeralkoholen hydriert werden. So wird ihre Reduktionskraft beseitigt. Von dem resultierenden Material kann Glucose durch die vorstehenden Reinigungsverfahren wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie entfernt werden, wobei Fraktionen mit hohem Trehalo se-Gehalt erhalten werden. Die so erhaltenen Fraktionen können einfach gereinigt und zu sirupartigen Produkten konzentriert werden und, falls notwendig, können die sirupartigen Produkte weiter zu übersättigten Lösungen konzentriert und zu wasserhaltiger oder wasserfreier kristalliner Trehalose kristallisiert werden.
  • Die Ionenaustausch-Säulenchromatographie, die in der Erfindung verwendet werden kann, schließt zum Beispiel jene ein, die ein stark saures Kationen-austauscherharz verwenden, wie in den Japanischen Patenten mit den Offenlegungsnr. 23,799/83 und 72,598/83 offenbart. Durch die Verwendung der Säulenchromatographie können die begleitenden Saccharide, die in einem Trehalose-Rohprodukt enthalten sind, einfach entfernt werden, wobei Fraktionen mit hohem Trehalose-Gehalt erhalten werden. In diesem Fall kann jedwede von Festbett-, Wanderbett- und Halbwandermethoden beliebig verwendet werden.
  • Um eine wasserhaltige kristalline Trehalose herzustellen, wird eine 65 bis 90 %ige Lösung von Trehalose mit einer Reinheit von 60 % oder höher in eine Kristallisiervorrichtung gegeben und schrittweise während Rühren gekühlt, in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Impfkristalls von ca. 0,1 bis 20 % bei einer Temperatur von 95°C oder niedriger, bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 90°C, um eine Füllmasse zu erhalten, die wasserhaltige kristalline Trehalose enthält. Kontinuierliche Kristallisationsmethoden, die die Kristallisation der beabsichtigten Saccharide unter ihrer Konzentration in Vakuum erreichen, können beliebig verwendet werden. Herkömmliche Methoden wie Abtrennen, Blockpulverisieren, Fließbettgranulieren und Sprühtrocknen können in der Erfindung verwendet werden, um aus der Füllmasse wasserhaltige kristalline Trehalose oder kristalline Saccharide, die sie enthalten, herzustellen.
  • Im Falle des Abtrennens werden die Füllmassen normalerweise einer Zentrifuge vom Siebtrommel-Typ ausgesetzt, um wasserhaltige kristalline Tre halose von einer Mutterlauge abzutrennen, und, falls notwendig, wird die resultierende wasserhaltige kristalline Trehalose gewaschen, indem sie mit einer kleinen Menge an kaltem Wasser besprüht wird, wobei die Herstellung von wasserhaltiger kristalliner Trehalose mit einer erhöhten Reinheit ermöglicht wird.
  • Im Falle des Sprühtrocknens werden kristalline Saccharide ohne oder im Wesentlichen ohne Hygroskopie einfach durch Sprühen von Füllmassen mit einer Konzentration von ca. 60 bis 85 %, Tfb., und einer Kristallinität von ca. 20 bis 60 %, Tfb., aus einer Düse durch eine Hochdruckpumpe; Trocknen des resultierenden Materials mit einer warmen Luft von ca. 60 bis 100°C, die die resultierenden kristallinen Pulver nicht schmilzt; und Reifen der resultierenden Pulver für ca. 1 bis 20 Stunden während Blasen mit einer warmen Luft von ca. 30 bis 60°C hergestellt.
  • Im Falle des Blockpulverisierens werden kristalline Saccharide ohne oder im Wesentlichen ohne Hygroskopie einfach hergestellt, indem ermöglicht wird, dass Füllmassen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 10 bis 25 % und einer Kristallinität von ca. 10 bis 60 %, Tfb., für mehrere Stunden bis zu 3 Tage oder so stehen, um die gesamten Inhalte zu Blöcken zu kristallisieren und zu verfestigen, die resultierenden Blöcke pulverisiert oder geschnitten werden und das resultierende Material getrocknet wird.
  • Obwohl wasserfreie kristalline Trehalose durch Trocknen von wasserhaltiger kristalliner Trehalose, um sie in die wasserfreie Form umzuwandeln, hergestellt werden kann, wird sie im Allgemeinen hergestellt, indem eine Lösung mit hohem Trehalose-Gehalt und mit einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10 % bereitgestellt wird, die Lösung in eine Kristallisiervorrichtung gegeben wird, die Lösung in der Gegenwart eines Impfkristalls bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 160°C, bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 80 bis 140°C unter Rührbedingungen gehalten wird, wobei eine Füllmasse erhalten wird, die wasserfreie kristalline Trehalose enthält, und die wasserfreie kristalline Trehalose durch herkömmliche Methoden wie Blockpulverisieren, Fließbettgranulieren und Sprühtrocknen unter den Bedingungen von Trocknen und relativ hoher Temperatur kristallisiert und pulverisiert wird.
  • Die so erhaltene vorliegende Trehalose ist stabil und im Wesentlichen ohne Reduktionskraft und kann mit anderen Materialien, insbesondere Aminosäuren und Aminosäure-enthaltenden Substanzen wie Oligopeptiden und Proteinen ohne Bedenken, nicht zufriedenstellendes Braunfärben und Geruch sowie Verschlechterung der Materialien zu verursachen, gemischt und verarbeitet werden. Trehalose hat per se eine zufriedenstellend hohe Qualität und Süße. Da Trehalose einfach durch Trehalase zu Glucosen hydrolysiert, wird sie einfach von Lebewesen als eine Energiequelle, wenn sie oral verabreicht wird, assimiliert, absorbiert und verwendet. Darüber hinaus wird Trehalose durch Zahnkaries-hervorrufende Mikroorganismen nicht stark fermentiert und dies macht sie als ein Süßungsmittel, welches Zahnkaries nicht stark hervorruft, nützlich.
  • Die vorliegende Trehalose ist ein stabiles Süßungsmittel und speziell kristalline Trehalose wird beliebig als ein Zuckerüberzugsmittel für Tabletten verwendet, wenn sie zusammen mit einem Bindemittel wie Pullulan, Hydroxyethylstärke oder Polyvinylpyrrolidon verwendet wird. Zusätzlich weist die Trehalose Eigenschaften wie osmotischen Druck-kontrollierendes Vermögen, Füllstoffverleihendes Vermögen, Glanz-verleihendes Vermögen, Feuchtigkeitsrückhaltevermögen, Viskosität-verleihendes Vermögen, im Wesentlichen keine Fermentierbarkeit, Vermögen zur Vorbeugung von Retrogradation von gelierter Stärke und Vermögen zur Vorbeugung von Kristallisation von anderen Sacchariden auf.
  • Folglich können die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, beliebig als ein Süßungsmittel, Geschmack verbesserndes Mittel, Qualität verbesserndes Mittel, Stabilisator und Füllstoff in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Zigaretten, Tabakwaren, Futtern, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung können intakt als ein "Würzmittel" zum Süßen verwendet werden. Falls notwendig, können sie zusammen mit geeigneten Mengen an einem oder mehreren anderen Süßungsmitteln, zum Beispiel gepulvertem Sirup, Glucose, Maltose, Saccharose, isomerisiertem Zucker, Honig, Ahornzucker, Sorbit, Maltitol, Lactitol, Dihydrocharcon, Steviosid, α-Glycosylsteviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, Saccharin, Glycin und Alanin; und/oder einem Füllstoff wie Dextrin, Stärke und Lactose verwendet werden.
  • Pulverförmige oder kristalline Produkte, die die vorliegende Trehalose oder die Saccharid-Zusammensetzung enthalten, können intakt verwendet werden und, falls notwendig, können sie vor ihrer Verwendung mit einem Exzipienten, Füllstoff, Verdünnungsmittel und Bindemittel gemischt und zu Granula, Kugeln, Granulierstäbchen, Platten, Würfeln und Tabletten geformt werden.
  • Die vorliegende Saccharid-Zusammensetzung, die Trehalose mit einer niedrigen Reduktionskraft enthält, und davon abgetrennte Trehalose passen gut mit anderen Materialien mit sauerem, säurebedingtem, salzigem, bitterem, astringentem und wohlschmeckendem Geschmack zusammen und weisen eine relativ hohe Säuretoleranz und Wärmebeständigkeit auf. Folglich können sie vorteilhafterweise in Nahrungsmittelprodukten im Allgemeinen als ein Süßungsmittel, Geschmack verbesserndes Mittel und Qualität verbesserndes Mittel verwendet werden.
  • Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, können in Würzmitteln verwendet werden, wie in einer Sojaso ße, pulverisierten Sojasoße, „Miso", „Funmatsu-miso" (eine pulverisierte Miso), „Moromi" (ein raffinierter Reiswein), „Hishio" (eine raffinierte Sojasauce), „Furikake" (ein gewürztes Fischmehl), Majonäse, Dressing, Essig, „Saubai-zu" (eine Soße aus Zucker, Sojasoße und Essig), „Funmatsu-sushi-su" (gepulverter Essig für Sushi), „Chuka-no-moto" (eine Instantmischung für chinesische Speisen), „Tentsuyu" (eine Soße für japanische frittierte Nahrungsmittel mit viel Fett), „Mentsuyu" (eine Soße für japanische Fadennudeln), Soße, Ketchup, „Takuanzuke-no-moto" (eine Vormischung für eingelegten Rettich), „Hakusai-zuke-no-moto" (eine Vormischung für frische weiße Rapspickles), „Yakiniku-no-tare" (eine Soße für japanisches gegrilltes Fleisch), Curryeinbrenne, Instanteintopfmischung, Instantsuppenmischung, „Dashi-no-moto" (eine Instantbrühemischung), Würzmittelmischung, „Mirin" (ein süßer Reiswein), „Shin-mirin" (ein synthetischer Mirin), Tafelzucker und Kaffeezucker.
  • Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, können auch frei verwendet werden zum Süßen von „Wagashi" (japanische Kuchen) wie „Senbei" (ein Reiskräcker), „Arare-mochi" (ein Reiskuchenwürfel), „Okoshi" (ein Kuchen aus Hirse und Reis), „Mochi" (eine Reispaste), „Manju" (ein Brötchen mit einer Bohnenmarmelade), „Uiro" (ein süßes Reisgelee), „An" (eine Bohnenmarmelade), „Yokan" (ein süßes Gelee aus Bohnen), „Mizu-yokan" (ein mildes Adzuki-Bohnengelee), „Kingyoku" (eine Art von Yokan), Gelee, Pao de Castella und „Amedama" (ein japanisches Sahnebonbon); Konditorwaren wie Brötchen, Biskuit, Kräcker, Keks, Torte, Pudding, Buttercreme, Eiercreme, Windbeutel, Waffel, Biskuitkuchen, Krapfen, Schokolade, Kaugummi, Karamell und Konfekt; gefrorenen Desserts wie Eiscreme und Sorbet; Sirupen wie „Kajitsu-no-syrup-zuke" (eine konservierte Frucht) und „Korimitsu" (ein Zuckersirup für offenes Eis); Pasten wie Mehlpaste, Erdnusspaste, Fruchtpaste und Brotaufstrich; verarbeiteten Früchten und Gemüse wie Marmelade, Marmelade aus Zitrusfrüchten, „Syrup-zuke" (Früchtepickles) und „Toka" (Konserven); Pickles und eingelegten Produkten wie „Fukujin-zuke" (rote gefärbte Rettichpickles), „Bettara-zuke" (eine Art von ganzen frischen Rettichpickles), „Senmai-zuke" (eine Art von aufgeschnittenen frischen Rettichpickles) und „Rakkyo-zuke" (eingelegte Schalotten); Fleischprodukten wie Schinken und Wurst; Produkten aus Fischmehl wie Fischschinken, Fischwurst, „Kamaboko" (eine mit Dampf behandelte Fischpaste), „Chikuwa" (eine Art von Fischpaste) und „Tenpura" (eine japanische Paste aus frittiertem Fisch mit viel Fett); „Chinmi" (Gewürz) wie „Uni-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Seeigel), „Ika-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Tintenfisch), „Su-konbu" (verarbeiteter Tang), „Saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen) und „Fugu-no-mirin-boshi" (ein getrockneter mit Mirin gewürzter Schwellfisch); „Tsukudani" (mit Sojasoße verkochte Nahrungsmittel) wie jene von Laver, essbaren wilden Pflanzen, getrocknetem Tintenfisch, Fisch und Schalentier; täglichen Speisen wie „Nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalat und „Konbu-maki" (ein Tangring); Milchprodukten wie Milchgetränk, Yoghurt und Käse; Konserven und Produkten in Flaschen wie jene aus Fleisch, Fischmehl, Frucht und Gemüse; alkoholischen Getränken wie synthetischem Reiswein, Wein und Spirituosen; alkoholfreien Getränken wie Kaffee, Tee, Kakao, Saft, Getränk mit Kohlensäure, Sauermilchgetränk und Getränk, welches ein Milchsäurebakterium enthält; Instantnahrungsmittelprodukten wie Instantpuddingmischung, Instantmischung für heißen Kuchen und „Sokuseki-shiruco" (eine Instantmischung für Adzuki-Bohnensuppe mit Reiskuchen) und Instantsuppenmischung; und Getränken wie Babynahrungsmitteln, Nahrungsmitteln für Therapie und Getränken, die mit Nährstoffen ergänzt wurden; sowie zum Verbessern des Geschmacks und der Qualität der vorstehend erwähnten Nahrungsmittelprodukte.
  • Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, können auch in Futtern und Haustiernahrungsmitteln für Tiere wie Haustiere, Geflügel, Honigbienen, Seidenraupen und Fische verwendet werden, um ihre Geschmacksvorzüge zu verbessern. Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung können beliebig als ein Süßungsmittel, Ge schmack-verbesserndes Mittel, Qualität verbesserndes Mittel und Stabilisator in anderen Produkten in Pasten- und flüssiger Form wie einer Tabakware, Zigarette, Zahnputzmittel, Lippenstift, Rouge, Lippenbalsam, in der inneren Medizin, als Tablette, Pastille, Lebertran in der Form eines Gläschens, Cachou, als orales kühlendes Mittel, Gurgelmittel, Kosmetikum und Arzneimittel verwendet werden.
  • Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, können als ein Qualität verbesserndes Mittel und Stabilisator für biologisch aktive Substanzen verwendet werden, die für einen Verlust ihrer Wirkstoffe und Aktivitäten empfindlich sind, sowie in Reformkost und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die biologisch aktive Substanzen enthalten. Beispiele einer solchen biologisch aktiven Substanz sind Lymphokine wie α-, β- und γ-Interferone, Tumornekrosefaktor α (TNF-α), Tumornekrosefaktor β (TNF-β), inhibitorischer Makrophagenmigrationsfaktor, Kolonie-stimulierender Faktor, Transferfaktor und Interleukin 2 (IL-2); Hormone wie Insulin, Wachstumshormon, Prolaktin, Erythropoietin, Follikel-stimulierendes Hormon und Plazentahormon; biologische Zubereitungen wie BCG-Vakzine, japanisches Enzephalitisvakzine, Masernvakzine, Polio-Lebendvakzine, Pockenvakzine, Tetanusanatoxin, Trimeresurus-Antitoxin und menschliches Immunglobulin; Antibiotika wie Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycinsulfat; Vitamine wie Thiamin, Riboflavin, L-Ascorbinsäure, Lebertran, Karotinoid, Ergosterol und Tocopherol; Enzyme wie Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, β-Amylase, Isoamylase, Glucanase und Lactase; Extrakte wie Ginsengextrakt, Schnappschildkrötenextrakt, Chlorellaextrakt, Aloeextrakt und Propolisextrakt; lebende Mikroorganismen wie Viren, Milchsäurebakterien und Hefen; und andere biologisch aktive Substanzen wie Königsgelee. Durch Verwenden der vorliegenden Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, werden die vorstehend erwähnten biologisch aktiven Substanzen einfach zu Reformkost und pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einer zufriedenstellend hohen Stabilität und Qualität, ohne Bedenken, was das Verlieren oder Inaktivieren von Aktivitäten der Wirkstoffe angeht, zubereitet.
  • Wie vorstehend beschrieben, schließen die Methoden zum Einbringen der vorliegenden Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, in die vorstehend erwähnten Substanzen und Zusammensetzungen herkömmliche Methoden ein, zum Beispiel Mischen, Kneten, Lösen, Schmelzen, Einweichen, Permeieren, Besprengen, Aufbringen, Beschichten, Sprühen, Einspritzen, Kristallisieren und Verfestigen. Die Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung werden normalerweise in die vorstehend erwähnten Substanzen und Zusammensetzungen in einer Menge von 0,1 % oder mehr, bevorzugt ein % oder mehr, Tfb., eingebracht.
  • Die folgenden Versuche erklären die vorliegende Erfindung detaillierter:
  • Versuch 1
  • Herstellung eines Enzyms
  • Einhundert ml-Aliquote eines flüssigen Nährkulturmediums, das aus 2,0 w/v % Glucose, 0,5 w/v % Polypepton, 0,1 w/v % Hefeextrakt, 0,06 w/v % Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1 w/v % Kaliumhydrogenphosphat, 0,05 w/v % Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,5 w/v % Calciumcarbonat und Wasser besteht, wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, bei 115°C für 30 min autoklaviert, um Sterilisierung zu bewirken, gekühlt und mit einer Impfkultur von Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) angeimpft, gefolgt von der Kultivierung bei 27°C für 24 Stunden unter Rührbedingungen von 200 UpM. Die resultierenden Kulturen wurden vereinigt und als eine Impfkultur verwendet.
  • Ein ca. 20 I-Aliquot einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Nährkulturmediums, wie in der vorstehenden Kultur verwendet, wurde in einen 30 I-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 27°C gekühlt und mit einem v/v % der Impfkultur angeimpft, gefolgt von der Kultur bei 27°C und einem pH-Wert von 6,0 bis 8,0 für ca. 40 Stunden unter Rühr- und aeroben Bedingungen.
  • Die Aktivität eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das sich in der resultierenden Kultur angesammelt hatte, war 0,55 Einheiten/ml. Ein Anteil der Kultur wurde durch Zentrifugation zu Zellen und einem Überstand aufgetrennt und die Zellen wurden in 50 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert, um das gleiche Volumen wie das des Anteils zu ergeben, gefolgt von Testen der Enzymaktivität in der Zellsuspension und dem Überstand, wobei 0,5 Einheiten/ml bzw. 0,05 Einheiten/ml erhalten wurden. Die Enzymaktivität war der Wert, der bei 25°C getestet wurde.
  • Versuch 2
  • Reinigung eines Enzyms
  • Die in Versuch 1 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, wobei ca. 0,5 kg feuchte Zellen erhalten wurden, die dann in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert wurden. Die Zellsuspension wurde einer „VIBROGENZELLMÜHLE", einer Apparatur zum Aufbrechen von Zellen, die kommerziell von Edmund Bühler, Tübingen, Deutschland vertrieben wird, ausgesetzt und das resultierende Gemisch wurde bei 15.000xg für 30 min zentrifugiert, wobei ein Überstand von ca. 4,5 l erhalten wurde. Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand gegeben und darin gelöst, um einen Sättigungsgrad von 0,3 zu ergeben, und man ermöglichte, dass die Lösung bei 4°C für 4 Stunden stand und zentrifugierte, wobei ein Überstand erhalten wurde.
  • Ammoniumsulfat wurde weiter zu dem resultierenden Überstand gegeben und darin gelöst, um einen Sättigungsgrad von 0,8 zu ergeben, und man ermöglichte, dass die Lösung bei 4°C über Nacht stand und zentrifugierte, wobei eine Abscheidung erhalten wurde.
  • Die Abscheidung wurde in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) gelöst, gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers für 24 Stunden dialysiert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Vierhundert ml der resultierenden dialysierten Lösung wurden in 2 Anteile aufgeteilt, die dann getrennt einer Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 300 ml „DEAETOYOPEARL® GEL" gepackt wurde, einem Ionenaustauscher, der kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen wurden.
  • Das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym, das an dem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, wurde von der Säule mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers, welche mit Salz ergänzt worden war, eluiert. Fraktionen mit der Enzymaktivität, die von der Säule eluiert wurden, wurden gewonnen, vereinigt und gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers, welche mit einem M Ammoniumsulfat ergänzt worden war, dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und einer hydrophoben Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 300 ml „BUTYL-TOYOPEARL® 650 GEL" gepackt wurde, einem hydrophoben Gel, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen. Das Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym, das an dem Gel adsorbiert wurde, wurde von der Säule mit einem Puffer eines linearen Gradienten im Bereich von 1 M nach 0 M Ammoniumsulfat eluiert, gefolgt von Gewinnen der Fraktionen mit der Enzymaktivität.
  • Die Fraktionen wurden vereinigt und einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 10 ml „MONO Q HR5/5" gepackt wurde, einem Gel, das kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, unterworfen, gefolgt von Gewinnen der Fraktionen mit der Enzymaktivität. Die Gesamtaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 1 tabellarisch dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00360001
  • Die gereinigte Enzymzubereitung, die durch das vorstehende Reinigungsverfahren erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines 7,5 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgels elektrophoretisiert, wobei eine einzelne Proteinbande erhalten wurde, und dies bedeutet, dass es eine Zubereitung mit einer sehr hohen Reinheit war.
  • Versuch 3
  • Eigenschaften des Enzyms
  • Ein Anteil einer Zubereitung des gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms, die durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgels elektrophoretisiert. Das Molekulargewicht wurde mit ca. 57.000 bis 67.000 Dalton bestimmt, indem es mit jenen von Markerproteinen, die kommerziell von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan vertrieben werden und gleichzeitig elektrophoretisiert worden waren, verglichen wurde.
  • Ein anderer Anteil der Zubereitung des gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms wurde unter Verwendung eines Polyacrylamidgels, das 2 v/v % „AMPHOLINE" enthielt, ein Ampholyt, der kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, isoelektrophoretisiert. Das resultierende Gel wurde in Stücke geschnitten, gefolgt von Messen ihrer pH-Werte, um den pl des Enzyms zu enthüllen, der ca. 4.1-5.1 war.
  • Die Wirkungen der Temperatur und des pH-Werts auf die Aktivität des vorliegenden Enzyms wurden gemäß der Methode, wie zum Testen der Enzymaktivität verwendet, untersucht. Die Ergebnisse wurden jeweils in 1 (Wirkung der Temperatur) und 2 (Wirkung des pH-Werts) gezeigt. Die optimale Temperatur des Enzyms betrug ca. 20°C, als bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wurde, und der optimale pH-Wert betrug ca. 7,0 bis 8,0, als bei 25°C für 60 min inkubiert wurde. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren davon in 50 mM Phosphat-Puffern (pH-Wert 7,0) in Teströhrchen bei unterschiedlichen Temperaturen für 60 min, Kühlen der Teströhrchen mit kaltem Wasser und Testen der verbleibenden Enzymaktivität in jedem Puffer bestimmt. Die pH-Wert-Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren davon in 50 mM Phosphat-Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten bei 20°C für 60 min, Einstellen der Puffer auf einen pH-Wert von 7,0 und Testen der verbleibenden Enzymaktivität in jedem Puffer bestimmt. Die Ergebnisse der thermischen und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms wurden jeweils in 3 und 4 gezeigt. Das Enzym war bis zu einer Temperatur von ca. 30°C stabil und bei einem pH-Wert von ca. 6,0 bis 9,0 stabil. Ein mM Cu++ oder Hg++ und 50 mM Tris-HCl Puffer waren für das Enzym inhibierend.
  • Versuch 4
  • Wirkung auf Saccharide
  • Eine Vielzahl von Sacchariden wurde getestet, um zu bestimmen, ob sie als ein Substrat für das vorliegende Enzym verwendet werden können. Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, lösliche Stärke, Amylose mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 18, Trehalose, Neotrehalose, Gentiobiose, Kojibiose, Isomaltose, Cellobiose, Maltitolsaccharose, Maltulose, Turanose, Paratinose, Trehalulose oder Lactose wurden zu einer Lösung zubereitet. Eine Lösung, die Glucose und die gleiche Menge an α-Glucose-1-phosphat oder β-Glucose-1-phosphat enthielt, wurde hergestellt.
  • Die Lösungen wurden jeweils mit 2 Einheiten/g Substrat, Tfb., eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, gemischt, ihre Substratkonzentrationen wurden auf 5 w/v % eingestellt und sie wurden einer enzymatischen Umsetzung bei 20°C und einem pH-Wert von 7,0 für 24 Stunden unterworfen. Die Lösungen vor und nach ihren enzymatischen Umsetzungen wurden einer Dünnschichtchromatographie (DC) mit „KIESELGEL 60 (20 × 20 cm)", eine Aluminiumplatte für DC, die kommerziell von Merck & Co., Inc., Rahway, USA vertrieben wird, unterworfen, um zu bestimmen, ob das vorliegende Enzym auf die Saccharide einwirkt. Als sie auf den Platten waren, wurden die resultierenden Produkte unter Verwendung eines Entwicklungslösungsmittelsystems aus 1-Butanol, Pyridin und Wasser (= 6:4:1 bezogen auf das Volumen) entwickelt. Die Produkte auf den Platten wurden gefärbt, indem darauf eine 20 v/v %ige Schwefelsäure in Methanol gesprüht und die Platten bei 110°C für 10 min erwärmt wurden. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Figure 00390001
  • Anmerkung:
  • In der Tabelle bedeutet das Symbol „–", dass keine Veränderung vor und nach der enzymatischen Umsetzung beobachtet wurde; das Symbol „+", dass die Größe des Substratflecks wegen der Bildung von anderen Produkten leicht verringert war; und das Symbol „++", dass die Größe des Substratflecks wegen der Bildung von anderen Produkten beträchtlich verringert war.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, wurde gezeigt, dass das vorliegende Enzym unter den Sacchariden nur auf Maltose und Trehalose einwirkt und insbesondere nicht auf beide Systeme, die Glucose und α-Glucose-1-phosphat oder β-Glucose-1-phosphat enthalten, einwirkt. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass das vorliegende Enzym ein neues Enzym ist, das sich von herkömmlichen Maltose- und Trehalose-Phosphorylasen unterscheidet.
  • Versuch 5
  • Produkte aus Maltose oder Trehalose
  • Zu einer wässrigen Maltose-Lösung wurden 2 Einheiten/g Maltose als ein Substrat, Tfb., eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, gegeben, wobei eine Endsubstratkonzentration von 5 w/v % erhalten wurde, und die resultierende Lösung wurde einer enzymatischen Umsetzung bei 20°C und einem pH-Wert von 7,0 für 24 Stunden unterworfen. Die Saccharid-Zusammensetzung des resultierenden Reaktionsgemisches wurde an Gaschromatographie (hier nachstehend als „GC" abgekürzt) analysiert. Ein Anteil des Reaktionsgemisches wurde getrocknet, in Pyridin gelöst und trimethylsilyliert, wobei ein Produkt erhalten wurde, eine Probe für Analyse. Die bei der GC-Analyse verwendete Apparatur und Bedingungen waren „CG-16A", ein Gaschromatograph, der kommerziell von Shimadzu Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird; eine Edelstahlsäule mit 3 mm Durchmesser und 2 m Länge, die mit 2 % „SILICONE OV-17/CHROMOSORB W" gepackt wurde, das kommerziell von GL Sciences Inc., Tokio, Japan vertrieben wird; eine Fließrate von 40 ml/min Stickstoffgas als ein Trägergas; und ein Verhältnis der ansteigenden Temperatur in einem Ofen von 7,5°C/min im Bereich von 160°C bis 320°C. Die Saccharid-Zusammensetzung wurde an einem Wasserstoffflammenionisationsdetektor analysiert. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00410001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 ersichtlich ist, wurde gezeigt, dass das Produkt „X" in Mengen gebildet wurde und die Retentionszeit mit der einer herkömmlich erhältlichen Trehalose übereinstimmte. Um das Produkt „X" zu identifizieren, wurde der folgende Nachweistest durchgeführt. Eine frische Zubereitung der gleichen wässrigen Maltose-Lösung, wie vorstehend verwendet wurde, wurde mit 20 mM Acetat-Puffer (pH-Wert 4,5) verdünnt, um eine Maltose-Konzentration von 2 w/v % zu ergeben, und 0,5 ml davon wurden mit 0,1 Einheiten einer Glucoamylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, gemischt, gefolgt von Unterwerfen des Gemisches einer enzymatischen Umsetzung bei 40°C für 20 Stunden.
  • In ähnlicher Weise wurde eine frische Zubereitung der gleichen wässrigen Maltose-Lösung, wie vorstehend verwendet wurde, mit 20 mM Acetat-Puffer (pH-Wert 7,0) verdünnt, um eine Maltose-Konzentration von 2 w/v % zu ergeben, und 0,5 ml davon wurden mit 0,5 Einheiten Trehalase gemischt, gefolgt von Unterwerfen des Gemisches einer enzymatischen Umsetzung bei 40°C für 20 Stunden. Die intakte wässrige Maltose-Lösung und die wässrigen Maltose-Lösungen, die mit Glucoamylase und Trehalase behandelt worden waren, wurden durch GC analysiert, gefolgt vom Studium der Daten, wobei enthüllt wurde, dass Maltose vollständig zu Glucosen durch Glucoamylase zersetzt worden war, aber das Produkt „X" intakt blieb.
  • Als mit Trehalase behandelt wurde, blieb Maltose intakt, aber das Produkt „X" wurde vollständig zu Glucosen zersetzt. Angesichts der Reaktionsmechanismen von Glucoamylase und Trehalase wurde gefolgert, dass das vorliegende Enzym aus Maltose ein Oligosaccharid, d.h. Trehalose, bildet.
  • Darüber hinaus ermöglichte man, dass das gereinigte Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung auf Trehalose als ein Substrat unter den gleichen Bedingungen, wie im Falle von Maltose verwendet wurden, einwirkte und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch GC analysiert. Die Daten bestätigten, dass das vorliegende Enzym Maltose aus Trehalose bildet. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00420001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 ersichtlich ist, wandelt das vorliegende Enzym Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Es wurde gezeigt, dass die Gleichgewichtslage der Umwandlungsreaktion zur Trehalose-Bildung verschoben war, d.h. die Umwandlungsrate von Maltose zu Trehalose war ca. 70 % oder höher, was höher war, als die von Trehalose zu Maltose.
  • Versuch 6
  • Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Trehalose-Bildung
  • Eine Lösung, die 2,5, 5, 10, 20 oder 40 w/v % Maltose enthielt, wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, Tfb., eines gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 20°C und einem pH-Wert von 7,0 umgesetzt. Während der enzymatischen Umsetzung wurden von dem Reaktionsgemisch Proben genommen und bei 100°C für 10 min erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren.
  • Der Gesamtzuckergehalt des Reaktionsgemisches wurde durch die Anthron-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Der Gehalt an reduzierendem Zucker wurde bezogen auf Glucose durch die Somogyi-Nelson-Methode quantifiziert und die Reduktionskraft wurde als ein Verhältnis des Gehalts an reduzierendem Zucker zum Gesamtzuckergehalt bestimmt.
  • Die Probe wurde verdünnt, um eine Saccharid-Konzentration von ca. ein w/v % zu ergeben, welche dann „MOL-CUT II LGC", Japan Millipore Ltd., Tokio, Japan unterworfen wurde, um Protein zu entfernen, und auf ihre Saccharid-Zusammensetzung durch Hochleistungsflüssigchromatographie (hier nachstehend als „HPLC" abgekürzt) analysiert wurde. Die bei der Analyse verwendete Apparatur und Bedingungen waren „CCPD SYSTEM", eine HPLC-Apparatur, die kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird; „YMC-PACK PA-03", eine Säule mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 250 mm, die kommerziell von YMC Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird; ein Eluentsystem aus Acetonitril und Wasser (= 78:22 bezogen auf das Volumen); eine Fließrate von 1,2 ml/min; und ein Differentialrefraktometer als ein Detektor. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 5 gezeigt.
  • Figure 00450001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 ersichtlich ist, verlief die Umwandlungsreaktion von Maltose in Trehalose unabhängig von der Maltose-Konzentration gleichmäßig bei einer Umwandlungsrate von ca. 80 %.
  • Versuch 7
  • Wirkung der Temperatur auf die Trehalose-Bildung
  • Eine 20 w/v %ige Maltose-Lösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, Tfb., eines gereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung bei 5, 10, 15, 20 oder 25°C unterworfen. Während der enzymatischen Umsetzung wurden von dem Reaktionsgemisch in einem vorbestimmten Zeitintervall Proben genommen und die Proben wurden bei 100°C für 10 min erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren. In einer ähnlichen Weise wie in Versuch 6 wurde die Saccharid-Zusammensetzung der Probe durch HPLC analysiert. Die Trehalose-Gehalte in den Proben, die bei unterschiedlichen Temperaturen und Reaktionszeiten genommen wurden, waren, wie in Tabelle 6 gezeigt.
  • Tabelle 6
    Figure 00460001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 6 ersichtlich ist, neigte die Trehalose-Bildungsrate zum Ansteigen, als die Reaktionstemperatur anstieg, und die Umwandlungsreaktion von Maltose zu Trehalose verlief sogar bei 5°C bei einer Trehalose-Umwandlungsrate von ca. 82 % gleichmäßig.
  • Versuch 8
  • Herstellung von Trehalose aus Maltose
  • Zehn Gewichtsteile Maltose, die kommerziell von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, wurden in 40 Gewichtsteilen Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, Tfb., eines gereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung bei 15°C und einem pH-Wert von 7,0 für 48 Stunden unterworfen, gefolgt von Erwärmen des resultierenden Reaktionsgemisches bei 100°C für 10 min, um das verbleibende Enzym zu inaktivieren. Das Reaktionsgemisch, das ca. 74 % Trehalose, Tfb., enthielt, wurde mit einer Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt, zu einer ca. 78 w/v %igen Lösung konzentriert, die dann mit 0,1 % kristalliner Trehalose als ein Impfkristall, Tfb., gemischt wurde, gefolgt von Ermöglichen, dass sie bei Umgebungstemperatur über Nacht stand, um Kristallisation zu bewirken. Von der resultierenden Füllmasse wurde ein Kristall abgetrennt, der dann mit einer kleinen Menge Wasser besprüht und gewaschen wurde, gefolgt von der Gewinnung von ca. 3,0 Gewichtsteilen einer hoch-reinen kristallinen Trehalose mit einer Reinheit von 99,8 %, Tfb.
  • Versuch 9
  • Herstellung von Enzym
  • Einhundert ml-Aliquote eines flüssigen Nährkulturmediums, das aus 2,0 w/v % Glucose, 1,0 w/v % Ammoniumsulfat, 0,1 w/v % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,06 w/v % Natriumdihydrogenphosphat, 0,05 w/v % Magnesium sulfat, 0,3 w/v % Calciumcarbonat und Wasser besteht, wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, bei 115°C für 30 min autoklaviert, um Sterilisierung zu bewirken, gekühlt und mit einer Impfkultur von Pseudomonas putida (FERM BP-4579) angeimpft, gefolgt von der Kultur bei 27°C für 24 Stunden unter Rührbedingungen von 200 UpM. Die resultierenden Kulturen wurden vereinigt und als eine Impfkultur verwendet.
  • Ein ca. 20 I-Aliquot einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Nährkulturmediums, wie in der vorstehenden Kultur verwendet, wurde in einen 30 I-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 27°C gekühlt und mit einem v/v % der Impfkultur angeimpft, gefolgt von der Kultur bei 27°C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 für ca. 20 Stunden unter Rühr- und aeroben Bedingungen.
  • Die Aktivität eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das sich in der resultierenden Kultur angesammelt hatte, war 0,12 Einheiten/ml. Ein Anteil der Kultur wurde zentrifugiert, um in Zellen und einen Überstand aufzutrennen, und die Zellen wurden in 50 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert, um das gleiche Volumen wie das des Anteils zu ergeben, gefolgt von Testen der Enzymaktivitäten in der Zellsuspension und dem Überstand, wobei 0,11 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml enthüllt wurden. Die Enzymaktivität wurde bei 35°C getestet.
  • Versuch 10
  • Reinigung des Enzyms
  • Die in Versuch 9 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, wobei ca. 0,45 kg feuchte Zellen erhalten wurden, die dann in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert wurden. Ca. 2 l der resultierenden Zellsuspension wurden mit „MINI-RABO", einer Apparatur zum Aufbrechen von Zellen mit hohem Druck, die kommerziell von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, behandelt, um Zellen aufzubrechen, und das resultierende Gemisch wurde bei 15.000xg für 30 min zentrifugiert, wobei ein Überstand von ca. 1,7 l erhalten wurde. Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand gegeben und darin gelöst, um einen Sättigungsgrad von 0,7 zu ergeben, man ermöglichte ein Stehen bei 4°C für 4 Stunden und zentrifugierte, wobei die resultierende Abscheidung erhalten wurde.
  • Die Abscheidung wurde in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) gelöst und die Lösung wurde gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers für 24 Stunden dialysiert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Vierhundert ml der dialysierten Lösung wurden in 2 Anteile aufgeteilt, die jeweils einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 300 ml „DEAE-TOYOPEARL® GEL" gepackt wurde, einem Gel, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen wurden.
  • Das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym adsorbierte an dem Gel und eluierte davon mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers, welcher mit Salz ergänzt worden war. Die Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden gewonnen und einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 80 ml „DEAE-TOYOPEARL® GEL" gepackt wurde, unterworfen. Das Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym, das an dem Gel adsorbiert wurde, wurde davon mit einem linearen Gradienten von Salz im Bereich von 0,1 M nach 0,3 M eluiert, gefolgt von Gewinnen der Fraktionen mit der Enzymaktivität.
  • Die Fraktionen wurden vereinigt und einer Gelfiltrations-Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 400 ml „TOYO-PEARL HW-55S" gepackt wurde, einem Gel, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen, gefolgt von Gewinnen der eluierten Fraktionen mit der Enzymaktivität. Die Gesamtaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 7 tabellarisch dargestellt.
  • Tabelle 7
    Figure 00500001
  • Die gereinigte Enzymzubereitung wurde einer Gelelektrophorese mit 7,5 w/v % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel unterworfen und es wurde gefunden, dass sie eine einzelne Proteinbande aufwies, was bedeutet, dass es eine Zubereitung mit einer relativ hohen Reinheit war.
  • Versuch 11
  • Eigenschaft des Enzyms
  • Ein Anteil einer Zubereitung des gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms, die durch die Methode in Versuch 10 erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines 7,5 w/v % Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgels elektrophoretisiert und sein Molekulargewicht wurde als ca. 110.000 bis 120.000 Dalton bestimmt, indem es mit jenen von Markerproteinen, die kommerziell von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan vertrieben werden und gleichzeitig elektrophoretisiert worden waren, verglichen wurde.
  • Ein anderer Anteil der Zubereitung des gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms wurde unter Verwendung eines Polyacrylamidgels, das 2 w/v % „AMPHOLINE" enthielt, ein Ampholyt, der kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, isoelektrophoretisiert. Danach wurde das resultierende Gel in Stücke geschnitten, gefolgt von Messen ihrer pH-Werte, um den pl des Enzyms zu enthüllen, der ca. 4.1-5.1 war.
  • Die Wirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität des vorliegenden Enzyms wurden gemäß der Methode, wie zum Testen der Enzymaktivität verwendet, untersucht. Die Ergebnisse wurden jeweils in 5 (Wirkung der Temperatur) und 6 (Wirkung des pH-Werts) gezeigt. Die optimale Temperatur des Enzyms betrug ca. 20°C, als bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wurde, und der optimale pH-Wert betrug ca. 7,3 bis 8,3, als bei 35°C für 60 min inkubiert wurde. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren davon in Behältern mit 50 mM Phosphat-Puffern (pH-Wert 7,0) bei unterschiedlichen Temperaturen für 60 min, Kühlen der resultierenden Puffer in den Behältern mit kaltem Wasser und Testen der verbleibenden Enzymaktivität in jedem Puffer bestimmt. Die pH-Wert-Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren davon in 50 mM Phosphat-Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten bei 35°C für 60 min, Einstellen der resultierenden Puffer auf einen pH-Wert von 7,0 und Testen der verbleibenden Enzymaktivität in jedem Puffer bestimmt. Die Ergebnisse der thermischen und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms wurden jeweils in 7 und 8 gezeigt. Das Enzym war bis zu einer Temperatur von ca. 40°C stabil und bei einem pH-Wert von ca. 6,0 bis 9,5 stabil. Ein mM Cu++ oder Hg++ und 50 mM Tris-HCl Puffer waren für das vorliegende Enzym inhibierend.
  • Versuch 12
  • Wirkung auf Saccharide
  • Eine Vielzahl von Sacchariden wurde getestet, um zu bestimmen, ob sie als ein Substrat für das vorliegende Enzym von Pseudomonas putida H262, das in Versuch 10 gemäß der Methode in Versuch 4 erhalten wurde, außer, dass die Reaktionstemperatur auf 35°C gesetzt wurde, verwendet werden können. In einer ähnlichen Weise wie das Enzym von Pseudomonas putida H262 wirkte das Enzym von Pimelobacter sp. R48 speziell auf Maltose und Trehalose ein, d.h. es wandelte Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Es wurde enthüllt, dass die Gleichgewichtslage der Umwandlungsreaktion zur Bildung von Trehalose neigte, d.h. die Umwandlungsrate von Maltose zu Trehalose betrug bis zu ca. 70 %.
  • Versuch 13
  • Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Bildung von Trehalose
  • Zu einer Lösung, die 5, 10, 20 oder 30 % Maltose enthielt, wurden 2 Einheiten/g Maltose, Tfb., eines gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Versuch 10 erhalten wurde, gegeben und die Lösung wurde einer enzymatischen Umsetzung bei 35°C und einem pH-Wert von 7,0 unterworfen, während Proben von dem Reaktionsgemisch in einem vorbestimmten Zeitintervall genommen wurden. Die Proben wurden bei 100°C für 10 min erwärmt, um das verbleibende Enzym zu inaktivieren.
  • Von den Proben wurden die Reduktionskraft und die Saccharid-Zusammensetzung in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 6 bestimmt. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 8 gezeigt.
  • Figure 00540001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 8 ersichtlich ist, bildete das vorliegende Enzym Trehalose aus Maltose in einer Ausbeute von ca. 70 %, unabhängig von der Konzentration von Maltose als ein Substrat.
  • Versuch 14
  • Herstellung von Trehalose aus Maltose
  • Zehn Gewichtsteile Maltose, die kommerziell von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, wurden in 40 Gewichtsteilen Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, Tfb., des vorliegenden gereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt und einer enzymatischen Umsetzung bei 35°C und einem pH-Wert von 7,0 für 48 Stunden unterworfen, gefolgt von Erwärmen des resultierenden Reaktionsgemisches bei 100°C für 10 min, um das verbleibende Enzym zu inaktivieren. Das Reaktionsgemisch, das ca. 69 % Trehalose, Tfb., enthielt, wurde mit einer Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt und zu einer ca. 78 w/v %igen Lösung konzentriert, die dann mit 0,1 % kristalliner Trehalose als ein Impfkristall, Tfb., gemischt wurde, gefolgt von Ermöglichen, dass sie bei Umgebungstemperatur über Nacht stand, um Kristallisation zu bewirken. Von der resultierenden Füllmasse wurde ein Kristall abgetrennt, der dann mit einer kleinen Menge Wasser besprüht und gewaschen wurde, gefolgt von der Gewinnung von ca. 2,3 Gewichtsteilen einer hoch-reinen kristallinen Trehalose mit einer Reinheit von 99,7 %, Tfb.
  • Versuch 15
  • Herstellung eines Enzyms
  • Einhundert ml-Aliquote eines flüssigen Nährkulturmediums, das aus 0,5 w/v % Polypepton, 0,1 w/v % Hefeextrakt, 0,07 w/v % Natriumnitrat, 0,01 w/v % Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02 w/v % Magnesiumsulfat, 0,01 w/v % Calciumchlorid und Wasser besteht, wobei der pH-Wert auf 7,5 eingestellt worden war, wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, bei 120°C für 20 min autoklaviert, um Sterilisierung zu bewirken, gekühlt und mit einer Impfkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) angeimpft, gefolgt von der Kultur bei 60°C für 24 Stunden unter Rührbedingungen von 200 UpM. Die resultierenden Kulturen wurden vereinigt und als eine Impfkultur verwendet.
  • Ca. 20 I-Aliquote einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Nährkulturmediums, wie in der vorstehenden Kultur verwendet, wurden in zwei 30 I-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 60°C gekühlt und mit einem v/v % der Impfkultur angeimpft, gefolgt von der Kultur bei 60°C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 für ca. 20 Stunden unter Rühr- und aeroben Bedingungen.
  • Die Aktivität eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das sich in der resultierenden Kultur angesammelt hatte, war 0,35 Einheiten/ml. Ein Anteil der Kultur wurde zentrifugiert, um in Zellen und einen Überstand aufzutrennen, und die Zellen wurden in 50 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert, um das gleiche Volumen wie das des Anteils zu ergeben, gefolgt von Testen der Enzymaktivitäten in der Zellsuspension und dem Überstand, wobei 0,33 Einheiten/ml bzw. 0,02 Einheiten/ml enthüllt wurden. Die Enzymaktivität wurde bei 60°C getestet.
  • Versuch 16
  • Reinigung des Enzyms
  • Die in Versuch 15 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, wobei ca. 0,28 kg feuchte Zellen erhalten wurden, die dann in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert wurden. Ca. 1,9 l der resultierenden Zellsuspension wurden mit „MODEL US300", eine Ultraschallzerkleinerungsvorrichtung, die kommerziell von Nippon Seiki Co., Ltd., Niigata, Japan vertrieben wird, behandelt, um Zellen aufzubrechen. Das resultierende Gemisch wurde bei 15.000xg für 30 min zentrifugiert, wobei ein Überstand von ca. 1,8 l erhalten wurde. Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand gegeben und darin gelöst, um einen Sättigungsgrad von 0,7 zu ergeben, und man ermöglichte, dass die Lösung bei 4°C für 4 Stunden stand, und zentrifugierte, wobei die resultierende Abscheidung erhalten wurde.
  • Die Abscheidung wurde in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) gelöst und die Lösung wurde gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers für 24 Stunden dialysiert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Die dialysierte Lösung, 1.560 ml bezogen auf das Volumen, wurde in 3 Anteile aufgeteilt, die jeweils einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 530 ml „DEAE-TOYOPEARL® 650 GEL" gepackt wurde, einem Gel, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen wurden.
  • Das vorliegende Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym adsorbierte an dem Gel und eluierte davon mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers, welcher mit Salz ergänzt worden war. Die Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden gewonnen, gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers, der mit einem M Ammoniumsulfat ergänzt worden war, dialysiert und einer hydrophoben Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 380 ml „BUTYL-TOYOPEARL® 650 GEL" gepackt wurde, ein hydrophobes Gel, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen. Das Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym, das an dem Gel adsorbiert wurde, wurde davon mit einem linearen Gradienten von Salz im Bereich von 1 M nach 0 M eluiert, gefolgt von Gewinnen der Fraktionen mit der Enzymaktivität.
  • Die Fraktionen wurden vereinigt und einer Gelfiltrations-Säulenchromatographie mit einer Säule, die mit 380 ml „TOYOPEARL HW-55S" gepackt wurde, ein Gel, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen, gefolgt von Gewinnen der eluierten Fraktionen mit der Enzymaktivität.
  • Die Fraktionen wurden vereinigt und einer Ionenaustausch-Chromatographie mit einer Säule, die mit 1,0 ml „MONO Q HR5/5" gepackt wurde, was kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, unterworfen. Das Enzym wurde von der Säule mit einem linearen Gradienten von Salz im Bereich von 0,1 M nach 0,35 M eluiert, gefolgt von Gewinnen der Fraktionen mit der Enzymaktivität. Die Gesamtaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 9 tabellarisch dargestellt.
  • Tabelle 9
    Figure 00590001
  • Die gereinigte Enzymzubereitung wurde einer Gelelektrophorese mit 5 w/v % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel unterworfen, wobei eine einzelne Proteinbande gezeigt wurde. Dies bedeutet, dass sie eine Zubereitung mit einer relativ hohen Reinheit war.
  • Versuch 17
  • Eigenschaft eines Enzyms
  • Ein Anteil einer Zubereitung des gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms, die durch die Methode in Versuch 16 erhalten wurde, wurde an einem Gel, das 7,5 w/v % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel enthielt, elektrophoretisiert und sein Molekulargewicht wurde als ca. 100.000 bis 110.000 Dalton bestimmt, indem es mit jenen von Markerproteinen, die kommerziell von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan vertrieben werden und gleichzeitig elektrophoretisiert worden waren, verglichen wurde.
  • Ein anderer Anteil der Zubereitung des gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms wurde an einem Polyacrylamidgel, das 2 w/v % „AMPHOLINE" enthielt, ein Ampholyt, der kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, isoelektrophoretisiert. Danach wurde das resultierende Gel in Stücke geschnitten, gefolgt von Messen ihrer pH-Werte, um den pl des Enzyms zu enthüllen, der ca. 3.8-4.8 war.
  • Die Wirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität des vorliegenden Enzyms wurden gemäß der Methode, wie zum Testen der Enzymaktivität verwendet, untersucht. Die Ergebnisse wurden jeweils in 9 (Wirkung der Temperatur) und 10 (Wirkung des pH-Werts) gezeigt. Die optimale Temperatur des Enzyms betrug ca. 65°C, als bei einem pH-Wert von 7,0 für 60 min inkubiert wurde, und der optimale pH-Wert betrug ca. 6,0 bis 6,7, als bei 60°C für 60 min inkubiert wurde. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren davon in 50 mM Phosphat-Puffern (pH-Wert 7,0) in Teströhrchen bei unterschiedlichen Temperaturen für 60 min, Kühlen der Teströhrchen mit kaltem Wasser und Testen der verbleibenden Enzymaktivität in jedem Puffer bestimmt. Die pH-Wert-Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren davon in 50 mM Phosphat-Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten bei 60°C für 60 min, Einstellen der resultierenden Puffer auf einen pH-Wert von 7,0 und Testen der verbleibenden Enzymaktivität in jedem Puffer bestimmt. Die Ergebnisse der thermischen und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms wurden jeweils in 11 und 12 gezeigt. Das Enzym war bis zu einer Temperatur von ca. 80°C stabil und bei einem pH-Wert von ca. 5,5 bis 9,5 stabil. Ein mM Cu++ oder Hg++ und 50 mM Tris-HCl Puffer waren für das vorliegende Enzym inhibierend.
  • Versuch 18
  • Wirkung auf Saccharide
  • Eine Vielzahl von Sacchariden wurde getestet, um zu bestimmen, ob sie als ein Substrat für das vorliegende Enzym von Thermus aquaticus (ATCC 33923), das gemäß der Methode in Versuch 4 erhalten wurde, außer, dass die Reaktionstemperatur auf 50°C gesetzt wurde, verwendet werden können. In einer ähnlichen Weise wie die Enzyme von Pimelobacter sp. R48 und Pseudomonas putida H262 wirkte das Enzym von Thermus aquaticus (ATCC 33923) speziell auf Maltose und Trehalose ein, d.h. es wandelte Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Es wurde enthüllt, dass die Gleichgewichtslage der Umwandlungsreaktion zur Bildung von Trehalose neigte, d.h. die Umwandlungsrate von Maltose zu Trehalose betrug ca. 70 % oder mehr.
  • Versuch 19
  • Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Bildung von Trehalose
  • Zu einer Lösung, die 2,5, 5, 10, 20 oder 40 % Maltose enthielt, wurden 2,5 Einheiten/g Maltose, Tfb., eines gereinigten Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet war und durch die Methode in Versuch 16 erhalten wurde, gegeben und die Lösung wurde einer enzymatischen Umsetzung bei 60°C und einem pH-Wert von 6,5 unterworfen. Von dem Reaktionsgemisch wurden bei 72 Stunden nach der Initiierung der enzymatischen Umsetzung Proben genommen und erwärmt, um das verbleibende Enzym bei 100°C für 30 zu inaktivieren. Von den Proben wurden die Reduktionskraft und die Saccharid-Zusammensetzung in einer ähn lichen Weise wie in Versuch 6 bestimmt. Die Ergebnisse waren, wie in Tabelle 10 gezeigt.
  • Figure 00630001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 10 ersichtlich ist, bildete das vorliegende Enzym Trehalose aus Maltose in einer Ausbeute von ca. 70 %, unabhängig von der Konzentration an Maltose als ein Substrat.
  • Versuch 20
  • Einfluss der Temperatur auf die Bildung von Trehalose
  • Zu einer 20 %igen Maltose-Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 wurden 2,5 Einheiten/g Maltose, Tfb., eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet war und durch die Methode in Versuch 16 erhalten wurde, gegeben und das Gemisch wurde einer enzymatischen Umsetzung bei 40, 50, 60 oder 70°C unterworfen, während in einem vorbestimmten Zeitintervall Proben genommen wurden. Die Proben wurden bei 100°C für 30 min erwärmt, um das verbleibende Enzym zu inaktivieren. Die resultierenden Reaktionsgemische wurden auf ihre Saccharid-Zusammensetzungen an HPLC in einer ähnlichen Weise wie in Versuch 6 analysiert. Der Trehalose-Gehalt bei unterschiedlichen Temperaturen und Reaktionszeiten war, wie in Tabelle 11 gezeigt.
  • Tabelle 11
    Figure 00640001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 11 ersichtlich ist, gilt, je niedriger die Temperatur der enzymatischen Umsetzung, desto höher die Umwandlungsrate von Maltose zu Trehalose. Das Enzym wandelte Maltose zu Trehalose in einer Umwandlungsrate von ca. 80 % um.
  • Versuch 21
  • Herstellung und Eigenschaft eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms durch einen Mikroorganismus
  • Unter herkömmlichen Mikroorganismen wurde ein Mikroorganismus, für welchen die Fähigkeit bestätigt wurde, das vorliegende Maltose-Trehaloseumwandelnde Enzym zu bilden, in einem Erlenmeyerkolben für 48 Stunden gemäß Versuch 15 inkubiert. Nach der Analyse der Enzymaktivität wurde die resultierende Kultur einer Apparatur zum Aufbrechen von Zellen gemäß Versuch 16 ausgesetzt. Von dem resultierenden Gemisch wurde ein Überstand hergestellt und dialysiert, um ein teilweise gereinigtes Enzym zu erhalten, gefolgt von Analysieren der Eigenschaft gemäß Versuch 17. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
  • Figure 00660001
  • Teilweise gereinigte Enzyme, die von bekannten Mikroorganismen der Gattung Thermus, wie in Tabelle 12 gezeigt, abgeleitet sind, wurden auf ihr Einwirken auf eine Vielzahl von Sacchariden gemäß der Methode in Versuch 18 untersucht. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass in einer ähnlichen Weise wie das Enzym, das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet ist, die teilweise gereinigten Enzyme spezifisch auf Maltose und Trehalose einwirkten und Trehalose aus Maltose bildeten.
  • Es wurde gefunden, dass das Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym, das von Thermus ruber (ATCC 35948) abgeleitet wurde, ein niedrigeres Temperaturoptimum und bei niedrigeren Temperaturen stabil war, als das von Thermus aquaticus (ATCC 33923), während die Enzyme, die von den Mikroorganismen der Gattung Thermus abgeleitet wurden, ungefähr die gleiche Eigenschaft wie das von Thermus aquaticus (ATCC 33923) sowie eine relativ hohe thermische Stabilität aufwiesen.
  • Versuch 22
  • Aminosäureteilsequenz des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms
  • Ein Anteil einer gereinigten Enzymzubereitung, die abgeleitet war von Pimelobacter sp. R48, welche durch die Methode in Versuch 2 erhalten wurde, Pseudomonas putida H262, welche durch die Methode in Versuch 10 erhalten wurde, oder Thermus aquaticus (ATCC 33923), welche durch die Methode in Versuch 16 erhalten wurde, wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und ca. 80 μg Protein des resultierenden Materials wurden als eine Probe zum Analysieren einer Aminosäureteilsequenz, die den N-Terminus des Enzyms enthielt, verwendet. Der N-Terminus wurde an „PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", eine Proteinsequenziervorrichtung, die kommerziell von Applied Biosystems Inc., Foster City, USA vertrieben wird, analysiert. Die Aminosäureteilsequenz, die den N-Terminus von jedem Enzym enthielt, war, wie in Tabelle 13 gezeigt.
  • Tabelle 13
    Figure 00680001
  • Anmerkung:
  • In der Tabelle bedeutet jede Ziffer die Anzahl der Aminosäuren, welche ausgehend vom N-Terminus von jeder Aminosäureteilsequenz gezählt wird.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 13 ersichtlich ist, wurde gezeigt, dass die Enzyme, die von Pimelobacter sp. R48, Pseudomonas putida H262 und Thermus aquaticus (ATCC 33923) abgeleitet wurden, Aminosäureteilsequenzen aufwiesen, die hoch homolog waren. Eine relativ hohe Homologie wurde zwischen einer Aminosäureteilsequenz gefunden, die im Bereich der 10. Aminosäure „Trp" bis zur 16. Aminosäure „Phe", abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, und im Bereich von der 3. Aminosäure „Trp" bis zur 9. Aminosäure „Phe", abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, liegt. Die Aminosäureteilsequenz kann als Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe ausgedrückt werden (wobei das Symbol „X1", „Phe" oder „Pro" bedeutet; das Symbol „X2", „Thr" oder „Pro"; und das Symbol „X3", „Val" oder „Ala"). Eine relativ hohe Homologie wurde zwischen einer Aminosäureteilsequenz gefunden, die im Bereich der 14. Aminosäure „Ala" bis zur 17. Aminosäu re „Tyr", abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, und im Bereich von der 9. Aminosäure „Ala" bis zur 12. Aminosäure „Tyr", abgeleitet von einem Mikroorganismus der Gattung Thermus, liegt. Die Aminosäureteilsequenz kann als Ala-Val-X4-Tn ausgedrückt werden (wobei das Symbol „X4", „Phe" oder „Ile" bedeutet).
  • Versuch 23
  • Physikochemische Eigenschaft von Trehalose
  • Eine hoch-reine Trehalose für Prüfzwecke, die durch die Methode in Versuch 8 hergestellt wurde, wurde auf ihre physikochemische Eigenschaft untersucht. Als ein Ergebnis für wasserfreie Trehalose wurde der Schmelzpunkt als 97,0°C bestimmt, die spezifische Drehung war [α]D 20 + 199°C (c = 5), die Schmelzwärme betrug 57,8 kJ/Mol und die Löslichkeit in Wasser bei 25°C war 77,0 g. Diese Daten stimmten gut mit jenen einer kommerziell verfügbaren wasserhaltigen kristallinen Trehalose überein, die von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan gekauft und im Zuge der vorstehenden Versuche untersucht worden war.
  • Versuch 24
  • Verwendungstest in vivo
  • Gemäß der Methode, wie von H. Atsuji et al. in Journal of Clinical Nutrition, Bd. 41, Nr. 2, S. 200-208 (1972) berichtet, wurden 30 g der hoch-reinen Trehalose für Prüfzwecke mit einer Reinheit von 99,8 %, Tfb., aus Versuch 8 zu einer 20 w/v %igen wässrigen Lösung bereitet, die dann oral an 3 gesunde männliche Freiwillige, die 26, 27 und 30 Jahre alt waren, verabreicht wurde. Es wurden in vorbestimmten Zeitintervallen Blutproben genommen, gefolgt von den Messungen der Blutzucker- und Insulin-Level. Als eine Kontrolle wurde Glucose verwendet. Als ein Ergebnis verhielt sich Trehalose ähnlich wie Glucose und die Maxima der Blutzucker- und Insulin-Level wurden bei ca. 0,5 bis 1 Stunde nach der Verabreichung beobachtet. Dies zeigte, dass die vorliegende Trehalose durch Lebewesen leicht verdauert, absorbiert und metabolisiert und als eine Energiequelle verwendet wird. So werden die vorliegende Trehalose und die Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, geeigneterweise als ein energieergänzendes Saccharid verwendet.
  • Versuch 25
  • Test auf akute Toxizität
  • Unter Verwendung von Mäusen wurde die hoch-reine Trehalose für Prüfzwecke mit einer Reinheit von 99,8 %, Tfb., die in Versuch 8 hergestellt wurde, oral an Mäuse für einen Test auf akute Toxizität verabreicht. Das Ergebnis zeigte, dass die vorliegende Trehalose eine Substanz mit relativ niedriger Toxizität ist, und es starb keine Maus, sogar als der höchste Dosislevel verabreicht wurde, der an Mäuse verabreicht werden kann. Obwohl dieser Wert nicht genau ist, wurde der LD50-Wert als 50 g/kg oder höher bestimmt.
  • Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, die mit dem vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzym hergestellt wurden, sowie ihre Zubereitungen sind in Beispiel A veranschaulicht. Die vorliegenden Zusammensetzungen, die entweder die Trehalose oder die Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, enthalten, sind in Beispiel B veranschaulicht:
  • Beispiel A-1
  • Gemäß der Methode in Versuch 1 wurde eine Impfkultur eines Mikroorganismus der Spezies Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) in einem Fermenter für ca. 60 Stunden unter Belüftungs- und Rührbedingungen in einer frischen Zubereitung des gleichen Nährkulturmediums, wie in Versuch 1 verwendet, außer, dass die Glucose-Konzentration auf 4,0 w/v % eingestellt wurde, kultiviert. Die Aktivität des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms in der resultierenden Kultur war 0,75 Einheiten/ml. Ein Anteil der Kultur wurde durch Zentrifugation in Zellen und einen Kulturüberstand aufgetrennt, von welchen dann die Enzymaktivität getestet wurde. Als ein Ergebnis wurden ca. 65 % der Enzymaktivität in den Zellen beobachtet und ca. 35 % der Enzymaktivität wurden in dem Kulturüberstand beobachtet. Eine Kultur mit ca. 35 l, die Zellen enthielt, wurde mit „MINI-RABO", ein Apparatur zum Aufbrechen von Zellen mit hohem Druck, die kommerziell von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, behandelt, um die Zellen aufzubrechen. Die resultierende Zellsuspension wurde zentrifugiert, wobei ein Überstand erhalten wurde, der dann mit einer UF-Membran membranfiltriert wurde, gefolgt von Gewinnen eines Konzentrats mit ca. 1,2 l, das ca. 15 Einheiten/ml des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms enthielt.
  • Zu einer 10 w/v %igen Suspension (pH-Wert 5,5) von Kartoffelstärke wurden 2 Einheiten/g Stärke, Tfb., „SPITASE HS", eine α-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, gegeben und das resultierende Gemisch wurde unter Rühr- und Erwärmungsbedingungen geliert und verflüssigt, gefolgt von unmittelbarem Halten des Gemisches bei 120°C für 20 min und Einstellen des resultierenden Materials auf 50°C und einen pH-Wert von 5,0. Das so erhaltene Gemisch wurde mit 20 Einheiten/g Stärke, Tfb., einer β-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, und 500 Einheiten/g Stärke, Tfb., einer Isoamylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, gemischt und das resultierende Gemisch wurde einer enzymatischen Umsetzung für 24 Stunden unterworfen, wobei eine Saccharid-Lösung erhalten wurde, die ca. 92 w/v % Maltose enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 20 min erwärmt, auf 10°C erwärmt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, mit einer Einheit/g trockenem Material des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, welches vorstehend hergestellt wurde, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung für 96 Stunden unterworfen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde bei 95°C für 10 min gehalten, gekühlt, entfärbt und in einer herkömmlichen Weise mit einer Aktivkohle filtriert. Das Filtrat wurde gereinigt, indem es mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt wurde, und konzentriert, wobei ein Sirup mit einer Konzentration von ca. 70 w/v % in einer Ausbeute von ca. 95 %, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt, das ca. 69 % Trehalose, Tfb., enthält und eine Reduktionskraft von nur DÄ 18,2 aufweist, weist eine milde Süße sowie eine geeignete Viskosität und Feuchtigkeitsrückhaltsvermögen auf und deshalb wird es geeigneterweise als ein Süßungsmittel, Geschmack-verbesserndes Mittel, Stabilisator, Verdünnungsmittel, Exzipient und Füllstoff in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet.
  • Beispiel A-2
  • Ein Reaktionsgemisch, wobei eine enzymatische Umsetzung einer Maltose-Trehalose-Umwandlung abgestoppt worden war, wurde durch die Methode in Beispiel A-1 hergestellt, mit 10 Einheiten/g „GLUCOZYME", eine Glucoamylase, die kommerziell von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung bei einem pH-Wert von 5,0 und 50°C für 24 Stunden unterworfen. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde erwärmt, um das verbleibende Enzym zu inaktivieren, entfärbt, entsalzt und gereinigt, um eine Saccharid-Lösung als eine Futterlösung zu erhalten. Die Saccharid-Lösung wurde einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie mit „XT-1016 (Na+-Form, Polymerisationsgrad 4 %)", welches kommerziell von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen. Die Harze wurden in vierfach ummantelte Edelstahlsäulen mit einem Innendurchmesser von 5,4 cm in Kaskadenreihenschaltung gepackt, um eine Gesamtgelbetttiefe von 20 m zu ergeben.
  • Während die Säuleninnentemperatur bei 60°C gehalten wurde, wurde die Saccharid-Lösung auf die Säulen in einer Menge von 5 v/v % aufgebracht, wobei durch Aufbringen von 60°C warmen Wasser auf die Säule bei einer RG (Raumgeschwindigkeit) von 0,15, um Glucose zu entfernen, fraktioniert wurde, gefolgt von Gewinnen von Fraktionen mit einem hohen Trehalose-Gehalt. Die Fraktionen wurden vereinigt, gereinigt, konzentriert, in Vakuum getrocknet und pulverisiert, wobei ein Pulver mit hohem Trehalose-Gehalt in einer Ausbeute von ca. 55 %, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt, das ca. 97 % Trehalose, Tfb., enthält und eine zufriedenstellend niedrige Reduktionskraft sowie eine milde und qualitativ hochwertige Süße aufweist, kann beliebig als ein Süßungsmittel, Geschmack-verbesserndes Mittel, Qualität-verbesserndes Mittel, Stabilisator, Verdünnungsmittel, Exzipient und Füllstoff in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Beispiel A-3
  • Eine Fraktion mit hohem Trehalose-Gehalt, die durch die Methode in Beispiel A-2 erhalten wurde, wurde in einer herkömmlichen Weise mit einer Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Ionenaustauscher gereinigt. Das Filtrat wurde zu einer ca. 70 w/v %igen Lösung konzentriert, die dann in eine Kristallisiervorrichtung gegeben wurde, mit ca. 2 % wasserhaltiger kristalliner Trehalose als ein Impfkristall gemischt wurde und schrittweise gekühlt wurde, um eine Füllmasse mit einer Kristallinität von ca. 45 % zu erhalten. Die Füllmasse wurde bei einem hohen Druck von 150 kg/cm2 aus einer Düse gesprüht, die am Kopf eines Trockenturms angebracht war. Im Sprühschritt wurde die Füllmasse gleichzeitig mit 85°C warmer Luft, die vom Kopf des Trockenturms ausgeströmt wurde, durchlüftet und das resultierende kristalline Pulver wurde auf einem Metalldrahtnetzwerkfließband gesammelt, das am Fuß des Trockenturms bereitgestellt wurde, und schrittweise aus dem Trockenturm herausbefördert, während ein Strom von Luft mit 45°C aufwärts durch das Metalldrahtnetzwerk geleitet wurde. Das resultierende kristalline Pulver wurde in einen Reifungsturm injiziert und für 10 Stunden gereift, um die Kristallisation und das Trocknen zu vervollständigen, gefolgt von Rückgewinnen des resultierenden wasserhaltigen kristallinen Trehalose-Pulvers in einer Ausbeute von ca. 90 %, bezogen auf das Material der Fraktion mit hohem Trehalose-Gehalt, Tfb.
  • Das Produkt ist im Wesentlichen nicht hygroskopisch und kann einfach gehandhabt werden und dies macht es beliebig bei einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als ein Süßungsmittel, Geschmack verbesserndes Mittel, Qualität verbesserndes Mittel und Stabilisator nützlich.
  • Beispiel A-4
  • Eine Fraktion mit hohem Trehalose-Gehalt, die durch die Methode in Beispiel A-2 erhalten wurde, wurde in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-3 gereinigt und das resultierende Material wurde in eine Verdampfungsvorrichtung gegeben und in Vakuum aufgekocht, um einen Sirup mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 3,0 % zu erhalten. Der resultierende Sirup wurde in eine Kristallisiervorrichtung gegeben, mit einem % wasserfreier kristalliner Trehalose, bezogen auf den Sirup, Tfb., gemischt, und bei 120°C unter Rührbedingungen kristallisiert und das resultierende Gemisch wurde in einen ebenen Aluminiumbehäl ter gegeben und bei 100°C für 6 Stunden gereift, wobei ein Block gebildet wurde.
  • Der resultierende Block wurde mit einer Schneidevorrichtung pulverisiert und durch ein Fließbetttrocknen getrocknet, wobei ein wasserfreies kristallines Trehalose-Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 0,3 % in einer Ausbeute von ca. 85 %, bezogen auf das Material der Fraktion mit hohem Trehalose-Gehalt, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt kann beliebig als ein Trockenmittel in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Arzneimitteln und mit diesen verwandten Materialien und Zwischenprodukten verwendet werden und kann auch als ein weißes pulverförmiges Süßungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Beispiel A-5
  • Gemäß der Methode in Versuch 1 wurde eine Impfkultur von Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) in ein Nährkulturmedium überimpft und darin kultiviert und die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, wobei 100 g feuchte Zellen mit einer Aktivität von ca. 800 Einheiten des vorliegenden Enzyms erhalten wurden, die dann mit 100 ml 10 mM Phosphat-Puffer geknetet wurden, in welchem 2,5 % Natriumalginat mit einer Viskosität von 300 bis 400 cp, das kommerziell von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, vorher in 10 mM Phosphat-Puffer gelöst wurden. Die resultierende Aufschlämmung, die die Zellen enthielt, wurde darauffolgend in eine 0,1 M Calciumchlorid-Lösung von einer Höhe von ca. 20 cm über der Oberfläche der Lösung getropft, die durch einen Magnetrührer gerührt wurde, um kugelförmige Gele mit einem Durchmesser von ca. 2 mm zu bilden. Man ermöglichte, dass die Gele in der Lösung bei Umgebungstemperatur für ca. 2 Stunden standen und filtrierte mit einem Büchner-Trichter, gefolgt von Rückgewinnen der mit Alginat immobilisierten Zellen. Die resultierenden immobilisierten Zellen wurden in eine ummantelte Glassäule, 30 mm im Durchmesser und 200 mm in der Länge, gepackt und die Säule wurde erwärmt und bei 20°C gehalten. Eine 40 %ige Maltose-Lösung (pH-Wert 6,8) wurde auf die Säule bei einer RG von 0,2 aufgebracht, wobei man sie nach unten durchlaufen ließ, wobei eine Saccharid-Zusammensetzung erhalten wurde, die ca. 70 % Trehalose, Tfb., enthielt. Die so erhaltene Saccharid-Zusammensetzung wurde gereinigt und konzentriert, wobei ein Sirup mit einer Konzentration von ca. 70 % in einer Ausbeute von ca. 95 %, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt weist eine relativ niedrige Reduktionskraft und eine milde Süße sowie ein geeignetes Feuchtigkeitsrückhaltevermögen auf und deshalb kann es beliebig in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, die ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-1 sind, verwendet werden.
  • Beispiel A-6
  • Eine 33 %ige Maisstärkesuspension wurde mit Calciumcarbonat gemischt, um eine Endkonzentration von 0,1 % zu ergeben, und das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, welches dann mit 0,2 Einheiten/g Stärke, Tfb., „TERMAMYL 60L", eine α-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Novo Industri A/S, Kopenhagen, Dänemark vertrieben wird, gemischt wurde und einer enzymatischen Umsetzung bei 95°C für 15 min unterworfen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 120°C für 30 min autoklaviert, auf 55°C gekühlt, mit 500 Einheiten/g Stärke, Tfb., einer Isoamylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, und 30 Einheiten/g Stärke, Tfb., einer β-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung für 48 Stunden unterworfen, gefolgt von Gewinnen einer Saccharid-Lösung mit einem Maltose-Gehalt von ca. 84 %, Tfb. Die Saccharid-Lösung wurde bei 100°C für 10 min gehalten, auf 15°C gekühlt, mit 1,5 Einheiten/g Stärke, Tfb., des vorliegenden Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das durch die Methode in Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung für 72 Stunden unterworfen. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 15 min erwärmt, um das verbleibende Enzym zu inaktivieren, und in einer herkömmlichen Weise mit einer Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Ionenaustauscher gereinigt, gefolgt von Konzentrieren des resultierenden Materials, wobei ein Sirup mit einer Konzentration von ca. 70 % in einer Ausbeute von ca. 95 %, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt enthält ca. 64 % Trehalose, Tfb., und weist eine relativ niedrige Reduktionskraft und eine milde Süße sowie ein geeignetes Feuchtigkeitsrückhaltevermögen auf und deshalb kann es beliebig in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, die ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-1 sind, verwendet werden.
  • Beispiel A-7
  • Ein Sirup, der durch die Methode in Beispiel A-5 erhalten wurde, wurde zu einem ca. 82 %igen Sirup konzentriert, der dann in eine Kristallisiervorrichtung gegeben wurde, mit ca. einem % Impfkristall gemischt wurde, in ein ebenes Gefäß überführt wurde und dem ermöglicht wurde, bei 20°C für 4 Tage zu stehen, um Kristallisation zu bewirken. Der resultierende Kristall wurde mit einer Schneidevorrichtung pulverisiert und getrocknet, wobei ein wasserhaltiges kristallines Trehalose-Pulver vom Füllmasse-Typ in einer Ausbeute von ca. 95 %, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt zeigt im Wesentlichen keine Hygroskopie und kann einfach gehandhabt werden und deshalb kann es beliebig in einer Vielzahl von Zusammensetzungen in einer ähnlichen Weise wie das Produkt in Beispiel A-1 verwendet werden.
  • Beispiel A-8
  • Ein Sirup, der durch die Methode in Beispiel A-6 erhalten wurde, wurde zu einem ca. 80 %igen Sirup konzentriert, der dann in eine Kristallisiervorrichtung gegeben wurde, mit ca. einem % wasserhaltiger kristalliner Trehalose als ein Impfkristall gemischt wurde und unter Rührbedingungen gekühlt wurde, um Kristallisation zu bewirken. Das resultierende Material wurde mit einer Zentrifuge vom Siebtrommel-Typ aufgetrennt, wobei ein Kristall erhalten wurde, der dann mit einer kleinen Menge an kaltem Wasser besprüht wurde, wobei eine hoch-reine wasserhaltige kristalline Trehalose in einer Ausbeute von ca. 20 %, Tfb., erhalten wurde.
  • Das Produkt, das die selben physikochemischen Eigenschaften, wie in Versuch 23 gezeigt, aufweist, kann beliebig als ein Süßungsmittel, Geschmackverbesserndes Mittel, Qualität-verbesserndes Mittel, Stabilisator in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln sowie industriellen Reagenzien und chemischen Materialien verwendet werden.
  • Beispiel A-9
  • Eine Impfkultur von Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) wurde in ein Nährkulturmedium überimpft und gemäß der Methode in Versuch 9 in einem Fermenter für ca. 20 Stunden unter Rühr- und aeroben Bedingungen fermentiert. Ca. 18 l der resultierenden Kultur wurden zentrifugiert, wobei ca. 0,4 kg feuchte Zellen erhalten wurden, die dann in 4 l 10 mM Phosphat-Puffer suspendiert und mit „MODEL US300", einer Ultraschallzerkleinerungsvorrichtung, die kommerziell von Nippon Seiki Co., Ltd., Niigata, Japan vertrieben wird, behandelt wurden, um Zellen aufzubrechen. Das resultierende Gemisch wurde zentrifugiert, wobei ein Überstand erhalten wurde, der dann mit einer UF-Membran konzentriert wurde, gefolgt von Gewinnen von ca. 400 ml einer konzentrierten Enzymlösung, die 3,8 Einheiten/ml eines Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms enthielt. Eine zehn %ige Kartoffelsuspension (pH-Wert 5,5) wurde mit 2 Einheiten/g Stärke, Tfb., „SPITASE NS", eine α-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, geliert und durch Erwärmen unter Rührbedingungen verflüssigt, gefolgt von Autoklavieren bei 120°C für 20 min, Kühlen auf 50°C und Einstellen des pH-Werts auf 5,5. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 500 Einheiten/g Stärke, Tfb., einer Pullulanase für Prüfzwecke, die kommerziell von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, und 20 Einheiten/g Stärke, Tfb., einer β-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, gegeben und einer enzymatischen Umsetzung für 24 Stunden unterworfen, gefolgt von Gewinnen einer Saccharid-Lösung, die ca. 92 % Maltose enthielt. Die Saccharid-Lösung wurde bei 100°C für 20 min erwärmt, auf 40°C und einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, mit 1,5 Einheiten/g des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms, das vorstehend hergestellt wurde, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung für 72 Stunden unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 95°C für 10 min erwärmt, gekühlt und in einer herkömmlichen Weise entfärbt und mit einer Aktivkohle filtriert, gefolgt von Entsalzen und Reinigen des resultierenden Materials mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form und Konzentrieren der resultierenden Lösung, wobei ein Sirup mit einer Konzentration von ca. 70 w/v % in einer Ausbeute von ca. 97 %, Tfb., erhalten wurde. Das Produkt enthielt ca. 65 Trehalose, Tfb., und wies eine relativ niedrige Reduktionskraft von nur DÄ 16,2 sowie eine moderate Süße und eine geeignete Viskosität und Feuchtigkeits rückhaltevermögen auf und deshalb kann es beliebig als ein Süßungsmittel, Geschmack-verbesserndes Mittel, Stabilisator, Füllstoff, Verdünnungsmittel und Exzipient in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Beispiel A-10
  • Ein Gemisch des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms nach der Umsetzung, das durch die Methode in Beispiel A-9 erhalten wurde, wurde bei 95°C für 10 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, auf einen pH-Wert von 5,0 und 55°C eingestellt, mit 10 Einheiten/g Stärke, Tfb., „GLUCOZYME", eine Glucoamylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, gemischt und einer enzymatischen Umsetzung für 24 Stunden unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde in einer herkömmlichen Weise erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, entfärbt, entsalzt, gereinigt und zu einer 55 %igen Saccharid-Lösung konzentriert. In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel A-2 wurde die resultierende Saccharid-Lösung einer Säulenchromatographie mit „DOWEX 99 (Ca++-Form, Polymerisationsgrad 6 %)", ein stark saurer Erdalkalimetall-Kationenaustauscher, der kommerziell von Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA vertrieben wird, unterworfen, gefolgt von Gewinnen von Fraktionen mit hohem Trehalose-Gehalt. Die Fraktionen wurden vereinigt, gereinigt und während Konzentrieren kontinuierlich kristallisiert und die resultierende Füllmasse wurde mit einer Zentrifuge vom Siebtrommel-Typ aufgetrennt, gefolgt von Besprühen des resultierenden Kristalls mit einer kleinen Menge an Wasser, wobei eine hoch-reine wasserhaltige kristalline Trehalose in einer Ausbeute von ca. 25 %, Tfb., erhalten wurde. Das Produkt weist die selben physikochemischen Eigenschaften wie das Produkt in Versuch 23 auf und ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-8 kann es beliebig in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelpro dukten, Kosmetika und Arzneimitteln sowie industriellen Reagenzien und chemischen Materialien verwendet werden.
  • Beispiel A-11
  • Eine Impfkultur von Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) wurde ähnlich wie in Versuch 9 in einem Nährkulturmedium kultiviert und die resultierenden Zellen wurden durch Zentrifugation rückgewonnen, wobei 100 g feuchte Zellen mit einer Aktivität des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms von ca. 400 Einheiten erhalten wurden, die dann mit 100 ml 10 mM Phosphat-Puffer geknetet wurden, in welchem 2,5 % Natriumalginat mit einer Viskosität von 300 bis 400 cp gelöst worden waren. Die Aufschlämmung, die die Zellen enthielt, wurde kontinuierlich in eine 0,1 M CaCl2-Lösung von einer Höhe von ca. 20 cm über der Oberfläche der Lösung getropft, die durch einen Magnetrührer gerührt wurde, um kugelförmige Gele mit einem Durchmesser von ca. 2 mm zu bilden. Die Gele wurden in der CaCl2-Lösung bei Umgebungstemperatur für ca. 2 Stunden gehalten, mit einem Büchner-Trichter abfiltriert, wobei mit Natriumalginat immobilisierte Zellen rückgewonnen wurden. Die immobilisierten Zellen wurden in eine ummantelte Glassäule mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 200 mm gepackt und bei 35°C gehalten. Auf die Säule wurde ein Durchlauf von 40 %iger Maltose-Lösung (pH-Wert 6,8) bei einer RG von 0,1 aufgebracht, wobei eine 67 %ige Trehalose-Lösung erhalten wurde. Gemäß der Methode in Beispiel A-9 wurde die Trehalose-Lösung gereinigt, konzentriert, kristallisiert und sprühgetrocknet, wobei ein wasserhaltiges kristallines Trehalose-Pulver vom Füllmasse-Typ in einer Ausbeute von ca. 90 %, Tfb., erhalten wurde. Das Produkt weist eine relativ niedrige Reduktionskraft, eine milde Süße und ein geeignetes Feuchtigkeitsrückhaltevermögen auf und deshalb kann es beliebig als eine Vielzahl von Zusammensetzungen in einer ähnlichen Weise wie das Produkt in Beispiel A-9 verwendet werden.
  • Beispiel A-12
  • Eine Impfkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) wurde in ein Nährkulturmedium überimpft und gemäß der Methode in Versuch 15 für ca. 20 Stunden unter Bewegungs-Belüftungs-Bedingungen kultiviert. Die Kultur wies eine Aktivität von ca. 0,32 Einheiten/ml eines Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms auf. 0,18 kg feuchte Zellen, die aus ca.18 l der Kultur rückgewonnen wurden, wurden in 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 7,0) suspendiert. Ca. 1,5 l der Zellsuspension wurden mit einer Ultraschallzerkleinerungsvorrichtung behandelt, um die Zellen aufzubrechen. Die resultierenden Zelltrümmer wurden zentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen, der dann mit einer UF-Membran konzentriert wurde, wobei ein Konzentrat mit ca. 500 ml mit einer Aktivität von ca. 10 Einheiten/ml eines Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms erhalten wurde. Zu einer 15 %igen Maisstärkesuspension (pH-Wert 5,5) wurden 2 Einheiten/g Stärke „SPITASE HS", eine α-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, gegeben und es wurde geliert und unter Rühr- und Erwärmungsbedingungen verflüssigt. Unmittelbar danach wurde das Gemisch bei 120°C für 20 min autoklaviert, auf 55°C gekühlt und auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 300 Einheiten/g Stärke einer Isoamylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, und 20 Einheiten/g Stärke einer β-Amylase für Prüfzwecke, die kommerziell von Nagase Biochemicals, Kyoto, Japan vertrieben wird, gegeben und es wurde einer enzymatischen Umsetzung für 24 Stunden unterworfen, wobei eine ca. 92 %ige Maltose-Lösung erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde bei 100°C für 20 min erwärmt, auf 50°C gekühlt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, mit dem Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzym, das vorstehend hergestellt wurde, in einer Menge von 1,5 Einheiten/g Trockengewicht gemischt und einer enzymatischen Umsetzung für 72 Stunden unterworfen. Darauffolgend wurde die resul tierende Kultur auf 95°C für 10 min erwärmt, gekühlt und in einer herkömmlichen Weise entfärbt und mit einer Aktivkohle filtriert, gefolgt von Entsalzen und Reinigen der resultierenden Lösung mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form. Die resultierende Lösung wurde konzentriert, wobei ein 70 %iger Sirup in einer Ausbeute von ca. 95 %, Tfb., erhalten wurde. Das Produkt enthält ca. 64 % Trehalose, Tfb., und weist eine niedrige Reduktionskraft von DÄ 18,0 sowie eine milde Süße, eine geeignete Viskosität und ein zufriedenstellendes Feuchtigkeitsrückhaltevermögen auf. Deshalb kann es beliebig als ein Süßungsmittel, Geschmack-verbesserndes Mittel, Stabilisator, Füllstoff, Verdünnungsmittel und Exzipient in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Beispiel A-13
  • Ein Sirup, der durch die Methode in Beispiel A-12 erhalten wurde, wurde zu einem ca. 80 %igen Sirup konzentriert, der dann in eine Kristallisiervorrichtung gegeben wurde und ähnlich wie in Beispiel A-8 kristallisiert und aufgetrennt wurde, wobei eine hoch-reine wasserhaltige kristalline Trehalose in einer Ausbeute von ca. 20 %, Tfb., erhalten wurde. Das Produkt weist die selben physikochemischen Eigenschaften, ähnlich wie das Produkt in Versuch 23, auf und kann beliebig, ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-8, als ein industrielles Reagenz, industrielles Material und chemisches Material in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Beispiel A-14
  • Eine Impfkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) wurde in ein Nährkulturmedium überimpft und ähnlich wie die Methode in Versuch 15 kultiviert, gefolgt von Zentrifugieren der resultierenden Kultur, wobei 50 g feuchte Zellen mit ca. 1.500 Einheiten einer Aktivität eines Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms erhalten wurden. Die Zellen wurden in 100 ml 2,5 % Natriumalginat mit einer Viskosität von 300 bis 400 cp, ein Reagenz, das kommerziell von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, suspendiert. Die resultierende Aufschlämmung wurde kontinuierlich in eine 0,1 M CaCl2-Lösung von einer Höhe von ca. 20 cm über der Oberfläche der Lösung getropft, die durch einen Magnetrührer gerührt wurde, um kugelförmige Gele mit einem Durchmesser von ca. 2 mm zu bilden. Man ermöglichte, dass die Gele in der Lösung bei Umgebungstemperatur für ca. 2 Stunden standen, dann wurde mit einem Büchner-Trichter abfiltriert, wobei mit Alginat immobilisierte Zellen erhalten wurden. Die immobilisierten Zellen wurden in eine ummantelte Glassäule mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 200 mm gepackt und auf 60°C erwärmt. Auf die Säule wurde ein Durchlauf von 40 %iger Maltose-Lösung (pH-Wert 6,5) bei einer RG von 0,2 aufgebracht, wobei eine ca. 66 %ige Trehalose-Lösung erhalten wurde, die dann in einer herkömmlichen Weise gereinigt, konzentriert und sprühgetrocknet wurde, wobei ein Trehalose-Pulver in einer Ausbeute von ca. 90 %, Tfb., erhalten wurde. Das Pulver weist eine relativ niedrige Reduktionskraft und eine milde Süße auf und dies macht es, ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-12, beliebig in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln nützlich.
  • Beispiel B-1
  • Süßungsmittel
  • Zu einem Gewichtsteil eines wasserhaltigen kristallinen Trehalose-Pulvers, das durch die Methode in Beispiel A-8 erhalten wurde, wurden homogen 0,01 Gewichtsteile „αG SWEET", ein α-Glycosylsteviosid-Produkt, das kommerziell von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, und 0,01 Gewichtsteile „ASPARTAME", ein Produkt von L-Aspartyl-L- phenylalaninmethylester, das kommerziell von Ajinomoto Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, gegeben und das resultierende Gemisch wurde in eine Granuliervorrichtung gegeben, um ein gekörntes Süßungsmittel zu erhalten.
  • Das Produkt weist eine zufriedenstellende Süße und eine ca. 2,5-fach höhere Süßkraft wie Saccharose sowie einen kalorischen Wert von nur ca. 2/5 von dem von Saccharose auf.
  • Da das Produkt eine zufriedenstellende Stabilität aufweist und andere Süßungsmittel, welche zugemischt werden, nicht zersetzt, kann es geeigneterweise als ein Süßungsmittel mit wenig Kalorien für Nahrungsmittelprodukte mit wenig Kalorien für übergewichtige Personen und Diabetiker verwendet werden, die auf eine verringerte Kalorienaufnahme eingeschränkt sind.
  • Das Produkt bildet im Wesentlichen keine Säuren und unlöslichen Glucane, wenn auf es Zahnkaries-hervorrufende Mikroorganismen einwirken, und dies macht es zum Süßen von Nahrungsmittelprodukten nützlich, wobei Zahnkaries vorgebeugt wird.
  • Beispiel B-2
  • Bonbon
  • Einhundert Gewichtsteile einer 55 w/v %igen Saccharose-Lösung wurden durch Erwärmen mit 30 Gewichtsteilen eines Trehalose-Sirups, der durch die Methode in Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und die resultierende Lösung wurde in Vakuum konzentriert, bis sich der Feuchtigkeitsgehalt auf unter 2 % erniedrigt hatte. Das Konzentrat wurde mit einem Gewichtsteil Zitronensäure und geeigneten Mengen eines Zitronenaromas und eines farbgebenden Mittels gemischt und das resultierende Gemisch wurde in einer herkömmlichen Weise in das gewünschte Produkt geformt.
  • Das Produkt ist ein Bonbon mit hoher Qualität mit einem zufriedenstellenden Geschmack und angenehmer Eigenschaft. Es bestanden ferner keine Bedenken hinsichtlich der Kristallisation von Saccharose.
  • Beispiel B-3
  • Kaugummi
  • Drei Gewichtsteile einer Gummigrundlage wurden durch Erwärmen, bis sie erweichten, geschmolzen und das resultierende Material wurde mit 3 Gewichtsteilen kristallinem Maltitol und 4 Gewichtsteilen eines wasserhaltigen kristallinen Trehalose-Pulvers, das durch die Methode in Beispiel A-3 erhalten wurde, gemischt und ferner mit geeigneten Mengen von einem Aroma und einem farbgebenden Mittel gemischt. Das resultierende Gemisch wurde in einer herkömmlichen Weise durch eine Walze geknetet, geformt und verpackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt ist ein Kaugummi mit einer zufriedenstellenden Textur und Geschmack und wird geeigneterweise als ein Kaugummi verwendet, der relativ wenig oder im Wesentlichen keine Zahnkaries hervorruft.
  • Beispiel B-4
  • Pulverisierter Saft
  • Dreiunddreißig Gewichtsteile eines pulverisierten Orangensafts, der durch Sprühtrocknen hergestellt wurde, wurden bis zur Homogenität mit 50 Gewichtsteilen eines Pulvers mit hohem Trehalose-Gehalt vom Füllmasse-Typ, das durch die Methode in Beispiel A-7 erhalten wurde, 10 Gewichtsteilen Saccharose, 0,65 Gewichtsteilen wasserfreie Zitronensäure, 0,1 Gewichtsteilen Äpfelsäure, 0,1 Gewichtsteilen L-Ascorbinsäure, 0,1 Gewichtsteilen Natriumcit rat, 0,5 Gewichtsteilen Pullulan und einer geeigneten Menge an pulverisiertem Aroma gemischt. Das resultierende Gemisch wurde pulverisiert und mit einer Fließbettgranuliervorrichtung für 30 min granuliert, wobei Granula erhalten wurde, während es als ein Bindemittel mit einem Trehalose-Sirup, der durch die Methode in Beispiel A-6 erhalten wurde, besprüht wurde und mit Luft von 40°C bei einer Fließrate von 150 m3 belüftet wurde. Das so erhaltene Granula wurde gewogen und abgepackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt, das 30 % Orangensaft, Tfb., enthielt, erhielt seine hohe Qualität für einen relativ langen Zeitraum, ohne einen unbefriedigenden Geschmack und Geruch zu ergeben.
  • Beispiel B-5
  • Getränk mit Milchsäurebakterien
  • Einhundertfünfundsiebzig Gewichtsteile entfettetes Milchpulver, 130 Gewichtsteile eines Trehalose-Sirups, der durch die Methode in Beispiel A-9 erhalten wurde, 50 Gewichtsteile eines Pulvers mit hohem Lactosaccharose-Gehalt, das im Japanischen Patent mit der Offenlegungsnr. 281795/92 offenbart wird, wurden in 1.150 Gewichtsteilen Wasser gelöst und die Lösung wurde sterilisiert, indem sie bei 65°C für 30 Minuten erwärmt wurde, auf 40°C gekühlt, in einer herkömmlichen Weise mit 30 Gewichtsteilen Milchsäurebakterian als ein Starter gemischt und bei 37°C für 8 Stunden inkubiert, wobei das gewünschte Produkt mit einem zufriedenstellenden Geschmack und Aroma erhalten wurde. Da das Produkt Oligosaccharide enthält, erhält es die Milchsäurebakterien stabil und fördert auch das Wachstum.
  • Beispiel B-6
  • Eiercreme
  • Einhundert Gewichtsteile Maisstärke, 100 Gewichtsteile eines Trehalose-Sirups, der durch die Methode in Beispiel A-6 erhalten wurde, 80 Gewichtsteile Maltose, 20 Gewichtsteile Saccharose und ein Gewichtsteil Salz wurden ausreichend gemischt. Das Gemisch wurde mit 280 Gewichtsteilen Ei gemischt und schrittweise mit 1.000 Gewichtsteilen einer siedenden Milch gemischt. Das resultierende Gemisch wurde unter Erwärmungsbedingungen fortwährend gerührt und das Erwärmen wurde gestoppt, als die Maisstärke in dem Gemisch vollständig geliert war, was den Gesamtinhalt halbtransparent erscheinen ließ, gefolgt von Kühlen des resultierenden Materials und Dazugeben einer geeigneten Menge eines Vanillearomas. Das resultierende Gemisch wurde gewogen, injiziert und abgepackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt weist eine glatte Oberfläche und Glanz sowie einen milden Geschmack und Süße auf.
  • Beispiel B-7
  • „Uiro-no-moto" (Vormischung eines süßen Reisgelees)
  • Eine Uiro-no-moto wurde durch homogenes Mischen von 90 Gewichtsteilen Reispulver mit 20 Gewichtsteilen Maisstärke, 40 Gewichtsteilen Saccharose, 80 Gewichtsteilen einer wasserhaltigen kristallinen Trehalose vom Füllmasse-Typ, die durch die Methode in Beispiel A-11 erhalten wurde, und 4 Gewichtsteilen Pullulan hergestellt. Das Produkt wurde mit Wasser und einer geeigneten Menge an Matcha (gepulvertem Tee) geknetet und das resultierende Gemisch wurde in einen Behälter gegeben und für 60 min bedampft, wobei eine Uiro erhalten wurde. Das Produkt weist einen zufriedenstellenden Glanz, scharfe Eigenschaft, Aroma und Geschmack sowie eine relativ lange Lagerdauer auf, da die Retrogradation der darin enthaltenen Stärke gut inhibiert wird.
  • Beispiel B-8
  • Pulverförmiges Peptid
  • Ein Gewichtsteil „HINUTE S", eine Peptidlösung, die 40 % Speisesojabohnen enthält und kommerziell von Fuji Oil Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, wurde mit 2 Gewichtsteilen einer wasserhaltigen kristallinen Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-10 hergestellt wurde, gemischt und das resultierende Gemisch wurde in ein Kunststoffgefäß gegeben, in Vakuum bei 50°C getrocknet und pulverisiert, wobei ein pulverförmiges Peptid erhalten wurde. Das Produkt mit einem zufriedenstellenden Geschmack und Aroma kann beliebig als ein Material für Konditorwaren wie Vormischungen, Sorbets und Eiscremes sowie für Babynahrungsmittel und Ernährungsmittel für Therapie in der Form einer oralen oder einer Intubationsernährung verwendet werden.
  • Beispiel B-9
  • Pulverisierte Miso
  • Zu einem Gewichtsteil Akamiso (eine Art von Miso) wurden 3 Gewichtsteile einer pulverförmigen wasserfreien kristallinen Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-4 erhalten wurde, gegeben und das Gemisch wurde in eine Metallplatte mit halbkugelförmigen Vertiefungen auf ihrer Oberfläche gegossen und man ermöglichte, dass es bei Umgebungstemperatur über Nacht stand, wobei Miso-Feststoffe mit jeweils ca. 4 g Gewicht erhalten wurden, die dann einer Pulverisiervorrichtung ausgesetzt wurden, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt kann beliebig als ein Würzmittel für Instantnudeln und -suppen sowie eine Miso-Konditorware verwendet werden.
  • Beispiel B-10
  • Pulverförmiges Eigelb
  • Eigelb, das aus frischen Eiern hergestellt wurde, wurde bei 60 bis 64°C durch eine Plattenheizvorrichtung sterilisiert und ein Gewichtsteil der resultierenden Flüssigkeit wurde mit 4 Gewichtsteilen einer pulverförmigen wasserfreien kristallinen Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-4 hergestellt wurde, in Bezug auf einen Gewichtsteils der Flüssigkeit gemischt. Das resultierende Gemisch wurde in ein Gefäß überführt, man ermöglichte, dass es über Nacht stand, wobei ein Block gebildet wurde, während man ermöglichte, dass sich die wassertreie kristalline Trehalose in wasserhaltige kristalline Trehalose umwandelte. Der so erhaltene Block wurde mit einer Schneidevorrichtung pulverisiert, wobei ein pulverförmiges Eigelb erhalten wurde.
  • Das Produkt kann beliebig als ein Material für Konditorwaren für Vormischungen, Sorbets, Eiscremes und Emulgiermittel sowie für Babynahrungsmittel und Ernährungsmittel für Therapie in der Form einer oralen oder einer Intubationsernährung verwendet werden. Das Produkt kann auch als ein Hautpflegemittel und Haarwuchsmittel verwendet werden.
  • Beispiel B-11
  • An (Bohnenpaste)
  • Zehn Gewichtsteile Adzuki-Bohnen als ein Material wurden in herkömmlicher Weise mit Wasser gemischt und gekocht, gefolgt von Entfernen der harten Teile der Bohnen und wasserlöslichen Verunreinigungen, wobei ca. 21 Gewichtsteile „Adzuki-tsubu-nama-an" erhalten wurden. Zu dem resultierenden Material wurden 14 Gewichtsteile Saccharose, 5 Gewichtsteile eines Trehalose-Sirups, der durch die Methode in Beispiel A-12 erhalten wurde, und 5 Gewichtsteile Wasser gegeben und das resultierende Gemisch wurde gekocht, mit einer kleinen Menge Salatöl gemischt und vorsichtig durchgeknetet, so dass die Bohnen nicht zu einer Paste wurden. So wurden ca. 35 Gewichtsteile des gewünschten Produkts erhalten.
  • Das Produkt ist frei von Verfärbung, die durch Kochen hervorgerufen wird, und weist einen zufriedenstellenden Geschmack und Aroma auf und dies macht es als ein Material von An für Bohnenmarmeladebrötchen, Brötchen mit Bohnenmarmeladefüllung, Klöße, mit Bohnenmarmelade gefüllte Oblaten, Sorbets und Eiscremes nützlich.
  • Beispiel B-12
  • Brot
  • Einhundert Gewichtsteile Weizenpulver, 2 Gewichtsteile Hefe, 5 Gewichtsteile Zucker, ein Gewichtsteil einer pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-14 erhalten wurde, 0,1 Gewichtsteile Backpulver wurden mit Wasser in einer herkömmlichen Weise geknetet, bei 26°C für 2 Stunden fermentiert, für 30 min gereift und aufgebacken.
  • Das Produkt ist ein Brot von hoher Qualität mit einer zufriedenstellenden Färbung und Aufblähung sowie einer zufriedenstellenden Elastizität und milden Süße.
  • Beispiel B-13
  • Schinken
  • Zu eintausend Gewichtsteilen geschnittenem Schinkenfleisch wurden 15 Gewichtsteile Salz und 3 Gewichtsteile Kaliumnitrat gegeben und zur Homogenität vermahlen und die Schinkenfleischstücke wurden aufeinander gehäuft und man ermöglichte, dass sie über Nacht in einem kalten Lagerraum standen. Danach wurden die resultierenden Stücke zuerst für 7 Tage in einem kalten Lagerraum in eine Salzlösung, die aus 500 Gewichtsteilen Wasser, 100 Gewichtsteilen Salz, 3 Gewichtsteilen Kaliumnitrat, 40 Gewichtsteilen eines wasserhaltigen kristallinen Trehalose-Pulvers, das durch die Methode in Beispiel A-3 hergestellt wurde, und einer geeigneten Menge eines Pfefferminz bestand, eingelegt, mit kaltem Wasser in einer herkömmlichen Weise gewaschen, mit einem Faden zusammengebunden, geräuchert, gekocht, gekühlt und verpackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt ist ein Schinken von hoher Qualität mit einer zufriedenstellenden Färbung, Geschmack und Aroma.
  • Beispiel B-14
  • Gesüßte Kondensmilch
  • In 100 Gewichtsteilen einer Frischmilch als ein Material wurden 3 Gewichtsteile eines Trehalose-Sirups, der durch die Methode in Beispiel A-5 erhalten wurde, und ein Gewichtsteil Saccharose gelöst und das Gemisch wurde stersilisiert, indem es mit einer Plattenheizvorrichtung erwärmt wurde, und zu einem 70 %igen Sirup, Tfb., kondensiert, der dann aseptisch in Dosen abgefüllt wurde, wobei das gewünschte Produkt erreicht wurde.
  • Da das Produkt eine milde Süße und Aroma aufweist, kann es beliebig als ein Würzmittel für Nahrungsmittel für Kleinkinder und Kinder, Früchte, Kaffee, Kakao und Tee verwendet werden.
  • Beispiel B-15
  • Kosmetische Creme
  • Zwei Gewichtsteile Polyoxyethylenglycolmonostearat, 5 Gewichtsteile Glycerylmonostearat, selbstemulgierend, 2 Gewichtsteile eines Pulvers mit hohem Trehalose-Gehalt vom Füllmasse-Typ, das durch die Methode in Beispiel A-7 erhalten wurde, ein Gewichtsteil α-Glycosylrutin, ein Gewichtsteil Leichtparaffin, 10 Gewichtsteile Glyceryltri-2-ethylhexanoat und eine geeignete Menge eines Antiseptikums wurden durch Erwärmen in einer herkömmlichen Weise gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit 2 Gewichtsteilen L-Milchsäure, 5 Gewichtsteilen 1,3-Butylenglycol und 66 Gewichtsteilen veredeltes Wasser gemischt und das resultierende Gemisch wurde durch eine Homogenisiervorrσchtung emulgiert und mit einer geeigneten Menge eines Aromas unter Rührbedingungen gemischt, wobei eine kosmetische Creme erhalten wurde.
  • Das Produkt mit einer relativ hohen Stabilität kann beliebig als ein Sonnenschutzmittel, Hautpflegemittel und Hautbleichungsmittel mit hoher Qualität verwendet werden.
  • Beispiel B-16
  • Pulverförmiger Ginsengextrakt
  • Ein halber Gewichtsteil Ginsengextrakt wurde mit 1,5 Gewichtsteilen eines wasserfreien kristallinen Trehalose-Pulvers, das durch die Methode in Beispiel A-4 hergestellt wurde, gemischt und das resultierende Gemisch wurde in einen ebenen Behälter überführt, man ermöglichte, dass es für 2 Tage stand, um wasserfreie kristalline Trehalose in wasserhaltige kristalline Trehalose umzuwandeln und um einen Block zu bilden, gefolgt von Pulverisieren des Blocks durch eine Schneidevorrichtung und Klassifizieren des resultierenden Materials zu einem pulverförmigen Ginsengextrakt.
  • Das Produkt und geeignete Mengen pulverförmiger Vitamine B1 und B2 wurden einer Granuliervorrichtung ausgesetzt, um einen pulverförmigen Ginsengextrakt, der Vitamine enthält, zu erhalten.
  • Das so erhaltene Produkt kann beliebig als ein kräftigendes, Ermüdungverminderndes Mittel und Vitalität-verleihendes Mittel verwendet werden. Das Produkt kann auch als ein Haarwuchsmittel verwendet werden.
  • Beispiel B-17
  • Festes Arzneimittel
  • Eine Zubereitung von natürlichem menschlichem Interferono-α, die von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan hergestellt und kommerziell von Cosmo Bio, Tokio, Japan vertrieben wird, wurde in einer herkömmlichen Weise auf eine Säule eines immobilisierten anti-menschliches Interteron-α-Antikörpers aufgebracht, um das Interferon-α zu adsorbieren, und ein Puffer, der Kälberserumalbumin als einen Stabilisator enthielt, wurde auf die Säule aufgebracht, gefolgt von Entfernen einer überschüssigen Menge des Albumins. Danach wurde das Interferon-α von der Säule mit einer physiologischen Salzlösung, die 5 % eines Pulvers mit hohem Trehalose-Gehalt, das durch die Methode in Beispiel A-2 hergestellt wurde, enthielt, eluiert, während der pH-Wert der physiologischen Salzlösung variiert wurde. Das resultierende Eluat wurde membranfiltriert und das Filtrat wurde durch die Zugabe des ca. 20-fachen Volumens an „FINETOSE®", ein wassertreies kristallines Maltose-Pulver, das kommerziell von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, dehydratisiert, gefolgt von Pulverisieren des resultierenden dehydratisierten Produkts und Tablettieren des resultierenden Pulvers durch eine Tablettiermaschine, wobei Tabletten erhalten wurden, die ca. 150 Einheiten des natürlichen menschlichen Interferon-α pro Tablette, ca. 200 mg Gewicht, enthielten.
  • Das Produkt kann oral als eine sublinguale Tablette an Patienten in einer Dosis von 1 bis 10 Tabletten/Erwachsener/Tag verabreicht werden und beliebig zur Behandlung von viralen Erkrankungen, Allergien, Rheumatismus, Diabetes und malignen Tumoren verwendet werden. Genauer kann das Produkt geeigneterweise als ein therapeutisches Mittel gegen AIDS und Hepatitis verwendet werden, wobei die Anzahl der Patienten, die unter diesen Erkrankungen leiden, beträchtlich angestiegen ist. Die Trehalose und Maltose, die in das Produkt eingebracht wurden, wirken als ein Stabilisator für das natürliche menschliche Interferon-α, so dass die Aktivität für einen relativ langen Zeitraum sogar bei Umgebungstemperatur gut erhalten bleibt.
  • Beispiel B-18
  • Tablette mit Zuckerüberzug
  • Eine rohe Tablette als ein Kern, 150 mg Gewicht, wurde mit einer Lösung, die aus 40 Gewichtsteilen einer pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-3 erhalten wurde, 2 Gewichtsteilen Pullulan mit einem mittleren Molekulargewicht von 200.000, 30 Gewichtsteilen Wasser, 25 Gewichtsteilen Talk und 3 Gewichtsteilen Titanoxid bestand, überzogen, bis das Gesamtgewicht ca. 230 mg erreicht hatte und die resultierenden Tabletten wurden weiter mit einer Lösung, die aus 65 Gewichtsteilen einer frischen Zubereitung der gleichen pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, einem Gewichtsteil Pullulan und 34 Gewichtsteilen Wasser bestand, überzogen und mit einem Flüssigwachs mit Glanz versehen, wobei eine Tablette mit Zuckerüberzug mit einem zufriedenstellenden Glanz und Erscheinung erhalten wurde.
  • Das Produkt weist eine relativ hohe Stoßtoleranz auf und erhält ihre hohe Qualität für einen relativ langen Zeitraum.
  • Beispiel B-19
  • Zahnputzmittel
  • Ein Zahnputzmittel wurde in einer herkömmlichen Weise durch Mischen der folgenden Bestandteile hergestellt:
    Figure 00960001
  • Das Produkt wird zufriedenstellend als ein Zahnputzmittel für Kleinkinder verwendet, da es eine geeignete Süße aufweist.
  • Beispiel B-20
  • Feste Zubereitung für Intubationsernährung
  • Eine Zusammensetzung, die aus den folgenden Zusammensetzungen bestand, wurde hergestellt: Fünfhundert Gewichtsteile einer wasserhaltigen kristallinen Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-8 hergestellt wurde, 270 Gewichtseile pulverisiertes Eigelb, 209 Gewichtsteile entfettete Milch, 4,4 Gewichtsteile Natriumchlorid, 1,8 Gewichtsteile Kaliumchlorid, 4 Gewichtsteile Magnesiumsulfat, 0,01 Gewichtsteile Thiamin, 0,1 Gewichtsteile Natriumascorbat, 0,6 Gewichtsteile Vitamin E-Acetat und 0,04 Gewichtsteile Nicotinamid. Fünfundzwanzig g-Aliquote der Zusammensetzung wurden in feuchtigkeitsbeständige laminierte kleine Beutel gespritzt und wärmeversiegelt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Ein Beutel des Produkts wird in ca. 150 bis 300 ml Wasser zu einem Flüssignahrungsmittel gelöst und zur Energieergänzung an Lebewesen oral oder parenteral in die Nasenhöhle, den Magen oder den Darm durch Intubationsernährung verabreicht.
  • Beispiel B-21
  • Hochkalorische Ernährung
  • Eine hoch-reine wasserhaltige kristalline Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-10 hergestellt wurde, wurde in Wasser zu einer ca. 10 w/v %igen wässrigen Trehalose-Lösung gelöst, die dann in einer herkömmlichen Weise membranfiltriert wurde, um Pyrogen zu entfernen, aseptisch in eine Kunststoffflasche eingespritzt wurde und versiegelt wurde, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt, das eine zufriedenstellend stabile hochkalorische Ernährung ist, die im Wesentlichen frei von Veränderung beim Stehen ist, ist für intravenöse und intraperitoneale Verabreichungen geeignet. Eine 10 w/v %ige Lösung des Produkts ist isotonisch zu Blut und dies bedeutet, dass es für Lebewesen in einer 2-fach höheren Konzentration als im Falle von Glucose Energie ergänzen kann.
  • Beispiel B-22
  • Hochkalorische Ernährung
  • Eine hoch-reine wasserhaltige kristalline Trehalose, die durch die Methode in Beispiel A-13 hergestellt wurde, und eine Aminosäure-Zusammensetzung, die aus den folgenden Komponenten bestand, wurden durch Rühren in Wasser gelöst, um die jeweiligen Konzentrationen von 5 w/v % und 30 w/v % zu ergeben, und, ähnlich wie in Beispiel B-10, wurde die resultierende Lösung gereinigt, um eine pyrogenfreie Lösung zu erhalten, gefolgt von Einspritzen davon in eine Kunststoffflasche und Versiegeln, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Figure 00980001
  • Obwohl das Produkt eine multiple hochkalorische Ernährung ist, die Trehalose und Aminosäuren enthält, ist sie zufriedenstellend stabil ohne wesentliche Veränderung beim Stehen und kann geeigneterweise intravenös und intraperitoneal an Lebewesen verabreicht werden. Das Produkt kann beliebig zur Energieergänzung sowie zur Versorgung von Lebewesen mit Aminosäuren verwendet werden.
  • Beispiel B-23
  • Salbe zum Behandeln von Verletzungen/Wunden
  • Zweihundert Gewichtsteile eines Pulvers mit hohem Trehalose-Gehalt, das durch die Methode in Beispiel A-2 hergestellt wurde, und 300 Gewichtsteile Maltose wurden mit 50 Gewichtsteilen einer Methanol-Lösung, die drei Gewichtsteile Iod enthielt, gemischt und die resultierende Lösung wurde mit 200 Gewichtsteilen einer 10 w/v %igen wässrigen Pullulan-Lösung gemischt, wobei das gewünschte Produkt mit einer zufriedenstellenden Ausbreitungsfähigkeit und Haftfähigkeit erhalten wurde.
  • Das Iod, das in dem Produkt enthalten ist, übt eine bakterizide Wirkung aus und die Trehalose in dem Produkt wirkt als ein energieergänzendes Mittel auf lebende Zellen und deshalb verkürzt das Produkt eine Heildauer und heilt eine Wundoberfläche zufriedenstellend.
  • Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, wandelt das vorliegende neue Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym Maltose in Trehalose in einer zufriedenstellend hohen Ausbeute um. Die vorliegende Trehalose und Saccharid-Zusammensetzung, die die gleiche enthält, die durch die vorliegende enzymatische Umsetzung erhalten werden, weisen eine relativ hohe Stabilität und Qualität sowie eine sehr gute Süße auf. Sie werden von Lebewesen als eine Energiequelle assimiliert, absorbiert und verwendet, wenn sie oral verabreicht werden. Deshalb können sie beliebig als ein Süßungsmittel, Geschmackverbesserndes Mittel, Qualität-verbesserndes Mittel, Stabilisator, Exzipient, Verdünnungsmittel und Füllstoff in einer Vielzahl von Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln verwendet werden.
  • Folglich ist es gemäß der vorliegenden Erfindung gelungen, eine neue Technik zur Herstellung von Trehalose aus Maltose bereitzustellen, die Stärke als eine günstige und im Wesentlichen reichlich vorkommende natürliche Quelle verwenden kann. Ferner wird die Herstellung einer Saccharid-Zusammensetzung, die die Trehalose enthält, in einem industriellen Maßstab bei relativ niedrigen Kosten ermöglicht. Deshalb hat die vorliegende Erfindung einen unermesslich hohen Einfluss auf Gebiete wie Stärke-, Enzym- und biochemische Wissenschaften und auf andere industrielle Bereiche, insbesondere auf die Nahrungsmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrien, sowie auf die Forstwirtschaft, das Fischereiwesen und auf die Industrien in den Bereichen Landwirtschaft und Viehhaltung und die chemische Industrie. Folglich sind mit der Umsetzung der Erfindung verbundene Auswirkungen in den jeweiligen Gebieten erheblich.

Claims (20)

  1. Ein Enzym, das Maltose in Trehalose umwandelt und umgekehrt, wobei das Enzym von einem Mikroorganismus erhältlich ist und ein Molekulargewicht von ca. 57.000 bis 120.000 Dalton nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hat, wobei der Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, Pseudomonas oder Thermus angehört, wobei das Enzym die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat: (1) Isoelektrischer Punkt (pl) Ca. 3.8-5.1 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt; und (2) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein (1) mM Cu++, 50 mM Tris-HCl Puffer, und wobei das Enzym eine Aminosäureteilsequenz hat aus der Gruppe bestehend aus: (1) Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe (wobei "X1" bedeutet "Phe" oder "Pro"; "X2", "Thr" oder "Pro"; und "X3", "Val" oder "Ala"); (2) Ala-Val-X4-Tyr (wobei "X4" bedeutet "Phe" oder "Ile").
  2. Das Enzym gemäß Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315), Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) oder Thermus aquaticus (ATCC 33923) ist.
  3. Ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch 1, enthaltend: (a) Kultivierung eines zur Herstellung des Enzyms fähigen Mikroorganismus in einem Nährkulturmedium zur Bildung des Enzyms; und (b) Rückgewinnung des Enzyms aus der resultierenden Kultur.
  4. Ein Mikroorganismus, fähig zur Bildung des Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) und Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579).
  5. Eine Methode zur Senkung der Reduktionskraft von Maltose, enthaltend einen Schritt, der es dem Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 2 ermöglicht, auf Maltose in Lösung einzuwirken.
  6. Ein Verfahren zur Herstellung einer Saccharid-Zusammensetzung, die Trehalose enthält, enthaltend: (a) dem Enzym nach einem der Ansprüche 1 oder 2 ermöglichen, auf Maltose in Lösung einzuwirken, um Trehalose zu bilden; und (b) Rückgewinnung der resultierenden Saccharid-Zusammensetzung, die Trehalose enthält.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei Maltose hergestellt wird, indem es β-Amylase ermöglicht wird, auf eine Lösung stärkehaltiger Substanz zusammen mit einem oder ohne ein stärkespaltendes Enzym einzuwirken.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die Trehalose wasserhaltige kristalline Trehalose oder wasserfreie kristalline Trehalose ist.
  9. Ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose, enthaltend: (a) dem Enzym nach einem der Ansprüche 1 oder 2 ermöglichen, auf Maltose in Lösung einzuwirken, um Trehalose zu bilden; (b) Reinigung der Trehalose in der resultierenden Lösung; und (c) Rückgewinnung der gereinigten Trehalose.
  10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Schritt (b) enthält einen Schritt, in dem die Lösung der Einwirkung von Glucoamylase zur Erhöhung des Gehalts an Trehalose unterworfen wird, und Unterwerfen der resultierenden Trehaloselösung unter eine Säulenchromatographie, benutzend eine Säule eines stark sauren Kationenaustauschers.
  11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei die Maltose hergestellt wird, indem es der β-Amylase ermöglicht wird, auf eine Lösung stärkehaltiger Substanz zusammen mit oder ohne ein stärkespaltendes Enzym einzuwirken.
  12. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Trehalose wasserhaltige kristalline Trehalose oder wasserfreie kristalline Trehalose ist.
  13. Ein Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts, enthaltend: (a) Herstellen einer Saccharid-Zusammensetzung durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8; und (b) Einbringen der Saccharid-Zusammensetzug in ein Nahrungsmittelprodukt.
  14. Ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, enthaltend: (a) Herstellen einer Saccharid-Zusammensetzung durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8; und (b) Einbringen der Saccharid-Zusammensetzung in eine kosmetische Zusammensetzung.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend: (a) Herstellen einer Saccharid-Zusammensetzung durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8; und (b) Einbringen der Saccharid-Zusammensetzung in eine pharmazeutische Zusammensetzung.
  16. Ein Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts, enthaltend: (a) Herstellen von Trehalose durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12; und (b) Einbringen der Trehalose in ein Nahrungsmittelprodukt.
  17. Ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, enthaltend: (a) Herstellen von Trehalose durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12; und (b) Einbringen der Trehalose in eine kosmetische Zusammensetzung.
  18. Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend: (a) Herstellen von Trehalose durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12; und (b) Einbringen der Trehalose in eine pharmazeutische Zusammensetzung.
  19. Ein Verfahren gemäß Anspruch 13 oder Anspruch 18, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine energieergänzende Zusammensetzung ist, die zur Energieergänzung für Lebewesen benutzt werden kann.
  20. Verwendung eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Energieergänzung für Lebewesen.
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