DE69528019T9 - Nicht reduzierendes Saccharid, seine Herstellung und seine Verwendung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf nichtreduzierendes Saccharid und seine Produktion und Verwendung, insbesondere auf nichtreduzierende Saccharide einschließlich Trehalose und nichtreduzierenden Sacchariden, die an ihren Enden oder innerhalb ihrer Moleküle Trehalosestrukturen tragen, auf ein Verfahren zur Herstellung derselben aus Stärke und auf eine Zusammensetzung, die solch ein nichtreduzierendes Saccharid oder ein dasselbe enthaltende weniger reduzierendes Saccharid enthält.
  • Seit alters her ist Trehalose (alpha, alpha-Trehalose) als ein aus Glucose zusammengesetztes nichtreduzierendes Saccharid bekannt und läßt sich, wie in Advances in Carbohydrate Chemistry, veröffentlicht von Academic Press Inc., New York, New York, USA, Band 18, S. 201–225 (1963) und Applied and Environmental Microbiology, Band 56, S. 3.213–3.215 (1990) beschrieben, zwar nur in Spuren, aber in weit verbreiteter Form in Mikroorganismen, Pilzen und Insekten finden. Da nichtreduzierende Saccharide, wie auch Trehalose, keine Aminocarbonylreaktionen mit Substanzen hervorrufen, die Aminogruppen wie z. B. Aminosäuren und Proteine tragen, und diese daher weder abbauen noch verändern, wurden die Saccharide als nützlich bei der Nutzung und Verarbeitung solcher Substanzen angesehen, ohne daß man ihr Braunwerden und ihren Abbau fürchten muß: Somit wurden große Erwartungen in die Etablierung von Verfahren gesetzt, die ihre großtechnische Produktion ermöglichen würden.
  • Aus den Patents Abstracts of Japan, C Field 13(3), 1989, 5150 K557 und JP-A-63 216 492 ist ein Verfahren zur Herstellung einer Neotrehalose enthaltenden Zusammensetzung bekannt.
  • Aus WO 92/07947 ist eine Vorgehensweise zur Nachbehandlung einer Oligosaccharidmischung bekannt, wobei man Glucoamylase und/oder Hefe auf eine Oligosaccharidmischung einwirken läßt, die dadurch erhalten wurde, daß man Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase auf Stärke in Gegenwart eines Akzeptorzuckers einwirken ließ. Trehalose ist als ein Akzeptorzucker offenbart.
  • Es sind mehrere Verfahren zur Herstellung von Trehalose bekannt, beispielsweise solche, die Zellen von Mikroorganismen verwenden, wie in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 154,485/75 offenbart, und solche, die Maltose durch eine Kombination von Maltosephosphorylase und Trehalosephosphorylase umwandeln. Das erstere Verfahren mit Zellen von Mikroorganismen ist jedoch für ein großtechnisches Verfahren unzureichend, weil der Trehalosegehalt in Zellen von Mikroorganismen als Ausgangsmaterial im allgemeinen niedrig ist, d. h. weniger als 15% (w/w) (die im folgenden auftretenden Prozentangaben bedeuten, wenn nicht anders angegeben, „% (w/w)", und die Extraktions- und Reinigungsschritte für Trehalose sind sehr aufwending. Dahingegen wurde das letztere Verfahren mit Maltosephosphorylase und Trehalosephosphorylase aufgrund der Schwächen, daß nämlich beide Enzyme gewöhnlicherweise über Glucose-1-phosphat wirken und dies erhöhte Substratkonzentrationen verhindert, daß die Trehaloseausbeute niedrig ist, da beide Enzyme im gleichen Reaktionssystem irreversibel wirken, und daß weiterhin ein solches Reaktionssystem nur unter sehr großen Schwierigkeiten stabil aufrechtzuerhalten und reibungslos durchzuführen ist, nicht im großtechnischen Maßstab realisiert.
  • In diesem Zusammenhang wird im Gekkan Food Chemical (Monthly Food Chemical), „Recent Aspects and Issues in Utilization and Development of Starch", August, S. 67–72 (1992) unter der Rubrik „Oligosaccharide" angemerkt, daß, obwohl Trehalose sehr weit verbreitete Anwendungen finden würde, seine enzymatische Herstellung unter Verwendung von beliebigen direkten, Saccharid übertragenden oder hydrolysierenden Reaktionen zum gegenwärtigen Zeitpunkt als wissenschaftlich unmöglich angesehen wird, wodurch sich bestätigt, daß die Herstellung von Trehalose aus Stärke als Material unter Verwendung enzymatischer Reaktionen als wissenschaftlich unmöglich angesehen wird.
  • Bekanntermaßen zeigen partielle Stärkehydrolysate, zum Beispiel verflüssigte Stärke, Dextrine und Maltooligosaccharide, die allesamt aus Stärke hergestellt werden, im allgemeinen Reduktionspotential wegen der reduzierenden Endgruppen in ihren Molekülen. Solch ein partielles Stärkehydrolysat wird in dieser Patentschrift als „reduzierendes partielles Stärkehydrolysat" bezeichnet. Das Reduktionspotential reduzierender partieller Stärkehydrolysate ist auf trockenen Feststoff bezogen und wird gewöhnlich als „Dextroseäquivalent" oder „DE" ausgedrückt. Es ist ebenfalls bekannt, daß reduzierende partielle Stärkehydrolysate mit höheren DE-Werten, bei denen es sich im allgemeinen um kleine Moleküle handelt, niedrige Viskositäten und starkes Süßstoffpotential zeigen und ebenso hochreaktiv gegenüber Substanzen mit Aminogruppen, wie z. B. Aminosäuren und Proteinen, sind, wodurch die Aminocarbonylreaktion hervorgerufen wird, die zum Braunwerden, zu unangenehmem Geruch und zum Abbau führen.
  • Die Eigenschaften reduzierender partieller Stärkehydrolysate variieren in Abhängigkeit von der Größe ihrer DE, und daher ist die Beziehung zwischen bestimmten reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten und ihren DE-Werten sehr wichtig. Man hat es in Fachkreisen jedoch für unmöglich gehalten, diese Beziehung zu unterbrechen.
  • Die einzige Methode zur Unterbrechung der Beziehung besteht darin, reduzierende partielle Stärkehydrolysate in nichtreduzierende Saccharide zu verwandeln, indem beispielsweise ihre reduzierenden Gruppen über Hochdruckhydrierung in Alkoholgruppen umgewandelt werden. Dieses Verfahren erfordert jedoch Hochdruckautoklaven, Sicherheitseinrichtungen und eine sorgfältige Kontrolle zur Vermeidung von Unglücken und ebenso den Verbrauch großer Mengen an Wasserstoff und Energie. Weiterhin unterscheiden sich die erhaltenen Saccharidalkohole von den reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten dahingehend, daß reduzierende partielle Stärkehydrolysate aus Glucoseanteilen bestehen, während die Saccharidalkohole aus Glucose und Sorbit bestehen, wodurch eine vorübergehende Verdauungsstörung und Durchfall ausgelöst werden können. Daher besteht eine große Nachfrage darin, Verfahren einzuführen, durch die das Reduktionspotential reduzierender partieller Stärkehydrolysate verringert oder sogar eliminiert wird, ohne die Glucoseanteile, aus denen sich die reduzierenden Stärkehydrolysate zusammensetzen, zu verändern.
  • Zur Lösung dieser [Lakuna] wird von den Erfindern dieser Anmeldung in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. JP-A-143,876/95 ein neuartiges, nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym (im folgenden als „nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym" bezeichnet) offenbart, das dazu in der Lage ist, nichtreduzierende Saccharide, die an ihren Enden Trehalosestrukturen tragen, aus einem oder mehreren reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten mit Glucosepolymerisationsgrad 3 oder höher zu bilden, womit nichtreduzierende Saccharide, die an ihren molekularen Enden Trehalosestrukturen tragen, und weniger reduzierende Saccharide, die dieselbigen enthalten, eingeführt werden und somit ebenso ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose aus diesen Sacchariden unter Verwendung des nichtreduzierenden Saccharid bildenden Enzyms eingeführt wird.
  • Später entdeckte man jedoch, daß die mit diesem Verfahren erhaltenen nichtreduzierenden Saccharide zwar weniger Reduktionspotential, aber etwas zu hohe Viskosität besaßen, wenn es sich bei den reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten als Ausgangsmaterial um relativ große Moleküle handelte, während eine unzureichende Abnahme des Reduktionspotentials erhalten wurde, wenn es sich bei den reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten um relativ kleine Moleküle handelte. Man entdeckte ebenfalls, daß die Trehaloseproduktion, wobei die somit erhaltenen nichtreduzierenden Saccharide Glucoamylase ausgesetzt wurden, eine zu niedrige Ausbeute, bezogen auf Stärke als Material, aufwies, um die großtechnische Produktion von Trehalose zu ermöglichen. Um diese zu verbessern, bestand ein großer Bedarf an der Einführung von Verfahren, die wesentlich kleinere nichtreduzierende Saccharide aus reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten bei höheren Ausbeuten ergeben würden.
  • Während von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung in der japanischen Patentschrift Nr. JP-A-213,283/95 ein neuartiges Trehalose freisetzendes Enzym (im folgenden als „Trehalose freisetzendes Enzym" bezeichnet), welches die Verknüpfungen zwischen den Trehaloseanteilen und anderen Anteilen in nichtreduzierenden Sacchariden mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder höher spezifisch hydrolysiert, offenbart wird, wird gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose mit einer relativ hohen Ausbeute eingeführt, wobei das nichtreduzierende Saccharid bildende Enzym und das Trehalose freisetzende Enzym kombiniert verwendet werden. Um Trehalose im großtechnischen Maßstab zu produzieren, wurden große Erwartungen in die Einführung von Verfahren gesetzt, die eine verbesserte Trehaloseausbeute liefern würden.
  • In der europäischen Patentschrift Nr. EP 0688866 A1 , die nach Artikel 54(3) EPC, die Teil des Standes der Technik bildet, werden ein temperaturstabiles Trehalose freisetzendes Enzym und seine Herstellungen und Verwendungen offenbart.
  • Ein temperaturstabiles, nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym, seine Herstellung und Verwendungen werden in der europäischen Patentschrift Nr. EP 06988867A2, die Teil des Standes der Technik nach Artikel 54(3) EPC bildet, offenbart.
  • In der vorliegenden Erfindung geht es darum, ein Verfahren zur Herstellung von nichtreduzierenden Sacchariden und dieselbigen enthaltenden weniger reduzierenden Sacchariden, einschließlich relativ kleiner nichtreduzierender Saccharide, die an ihren Enden Trehalosestrukturen (im folgenden als „alpha-Glycosyltrehalose" bezeichnet) tragen, nichtreduzierender Saccharide, die in ihrem Molekül an beiden Enden Trehalosestrukturen tragen, oder anders ausgedrückt, solcher Saccharide, die innerhalb ihrer Moleküle Trehalosestrukturen (im folgenden als „alpha-Glycosyl-alpha-Glycosid" bezeichnet) und Trehalose tragen, aus Stärke als kostengünstiges und ständig verfügbares Material bei erhöhten Ausbeuten einzuführen, ebenso wie für ihre Verwendung zu sorgen.
  • Zur Lösung dieser Aufgaben haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung große Anstrengungen unternommen, verschiedene Verfahren zur Herstellung nichtreduzierender Saccharide mit Stärke als Material zu untersuchen. Als Ergebnis wurde von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung herausgefunden, daß die Aufgaben durch ein Verfahren gelöst werden, bei dem Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase kombiniert verwendet werden, wenn eine Lösung aus verflüssigter Stärke entweder nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym oder nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym ausgesetzt wird. Somit wurde von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung die vorliegende Erfindung verwirklicht.
  • Insbesondere wurde entdeckt, daß bei der Herstellung von alpha-Glycosyltrehalosen oder von diese enthaltenden weniger reduzierenden Sacchariden, wobei eine Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem relativ niedrigen DE-Wert, wünschenswerterweise mit einem DE-Wert von weniger als 15, nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym ausgesetzt wird, weniger reduzierende Saccharide, die nichtreduzierende Saccharide enthalten, die man erhält, indem sie zusätzlich Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase ausgesetzt werden, ein niedrigeres Molekulargewicht und eine niedrigere Viskosität aufwiesen und leichter handhabbar waren, ohne daß sich das Reduktionspotential wesentlich verringerte, als wenn sie nur nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym ausgesetzt wurden. Ebenso stellte sich heraus, daß, nachdem die weniger reduzierenden Saccharide Glucoamylase ausgesetzt worden waren, die Trehalosegehalte in ihren Strukturen stark erhöht waren. Es ergab sich weiterhin, daß bei der Herstellung von Trehalose, wobei eine Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem relativ niedrigen DE-Wert, wünschenswerterweise einem DE-Wert von weniger als 15, nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym ausgesetzt wurde, die Ausbeute an Trehalose wesentlich verbessert wurde, indem die Lösung zusätzlich Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase ausgesetzt wurde, als wenn sie nur nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym ausgesetzt wurde. Die somit erhaltenen nichtreduzierenden Saccharide und diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide haben eine hohe Stabilität, sind leicht handhabbar und daher für ausgedehnte Anwendungen geeignet, zum Beispiel in einer Vielfalt von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmitteln, Kosmetika und Medikamenten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines nichtreduzierenden Saccharids oder einer dasselbige enthaltenden Zusammensetzung zur Verfügung, wobei das nichtreduzierende Saccharid durch die allgemeine Formel Gn-T, worin G, n bzw. T Glucose, eine ganze Zahl größergleich 1 bzw. Trehalose bedeuten, dargestellt ist, wobei das Verfahren
    • A die Behandlung einer 20–50% (w/w) Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem DE-Wert von weniger als 15 mit:
    • (a) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym zusammen mit (i) Stärkeentzweigungsenzym und/oder (ii) Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase; oder mit
    • (b) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym zusammen mit (i) und/oder (ii); und
    • B das Sammeln des nichtreduzierenden Saccharids oder einer das nichtreduzierende Saccharid enthaltenden Zusammensetzung umfaßt.
  • Im folgenden wird die Erfindung ausschließlich beispielhaft mit Bezug auf die Zeichnungen erläutert, wobei:
  • 1 den Temperatureffekt auf die Aktivität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms zeigt.
  • 2 zeigt den pH-Effekt auf die Aktivität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 3 zeigt die Temperaturstabilität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 4 zeigt die pH-Stabilität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 5 zeigt den Temperatureffekt auf die Aktivität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 6 zeigt den pH-Effekt auf die Aktivität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 7 zeigt die Temperaturstabilität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 8 zeigt die pH-Stabilität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms.
  • 9 zeigt die Elutionsmuster auf DEAE TOYOPEARL für die beiden erfindungsgemäßen Enzyme Trehalose freisetzendes Enzym und nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym.
  • 10 zeigt den Temperatureffekt auf die Aktivität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 11 zeigt den pH-Effekt auf die Aktivität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 12 zeigt die Temperaturstabilität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 13 zeigt die pH-Stabilität des aus der Rhizobium-Spezies M-11 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 14 zeigt den Temperatureffekt auf die Aktivität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 15 zeigt den pH-Effekt auf die Aktivität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 16 zeigt die Temperaturstabilität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • 17 zeigt die pH-Stabilität des aus der Arthrobacter-Spezies Q36 stammenden Trehalose freisetzenden Enzyms.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Erstens handelt es sich bei den in der vorliegenden Erfindung geeigneten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzymen um solche Enzyme, die in der Lage sind, alpha-Glycosyltrehalosen aus einem oder mehreren reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher in Lösungen aus Stärke, die auf einen relativ niedrigen DE-Wert verflüssigt worden ist, zu bilden: Beispiele für ein solches Enzym sind die aus Mikroorganismen der Gattungen Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium, Flabobacterium, Micrococcus, Curtobacterium, Mycobacterium und Terrabacter stammenden Enzyme, die in der japanischen Patentschrift Nr. JP-A-143,876/95 offenbart sind. Gegebenenfalls lassen sich hitzebeständige nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzyme, beispielsweise diejenigen der Gattung Sulfolobus, wie vom gleichen Anmelder in der japanischen Patentschrift Nr. JP-A-66,188/96 veröffentlicht, willkürlich einsetzen. Dagegen handelt es sich bei den Trehalose freisetzenden Enzymen um solche, die die Verknüpfungen zwischen den Trehaloseanteilen und den anderen Anteilen in alpha-Glycosyltrehalosen, die dadurch gebildet wurden, daß man eine Lösung aus verflüssigter Stärke nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym aussetzte, spezifisch hydrolysieren: Beispiele für ein solches Enzym sind die aus den Gattugen Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium und Micrococcus stammenden Enzyme, die alle in der japanischen Patentschrift Nr. JP-A-213,283/95 offenbart sind.
  • Gegebenenfalls lassen sich hitzebeständige Trehalose freisetzende Enzyme, beispielsweise die vom gleichen Anmelder in der japanischen Patentschrift Nr. JP-A-66,187/96 offenbarten, willkürlich einsetzen. Zur Herstellung von nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und/oder Trehalose freisetzendem Enzym werden zur Herstellung jeweils eines der beiden Enzyme befähigte Mikroorganismen kultiviert.
  • Eine solche Kultivierung wird auf synthetischen oder natürlichen Kulturmedien durchgeführt, auf denen der gewünschte Mikroorganismus wachsen und nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und/oder Trehalose freisetzendes Enzym bilden kann. Bei den Kohlenstoffquellen handelt es sich um Substanzen, die sich von solch einem Mikroorganismus assimilieren lassen, einschließlich Sacchariden, beispielsweise Glucose, Fructose, Lactose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Zuckersirup und reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten, sowie organischen Säuren und ihren Salzen, beispielsweise Citronensäure, Bernsteinsäure und ihren Salzen. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle in den Kulturmedien wird je nach den Arten der jeweiligen Kohlenstoffquellen willkürlich gewählt. So betragen beispielsweise im Fall der reduzierenden partiellen Stärkehydrolysate bevorzugte Konzentrationen gewöhnlich 20% oder weniger, vorzugsweise 5% oder weniger, im Hinblick auf Wachstum und Vermehrung der Mikroorganismen. Beispiele für Stickstoffquellen sind anorganische Salze wie Ammoniumsalze und Nitrate und organische Stickstoffverbindungen wie Harnstoff, Maisquellwasser, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Bei den Mineralien handelt es sich beispielsweise um Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate, Mangansalze, Zinksalze, Eisensalze, Kupfersalze, Molybdänsalze und Cobaltsalze. Gegebenenfalls lassen sich Aminosäuren und Vitamine willkürlich einsetzen.
  • Die Kultivierung wird gewöhnlich unter aeroben Bedingungen bei 4–90°C, wünschenswerterweise 20–37°C, und bei pH 9–10, wünschenswerterweise pH 5–9, durchgeführt. Bei hitzebeständige Enzyme produzierenden Mikroorganismen wird die Temperatur gewöhnlich auf 90–90°C, wünschenswerterweise auf 50–80°C, eingestellt, wohingegen der pH 2–10, wünschenswerterweise 3–9, beträgt. Die Kultivierungsdauer wird so eingestellt, daß sich die Mikroorganismen vermehren können, beispielsweise auf 10–100 Stunden. Für die Sauerstoffkonzentration in den Kulturen gibt es keine spezifischen Limitierungen, aber bevorzugte Konzentrationen liegen gewöhnlich bei 0,5–20 ppm. Zu diesem Zweck kann man in Fermentern Belüftung, Rühren und Sauerstoffzufuhr kontrollieren und/oder den Druck erhöhen. Die Kultivierung läßt sich diskontinuierlich oder kontinuierlich durchführen.
  • Die Mikroorganismen werden wie oben kultiviert und die Enzyme dann gewonnen. Enzymatische Aktivitäten lassen sich sowohl in den Zellen als auch den Kulturüberständen finden und sich daher als Rohenzympräparationen gewinnen, oder man kann ganze intakte Kulturen als Rohenzympräparationen verwenden. Zur Abtrennung der Zellen aus den Kulturen werden herkömmliche Fest/Flüssig-Trennverfahren eingesetzt. So kann man beispielsweise willkürlich zwischen einem Verfahren, in dem die Kulturen einer Trennung durch Zentrifugation unterworfen werden, einem anderen Verfahren, in dem die Kulturen durch Filtration mit vorbeschichteten Filtern getrennt werden, und wiederum einem anderen Verfahren, bei dem Kulturen durch Membranfiltration mit einfachen Membranen und Hohlfasern getrennt werden, wählen. Zellfreie Flüssigkeiten lassen sich intakt als Rohenzympräparationen verwenden, werden aber gewöhnlich vor Gebrauch konzentriert. Die Konzentration läßt sich beispielsweise mit dem Ammoniumsulfatfällungsverfahren, dem Aceton/Alkohol-Fällungsverfahren und durch Membrankonzentration mit einfachen Membranen und Hohlfasern durchführen.
  • Zellfreie Flüssigkeiten und ihre Konzentrate lassen sich in herkömmlicher Weise immobilisieren. Für diese Zwecke werden beispielsweise die Bindung an Ionenaustauscher, die kovalente Bindung oder Adsorption an Harze und Membranen und das Einfangen mit Polymeren eingesetzt. Von den Kulturen abgetrennte Zellen werden entweder intakt als Rohenzympräparationen verwendet oder vor Gebrauch immobilisiert. Die Zellen werden beispielsweise zuerst mit Natriumarginat gemischt und danach in Calciumchloridlösung getaucht und in eine granulierte Form gelatinisiert. Das Granulat läßt sich mit Polyethylenimin oder Glutaraldehyd weiter behandeln. Man kann Enzyme aus Zellen extrahieren und den Extrakt als Rohenzymflüssigkeit verwenden. Dabei werden die Zellen beispielsweise zuerst einem Ultraschallaufschluß, einem mechanischen Aufschluß mit Glaskügelchen und Aluminium oder einem Aufschluß mit der „French Press" zur Extraktion der Enzyme und danach einer Zentrifugationstrennung oder Membranfiltration unterzogen, so daß man eine klare Rohenzymflüssigkeit erhält.
  • Eine solche Enzymflüssigkeit wird entweder intakt verwendet oder weiter in herkömmlicher Weise vor Gebrauch gereinigt. So wird beispielsweise eine Rohenzympräparation aus einer Kultur, die einem Aussalzen mit Ammoniumsulfat und einer Konzentration unterworfen wurde, zunächst dialysiert, danach auf einer Anionenaustauschchromatographiesäule mit „DEAE TOYOPEARL®", auf einer hydrophoben Chromatographiesäule mit „BUTYL TOYOPEARL®" und schließlich über eine Gelfiltrationschromatographie mit „TOYOPEARL® HW-55" gereinigt, wobei es sich bei den genannten Produkten um Produkte der Firma Tosoh Corp., Tokio, Japan, handelt, so daß eine elektrophoretisch homogene Enzympräparation erhalten wird.
  • Die somit erhaltenen nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzyme besitzen im allgemeinen die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    • (1) Wirkung Können alpha-Glycosyltrehalosen aus einem oder mehreren reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher bilden.
    • (2) Molekulargewicht Etwa 76.000–87.000 Dalton auf SDS-Gelelektrophorese.
    • (3) Isoelektrischer Punkt Etwa pI 3,6–4,6 auf Ampholin-Elektrophorese.
    • (4) Temperaturoptimum Um 35–40°C bei einer erlaubten Reaktionszeit von 60 Minuten bei pH 7,0.
    • (5) pH-Optimum Etwa pH 6,4–7,2 bei einer erlaubten Reaktionszeit von 60 Minuten bei 40°C.
    • (6) Temperaturstabilität Stabil bis zu etwa 35–40°C bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei pH 7,0.
    • (7) pH-Stabilität Etwa pH 5,5–11,0 bei einer Inkubationszeit von 16 Stunden bei 25°C.
  • Nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym wird wie folgt getestet: zu 4 ml 25% (w/v) Maltopentaose als Substrat in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) wird 1 ml Enzymflüssigkeit zugegeben, bei 40°C 60 Minuten reagieren gelassen, zum Abbrechen der Reaktion 10 Minuten bei 100°C erhitzt, genau 10fach mit deionisiertem Wasser verdünnt und mit dem Somogyi-Nelson-Verfahren auf Reduktionspotential bestimmt. Als Kontrolle wird eine Enzymflüssigkeit, die durch 10minütiges Erhitzen bei 100°C inaktiviert wurde, in ähnlicher Weise wie oben beschrieben behandelt. Eine Enzymeinheit ist definiert als diejenige Menge an Enzym, die das Reduktionspotential, bezogen auf die Menge an Maltopentaose, unter den obigen Testbedingungen um 1 Mikromol pro Minute erniedrigt.
  • Im Gegensatz dazu besitzen die wie oben erhaltenen Trehalose freisetzenden Enzyme im allgemeinen die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    • (1) Wirkung Können die Verknüpfungen zwischen den Trehaloseanteilen und den anderen Anteilen in alpha-Glycosyltrehalosen spezifisch hydrolysieren.
    • (2) Molekulargewicht Etwa 57.00–68.000 Dalton auf SDS-Gelelektrophorese.
    • (3) Isoelektrischer Punkt Etwa pI 3,3–4,6 auf Ampholin-Elektrophorese.
    • (4) Temperaturoptimum Um 35–45°C bei einer erlaubten Reaktionszeit von 30 Minuten bei pH 7,0.
    • (5) pH-Optimum Etwa pH 6,0–7,5 bei einer erlaubten Reaktionszeit von 30 Minuten bei 40°C.
    • (6) Temperaturstabilität Stabil bis zu etwa 30–45°C bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei pH 7,0.
    • (7) pH-Stabilität Etwa pH 5,0–10,0 bei einer Inkubationszeit von 16 Stunden bei 25°C.
  • Trehalose freisetzendes Enzym wird wie folgt getestet: zu 4 ml 1,25 (w/v) Maltotriosyltrehalose oder alpha-Maltotetraosyl-alpha-D-glucosid als Substrat in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) wird 1 ml Enzymflüssigkeit zugegeben, die Mischung wird danach 30 Minuten bei 40°C reagieren gelassen und dann zum Abbrechen der Reaktion mit Somogyi-Kupferlösung versetzt und mittels des Somogyi-Nelson-Verfahrens auf Reduktionspotential getestet. Als Kontrolle wird eine Enzymflüssigkeit, die durch 10minütiges Erhitzen bei 100°C inaktiviert wurde, in ähnlicher Weise wie oben behandelt. Eine Enzymeinheit ist definiert als diejenige Enzymmenge, die das Reduktionspotential, bezogen auf die Menge an Glucose, unter den obigen Testbedingungen um 1 Mikromol pro Minute erhöht.
  • Die in der vorliegenden Erfindung geeigneten Stärkeentzweigungsenzyme sind solche, die auf eine Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem relativ niedrigen DE-Wert, wünschenswerterweise einem DE-Wert von weniger als 15, einwirken und Verzweigungen in der Stärke hydrolysieren, wobei sich herkömmliche Pullulanase und Isoamylase sowie kommerziell verfügbare Enzympräparationen vorteilhafterweise einsetzen lassen. Dagegen handelt es sich bei der Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase mit Bezug auf die vorliegende Erfindung um ein Enzym, das in einer Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem relativ geringen DE-Wert, wünschenswerterweise mit einem DE-Wert von weniger als 15, wirkt und eine Saccharid-Transferreaktion und Disproportionierung in Stärkesacchariden hervorruft, wobei die aus herkömmlichen Mikroorganismen der Gattungen Bacillus und Klebsiella stammende Enzyme und kommerziell erhältliche Enzympräparationen vorteilhafterweise eingesetzt werden können.
  • Andere Amylasen, insbesondere diejenigen, die auf eine Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem relativ niedrigen DE-Wert einwirken, so daß Oligosaccharide mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher als Hauptprodukte gebildet werden, können zusammen mit dem obenerwähnten Stärkeentzweigungsenzym und/oder mit Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase vorteilhafterweise eingesetzt werden: Zu solchen Amylasen zählen beispielsweise alpha-Amylase, Maltotriose bildende Amylase, Maltotetraose bildende Amylase, Maltopentaose bildende Amylase, Maltohexaose bildende Amylase und Maltoheptaose bildende Amylase.
  • Sowohl oberirdische Stärken wie z. B. Maisstärke, Reisstärke und Weizenstärke, als auch unterirdische Stärken wie z. B. Kartoffelstärke, Süßkartoffelstärke und Tapiokastärke sind für die vorliegende Erfindung geeignet. Zur Verflüssigung solch einer Stärke wird diese gewöhnlich in Wasser, wünschenswerterweise zu 10% oder mehr und noch wünschenswerter zu etwa 20–50%, suspendiert, erhitzt und danach einer mechanischen, enzymatischen oder sauren Verflüssigung unterworfen. Der Verflüssigungsgrad ist relativ gering, insbesondere geringer als 15, vorzugsweise geringer als 10, bezogen auf den DE-Wert. Bei der Verflüssigung mit Säuren wird beispielsweise zuerst Salzsäure, Phosphorsäure oder Oxalsäure verwendet, und danach wird zur Neutralisierung auf den vorgeschriebenen pH Calciumcarbonat, Calciumoxid oder Natriumcarbonat verwendet. Bei der Verflüssigung mit Enzymen sind alpha-Amylasen, insbesondere hitzebeständige verflüssigende alpha-Amylasen, bevorzugt.
  • Um die so erhaltene Lösung aus verflüssigter Stärke entweder nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase oder nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym, Trehalose freisetzendem Enzym und Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase auszusetzen, stellt man den pH und die Temperatur auf solche Werte ein, bei denen diese Enzyme aktiv sind, insbesondere auf pH 4–10, wünschenswerterweise pH 5–8, und auf eine Temperatur von etwa 10–80°C, wünschenswerterweise von etwa 30–70°C. Es gibt jedoch keine Beschränkungen hinsichtlich der Reihenfolge, in der die Enzyme verwendet werden, und die Enzyme werden entweder nacheinander oder gleichzeitig verwendet.
  • Die zu verwendenden Enzymmengen werden je nach den Reaktionsbedingungen, einschließlich Reaktionszeit, willkürlich gewählt: Gegen verflüssigte Stärke in Lösung werden nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und Trehalose freisetzendes Enzym gewöhnlich zu etwa 0,01–100 Einheiten/g Feststoff; Stärkeentzweigungsenzym zu etwa 1–10.000 Einheiten/g Feststoff; und Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase zu etwa 0,05–500 Einheiten/g Feststoff verwendet. Die so erhaltenen weniger reduzierenden Saccharide, die nichtreduzierende Saccharide enthalten, sind dadurch charakterisiert, daß sie große Mengen relativ kleiner alpha-Glycosyltrehalosen oder alpha-Glycosyl-alpha-glycoside oder Trehalosen enthalten, weil Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase auf eine Lösung aus verflüssigter Stärke zusammen mit entweder nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym oder nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym einwirken. Die Bezeichnung „alpha-Glycosyl-alpha-glycosid" schließt alpha-D-Oligoglucosyl-alpha-D-oligoglucoside ein, die von dem Anmelder der vorliegenden Erfindung in der japanischen Patentanmeldung Nr. 54,377/94 offenbart werden.
  • Die Reaktionsmischungen werden in herkömmlicher Weise einer Filtration und Zentrifugation zur Abtrennung unlöslicher Substanzen unterzogen, mit Aktivkohle entfärbt, deionisiert, mit H- und OH-Ionenaustauschern gereinigt und zu sirupartigen Produkten konzentriert. Die Produkte lassen sich gegebenenfalls zu Pulver trocknen. Nichtreduzierende Saccharide des höchstmöglichen Reinheitsgrads lassen sich leicht durch weitere Reinigung der sirupartigen Produkte mit einem oder mehreren Verfahren, beispielsweise Fraktionierung mittels Säulenchromatographien wie z. B. Ionenaustauschsäulenchromatographie, Aktivkohlensäulenchromatographie und Kieselgelsäulenchromatographie, fraktionierter Fällung mit organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohol und Aceton, Trennung unter Verwendung von Membranen mit geeigneten Trennfähigkeiten, fermentativer Behandlung mit Hefe und Alkalibehandlung zur Entfernung oder zum Abbau gegebenenfalls verbliebener reduzierender Saccharide erhalten.
  • Bei der großtechnischen Produktion ist es vorteilhaft, eine Ionenaustauschsäulenchromatographie mit starksauren Kationenaustauschern zu verwenden, z. B. den in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 23,799/83 und 72,598/83 veröffentlichten, um auf diese Weise Saccharidverunreinigungen zu entfernen und auch den Gehalt an gewünschten nichtreduzierenden Sacchariden zu erhöhen. In diesem Fall kann man zwischen dem Festbettverfahren, Wanderbettverfahren und simulierten Wanderbettverfahren frei wählen.
  • Die innerhalb ihrer Moleküle Trehalosestrukturen tragenden nichtreduzierenden Saccharide oder die diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide können gegebenenfalls mit alpha-Glucosidasen oder Amylasen, z. B. alpha-Amylase, beta-Amylase und Glucoamylase, abgebaut werden, um ihr Süßungs- und Reduktionspotential zu kontrollieren und/oder ihre Viskositäten zu verringern und alternativ die verbliebenen reduzierenden Saccharide zu Saccharidalkohole zur Eliminierung ihrer Reduktionspotentiale zu hydrieren.
  • Vor allem Trehalose läßt sich leicht herstellen, indem man die innerhalb ihrer Moleküle Trehalosestrukturen tragenden nichtreduzierenden Saccharide oder die diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide Glucoamylase oder alpha-Glucosidase aussetzt: Nichtreduzierendes Saccharid oder weniger reduzierendes Saccharid wird Glucoamylase oder alpha-Glucosidase ausgesetzt, wobei eine gemischte Lösung aus Trehalose und Glucose entsteht, die dann den obenerwähnten Reinigungsverfahren, z. B. Ionenaustauschsäulenchromatographie, unterzogen wird, um Glucose zu entfernen und ebenfalls trehalosereiche Fraktionen zu gewinnen. Die Fraktionen können gereinigt und zu einem sirupartigen Produkt konzentriert werden, welches weiter zu einem supergesättigten Zustand konzentriert und in kristallines Trehalosehydrat oder wasserfreie kristalline Trehalose kristallisiert werden kann.
  • Zur Herstellung von kristallinem Trehalosehydrat wird beispielsweise eine Flüssigkeit mit hohem Trehalosegehalt, einem Reinheitsgrad von etwa 60% oder höher und einer Konzentration von etwa 65–90% in eine Kristallisationsapparatur gegeben und nach und nach bei einer Temperatur von 95°C oder niedriger, wünschenswerterweise bei 10–90°C, gekühlt, gegebenenfalls in Gegenwart von 0,1–20% Impfkristallen, um einen Zuckerdicksaft, der kristallines Trehalosehydrat enthält, zu gewinnen. In diesem Fall läßt sich vorteilhafterweise ein kontinuierliches Kristallisationsverfahren einsetzen, bei dem Trehalose unter Konzentration im Vakuum kristallisiert wird. Zu den Verfahren, die kristallines Trehalosehydrat oder eine dasselbige enthaltende Saccharidfeststoffmischung aus einem solchen Zuckerdicksaft ergeben, gehören beispielsweise das herkömmliche Kristalltrennungsverfahren, das Blockpulverisierungsverfahren, das Wirbelschichtgranulationsverfahren und das Sprühtrocknungsverfahren.
  • Das Kristalltrennungsverfahren eignet sich zur Herstellung von kristallinem Trehalosehydrat mit einem erhöhten Reinheitsgrad, wobei die Zuckerdicksäfte gewöhnlich einer korbartigen Zentrifuge zugeführt werden, in der sie in kristallines Trehalosehydrat und Mutterlauge getrennt werden, wonach die ersteren Kristalle mit einer minimalen Menge an gekühltem Wasser zum Waschen besprüht werden. Beim Sprühtrocknungsverfahren werden die Zuckerdicksäfte mit einer Konzentration von 70–85% und einem Kristallisationsverhältnis von bis zu 20–60% gewöhnlich durch eine mit einer Hochdruckpumpe kombinierte Düse gesprüht, dann in einem Heißluftstrom bei einer Temperatur, bei der das kristalline Pulver nicht schmilzt, z. B. 60–100°C, getrocknet und in einem Heißluftstrom bei einer Temperatur von 30–60°C etwa 1–20 Stunden gealtert, womit in einfacher Weise nicht oder weniger hygroskopische kristalline Feststoffmischungen erhalten werden. Beim Blockpulverisierungsverfahren werden Zuckerdicksäfte mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 10–20% und einem Kristallisationsverhältnis von bis zu 10–60% gewöhnlich durch etwa 0,1-3tägiges Stehenlassen in Form von Feststoffblöcken kristallisiert, die dann durch Schneiden oder Schaben pulverisiert und getrocknet werden, womit nicht oder weniger hygroskopische kristalline Feststoffmischungen erhalten werden.
  • Im Gegensatz dazu wird zur Herstellung von wasserfreier kristalliner Trehalose kristallines Trehalosehydrat durch Trocknen umgesetzt, und als Alternative wird eine konzentrierte Flüssigkeit mit hohem Trehalosegehalt und einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% gewöhnlich in eine Kristallisationsapparatur gegeben und bei 50–160°C, wünschenswerterweise 80– 140°C, in Gegenwart von Impfkristallen gerührt, um einen Zuckerdicksaft zu erhalten, der dann unter relativ heißen und trockenen Bedingungen durch beispielsweise das Blockpulverisierungsverfahren, das Wirbelschichtgranulationsverfahren und das Sprühtrocknungsverfahren kristallisiert und pulverisiert wird.
  • Die erfindungsgemäßen nichtreduzierenden Saccharide und die diese enthaltenden erfindungsgemäßen weniger reduzierenden Saccharide, die auf diese Weise erhalten werden, verursachen weder Braunwerden und unangenehmen Geruch noch Schäden an anderen Substanzen, insbesondere denjenigen mit Aminosäuren, wie z. B. Aminosäuren, Oligopeptide und Proteine, wenn sie damit gemischt oder verarbeitet werden, weil die Saccharide aufgrund ihrer verringerten Reduktionspotentiale stabil sind. Weiterhin besitzen die Saccharide ein niedriges Reduktionspotential und eine niedrige Viskosität, und die Saccharide mit einem niedrigen durchschnittlichen Glucosepolymerisationsgrad weisen üblicherweise eine leichte Süße von hoher Qualität auf.
  • Weiterhin werden die Saccharide bei oraler Aufnahme verdaut, resorbiert und als Energieeinheit verwendet, da sie durch Amylasen, insbesondere die alpha-Amylase der Bauchspeicheldrüse, zu kleinen nichtreduzierenden Oligosacchariden und kleinen Maltooligosacchariden abgebaut werden, welche wiederum durch alpha-Glucosidase und Enzyme des Dünndarms unter Bildung von Glucose und Trehalose abgebaut werden, wobei Trehalose dann durch Trehalase zu Glucose abgebaut wird. Weiterhin sind die Saccharide auch als Süßstoff mit geringer kariesauslösender Wirkung geeignet, da sie kaum von kariesverursachenden Mikroorganismen fermentiert werden. Die Saccharide besitzen weiterhin auch andere wünschenswerte Eigenschaften, wie z. B. die Fähigkeit zur Osmosekontrolle, die Fähigkeit zur Form- und Glanzgebung, die Fähigkeit, Flüssigkeit zurückzuhalten, Viskosität, die Fähigkeit, die Kristallisation anderer Saccharide zu verhindern, eine verringerte Neigung, fermentiert zu werden, und die Fähigkeit, eine Retrogradation gelatinisierter Stärke zu verhindern.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose läßt sich vorteilhafterweise zur Energiezufuhr für lebende Organismen verwenden, da es leicht metabolisiert und genutzt wird, ohne daß man Toxizität und Nebenwirkungen bei parenteraler Anwendung in der Nährung durch Intubation oder in Infusionsform befürchten muß. Kristalline Produkte mit hohem Trehalosegehalt lassen sich vorteilhafterweise als Tablettenbeschichtungsmittel zusammen mit Bindemitteln wie z. B. Pullulan, Hydroxyethylstärke und Polyvinylpyrrolidon aufgrund der Wirkung von Trehalose als stabilen Süßstoff einsetzen.
  • Weiterhin läßt sich die erfindungsgemäße Trehalose als Feuchthaltemittel, Füllstoff und viskositätsgebendes Mittel in kosmetischer Creme, Haarspülmittel, Lotionsmilch und Gesichtslotion einsetzen: Wird dabei Trehalose zusammen mit anderen Feuchthaltemitteln, wie z. B. Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Glycerin, Sorbit und Polyoxyethylenoleylalkohol, sowie Vitaminen wie z. B. alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure und enzymbehandeltem Rutin verwendet, erhält man vorteilhafterweise Kosmetika mit besonders guten Feuchthalteeigenschaften, die die Fähigkeit besäßen, durch ultraviolette Strahlung verursachte Ausschläge und Sommersprossen zu verhindern und ebenfalls die Haut aufzuhellen.
  • Im Gegensatz dazu läßt sich wasserfreie kristalline Trehalose vorteilhafterweise als Trocknungsmittel für wasserhaltige Substanzen wie z. B. Lebensmittel, Kosmetika, Medikamente sowie deren Materialien und Zwischenprodukte einsetzen, um die Herstellung stabiler Feststoffprodukte von hoher Qualität, einschließlich Pulvern, Granulat und Tabletten, zu erleichtern.
  • So lassen sich das erfindungsgemäße nichtreduzierende Saccharid und das dasselbige enthaltende erfindungsgemäße weniger reduzierende Saccharid vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator, Formgeber und Trocknungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmitteln, Tabak, Zigaretten, Futtermitteln, Kosmetika und Medikamenten, einsetzen.
  • Das erfindungsgemäße nichtreduzierende Saccharid und das dasselbige enthaltende erfindungsgemäße weniger reduzierende Saccharid lassen sich in intakter Form als Süßungsmittel einsetzen. Gegebenenfalls können sie mit einer geeigneten Menge an einem oder mehreren anderen Süßstoffen und/oder Füllstoffen, z. B. Stärkesiruppulver, Glucose, Maltose, Saccharode, isomeriertem Zucker, Honig, Ahornzucker, Isomaltooligosaccharid, Galactooligosaccharid, Fructooligosaccharid, Lactosaccharose, Sorbit, Maltit, Lactit, Dihydrochalcon, Steviosid, alpha-Glycosylsteviosid, Rhebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester, Saccharin, Glycin, Dextrin, Stärke und Lactose, vor Gebrauch vermischt werden.
  • Die erfindungsgemäßen nichtreduzierenden Saccharide und die erfindungsgemäßen diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide können in intakter Form oder gegebenenfalls zusammen mit Füllstoff, Träger und Bindemittel zu gewünschten Formen, z. B. Granulat-, Kugel-, Stäbchen-, Plättchen-, Würfel- und Tablettenform, verarbeitet werden.
  • Die erfindungsgemäßen nichtreduzierenden Saccharide und die erfindungsgemäßen diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide lassen sich vorteilhafterweise dazu verwenden, den Geschmack bzw. die Qualität von Lebensmitteln allgemein zu versüßen bzw. zu verbessern, da sie besonders gut mit einer Vielzahl von Substanzen mit anderen Geschmacksrichtungen, wie z. B. sauer, salzig, herb, lecker und bitter, harmonieren.
  • Beispielsweise lassen sie sich vorteilhafterweise in einer Vielzahl von Würzmitteln einsetzen, wie z. B. Aminosäuren, Peptiden, Sojasoße, Sojasoße in Pulverform, Miso, Miso in Pulverform, „moromi", „hishio", „furikake", Mayonnaise, Dressing, Essig, „sanbaizu", Essig in Pulverform für „sushi", „chuka-no-moto", „tentsuyu", „mentsuyu", Soße, Ketchup, „yakiniku-no-tare", „curry roux", Eintopfbrühe, Suppenbrühe, „dashi-no-moto", Nukleinsäurewürzmittel, Würzmischung, „mirin", „shin-mirin", Haushaltszucker und Zucker für Kaffee.
  • Weiterhin lassen sie sich vorteilhafterweise dazu einsetzen, den Geschmack bzw. die Qualität beispielsweise in einer Vielzahl von Süßwaren japanischer Art zu versüßen bzw. verbessern, wie z. B. in „senbei", „arare", „okoshi", „ame", „manju", „uiro", Bohnenpasten, „yokan", „mizuyokan", „kingyoku", Gelee, „castella" und „amedama"; in Süßigkeiten westlicher Art, wie z. B. süßen Brötchen, Plätzchen, Crackern, Keksen, Kuchen, Pudding, Buttercreme, Vanillecreme, cremegefüllter Blätterteig, Waffeln, Rührkuchen, Berliner, Schokolade, Kaugummi, Karamel und Bonbons; in gefrorenen Desserts wie z. B. Eiscreme und Fruchteis; Sirupe wie z. B. Fruchtkonserven und „kori-mitsu"; Pasten wie z. B. Mehlpaste, Erdnußpaste, Fruchtpaste und Brotaufstrich; in vorbehandelten Früchten und Gemüsen, wie z. B. Konfitüre, Marmelade, Fruchtkonserven und Gemüsekonserven und „toka"; Pickles und eingelegte Produkte, wie z. B. „fukuzin-zuke", „bettara-zuke", „senmai-zuke" und „rakkyo-zuke"; Brühen für eingelegte Produkte, wie z. B. „takuan-zuke-no-moto" und „hakusai-zuke-no-moto"; in Fleischprodukten wie z. B. Schinken und Wurst; Fischprodukten wie z. B. Schinken und Wurst aus Fisch, „kamaboko", „chikuwa" und „tenpura"; Relish wie z. B. „uni-no-shiokara", „ika-no-shiokara", „su-konbu", „saki-surume" und „fugu-no-mirin-boshi"; „tsukudani" wie z. B. diejenigen aus Seetang, „sansai", „surume", kleinen Fischen und Schalentieren; in alltäglichen Gerichten wie z. B. „nimame", Kartoffelsalat und „konbu-maki"; in Milchprodukten wie z. B. Joghurt und Käse; in in Dosen und Flaschen abgefüllten Produkten wie z. B. solchen aus Fisch, Fleisch, Früchten und Gemüsen; in alkoholischen Getränken wie z. B. Sake, künstlichem Sake, Likören und alkoholischen Getränken westlicher Art; in nichtalkoholischen Getränken wie z. B. Kaffee, Tee, Kakao, Fruchtsaft, kohlensäurehaltigen Getränken, Milchsäuregetränk und Getränk mit Milchsäurebakterien; in herkömmlichen Lebensmitteln wie z. B. Puddingmischung, Backmischung, „sokuseki-shiruko" und herkömmlichen Suppen; und in anderen Arten von Lebensmitteln, wie z. B. Kindernahrung, Diätnahrung, Flaschengetränken, Peptidnahrungsmitteln, gekühlten und getrockneten Lebensmitteln.
  • Weiterhin lassen sich die Saccharide auch vorteilhafterweise als Süßstoffe, Geschmacksverbesserer, Geschmackskorrigenzien, Qualitätsverbesserer und Stabilisatoren einsetzen, um die Geschmacksqualitäten von Futtermitteln, z. B. für Haustiere, Geflügel, Honigbienen, Seidenraupen und Fische, zu verbessern. Sie werden ebenfalls vorteilhafterweise in einer Vielzahl von Zusammensetzungen in Fest-, Pasten- oder Flüssigform eingesetzt, wie z. B. Tabak, Zigaretten, Kosmetika und Medikamenten, einschließlich Zahnpflegemitteln, Lippenstiften, Lippencreme, Medikamenten zur innen Anwendung, Tabletten, Lutschtabletten, Lebertrantropfen und Mitteln zur Mundspülung und zum Gurgeln.
  • Zu den Anwendungen als Qualitätsverbesserer oder Stabilisatoren gehören die Anwendungen für eine Vielzahl von bioaktiven Substanzen und gesundheitsfördernden Nahrungsmitteln und diese enthaltenden Medikamenten, deren wirksame Inhaltsstoffe und Aktivitäten leicht inaktiviert werden. Solche bioaktiven Substanzen sind beispielsweise Lymphokine wie z. B. Interferon-alpha, Interferon-beta, Interferongamma, Tumornekrosefaktor-alpha, Tumornekrosefaktorbeta, Makrophagenwanderunginhibitionsfaktor, kolonienstimulierender Faktor, Transferfaktor und Interleukin 2; Hormone wie z. B. Insulin, Wachstumshormon, Prolactin, Erythropoietin und follikel stimulierendes Hormon; biologische Präparationen wie z. B. BCG-Impfstoff, Impfstoff gegen den japanischen Encephalitisvirus, Masernimpfstoff, Impfstoff gegen Kinderlähmung, Pockenimpfstoff, Tetanustoxoid, Trimeresurus-Antitoxin und humanes Immunoglobulin; Antibiotika wie z. B. Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycinsulfat; Vitamine wie z. B. Thiamin, Riboflavin, L-Ascorbinsäure, Lebertran, Carotenoid, Ergosterol und Tocopherol; Enzyme wie z. B. Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, beta-Amylase, Isoamylase, Glucanase und Lactase; Extrakte wie z. B. solche aus Ginseng, Schnappschildkröte, Chlorella, Aloe und Propolis; lebende Mikroorganismen wie z. B. lebende Viren, Milchsäurebakterien und Hefe; und andere Arten bioaktiver Substanzen einschließlich Gelee royale. Somit lassen sich leicht stabile gesundheitsfördernde Nahrungsmittel und Medikamente in flüssiger, Pasten- oder fester Form in hoher Qualität ohne Verlust ihrer Aktivitäten oder wirksamen Inhaltsstoffe herstellen.
  • Das nichtreduzierende Saccharid und das dasselbige enthaltende weniger reduzierende Saccharid werden in solch einer Zusammensetzung mit herkömmlichen Verfahren eingebaut, beispielsweise Mischen, Auflösen, Schmelzen, Einweichen, Permeieren, Ausstreichen, Auftragen, Beschichten, Sprühen, Injizieren, Kristallisieren und Verfestigen, bevor ihre Verarbeitung beendet ist. Die einzubauenden Mengen liegen gewöhnlich bei 0,1% oder höher, wünschenswerterweise bei 1% oder höher.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf mehrere Experimente konkreter erläutert.
  • Zunächst werden nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzyme aus den neuartigen Mikroorganismen Rhizobium-Spezies M-11 und Arthrobacter-Spezies Q36 und danach die Enzyme aus herkömmlichen Mikroorganismen erläutert.
  • Experiment 1
  • Herstellung von nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym aus Rhizobium-Spezies M-11
  • Ein aus 2,0% (w/v) Maltose, 0,5% (w/v) Pepton, 0,1% (w/v) Hefeextrakt, 0,1% (w/v) Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1% (w/v) Kaliumdihydrogenphosphat und Wasser bestehendes Flüssigkulturmedium wurde auf pH 7,0 eingestellt. Kulturmediumaliquots von etwa 100 ml wurden in 500-ml-Kolben verteilt, bei 120°C 20 Minuten zur Sterilisation autoklaviert, abgekühlt, mit einer Impfkultur aus Rhizobium-Spezies M-11 (FERM BP-4130) angeimpft und bei 27°C und 130 UpM 24 Stunden lang zur Gewinnung einer Impfkultur kultiviert.
  • Etwa 20 Liter des gleichen, wie oben beschriebenen Kulturmediums wurden in einen 30-Liter-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 30°C abgekühlt, mit 1% (w/v) Impfkultur angeimpft und etwa 24 Stunden unter Begasung und Schütteln und Beibehaltung von 30°C und einem pH von 6,0–8,0 kultiviert. Die Enzymaktivität in der Kultur betrug etwa 1,5 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde als Probe entnommen und durch Zentrifugation in Zellen und Überstand getrennt, und die Zellen wurden danach in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) im gleichen Volumen wie das der Kulturprobe suspendiert, wonach die Enzymaktivität in der Zellsuspension und dem Überstand bestimmt wurde, wobei sich herausstellte, daß etwa 0,6 Einheiten/ml Enzymaktivität in der Zellsuspension vorlagen, wohingegen der Überstand etwa 0,9 Einheiten/ml enthielt.
  • Experiment 2
  • Reinigung des Enzyms
  • Die in Experiment 1 erhaltene Kultur, etwa 18 Liter, wurde zum Aufschluß der Zellen dem „MINI LABO®", einem Superhochdruck-Zellaufschlußgerät, das von der Firma Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan, vertrieben wird, ausgesetzt. Die entstandene Lösung wurde bei 10.000 UpM 30 Minuten zentrifugiert, so daß etwa 16 Liter eines Überstandes erhalten wurden. Der Überstand wurde mit Ammoniumsulfat zu einem Sättigungsgrad von 0,2 versetzt, 1 Stunde lang bei 4°C stehen gelassen und dann zentrifugiert, und anschließend wurde der Überstand zurückgewonnen.
  • Der Überstand wurde weiter mit Ammoniumsulfat zu einem Sättigungsgrad von 0,6 versetzt, 24 Stunden bei 4°C stehen gelassen und dann zentrifugiert, um das Sediment zu erhalten. Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, gegen eine frisch angesetzte Präparation des gleichen Puffers 24 Stunden dialysiert und zur Entfernung unlöslicher Substanzen zentrifugiert. Die dialysierte Lösung von etwa 360 ml wurde in zwei Teile geteilt, die dann getrennt auf eine Ionenaustauschchromatographiesäule mit 300 ml „DEAE TOYOPEARL®" aufgetragen wurden.
  • Das an „DEAE TOYOPEARL®" adsorbierte gewünschte Enzym wurde davon mit einer frisch angesetzten Präparation des gleichen Puffers, die jedoch zusätzlich Natriumchlorid enthielt, eluiert.
  • Die somit erhaltenen enzymatisch aktiven Fraktionen wurden gegen eine frisch angesetzte Präparation des gleichen Puffers, die jedoch zusätzlich 2 M Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert und danach zur Entfernung unlöslicher Substanzen zentrifugiert, wonach der erhaltene Überstand einer hydrophoben Säulenchromatographie auf 300 ml „BUTYL TOYOPEARL® 650" unterzogen wurde. Das in der Säule adsorbierte Enzym wurde daraus mit einem von 2 M auf 0 M Ammoniumsulfat abnehmenden linearen Gradienten eluiert und danach die enzymatisch aktiven Fraktionen gewonnen. Diese Fraktionen wurden auf eine Gelfiltrationschromatographiesäule mit 300 ml „TOYOPEARL® HW-55" aufgetragen und danach die enzymatisch aktiven Fraktionen gewonnen. Die erhaltenen Werte für die Enzymaktivitäten, spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten in den jeweiligen Reinigungsschritten sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • In den in Tabelle 1 gezeigten Reinigungsschritten wurde die als Eluat aus der Gelfiltration erhaltene Enzympräparation über eine Polyacrylamidgelelektrophorese mit einer Gelkonzentration von 7,5% bestimmt, was eine einzige Proteinbande ergab, wodurch sich bestätigte, daß die erhaltene Enzympräparation elektrophoretisch homogen war und einen hohen Reinheitsgrad aufwies.
  • Tabelle 1
    Figure 00320001
  • Experiment 3
  • Eigenschaften des Enzyms
  • Die in Experiment 2 erhaltene gereinigte Enzympräparation wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit einer Gelkonzentration von 10% unterzogen, und das Molekulargewicht wurde durch Vergleich mit von der Firma Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan, vertriebenen Molekulargewichtsmarkern, die auf dem gleichen Gel elektrophoretisch aufgetrennt worden waren, bestimmt, wobei sich herausstellte, daß das Molekulargewicht des Enzyms etwa 77.000–87.000 Dalton betrug.
  • Die gereinigte Enzympräparation wurde auf einem Polyacrylamidgel mit 2% Ampholine® elektrophoretisch aufgetrennt und danach hinsichtlich der pH-Werte vermessen, wobei sich herausstellte, daß der isoelektrische Punkt des Enzyms bei etwa 3,6–4,6 lag.
  • Temperatur- und pH-Effekte auf die Aktivität des Enzyms wurden gemäß dem Testverfahren untersucht. Es ergaben sich die in 1 gezeigten Ergebnisse für den Temperatureffekt und die in 2 gezeigten Ergebnisse für den pH-Effekt. Das Temperaturoptimum des Enzyms lag bei etwa 40°C bei einer erlaubten Reaktionsdauer von 60 Minuten bei pH 7,0, wohingegen das pH-Optimum bei etwa 7,0 lag, bei einer erlaubten Reaktionsdauer von 60 Minuten bei 40°C. Die Temperaturstabilität des Enzyms wurde durch 60minütige Inkubation des Enzyms in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei unterschiedlichen Temperaturen, Abkühlen mit Wasser und Testen der Restaktivitäten bestimmt. Dagegen wurde die pH-Stabilität durch 16stündige Inkubation bei 25°C in 50 mM Phosphatpuffer mit unterschiedlichen pH-Werten, Einstellen auf pH 7 und Testen der Restenzymaktivitäten bestimmt. Die jeweils erhaltenen Ergebnisse für die Temperaturstabilität sind in 3 und die für die pH-Stabilität in 4 gezeigt. Das Enzym war thermostabil bis zu etwa 40°C und pH-stabil bei etwa pH 6–9.
  • Experiment 4
  • Herstellung von nichtreduzierenden Sacchariden
  • Es wurden 20%ige wäßrige Lösungen von Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose oder Maltoheptaose als Substrat hergestellt, mit 2 Einheiten des in Experiment 2 erhaltenen gereinigten Enzyms pro g Substratfeststoff versetzt, bei 40°C und pH 7,0 48 Stunden reagieren gelassen, deionisiert und auf Reaktionsprodukte über Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit „WAKO BEADS WB-T-330", einem Produkt der Firma Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, analysiert. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde bei Umgebungstemperatur ausgeführt, wobei die Fließrate des Elutionsmittels Wasser 0,5 ml/min betrug und das Differenzrefraktometer „Model RI-8012", vertrieben durch Tosoh Corp., Tokio, Japan, für die Analyse verwendet wurde. Es ergaben sich die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, bestanden die Reaktionsprodukte aus den restlichen Substraten und den neugebildeten Sacchariden PI, PII, PIII, PIV und PV, wobei keine weiteren Saccharide nachgewiesen wurden. Die Ausbeute an Saccharid PI mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 war relativ gering, während sehr hohe Ausbeuten an Sacchariden PII, PIII, PIV und PV mit Glucosepolymerisationsgraden von 4 oder höher, d. h. 85% oder höher, beobachtet wurden. Aus Glucose und Maltose wurden keine Saccharide neu gebildet.
  • Tabelle 2
    Figure 00350001
  • Anmerkung:
  • In der Tabelle sind die aus Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose bzw. Maltoheptaose als Substrat neugebildeten Saccharide durch PI, PII, PIII, PIV bzw. PV dargestellt.
  • Um die neugebildeten Saccharide aus den jeweiligen Reaktionsprodukten aufzureinigen, wurden die Reaktionsprodukte entfärbt, deionisiert, konzentriert und einer Säulenfraktionierung auf „XT-1016", einem stark sauren Natriumkationenaustauscher mit einem Vernetzungsgrad von 4%, vertrieben durch Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, unterworfen. Das Harz wurde in drei mit rostfreiem Stahl ummantelten Säulen mit einem Innendurchmesser von 2,0 cm und einer Länge von 1 m gefüllt, und die Säulen wurden kaskadenförmig angeordnet, mit 5% (v/v), bezogen auf das Harz, Reaktionsprodukt unter Beibehaltung einer Säuleninnentemperatur von 55°C versetzt und zur Fraktionierung mit 55°C warmem Wasser bei SV0,13 durchspült, wonach hochreine Fraktionen mit einem Gehalt an neugebildeten Sacchariden von 97% oder höher gewonnen wurden. Die Fraktionen wurden zu entsprechenden hochreinen Saccharidpräparationen lyophilisiert. Die Ausbeuten von den jeweiligen Substraten betrugen, bezogen auf den trockenen Feststoff, etwa 9% für Saccharid PI, etwa 65% für Saccharid PII, etwa 82% für Saccharid PIII, etwa 80% für Saccharid PIV und etwa 77% für Saccharid PV. Die Reinheitsgrade betrugen 97,5 für Saccharid PI, 98,6 für Saccharid PII, 99,5% für Saccharid PIII, 98,4 für Saccharid PIV und 98,4 für Saccharid PV.
  • Das Reduktionspotential der hochreinen Präparationen der neugebildeten Saccharide wurden mit dem Somogyi-Nelson-Verfahren bestimmt und ist als DE-Wert dargestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 ersichtlich ist, wurden in allen Präparationen Spuren von Reduktionspotential nachgewiesen. Diese Spuren an Reduktionspotential könnten von den möglicherweise in den Präparationen noch vorhandenen Rückständen an reduzierenden Maltooligosacchariden aus den Substraten herrühren, wobei dann alle neugebildeten Saccharide im wesentlichen nichtreduzierend wären.
  • Tabelle 3
    Figure 00370001
  • Experiment 5
  • Maillard-Reaktion
  • Lösungen aus 10% in Experiment 4 hergestellter Saccharidpräparation PI, PII, PIII, PIV oder PV und 1% Glycin in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) wurden 90 Minuten bei 100°C inkubiert, abgekühlt und ihre Absorptionen in einer 1 cm-Küvette bei 480 nm bestimmt. Als Kontrolle wurde die als Ausgangsmaterial eingesetzte Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose bzw. Maltoheptaose in ähnlicher Weise wie oben behandelt und die Absorption bei 480 nm bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00380001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 ersichtlich ist, zeigten die Präparationen der neugebildeten Saccharide PI, PII, PIII, PIV bzw. PV sehr niedrige Färbungsgrade in der Maillard-Reaktion, die nur bis zu 3–6% der Färbungsgrade für Maltooligosaccharide als Material betrugen, wodurch sich bestätigte, daß die durch das erfindungsgemäße neuartige Enzym neugebildeten Saccharide kaum eine Maillard-Reaktion hervorriefen.
  • Experiment 6
  • Enzymatische Hydrolyse durch Glucoamylase
  • 50 Milligramm der in Experiment 4 hergestellten nichtreduzierenden Saccharidpräparation PI, PII, PIII, PIV oder PV wurden in 1 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 4,5) gelöst, mit einer Einheit der von der Firma Seikagaku Corp., Tokio, Japan, vertriebenen Glucoamylase versetzt, 6 Stunden zur enzymatischen Hydrolyse bei 40°C inkubiert und dann auf Abbauprodukte mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert und somit Glucose und Trehalose als alleinige Produkte nachgewiesen. Die erhaltenen Glucosegehalte, Trehalosegehalte sowie deren molare Verhältnisse sind in Tabelle 5 angegeben.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 ersichtlich ist, wurde das nichtreduzierende Saccharid PI durch Glucoamylase zu einem Glucosemolekül und einem Trehalosemolekül; das nichtreduzierende Saccharid PII zu zwei Glucosemolekülen und einem Trehalosemolekül; das nichtreduzierende Saccharid PIII zu drei Glucosemolekülen und einem Trehalosemolekül; das nichtreduzierende Saccharid PIV zu vier Glucosemolekülen und einem Trehalosemolekül; das nichtreduzierende Saccharid PV zu fünf Glucosemolekülen und einem Trehalosemolekül abgebaut.
  • Tabelle 5
    Figure 00400001
  • Unter Berücksichtigung der Reaktionseigenschaften der Glucoamylase besitzen diese Saccharide höchstwahrscheinlich Strukturen, bei denen das Glucosemolekül bzw. die Glucosemoleküle an das Trehalosemolekül über alpha-1,4- oder alpha-1,6-Verknüpfung gebunden ist bzw. sind: Saccharid PI ist ein nichtreduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3, wobei ein Glucosemolekül an ein Trehalosemolekül gebunden ist; Saccharid PII ist ein weiteres nichtreduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 4, wobei zwei Glucosemoleküle an ein Trehalosemolekül gebunden sind; Saccharid PIII ist noch ein weiteres nichtreduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 5, wobei drei Glucosemoleküle an ein Trehalosemolekül gebunden sind; Saccharid PIV ist noch ein weiteres nichtreduzierendes Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 6, wobei vier Glucosemoleküle an ein Trehalosemolekül gebunden sind; und Saccharid PV ist noch ein weiteres nichtreduzierendes Saccharid mit einem Polymerisationsgrad von 7, wobei fünf Glucosemoleküle an ein Trehalosemolekül gebunden sind. Nachdem sie in ähnlicher Weise wie oben beta-Amylase ausgesetzt wurden, wurden die nichtreduzierenden Saccharide PI und PII nicht abgebaut; das nichtreduzierende Saccharid PIII wurde zu einem Maltosemolekül und einem Saccharid-PI-Molekül; das nichtreduzierende Saccharid PIV zu einem Maltosemolekül und einem Saccharid-PII-Molekül; und das nichtreduzierende Saccharid PV zu zwei Maltosemolekülen und einem Saccharid-PI-Molekül abgebaut.
  • Die obigen Hinweise lassen darauf schließen, daß es sich bei der Reaktion durch das erfindungsgemäße nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym um eine Art intramolekulare Umwandlungsreaktion handeln könnte, die weder vom Abbau noch von der Polymerisation von Substraten begleitet wird, anders ausgedrückt, die von keinen Änderungen des Glucosepolymerisationsgrads begleitet wird, und lassen immer darauf schließen, daß es sich bei den von dem nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzym gebildeten nichtreduzierenden Sacchariden PI, PII, PIII, PIV bzw. PV um alpha-Glucosyltrehalose, alpha-Maltosyltrehalose, alpha-Maltotriosyltrehalose, alpha-Maltotetraosyltrehalose bzw. alpha-Maltopentaosyltrehalose handeln könnte, die sich üblicherweise mit der allgemeinen Formel „alpha-Glycosyltrehalose (Gn-T, worin G, n bzw. T einen Glucoserest, eine ganze Zahl größergleich 1 bzw. alpha-Trehalose bedeuten)" darstellen lassen.
  • Experiment 7
  • Abbau durch andere Enzyme
  • Die nichtreduzierenden Saccharidpräparationen PI, PII, PIII, PIV und PV wurden als in Experiment 4 hergestellte Substrate alpha-Amylase aus Schweinepankreas, alpha-Glucosidase aus Reis und dem in Aceton pulverform vorliegenden Enzym aus Rattendünndarm ausgesetzt, wobei es sich bei allen Enzymen um Produkte der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, handelte, und die Abbauprodukte wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf die Saccharidzusammensetzung hin analysiert. Die Reaktion mit alpha-Amylase wurde durchgeführt, indem 10 mg jeweils eines Substrats in 1 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,9) gelöst, mit einer Einheit alpha-Amylase versetzt und 18 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Die Reaktion mit alpha-Glucosidase wurde in ähnlicher Weise wie bei der alpha-Amylase ausgeführt, außer daß 50 mM Acetatpuffer (ph 4,0) verwendet wurde. Im Fall des Enzyms aus Rattendünndarm in Acetonpulverform wurde die Reaktion in ähnlicher Weise wie bei der alpha-Amylase ausgeführt, außer daß 50 mM Maleinsäurepuffer (pH 6,0) verwendet wurde. Die erhaltenen Saccharidzusammensetzungen in den Abbauprodukten von alpha-Amylase, alpha-Glucosidase bzw. dem Enzym aus Rattendünndarm in Acetonpulverform sind in den Tabellen 6, 7 bzw. 8 gezeigt.
  • Tabelle 6
    Figure 00430001
  • Anmerkung:
  • In der Tabelle sind Maltotriose, Maltose bzw. Glucose mit G3, G2 bzw. G1 dargestellt.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 6 ersichtlich ist, wurden die Saccharidpräparationen PI und PII kaum von alpha-Amylase abgebaut, wohingegen die Saccharidpräparationen PIII, PIV und PV von alpha-Amylase zu kleineren Oligosacchariden, d. h. den Sacchariden PI und PII, Maltotriose, Maltose und Glucose, abgebaut wurden.
  • Tabelle 7
    Figure 00440001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabellen 7 und 8 ersichtlich ist, zeigte sich, daß die Saccharidpräparationen PI, PII, PIII, PIV und PV von alpha-Glucosidase und dem Enzym aus Rattendünndarm in Acetonpulverform zu Glucose und Trehalose abgebaut werden können, in Gegensatz zu Glucoamylase in Experiment 6.
  • Tabelle 8
    Figure 00450001
  • Die Reaktionsprodukte von alpha-Glucosidase und dem Enzym aus Rattendünndarm in Acetonpulverform wurden zusätzlich der von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, vertriebenen Trehalase aus Schweineniere 18 Stunden bei pH 5,7 und 37°C ausgesetzt und dann mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf ihre Saccharidzusammensetzung hin analysiert, wobei sich herausstellte, daß in den Saccharidpräparationen PI, PII, PIII, PIV und PV die von alpha-Glucosidase oder dem Enzym aus Rattendünndarm in Acetonpulverform gebildete Trehalose durch die Trehalase zu Glucose abgebaut werden konnte.
  • Wie oben beschrieben,
    • (1) das nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym bildet alpha-Glycosyltrehalosen aus einem oder mehreren reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher, ohne daß dabei deren Glucosepolymerisationsgrade verändert werden.
    • (2) nichtreduzierendes Saccharid PV ergibt nichtreduzierendes Saccharid PII und Maltotriose als Hauptprodukte, wenn es alpha-Amylase ausgesetzt wird, wohingegen nichtreduzierendes Saccharid PII ein Trehalosemolekül und zwei Glucosemoleküle ergibt, wenn es Glucoamylase ausgesetzt wird.
  • Aus diesen Ergebnissen läßt sich schließen, daß das erfindungsgemäße nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym einen vollkommen neuen Wirkungsmechanismus zur Verfügung stellt, wobei die reduzierenden Enden in reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten intramolekular in nichtreduzierende Trehalosestrukturen umgewandelt werden.
  • Experiment 8
  • Akute Toxizität
  • Tests zur akuten Toxizität wurden an den in Experiment 4 hergestellten nichtreduzierenden Saccharidpräparationen PI, PII, PIII, PIV und PV durchgeführt, die 7 Wochen alten dd-Mäusen oral appliziert wurden. Wie das Ergebnis zeigt, handelte es sich bei diesen nichtreduzierenden Sacchariden sehr wahrscheinlich um niedrig toxische Substanzen, und nachdem in Mäusen die höchstmögliche Dosis verabreicht worden war, wurde kein Todesfall unter den Tieren beobachtet. Somit hatten diese Saccharide kurzgesagt einen LD50-Wert von 50 g/kg oder höher.
  • Experiment 9
  • Herstellung von nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym aus Arthrobacter-Spezies Q36
  • Arthrobacter-Spezies Q36 (FERM BP-4316) wurde anstelle von Rhizobium M-11 (FERM BP-4130) in einem Fermenter etwa 72 Stunden ähnlich wie in Experiment 1 kultiviert. Die Aktivität des nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms in der Kultur betrug etwa 1,2 Einheiten/ml. Nach einem ähnlichen Test wie in Experiment 1 betrugen die Enzymaktivitäten in der Zellsuspension bzw. dem Überstand etwa 0,5 Einheiten/ml bzw. etwa 0,7 Einheiten/ml.
  • Experiment 10
  • Reinigung des Enzyms
  • Die durch das Verfahren in Experiment 9 erhaltene Kultur, etwa 18 Liter, wurde ähnlich wie in Experiment 2 gereinigt. Die in den jeweiligen Reinigungsschritten erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
  • Nach der Elektrophorese der als Eluat aus der Gelfiltration in den Schritten in Tabelle 9 erhaltenen gereinigten Enzympräparation, die zur Bestimmung ihres Reinheitsgrades ähnlich wie in Experiment 2 durchgeführt wurde, wurde eine einzelne Proteinbande gefunden, was darauf schließen ließ, daß die Enzympräparation elektrophoretisch homogen war und einen hohen Reinheitsgrad aufwies.
  • Tabelle 9
    Figure 00480001
  • Experiment 11
  • Eigenschaften des Enzyms
  • Nach einer ähnlichen Messung wie in Experiment 3 zeigte die in Experiment 10 erhaltene gereinigte Enzympräparation ein Molekulargewicht von 76.000–86.000 Dalton. Nach einer ähnlichen Messung wie in Experiment 3 zeigte die gereinigte Enzympräparation einen isoelektrischen Punkt von etwa pI 3,6–4,6. Die Temperatur- und pH-Effekte auf die Enzymaktivität sowie die Temperatur- und pH-Stabilität wurden in ähnlicher Weise wie in Experiment 3 getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind für den Temperatureffekt in 5, für den pH-Effekt in 6, für die Temperaturstabilität in 7 und für die pH-Stabilität in 8 gezeigt.
  • Wie aus diesen Abbildungen ersichtlich ist, lag das Temperatur- bzw. pH-Optimum des Enzyms bei etwa 40°C bzw. etwa 6,5–7,0. Das Enzym war thermostabil bis zu etwa 40°C, wohingegen die pH-Stabilität bei etwa 6,0–9,5 lag.
  • Experiment 12
  • Herstellung nichtreduzierender Saccharide
  • Nachdem die in Experiment 10 erhaltene Enzympräparation hinsichtlich der Bildung nichtreduzierender Saccharide und der Bestätigung von deren Strukturen gemäß den Verfahren in Experimenten 4 und 6 getestet worden war, ergab sich, daß das Enzym, in ähnlicher Weise wie das aus Rhizobium-Spezies M-11 stammende nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym, alpha-Glycosyltrehalosen aus einem oder mehreren reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten mit einen Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder höher bilden kann.
  • Experiment 13
  • Herstellung und Eigenschaften von nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzymen aus herkömmlichen Mikroorganismen
  • Unter den herkömmlichen Mikroorganismen wurden mehrere, in Tabelle 10 aufgeführte Mikroorganismen, in denen die Produktivität des nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms nachgewiesen worden war, bei 27°C etwa 72 Stunden ähnlich wie in Experiment 1 kultiviert, mit der Ausnahme von Mycobacterium smegmatis (ATCC19420), das bei einer Temperatur von 37°C kultiviert wurde. Die entstandenen Kulturen von jeweils 18 Litern wurden ähnlich wie in Experiment 2 einem Zellaufschluß unterzogen, und die Überstände wurden mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, dialysiert und zur Gewinnung von Rohenzympräparationen, die danach auf ihre Eigenschaften untersucht wurden, auf eine Ionenaustauschsäule aufgetragen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Nach den Tests für die Bildung nichtreduzierender Saccharide und Bestätigung ihrer Strukturen gemäß dem Verfahren in Experiment 12 ergab sich, daß jedes Enzym alpha-Glycosyltrehalosen aus einem oder mehreren reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher in ähnlicher Weise wie das aus Rhizobium-Spezies M-11 stammende nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym bildete.
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Im folgenden werden zunächst die Trehalose freisetzenden Enzyme aus den neuartigen Mikroorganismen Rhizobium-Spezies M-11 und Arthrobacter-Spezies Q36 und danach die Enzyme aus herkömmlichen Mikroorganismen erläutert.
  • Experiment 14
  • Herstellung von Trehalose freisetzendem Enzym aus Rhizobium-Spezies M-11
  • Ein Flüssigkulturmedium aus 2,0% (w/v) „PINEDEX #4", einem partiellen Stärkehydrolysat, das von der Firma Matsutani Chemical Industry, Co., Ltd., Kyoto, Japan, vertrieben wird, 0,5% (w/v) Pepton, 0,1% (w/v) Hefeextrakt, 0,1% (w/v) Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1% (w/v) Kaliumdihydrogenphosphat und Wasser wurde auf pH 7,0 eingestellt. Das Kulturmedium wurde in Aliquots von etwa 100 ml in 500-ml-Kolben gegeben, bei 120°C 20 Minuten im Autoklaven sterilisiert, abgekühlt, mit einer Impfkultur von Rhizobium-Spezies M-11 (FERM BP-4130) angeimpft und bei 27°C und 130 UpM 24 Stunden kultiviert, um eine Impfkultur zu erhalten.
  • Etwa 20 Liter einer frisch angesetzten Präparation desselben Kulturmediums wurde in einen 30-Liter-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 27°C abgekühlt, mit einem 1% (w/v) Impfkultur angeimpft und etwa 72 Stunden unter Belüften und Rühren und Beibehaltung von 27°C und pH 6,0–8,0 kultiviert.
  • Die Aktivität des nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms in der Kultur betrug etwa 1,5 Einheiten/ml, während die des Trehalose freisetzenden Enzyms etwa 2 Einheiten/ml betrug. Ein Teil der Kultur wurde als Probe entnommen und durch Zentrifugation in Zellen und Überstand getrennt, und die Zellen wurden dann in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, so daß sich das gleiche Volumen wie für die Kulturprobe ergab, und anschließend wurden die Enzymaktivitäten in der Zellsuspension und dem Überstand getestet, wobei sich herausstellte, daß die Zellsuspension etwa 0,6 Einheiten/ml nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und etwa 0,8 Einheiten/ml Trehalose freisetzendes Enzym enthielt, wohingegen der Überstand etwa 0,9 Einheiten/ml nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und etwa 1,2 Einheiten/ml Trehalose freisetzendes Enzym enthielt.
  • Experiment 15
  • Reinigung des Enzyms
  • Eine durch das Verfahren in Experiment 14 erhaltene Kultur von etwa 18 Litern wurde zum Zellaufschluß in einem Superhochdruckzellaufschlußgerät „MINI LABO®" behandelt. Dreißigminütiges Zentrifugieren der entstandenen Suspension bei 10.000 UpM ergab etwa 16 Liter Überstand. Der Überstand wurde danach mit Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 0,2 versetzt, eine Stunde bei 4°C stehengelassen und danach 30 Minuten bei 10.000 UpM zentrifugiert, woraufhin der Überstand gewonnen wurde.
  • Der Überstand wurde weiterhin mit Ammoniumsulfat versetzt, bis sich ein Sättigungsgrad von 0,6 ergab, und wurde dann 24 Stunden bei 4°C stehengelassen und danach zentrifugiert, woraufhin das Sediment gewonnen wurde. Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, gegen eine frisch angesetzte Präparation des gleichen Puffers 24 Stunden dialysiert und zur Entfernung unlöslicher Substanzen zentrifugiert. Die dialysierte Lösung, etwa 360 ml, wurde in zwei Teile geteilt, die dann getrennt auf eine Ionenaustauschchromatographiesäule mit 300 ml „DEAE TOYOPEARL®" aufgetragen wurden.
  • Sowohl das erfindungsgemäße nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym als auch das erfindungsgemäße Trehalose freisetzende Enzym, die beide an „DEAE TOYOPEARL®" adsorbiert worden waren, wurde davon bei unterschiedlichen Natriumchloridkonzentrationen eluiert, indem eine frisch angesetzte Präparation des gleichen Puffers, die jedoch zusätzlich Natriumchlorid enthielt, durch die Säule geleitet wurde. Das erhaltene Muster der Elution von „DEAE TOYOPEARL®" ist in 9 gezeigt. Das nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym bzw. das Trehalose freisetzende Enzym wurde bei Natriumchloridkonzentrationen von etwa 0,2 M bzw. 0,3 M eluiert, und enzymatisch aktive Fraktionen der jeweiligen Enzyme wurden getrennt gewonnen und gereinigt.
  • Die Fraktionen mit dem nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzym wurden gegen eine frisch angesetzte Präparation des gleichen Puffers, die jedoch zusätzlich 2 M Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert, zur Entfernung unlöslicher Substanzen zentrifugiert und auf eine hydrophobe Chromatographiesäule mit 300 ml „BUTYL TOYOPEARL®" aufgetragen. Das adsorbierte Enzym wurde von der Säule mit einem von 2 M auf 0 M abnehmenden linearen Ammoniumsulfatgradienten eluiert, woraufhin enzymatisch aktive Fraktionen gewonnen wurden. Eine nachfolgende Gelfiltrationschromatographie wurde auf 300 ml „TOYOPEARL® HW-55" durchgeführt, und danach Fraktionen mit nichtreduzierendes Saccharid bildender Enzymaktivität gewonnen.
  • Die Reinigung des Trehalose freisetzenden Enzyms wurde wie folgt durchgeführt: „DEAE TOYOPEARL®" eluierte Fraktionen mit Trehalose freisetzender Enzymaktivität wurden gegen eine frisch angesetzte Präparation des gleichen Puffers, die jedoch zusätzlich 2 M Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert und sowohl auf eine hydrophobe als auch auf eine Gelfiltrationschromatographiesäule in ähnlicher Weise wie im Fall des nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms aufgetragen.
  • Die erhalten Enzymaktivitäten, spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten in den jeweiligen Reinigungsschritten sind für das nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym in Tabelle 11 und für das Trehalose freisetzende Enzym in Tabelle 12 gezeigt.
  • Nachdem sowohl das gereinigte nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym als auch das gereinigte Trehalose freisetzende Enzym auf ihren Reinheitsgrad mittels Elektrophorese mit einem 7,5%igen Polyacrylamidgel getestet worden waren, ergaben sie definierte einzelne Proteinbanden, was darauf schließen ließ, daß beide Enzympräparationen elektrophoretisch homogen waren und einen hohen Reinheitsgrad aufwiesen.
  • Tabelle 11
    Figure 00570001
  • Tabelle 12
    Figure 00580001
  • Experiment 16
  • Eigenschaften des Trehalose freisetzenden Enzyms Das durch die Verfahren in Experiment 15 erhaltene gereinigte, Trehalose freisetzende Enzym wurde einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit einer Gelkonzentration von 10% unterzogen und dann mit den von der Firma Japan Bio-Rad Laboratoaries, Tokio, Japan, vertriebenen Molekulargewichtsmarkern, die auf dem gleichen Gel elektrophoretisch aufgetrennt worden waren, verglichen, wobei sich ein Molekulargewicht des Enzyms von etwa 58.000–68.000 Dalton ergab.
  • Die gereinigte Enzympräparation wurde einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Bestimmung des isoelektrischen Punkts ausgesetzt, und die pH-Werte im Gel wurden ermittelt, wobei sich für das Enzym ein isoelektrischer Punkt von etwa 3,3–4,3 ergab.
  • Die Temperatur- und pH-Effekte auf die Enzymaktivität wurden in Übereinstimmung mit den Testverfahren getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind für den Temperatureffekt in 10 und für den pH-Effekt in 11 gezeigt. Das Temperaturoptimum lag bei einer erlaubten Reaktionsdauer von 30 Minuten und pH 7,0 bei etwa 45°C, wohingegen das pH-Optimum bei einer erlaubten Reaktionsdauer von 30 Minuten und 40°C bei etwa 6,0–7,5 lag. Die Temperaturstabilität wurde durch 60minütige Inkubation des Enzyms in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei unterschiedlichen Temperaturen, Abkühlen mit Wasser und Testen der verbliebenen Enzymaktivitäten bestimmt. Im Gegensatz dazu wurde die pH-Stabilität durch 16stündige Inkubation des Enzyms in 50 mM Phosphatpuffer mit unterschiedlichen pH-Werten bei 25°C, Einstellen auf pH 7 und Testen der verbliebenen Enzymaktivitäten bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind für die Temperaturstabilität in 12 und für die pH-Stabilität in 13 gezeigt. Das Enzym war temperaturstabil bis zu etwa 40°C, wohingegen seine pH-Stabilität bei etwa pH 5–10 lag.
  • Experiment 17
  • Herstellung von Trehalose aus alpha-Glycosyltrehalose
  • Alpha-Glycosyltrehalosen wurden als Substrate gemäß dem in der japanischen Patentschrift Nr. JP-A-143,876/95 beschriebenen Verfahren hergestellt. Im einzelnen wurden 20%ige wäßrige Lösungen aus Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose oder Maltoheptaose als reduzierendes partielles Stärkehydrolysat mit 2 Einheiten eines durch das Verfahren in Experiment 15 gewonnenen gereinigten, nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms pro g Substratfeststoff versetzt, und die Mischung wurde bei 40°C und pH 7,0 48 Stunden umgesetzt, zur Inaktivierung erhitzt, dann gefiltert, deionisiert, in herkömmlicher Weise konzentriert und auf eine Ionenaustauschchromatographiesäule mit einem stark sauren Natriumkationenaustauscher „XT-1016" aufgetragen. Das Ionenaustauscherharz wurde in 3 mit rostfreiem Stahl ummantelte Säulen mit einem Innendurchmesser von 2,0 cm und einer Länge von 1 m gefüllt, und die Säulen wurden kaskadenförmig angeordnet, mit 5% (v/v), bezogen auf das Harz, der flüssigen Saccharidreaktionsmischung beladen und zur Fraktionierung mit 55°C warmem Wasser bei SV 0,13 injiziert, wobei die Temperatur in der Säule auf 55°C gehalten wurde, so daß hochreine Präparationen von nichtreduzierenden Sacchariden mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher erhalten wurden. Von diesen hochreinen Präparationen hatte die Glycosyltrehalosepräparation einen Reinheitsgrad von 97,6; die Maltosyltrehalosepräparation einen Reinheitsgrad von 98,6, die Maltotriosyltrehalosepräparation einen Reinheitsgrad von 99,6; die Maltotetraosyltrehalosepräparation einen Reinheitsgrad von 98,3%, und die Maltopentaosyltrehalose einen Reinheitsgrad von 98,1.
  • Tabelle 13
    Figure 00620001
  • Es wurden 20%ige wäßrige Lösungen dieser fünf Arten von nichtreduzierenden Sacchariden oder alpha-Glycosyltrehalosen hergestellt, mit 2 Einheiten des in Experiment 15 gewonnenen gereinigten Trehalose freisetzenden Enzyms pro g Substratfeststoff versetzt, und die Mischung wurde 48 Stunden bei 40°C und pH 7,0 umgesetzt, dann deionisiert und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf „WAKO BEADS WB-T-330" zur Analyse der Reaktionsprodukte unterworfen. Zur Kontrolle wurden Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose in ähnlicher Weise wie oben dem gereinigten Trehalose freisetzenden Enzym ausgesetzt und dann mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 13 ersichtlich ist,
    • (1) hydrolysiert das Trehalose freisetzende Enzym spezifisch die Verknüpfungen zwischen Trehaloseanteilen und Glycosylanteilen in alpha-Glycosyltrehalosen unter Bildung von Trehalose und reduzierenden Sacchariden mit Glucosepolymerisationsgraden von 1 oder höher.
    • (2) Maltooligosaccharide werden in keinster Weise von dem Trehalose freisetzenden Enzym angegriffen.
  • Aus diesen Ergebnissen könnte man schließen, daß das erfindungsgemäße Trehalose freisetzende Enzym einen vollkommen neuartigen Wirkmechanismus zur Verfügung stellt, wobei die Verknüpfungen zwischen den Trehaloseanteilen und den Glycosylanteilen in alpha-Glycosyltrehalosen sehr spezifisch zur Freisetzung von Trehalose hydrolysiert werden.
  • Um Trehalose von den jeweiligen Reaktionsprodukten zu reinigen, wurden diese entfärbt, deionisiert, konzentriert und einer Säulenfraktionierung auf einem stark sauren Natriumkationenaustauscher „TX-1016" unterworfen, woraufhin hochreine Fraktionen mit Trehalosegehalten von 97% oder höher gewonnen wurden. Die Fraktionen wurden dann auf etwa 65% konzentriert und bei 25°C 2 Tage zur Auskristallisation von kristallinem Trehalosehydrat stehengelassen, das dann abgetrennt und im Vakuum getrocknet wurde, so daß eine hochreine Präparation mit einem Trehalosegehalt von 99% oder höher erhalten wurde. Die Ausbeuten gegenüber den jeweiligen Ausgangssubstraten, bezogen auf trockenen Feststoff, waren wie folgt: von Glycosyltrehalose 9,5%, von Maltosyltrehalose 14,9%; von Maltotriosyltrehalose 16,0; von Maltotetraosyltrehalose 18,5; und von Maltopentaosyltrehalose 17,7%. Die erhaltene Trehalose wurde hinsichtlich dem Schmelzpunkt, der Schmelzwärme, dem Drehwert, dem Infrarotabsorptionsspektrum, dem Röntgendiffraktionsmuster des Pulvers und dem Abbau durch die aus Schweineniere stammende und von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, vertriebene Trehalase mit dem als Standard von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, erhältlichen Trehalosereagens verglichen, wobei sich herausstellte, daß die hochreinen Trehalosepräparationen im Test einen Schmelzpunkt von 97,0 ± 0,5°C, eine Schmelzwärme von 57,8 ± 1,2 KJ/mol und einen Drehwert von +182 ± 1° aufwiesen, wobei alle Werte mit den für das Trehalosereagens beobachteten Werten gut übereinstimmten, und ebenso, daß ihre Infrarotspektren und Röntgendiffraktionsmuster des Pulvers ebenfalls mit den Werten für das Trehalosereagens gut übereinstimmten. Weiterhin wurden die hochreinen Trehalosepräparationen durch die aus Schweineniere stammende Trehalase in ähnlicher Weise wie das Trehalosereagens abgebaut. Aus den obigen Ergebnissen wurde ersichtlich, daß es sich bei den durch Inkubieren von alpha-Glycosyltrehalosen mit dem Trehalose freisetzenden Enzym gebildeten Sacchariden um Trehalose handelte.
  • Experiment 18
  • Herstellung von Trehalose aus reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten
  • Ein 5%ige Suspension aus wachsartiger Maisstärke wurde durch Erhitzen gelatinisiert, auf pH 4,5 und 50°C eingestellt, mit 4.000 Einheiten der von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vertriebenen Isoamylase pro g Stärkefeststoff versetzt und 20 Stunden lang umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 120°C 10 Minuten autoklaviert, auf 60°C abgekühlt und danach einer Gelfiltrationschromatographie auf 750 ml „TOYOPEARL® HW-50S", einem Produkt der Firma Tosoh Corp., Tokio, Japan, unterworfen, so daß reduzierende partielle Stärkehydrolysate mit Glucosepolymerisationsgraden von 10–35 erhalten wurden.
  • Die so erhaltenen reduzierenden partiellen Stärkehydrosylate sowie Maltotriose als reduzierendes partielles Stärkehydrolysat mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 wurden auf 1% in 10 mM Phosphatpuffer (ph 7,0) verdünnt, mit dem gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzym und dem gereinigten Trehalose freisetzenden Enzym, die beide durch die Verfahren in Experiment 15 hergestellt wurden, in Mengen von jeweils 4 Einheiten/g Substratfeststoff versetzt, bei 40°C 24 Stunden umgesetzt, in kleine Probenportionen eingeteilt, deionisiert und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf Reaktionsprodukte hin analysiert.
  • Die verbliebenen Reaktionsmischungen wurden auf 50°C und pH 4,5 eingestellt, mit 50 Einheiten der von Seikagaku Corp., Tokio, Japan, vertriebenen Glucoamylase pro g Substratfeststoff versetzt, 24 Stunden lang umgesetzt, in ähnlicher Weise wie oben deionisiert und dann mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf Reaktionsprodukte hin analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt.
  • Wie in Tabelle 14 gezeigt, waren die Trehaloseausbeuten von Maltotriose durch das nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym und das Trehalose freisetzende Enzym niedrig, d. h. 4,2%, wohingegen die reduzierenden partiellen Stärkehydrolysate mit Glucosepolymerisationsgraden von 10–34,1 hohe Ausbeuten zeigten, d. h. 66,1–80,8. Weiterhin stellte sich heraus, daß sich ein höherer TrehaloseReinheitsgrad erzielen ließ, je höher der Glucosepolymerisationsgrad des als Material verwendeten reduzierenden partiellen Stärkehydrolysats war. Ebenso stellte sich heraus, daß der Trehalosereinheitsgrad weiter dadurch erhöht wurde, daß die beiden Enzymen ausgesetzte Reaktionsmischung Glucoamylase ausgesetzt wurde, um die verbliebene alpha-Glycosyltrehalose mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher zu Trehalose und Glucose abzubauen.
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Experiment 19
  • Maillard-Reaktion
  • 10% einer durch das Verfahren in Experiment 17 erhaltenen hochreinen Trehalosepräparation mit einem Reinheitsgrad von 99,5 sowie 1% Glycin wurden in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) 90 Minuten bei 100°C inkubiert, abgekühlt und auf Absorption bei 480 nm in einer 1-cm-Küvette vermessen. Glucose und Maltose wurden als Kontrollen in ähnlicher Weise wie oben behandelt und dann auf Absorption bei 480 nm vermessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt.
  • Tabelle 15
    Figure 00690001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 15 ersichtlich ist, rief die Trehalosepräparation nur Spuren einer Färbung durch die Maillard-Reaktion hervor, wobei diese Färbung nur bis zu 0,4–0,6% der mit Glucose und Maltose gefundenen Färbung betrug, wodurch sich zeigte, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Trehalosepräparation um ein Saccharid handelte, das eine geringere Maillard-Reaktion hervorrufen könnte. Somit verursachte das Saccharid in einer Mischung mit Aminosäuren weniger Schaden an diesen.
  • Experiment 20
  • In-vivo-Assimilationstest
  • Nach dem von Atsuji et al., Rinsho Eiyo (Clinical Nutrition); Bd. 41, Nr. 2, S. 200–208 (1972) beschriebenen Verfahren wurden 30 g einer durch das Verfahren in Experiment 17 erhaltenen hochreinen Trehalosepräparation mit einem Reinheitsgrad von 99,5 in einer 20%igen (w/v) wäßrigen Lösung angesetzt und gesunden Männern im Alter von 26, 27, 28, 29, 30 bzw. 31 Jahren oral verabreicht, woraufhin diesen Männern in regelmäßigen Abständen Blutproben entnommen und hinsichtlich Blutzucker- und Insulinwerten gemessen wurden. Als Kontrolle wurde Glucose verwendet. Es ergab sich, daß sich Trehalose ähnlich zu Glucose verhielt und daß die Blutzucker- und Insulinwerte etwa 0,5–1 Stunde nach Verabreichung Maxima erreichten. Somit wurde bestätigt, daß Trehalose leicht verdaut und resorbiert und danach metabolisiert und als Energiequelle benutzt wurde.
  • Experiment 21
  • Test auf akute Toxizität
  • Ein Test zur akuten Toxizität wurde mit einer durch das Verfahren in Experiment 17 erhaltenen hochreinen Trehalosepräparation mit einem Reinheitsgrad von 99,5 durchgeführt, die dazu Mäusen oral verabreicht wurde. Es ergab sich, daß Trehalose sogar in der höchstmöglichen Dosis keine Todesfälle verursachte. Somit wäre kurz gesagt sein LD50-Wert 50 g/kg oder höher.
  • Experiment 22
  • Herstellung von Trehalose freisetzendem Enzym aus Arthrobacter-Spezies Q36
  • Arthrobacter-Spezies Q36 (FERM BP-4316) wurde anstelle von Rhizobium-Spezies M-11 (FERM BP-4130) in ähnlicher Weise wie in Experiment 14 etwa 72 Stunden in einem Fermenter kultiviert. Die Aktivität von nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym in der Kultur betrug etwa 1,3 Einheiten/ml, während die des erfindungsgemäßen Trehalose freisetzenden Enzyms etwa 1,8 Einheiten/ml betrug. Nachdem die Enzymaktivitäten in der Zellsuspension und dem Überstand in ähnlicher Weise wie in Experiment 14 getestet worden waren, ergab sich, daß die Zellsuspension etwa 0,5 Einheiten/ml nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und etwa 0,5 Einheiten/ml Trehalose freisetzendes Enzym enthielt, wohingegen der Überstand etwa 0,8 Einheiten/ml nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und etwa 1,3 Einheiten/ml Trehalose freisetzendes Enzym enthielt.
  • Experiment 23
  • Reinigung des Enzyms
  • Eine durch das Verfahren in Experiment 22 erhaltene Kultur von etwa 18 Litern wurde ähnlich wie in Experiment 15 gereinigt. Die in den jeweiligen Reinigungsschritten erhaltenen Ergebnisse sind für das nichtreduzierendes Saccharid bildende Enzym in Tabelle 16 und für das Trehalose freisetzende Enzym in Tabelle 17 gezeigt.
  • Tabelle 16
    Figure 00720001
  • Die als Eluate der Gelfiltration in den Schritten in Tabelle 16 und 17 erhaltenen gereinigten Enzyme nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und Trehalose freisetzendes Enzym wurden zur Bestimmung des Reinheitsgrads einer Elektrophorese in ähnlicher Weise wie in Experiment 15 unterzogen, wobei sich herausstellte, daß die Proteinbanden Einzelbanden waren und daß beide gereinigten Enzyme elektrophoretisch homogen waren und einen hohen Reinheitsgrad aufwiesen.
  • Tabelle 17
    Figure 00730001
  • Experiment 24
  • Eigenschaften des Enzyms
  • Nach einer in ähnlicher Weise wie in Experiment 16 durchgeführten Messung mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese betrug das Molekulargewicht eines durch das Verfahren in Experiment 23 erhaltenen gereinigten Trehalose freisetzenden Enzyms etwa 57.000–67.000 Dalton. Ein in ähnlicher Weise wie in Experiment 3 durchgeführter Test zeigte einen isoelektrischen Punkt des Enzyms von etwa 3,6–4,6. Temperatur- und pH-Effekte sowie Temperatur- und pH-Stabilität des Enzyms wurden ähnlich wie in Experiment 16 bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind für den Temperatureffekt in 14, für den pH-Effekt in 15, für die Temperaturstabilität in 16 und für die pH-Stabilität in 17 gezeigt.
  • Wie aus den Abbildungen ersichtlich ist, lag das Temperaturoptimum des Enzyms bei etwa 45°C, wohingegen das pH-Optimum bei etwa 6,0–7,5 lag. Das Enzym war bis etwa 45°C temperaturstabil, während die pH-Stabilität bei etwa pH 5,0–10,0 lag.
  • Experiment 25
  • Herstellung von Trehalose aus alpha-Glycosyltrehalose
  • Ein durch das Verfahren in Experiment 23 erhaltenes gereinigtes Enzym wurde gemäß dem Verfahren in Experiment 17 auf die Bildung von Trehalose aus alpha-Glycosyltrehalosen mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher getestet, wobei sich herausstellte, daß das Enzym Trehalose aus alpha-Glycosyltrehalosen in ähnlicher Weise freisetzte wie das aus Rhizobium-Spezies M-11 stammende Trehalose freisetzende Enzym.
  • Experiment 26
  • Herstellung und Eigenschaften von Trehalose freisetzendem Enzym aus herkömmlichen Mikroorganismen
  • Von den herkömmlichen Mikroorganismen wurden Brevibacterium helobolum (ATCC11822) und Micrococcus roseus (ATCC186), für die die Produktion von erfindungsgemäßem Trehalose freisetzendem Enzym bestätigt worden war, in ähnlicher Weise wie in Experiment 14 bei 27°C 72 Stunden in einem Fermenter kultiviert. Die entsprechenden Kulturen, jeweils etwa 18 Liter, wurden im Zellaufschlußgerät behandelt; und der Überstand wurde durch Zentrifugation gewonnen und einem Aussalzen mit Ammoniumsulfat, einer Dialyse und einer Ionenaustauschsäulenchromatographie, in dieser Reihenfolge, unterworfen, und danach wurden die erhaltenen, teilweise gereinigten Enzympräparationen charakterisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 zusammen mit denjenigen für Rhizobium-Spezies M-11 und Arthrobacter-Spezies Q36 angegeben.
  • Diese aus herkömmlichen Mikroorganismen stammenden, teilweise gereinigten Enzyme wurden weiter gemäß dem Verfahren in Experiment 25 auf die Bildung von Trehalose aus alpha-Glycosyltrehalosen mit Glucosepolymerisationsgraden von 3 oder höher getestet, wobei sich herausstellte, daß sie Trehalose aus alpha-Glycosyltrehalosen in ähnlicher Weise freisetzten wie das aus Rhizobium-Spezies M-11 stammende Trehalose freisetzende Enzym.
  • Figure 00760001
  • Experiment 27
  • Effekte des Stärkeverflüssigungsgrads und der Enzymarten auf die Herstellung von Sacchariden mit hohem Trehalosegehalt
  • Zur Herstellung von Sacchariden mit hohem Trehalosegehalt aus Stärke wurden die Effekte des Stärkeverflüssigungsgrads und von Enzymkombinationen untersucht. Eine 20%ige Maisstärkesuspension wurde auf pH 6,5 durch Zugabe von 0,1% Calciumcarbonat eingestellt, mit 0,1–2,0%, bezogen auf Stärkefeststoff, „TERMAMYL®", einer von Novo Industri AS, Kopenhagen, Dänemark, vertriebenen alpha-Amylase, 15 Minuten bei 95°C umgesetzt und 10 Minuten bei 120°C im Autoklaven gehalten, um verflüssigte Stärkelösungen mit einem DE-Wert von 2,5–20,5 zu erhalten, die unmittelbar danach abgekühlt wurden, mit 5 Einheiten/g Stärkefeststoff eines durch das Verfahren in Experiment 2 hergestellten gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms, 10 Einheiten/g Stärkefeststoff eines durch das Verfahren in Experiment 15 hergestellten gereinigten Trehalose freisetzenden Enzyms zusammen mit 500 Einheiten/g Stärkefeststoff Isoamylase, einer Art Stärkeentzweigungsenzym, und 5 Einheiten/g Stärkefeststoff Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, beides Produkte der Firma Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, versetzt und bei pH 6,0 und 45°C 24 Stunden umgesetzt wurden. Die Reaktionsmischungen wurden 10 Minuten bei 95°C erhitzt, abgekühlt, mit 10 Einheiten/g Stärkefeststoff Glucoamylase versetzt und 10 Stunden bei pH 5,0 umgesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, um die Trehalosegehalte (%) in den entstandenen Sacchariden zu bestimmen. Als Kontrolle wurden frisch angesetzte Präparationen derselben Lösungen von verflüssigter Stärke lediglich dem nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzym und dem Trehalose freisetzenden Enzym in ähnlicher Weise wie oben ausgesetzt und danach mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 19 gezeigt.
  • Tabelle 19
    Figure 00780001
  • Anmerkung:
  • In der Tabelle wird nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym, Trehalose freisetzendes Enzym, Stärkeentzweigungsenzym bzw. Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase durch N, T, D bzw. C dargestellt.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 19 ersichtlich ist, stellte sich heraus, daß Stärken mit relativ niedrigen Verflüssigungsgraden, wünschenswerterweise mit einem DE-Wert von weniger als 15 und noch wünschenswerter mit einem DE-Wert von weniger als 10, zur Herstellung von Sacchariden mit hohem Trehalosegehalt aus Stärken bevorzugt sind. Bezüglich der Enzyme dafür stellte sich heraus, daß eine Kombination aus nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym, Trehalose freisetzendem Enzym und Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase bei der großtechnischen Herstellung von Trehalose aus Stärke sehr vorteilhaft ist, im Gegensatz zu einer Kombination aus nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym, da die erstere Kombination die Trehaloseausbeuten aus Stärke um etwa das 2–4fache erhöht.
  • Die folgenden Beispiele A dienen der Verdeutlichung der Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen nichtreduzierenden Saccharids, des erfindungsgemäßen dasselbige enthaltenden weniger reduzierenden Saccharids und der erfindungsgemäßen Trehalose, wohingegen die Beispiele B Zusammensetzungen, die das nichtreduzierende Saccharid, weniger reduzierende Saccharid und/oder Trehalose enthalten, verdeutlichen sollen.
  • Beispiel A-1
  • Eine etwa 20%ige Suspension aus Kartoffelstärke wurde mit 0,3% Oxalsäure versetzt, autoklaviert, abgekühlt und mit Calciumcarbonat auf pH 6,5 neutralisiert, so daß eine Lösung von verflüssigter Stärke mit einem DE-Wert von etwa 12 erhalten wurde. Die verflüssigte Stärkelösung wurde mit 2 Einheiten/g Stärkefeststoff eines durch das Verfahren in Experiment 2 erhaltenen gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms sowie 300 Einheiten/g Stärkefeststoff der von Hayashibara Biochemical Laboratoreis, Inc., Okayama, Japan, vertriebenen Isoamylase versetzt und 24 Stunden bei 45°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung der Enzyme auf 95°C erhitzt, abgekühlt und gefiltert, und das Filtrat wurde dann mit Aktivkohle entfärbt, mit H- OH-Ionenaustauschern zur Reinigung deionisiert und konzentriert, so daß ein Sirupprodukt mit einer Konzentration von etwa 70% und einer Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Bei dem Produkt handelt es sich um ein weniger reduzierendes Saccharid mit alpha-Glycosyltrehalosen mit einem DE-Wert von etwa 8, das sich vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten einsetzen läßt, da es eine leichte und angenehme Süße, eine relativ niedrige Viskosität und ein angemessenes Feuchthaltevermögen aufweist.
  • Beispiel A-2
  • Eine etwa 25%ige Tapiokastärkesuspension wurde mit 0,2%, bezogen auf Stärkefeststoff, „NEO-SPITASE®", einer von der Firma Nagase Biochemicals, Kyoto, Japan, vertriebenen alpha-Amylase, versetzt, etwa 20 Minuten bei 85–90°C umgesetzt, bei 120°C autoklaviert und direkt danach abgekühlt, so daß eine Lösung von verflüssigter Stärke mit einem DE-Wert von etwa 4 erhalten wurde, die dann mit 5 Einheiten/g Stärkefeststoff eines aus dem Verfahren in Experiment 9 erhaltenen gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms zusammen mit 100 Einheiten/g Stärkefeststoff Pullulanase und 5 Einheiten/g Stärkefeststoff maltotetraosebildenden Enzyms, beides Produkte von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, versetzt und bei pH 6,5 und 40°C 36 Stunden umgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt und dann in ähnlicher Weise wie in Beispiel A-1 gereinigt und zu etwa 60% konzentriert. Um den Gehalt an nichtreduzierendem Saccharid in dem als Ausgangssaccharidflüssigkeit verwendeten entstandenen Konzentrats zu erhöhen, wurde eine Säulenchromatographie auf „XT-1016", einem stark sauren Natrium-Kationenaustauscher, durchgeführt. Das Ionenaustauscherharz wurde in 4 von rostfreiem Stahl ummantelte Säulen mit einem Innendurchmesser von jeweils 5,4 cm gefüllt, die dann kaskadenförmig angeordnet wurden, so daß sich eine Gesamtlänge von 20 m ergab. Unter Beibehaltung einer Säuleninnentemperatur von 55°C, wurden diese mit 5% (v/v), bezogen auf das Harz, Saccharidflüssigkeit versetzt und mit 55°C warmem Wasser bei SV 0,2 injiziert, woraufhin Fraktionen, die nichtreduzierende Saccharide mit Polymerisationsgraden von 4–6 enthielten, gewonnen wurden. Die Fraktionen wurden gereinigt, konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, so daß sich ein Pulverprodukt mit einem hohen Gehalt an nichtreduzierendem Saccharid bei einer Ausbeute von etwa 63%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Bei dem Produkt handelt es sich um ein nichtreduzierendes Saccharid mit alpha-Glycosyltrehalosen mit einem DE-Wert von 5,4, das sich vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten einsetzen läßt, da es eine leichte und angenehme Süße, eine relativ niedrige Viskosität und ein angemessenes Feuchthaltevermögen aufweist.
  • Beispiel A-3
  • Eine etwa 30%ige Maisstärkesuspension wurde mit 0,1% Calciumcarbonat versetzt, auf pH 6,5 eingestellt, mit 0,3%, bezogen auf Stärkefeststoff, „TERMAMYL® 60L", einer von Novo Industri AS, Kopenhagen, Dänemark, vertriebenen alpha-Amylase, versetzt, 15 Minuten bei 95°C umgesetzt, bei 120°C autoklaviert und unmittelbar danach abgekühlt, so daß eine Lösung von verflüssigter Stärke mit einem DE-Wert von etwa 4 erhalten wurde, die dann mit 4 Einheiten/g Stärkefeststoff eines aus dem Verfahren in Experiment 2 erhaltenen gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms zusammen mit 300 Einheiten/g Stärkefeststoff Isoamylase und 5 Einheiten/g Stärkefeststoff Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, beides Produkte der Firma Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, versetzt und 48 Stunden bei pH 6,3 und 45°C umgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten bei 95°C gehalten, dann abgekühlt, mit 10 Einheiten/g Stärkefeststoff Beta-Amylase versetzt und 16 Stunden bei pH 5,5 und 55°C weiter umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, zur Reinigung in herkömmlicher Weise entfärbt und deionisiert und danach konzentriert, so daß ein Sirupprodukt mit einer Konzentration von etwa 70% bei einer Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Bei dem Produkt handelt es sich um ein weniger reduzierendes Saccharid mit nichtreduzierenden Sacchariden wie z. B. alpha-Glycosyltrehalosen und alpha-Glycosyl-alpha-glycosiden, das sich vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten einsetzen läßt, da es eine leichte und angenehme Süße, eine relativ niedrige Viskosität und ein angemessenes Feuchthaltevermögen aufweist.
  • Beispiel A-4
  • Ein durch das Verfahren in Beispiel A-3 erhaltenes Sirupprodukt wurde auf etwa 55% verdünnt und gemäß dem Verfahren in Beispiel A-2 einer Säulenchromatographie auf einem stark sauren Kationenaustauscher auf Salzbasis unterworfen, um den Gehalt an nichtreduzierenden Sacchariden zu erhöhen, und danach wurden Fraktionen mit nichtreduzierenden Sacchariden mit Glucosepolymerisationsgraden von 3–6 gewonnen, gereinigt, konzentriert und sprühgetrocknet, so daß ein Pulverprodukt mit einem hohen Gehalt an nichtreduzierendem Saccharid bei einer Ausbeute von etwa 38%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Bei dem Produkt handelt es sich um ein weniger reduzierendes Saccharid mit großen Mengen an nichtreduzierenden Sacchariden wie z. B. alpha-Glycosyltrehalosen und alpha-Glycosyl-alpha-glycosiden mit einem DE-Wert von 8, das sich vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten einsetzen läßt, da es eine leichte und angenehme Süße, eine relativ niedrige Viskosität und ein angemessenes Feuchthaltevermögen aufweist.
  • Beispiel A-5
  • Eine etwa 30%ige Maisstärkesuspension wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel A-3 alpha-Amylase ausgesetzt, so daß eine verflüssigte Stärkelösung mit DE4 entstand, die dann mit 5 Einheiten/g Stärkefeststoff eines aus dem Verfahren in Experiment 15 erhaltenen gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms sowie 500 Einheiten/g Stärkefeststoff Isoamylase versetzt und bei pH 6,0 und 40°C 48 Stunden umgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung enthielt hinsichtlich der Saccharidzusammensetzung 76,3 Trehalose. Die Reaktionsmischung wurde danach zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt, zur Reinigung in herkömmlicher Weise entfärbt und deionisiert, auf etwa 85% konzentriert, in eine Kristallisationsapparatur gegeben, unter Rühren und allmählichem Abkühlen kristallisiert, auf Plastikwannen verteilt, bei Raumtemperatur 2 Tage lang stehen und bis zur vollständigen Kristallisation altern gelassen, so daß feste blockförmige Produkte erhalten wurden. Diese Produkte wurden dann in eine Zerkleinerungsmaschine gegeben, so daß ein Pulverprodukt aus kristallinem Trehalosehydrat bei einer Ausbeute von 92%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten einsetzen, da es weitgehend nicht hygroskopisch und leicht handhabbar ist.
  • Beispiel A-6
  • Eine etwa 30%ige Tapiokastärkesuspension wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel A-2 alpha-Amylase ausgesetzt, so daß eine verflüssigte Stärkelösung mit DE 5 erhalten wurde, die dann mit 3 Einheiten/g Stärkefeststoff eines durch das Verfahren in Experiment 10 erhaltenen gereinigten nichtreduzierendes Saccharid bildenden Enzyms und 5 Einheiten/g Stärkefeststoff eines durch das Verfahren in Experiment 23 erhaltenen gereinigten Trehalose freisetzenden Enzyms zusammen mit 200 Einheiten/g Stärkefeststoff Pullulanase und 3 Einheiten/g Stärkefeststoff Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase versetzt und 48 Stunden bei pH 6,0 und 45°C umgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung enthielt, bezogen auf trockenen Feststoff, 84,7 Trehalose. Die Reaktionsmischung wurde danach zu Inaktivierung der Enzyme erhitzt, zur Reinigung in herkömmlicher Weise entfärbt und deionisiert und in kontinuierlicher Weise während der Konzentration kristallisiert, und die Kristalle in dem entstandenen Zuckerdicksaft wurden in einer korbartigen Zentrifuge abgetrennt und zum Waschen mit einer Mindestmenge an Wasser besprüht, so daß ein hochreines kristallines Trehalosehydrat bei einer Ausbeute von etwa 55%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Das Produkt, ein kristallines Trehalosehydrat mit einem extrem hohen Reinheitsgrad, läßt sich vorteilhafterweise in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten, ebenso wie als Reagens und Material für großtechnische und chemische Anwendungen einsetzen.
  • Beispiel A-7
  • Eine durch das Verfahren in Beispiel A-6 erhaltene hitzeinaktivierte Reaktionsmischung wurde mit 10 Einheiten/g Substratfeststoff Glucoamylase versetzt und 10 Stunden bei pH 5,0 und 50°C umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, zur Reinigung in herkömmlicher Weise entfärbt und deionisiert, auf etwa 70% konzentriert, in eine Kristallisationsapparatur gegeben und unter Rühren und allmählichem Abkühlen kristallisiert, so daß ein Zuckerdicksaft mit einem Kristallisationsgrad von etwa 40% erhalten wurde. Der Zuckerdicksaft wurde dann mit 150 kg/cm2 durch eine an der Spitze eines Trockenturms befindliche Hochdruckdüse versprüht, unter Zuführung von 85°C heißer Luft von der Spitze des Trockenturms nach unten und Sammeln des entstandenen kristallinen Pulvers auf einer am Boden des Trockenturms befindlichen, aus einem Metallnetz bestehenden Fördereinrichtung. Das kristalline Pulver wurde mit durch die Fördereinrichtung hindurch nach oben zugeführter, 45°C warmer Luft nach und nach bewegt und aus dem Trockenturm nach außen transportiert. Das kristalline Pulver wurde in einen Alterungsturm gegeben, wo es 10 Stunden in einem Strom aus warmer Luft zur Vervollständigung der Kristallisation und Trocknung gealtert wurde, so daß ein kristallines Trehalosehydratprodukt bei einer Ausbeute von etwa 87%, bezogen auf Stärkefeststoffmaterial, erhalten wurde. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten einsetzen, da es weitgehend nicht hygroskopisch und leicht handhabbar ist.
  • Beispiel A-8
  • Eine Rhizobium-Spezies-M-11-Mutante (FERM BP-4130) wurde gemäß dem Verfahren in Experiment 1 etwa 70 Stunden kultiviert. Zur Entfernung der Zellen wurde die Kultur durch eine SF-Membran geleitet, und das Filtrat, etwa 100 Liter, wurde dann durch eine UF-Membran geleitet, so daß 5 Liter eines Konzentrats erhalten wurden, das etwa 410 Einheiten/ml nichtreduzierendes Saccharid bildendes Enzym und etwa 490 Einheiten/ml Trehalose freisetzendes Enzym enthielt. Eine etwa 33%ige Maisstärkesuspension wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel A-3 alpha-Amylase ausgesetzt, so daß eine Lösung von verflüssigter Stärke mit einem DE-Wert von etwa 4 erhalten wurde, die dann mit 0,02 ml/g Stärkefeststoff des obigen Konzentrats, 500 Einheiten/g Stärkefeststoff Isoamylase und 5 Einheiten/g Stärkefeststoff Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase versetzt und 48 Stunden bei pH 6,2 und 40°C umgesetzt wurde. Die Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt, mit 10 Einheiten/g Substratfeststoff Glucoamylase versetzt und 10 Stunden bei pH 5,0 und 50°C weiter umgesetzt. Die Reaktionsmischung enthielt 85,6 Trehalose, bezogen auf trockenen Feststoff. Die Reaktionsmischung wurde danach zur Inaktivierung des Enzyms erhitzt, in herkömmlicher Weise zur Reinigung entfärbt und deionisiert und in kontinuierlicher Weise während der Konzentration kristallisiert, und die Kristalle in dem entstandenen Zuckerdicksaft wurden danach in einer korbartigen Zentrifuge abgetrennt und zum Waschen mit einer minimalen Wassermenge besprüht, so daß ein hochreines kristallines Trehalosehydrat bei einer Ausbeute von 65%, bezogen auf trockenen Feststoff, erhalten wurde. Das Produkt, ein kristallines Trehalosehydrat mit einem extrem hohen Reinheitsgrad, läßt sich vorteilhafterweise in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten, ebenso wie als Reagens und Material für großtechnische und chemische Anwendungen einsetzen.
  • Beispiel A-9
  • Eine durch das Verfahren in Beispiel A-8 erhaltene Reaktionsmischung wurde zur Inaktivierung der Enzyme erhitzt, in herkömmlicher Weise zur Reinigung entfärbt und deionisiert und dann konzentriert, so daß ein 55%iges Sirupprodukt erhalten wurde. Das Produkt wurde als Ausgangssaccharidflüssigkeit auf eine Chromatographiesäule mit „DOWEX 99", einem stark sauren Calciumkationenaustauscher mit einem Quervernetzungsgrad von 6% und vertrieben von der Firma The Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA, aufgetragen, um den Trehalosegehalt zu erhöhen, woraufhin trehalosereiche Fraktionen gewonnen wurden. Die Fraktionen wurden danach in herkömmlicher Weise entfärbt und deionisiert, in einen Verdampfer gegeben und im Vakuum zu einem Sirup mit einem Feuchtgehalt von etwa 3,0% eingekocht. Der Sirup wurde in eine Kristallisationsapparatur gegeben, mit 1%, bezogen auf Sirupfeststoff, wasserfreier kristalliner Trehalose als Impfkristall versetzt, unter Rühren bei 120°C kristallisiert, in Aluminiumwannen verteilt und 6 Stunden bei 100°C gealtert, so daß blockförmige Feststoffprodukte erhalten wurden. Diese Feststoffprodukte wurden danach in eine Zerkleinerungsmaschine gegeben und unter Verwirbelung getrocknet, so daß ein Pulverprodukt aus wasserfreier kristalliner Trehalose mit einem Feuchtgehalt von etwa 0,3% bei einer Ausbeute von etwa 75%, bezogen auf den Feststoff in den trehalosereichen Fraktionen, erhalten wurde. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise als Trocknungsmittel für wasserhaltige Substanzen wie z. B. Lebensmittelprodukte, Kosmetika, Medikamente sowie deren Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukte, ebenso wie als Süßstoff mit einer angenehmen Süße in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten, einsetzen.
  • Beispiel B-1
  • Süßstoff
  • Ein Gewichtsanteil eines aus dem Verfahren in Beispiel A-7 erhaltenen kristallinen Trehalosehydratpuffers wurde mit 0,01 Gewichtsanteilen „ALPHA G SWEET®", einem von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japan, vertriebenen alpha-Glycosylsteviosid sowie 0,01 Gewichtsanteilen „ASPARTAME®", einem von Ajinomoto Inc., Tokio, Japan, vertriebenen L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, zur Homogenität vermischt und die Mischung wurde einer Granulationsapparatur zugeführt, so daß ein granuläres Produkt eines Süßstoffs erhalten wurde. Das Produkt weist eine besonders hochqualitative Süße sowie ein Süßungspotential, das etwa doppelt so stark wie das von Saccharose ist, auf und seine Kalorienzahl ist etwa halb so groß wie die von Saccharose pro Süßungspotentialeinheit. Da das Produkt eine besonders gute Stabilität aufweist und seine Bestandteile mit dem hohen Süßungspotential nicht abgebaut werden, ist es als kalorienarmer Süßstoff geeignet, kalorienarme Lebensmittelprodukte für Diabetiker oder Personen mit Übergewicht, deren Kalorienaufnahme beschränkt ist, zu süßen. Das Produkt ist weiterhin zum Süßen von Lebensmittelprodukten geeignet, die Zahnkaries unterdrücken, da es zu einer geringeren Ausbildung von Säuren und unlöslichen Glucanen durch Zahnkaries auslösende Mikroorganismen führt.
  • Beispiel B-2
  • Harte Bonbons
  • Einhundert Gewichtsanteile einer 55%igen Saccharoselösung wurden mit 30 Gewichtsanteilen eines aus dem Verfahren in Beispiel A-1 erhaltene nichtreduzierende Saccharide enthaltenden Sirups unter Erwärmung vermischt, durch Erhitzen im Vakuum auf einen Feuchtgehalt von weniger als 2% konzentriert, mit einem Gewichtsanteil Citronensäure und entsprechenden Mengen an Zitronengeschmacksstoff und Farbstoff versetzt und in herkömmlicher Weise zur Gewinnung der Produkte geformt. Bei den Produkten handelt es sich um hochqualitative harte Bonbons, die fest und besonders gut im Geschmack sind und keine Zuckerkristallisation oder Verformung aufweisen.
  • Beispiel B-3
  • Schokolade
  • Vierzig Gewichtsanteile Kakaomasse, 10 Gewichtsanteile Kakaobutter, 30 Gewichtsanteile Saccharose, 20 Gewichtsanteile eines durch das Verfahren in Beispiel A-8 erhaltenen hochreinen kristallinen Trehalosehydrats wurden gemischt, zur Verringerung der Teilchengrößen einem Refiner zugeführt und in einer Schnecke bei 50°C 2 Tage geknetet. Während des Knetprozesses wurden 0,5 Gewichtsanteile Lecithin zugesetzt und bis zur Homogenität hinreichend verteilt. Die erhaltene Masse wurde mit einem Thermostat auf 31°C eingestellt, unmittelbar vor der Verfestigung der Butter in Formen verteilt, mit einem Vibrationsgerät entlüftet und zur Verfestigung über einen Zeitraum von 20 Minuten durch einen 10°C warmen Kühltunnel geleitet. Die Inhalte wurden aus den Formen entfernt und zur Gewinnung der Produkte verpackt. Die Produkte sind nicht hygroskopisch und besitzen eine besonders gute Farbe, einen besonders guten Glanz und eine besonders gute Konsistenz und lösen sich im Mund gleichmäßig auf, so daß sich eine angenehme Süße sowie ein mildes Aroma und ein milder Geschmack ergeben.
  • Beispiel B-4
  • Kaugummi
  • Drei Gewichtsanteile Kaugummigrundstoff wurden durch Schmelzen unter Erwärmen aufgeweicht, mit 4 Gewichtsanteilen Saccharose und 3 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-5 erhaltenen kristallinen Trehalosehydratpulvers versetzt, mit entsprechenden Mengen an Geschmacks- und Farbstoffen vermischt, in herkömmlicher Weise mit einer Rolle geknetet, geformt und zur Erhaltung eines Produkts verpackt. Bei dem Produkt handelt es sich um einen Kaugummi mit besonders guter Konsistenz sowie besonders gutem Aroma und Geschmack.
  • Beispiel B-5
  • Gesüßte Kondensmilch
  • Drei Gewichtsanteile eines durch das Verfahren in Beispiel A-3 erhaltene nichtreduzierende Saccharide enthaltenden Sirups sowie 1 Gewichtsanteil Saccharose wurden in 100 Gewichtsanteilen frischer Milch gelöst, und die Mischung wurde durch Erhitzen auf einer Wärmeplatte pasteurisiert, auf 70% konzentriert und zur Erhaltung eines Produkts steril in Dosen abgefüllt. Das Produkt, das eine leichte Süße und ein besonders gutes Aroma sowie einen besonders guten Geschmack aufweist, läßt sich vorteilhafterweise zum Süßen von Säuglingsnahrung, Fruchtsäften, Kaffee, Kakao und Tee verwenden.
  • Beispiel B-6
  • Getränk mit Milchsäurebakterien
  • Einhundertundfünfundsiebzig Gewichtsanteile entfetteter Milch, 8 Gewichtsanteile eines aus dem Verfahren in Beispiel A-2 erhaltenen Pulvers mit einem hohen Gehalt an nichtreduzierendem Saccharid sowie 50 Gewichtsanteile eines wie in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 281,795/92 offenbarten Pulvers mit hohem Lactosaccharosegehalt wurden in 1200 Gewichtsanteilen Wasser gelöst, 30 Minuten bei 65°C pasteurisiert, auf 40°C abgekühlt, mit 30 Gewichtsanteilen eines Starters versetzt und 8 Stunden in herkömmlicher Weise bei 37°C kultiviert, so daß ein Getränk, das Milchsäurebakterien enthielt, erhalten wurde. Das Produkt hat einen besonders guten Geschmack und ein besonders gutes Aroma. Die in dem Produkt vorhandenen Oligosaccharide sorgen für die stabile Präsenz der Milchsäurebakterien und stimulieren das Wachstum von Bifidobakterien.
  • Beispiel B-7
  • Fruchtsaft in Pulverform
  • Dreiunddreißig Gewichtsanteile eines durch Sprühtrocknung hergestellten Orangensaftpulvers wurden mit 50 Gewichtsanteilen eines aus dem Verfahren in Beispiel A-6 erhaltenen hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, 10 Gewichtsanteilen Saccharose, 0,65 Gewichts anteilen wasserfreier Citronensäure, 0,1 Gewichtsanteilen Äpfelsäure, 0,1 Gewichtsanteilen L-Ascorbinsäure, 0,1 Gewichtsanteilen Natriumcitrat, 0,5 Gewichtsanteilen Pullulan sowie einer entsprechenden Menge an Aromastoff in Pulverform durch Rühren zur Homogenität vermischt, zu einem feinen Pulver zerkleinert, einem Wirbelschicht-Granulationsgerät zugeführt, mit einem Sirup, der durch Reinigung und Konzentration einer durch das Verfahren in Beispiel A-6 erhaltenen Reaktionsmischung mit hohem Trehalosegehalt erhalten worden war, als Bindemittel bei einer Auslasttemperatur von 40°C versprüht, 30 Minuten granuliert, in die vorgeschriebenen Mengen aufgeteilt und zur Erhaltung eines Produkts verpackt. Bei dem Produkt handelt es sich um einen Saft in Pulverform mit einem Fruchtsaftgehalt von etwa 30%. Das Produkt war frei von unangenehmem Geschmack und Geruch und über einen ausgedehnten Zeitraum hinweg stabil.
  • Beispiel B-8
  • Vanillecreme
  • Einhundert Gewichtsanteile Maisstärke, 100 Gewichtsanteile eines aus dem Verfahren in Beispiel A-1 erhaltene nichtreduzierende Saccharide enthaltenden Sirups, 80 Gewichtsanteile Maltose, 20 Gewichtsanteile Saccharose und 1 Gewichtsanteil Natriumchlorid wurden zur Homogenität vermischt, mit 280 Gewichtsanteilen an Eiern versetzt, gerührt, nach und nach mit 1.000 Gewichtsanteilen kochender Milch versetzt, weiter auf kleiner Flamme gerührt, bis die Maisstärke vollständig gelatinisiert war und die Masse semitransparent wurde, woraufhin die entstandene Masse abgekühlt, mit einer entsprechenden Menge Vanillearoma versetzt, in vorgeschriebene Portionen aufgeteilt und zur Erhaltung eines Produkts verpackt wurde. Das Produkt besitzt einen gleichmäßigen Glanz, eine leichte Süße und einen besonders guten Geschmack.
  • Beispiel B-9
  • „Uiro-no-moto"
  • Neunzig Gewichtsanteile Reispulver wurden mit 20 Gewichtsanteilen Maisstärke, 40 Gewichtsanteilen Saccharose, 80 Gewichtsanteilen eines aus dem Verfahren in Beispiel A-5 erhaltenen kristallinen Trehalosehydratpulvers sowie 4 Gewichtsanteilen Pullulan bis zur Homogenität gemischt, so daß man „uiro-no-moto" erhielt. Das uiro-no-moto wurde danach mit entsprechenden Mengen an „matcha" oder grünem Teepulver in Wasser bis zur Homogenität verknetet, in Gefäße gefüllt und 60 Minuten im Dampf erhitzt, so daß man „matcha-uiro" erhielt. Das Produkt ist besonders gut hinsichtlich Glanz, Konsistenz, Geschmack und Aroma. Das Produkt weist eine verbesserte Lagerstabilität auf, da die Retrogradation der Stärke wirksam unterdrückt wird.
  • Beispiel B-10
  • „An (Bohnenpaste)"
  • 10 Gewichtsanteile Adzukibohnen als Ausgangsmaterial wurden in herkömmlicher Weise mit Wasser versetzt und gekocht, und die Säure, Schärfe und wasserlöslichen Begleitstoffe wurden entfernt, so daß etwa 21 Gewichtsanteile einer klumpigen rohen Adzukibohnenpaste erhalten wurden. Die rohe Bohnenpaste wurde dann mit 14 Gewichtsanteilen Saccharose, 5 Gewichtsanteilen eines aus dem Verfahren in Beispiel A-3 erhaltene nichtreduzierende Saccharide enthaltenden Sirups sowie 4 Gewichtsanteilen Wasser versetzt, gekocht, weiterhin mit einer geringen Menge an Salatöl versetzt und verknetet, wobei dafür Sorge getrage wurde, daß die Körnchen aus Adzukibohnen nicht zerstört wurden, so daß etwa 35 Gewichtsanteile eines Bohnenpastenprodukts erhalten wurden. Das Produkt, das verfärbungsfrei und besonders gut hinsichtlich Konsistenz, Geschmack und Aroma ist, eignet sich als Material für „anpan", „manju", „dango", „monaka" sowie gefrorene Desserts.
  • Beispiel B-11
  • Süßes Brötchen
  • 100 Gewichtsanteile Weizenmehl, 2 Gewichtsanteile Hefe, 5 Gewichtsanteile Saccharode, 1 Gewichtsanteil eines durch das Verfahren in Beispiel A-4 erhaltene nichtreduzierende Saccharide enthaltenden Pulvers sowie 0,1 Gewichtsanteile anorganischer Lebensmittel wurden in herkömmlicher Weise in Wasser verknetet, 2 Stunden bei 26°C fermentiert, 30 Minuten gehen gelassen und gebacken. Bei dem Produkt handelt es sich um ein süßes Brötchen von hoher Qualität mit besonders guter Farbe und Konsistenz, einer angemessenen Elastizität und einer leichten Süße.
  • Beispiel B-12
  • Schinken
  • Eintausend Gewichtsanteile Oberschenkelfleisch vom Schwein wurden mit 15 Gewichtsanteilen Natriumchlorid sowie 3 Gewichtsanteilen Kaliumnitrat gleichmäßig gesalzen und einen Tag lang an einen kühlen Ort gelegt. Die entstandene Masse wurde an einem kühlen Ort 7 Tage in einer Salzlösung aus 500 Gewichtsanteilen Wasser, 100 Gewichtsanteilen Natriumchlorid, 3 Gewichtsanteilen Kaliumnitrat, 40 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-4 erhaltene nichtreduzierende Saccharide enthaltenden Pulvers sowie Gewürzen eingelegt, mit gekühltem Wasser gewaschen, gebunden, geräuchert, gekocht, gekühlt und schließlich zur Erhaltung eines Produkts verpackt. Bei dem Produkt handelt es sich um einen Schinken von hoher Qualität mit besonders guter Farbe, einem besonders guten Geschmack und Aroma.
  • Beispiel 13
  • Peptid in Pulverform
  • Ein Gewichtsanteil „HIMUTE® S", einer 40%igen Lösung eines für die Verwendung in Lebensmittelprodukten bestimmten und von Fuji Oil Co., Ltd., Osaka, Japan, vertriebenen Sojabohnenpeptids, wurde mit 2 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-6 erhaltenen hochreinen kristallinen Trehalosehydrats vermischt, in Plastikwannen gefüllt, bei 50°C im Vakuum getrocknet und danach zerkleinert, so daß man ein Pulverprodukt eines Peptids erhielt. Dieses Produkt, welches einen besonders guten Geschmack und ein besonders gutes Aroma besitzt, läßt sich vorteilhafterweise als Material in Süßwaren, wie z. B. Mischungen und Desserteiscreme, ebenso wie Babynahrung und Nahrungsmittel für therapeutische Anwendungen, einschließlich Flüssignahrung zur oralen und parenteralen Verabreichung, verwenden.
  • Beispiel B-14
  • Miso in Pulverform
  • Ein Gewichtsanteil an rotem Miso wurde mit 3 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-9 erhaltenen kristallinen Trehalosepulvers vermischt, in mehrere konkave Vertiefungen auf einer Metallplatte gegossen, zur Verfestigung über Nacht bei Umgebungstemperatur stehen gelassen und aus der Platte genommen, so daß man Miso in fester Form in Stücken von jeweils 4 g erhielt, die dann einer Zerkleinerungsmaschine zugeführt wurden und in Pulver überführt wurden. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise zum Würzen von herkömmlichen Nudeln chinesischer Art und „suimono", einer Art klare Suppe, verwenden. Im Gegensatz dazu lassen sich die Misostücke in intakter Form als Süßwaren ebenso wie als fester Würzstoff einsetzen.
  • Beispiel B-15
  • Eigelb in Pulverform
  • Rohes Eigelb wurde bei 60–64°C auf einer Wärmeplatte pasteurisiert und die erhaltene Eigelbflüssigkeit mit 9 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-9 erhaltenen wasserfreien kristallinen Trehalosepulvers auf einen Gewichtsanteil der Eigelbflüssigkeit vermischt, auf Wannen verteilt und über Nacht stehen gelassen, um die Trehalose in seine kristalline Hydratform zu verwandeln, so daß blockförmige feste Produkte erhalten wurden. Die festen Produkte wurden dann einer Zerkleinerungsmaschine zugeführt, so daß Eigelb in Pulverform erhalten wurde. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise als Material für Süßwaren, wie z. B. Mischungen, Desserteiscremes und Emulsionsmittel, ebenso wie für Babynahrung und Nahrungsmittel für therapeutische Anwendungen, einschließlich Flüssignahrung zur oralen und parenteralen Verabreichung, einsetzen.
  • Beispiel B-16
  • Kosmetische Creme
  • Zwei Gewichtsanteile Polyoxyethylenglykol-Monostearat, 5 Gewichtsanteile an selbstemulgierendem Glycerinmonostearat, 2 Gewichtsanteile eines aus dem Verfahren in Beispiel A-2 erhaltenen Pulvers mit hohem Gehalt an nichtreduzierendem Saccharid, ein Gewichtsanteil alpha-Glycosylrutin, ein Gewichtsanteil flüssiges Paraffin, 10 Gewichtsanteile Glyceryltrioctanat und eine entsprechende Menge an Antiseptikum wurden durch Erwärmen in herkömmlicher Weise gelöst, mit 2 Gewichtsanteilen L-Milchsäure, 5 Gewichtsanteilen 1,3-Butylenglykol und 66 Gewichtsanteilen aufbereiteten Wassers versetzt, zur Emulgierung einem Homogenisationsgerät zugeführt und unter Rühren mit einer entsprechenden Menge Aromamittel versetzt, so daß ein Cremeprodukt erhalten wurde. Das Produkt, welches Antioxidationsaktivität und erhöhte Stabilität aufweist, läßt sich vorteilhafterweise als hochqualitatives Antibräunungsmittel, Hautreinigungsmittel und Hautaufhellungsmittel einsetzen.
  • Beispiel B-17
  • Haarspülmittel
  • Ein Gewichtsanteil der in dem Verfahren in Beispiel A-6 erhaltenen Trehalose, 2 Gewichtsanteile alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure, vertrieben von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, 2 Teile „ALPHA G RUTIN", einem von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japan, vertriebenen enzymbehandelten Rutin, 2 Gewichtsanteile Distearinmethylammoniumchlorid, 2 Gewichtsanteile Cetanol, 2 Gewichtsanteile Silikonöl, 1 Gewichtsanteil Polyoxyethylen-Oleylalkoholether sowie eine entsprechende Menge Aromamittel wurden unter Erwärmen gelöst, mit einer Mischung aus 3 Gewichtsanteilen 1,3-Butylenglykol, 89 Gewichtsanteilen aufbereiteten Wassers und einer entsprechenden Menge Antiseptikum unter Rühren versetzt, abgekühlt und stehen gelassen, so daß ein Haarspülmittel erhalten wurde. Das Produkt mit alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure und enzymbehandeltem Rutin läßt sich vorteilhafterweise zur Stimulierung der Neubildung und des Wachstums von Haar bei Menschen und Tieren ebenso wie zur Behandlung und Vorbeugung von Schuppen, Juckreiz und Haarausfall einsetzen.
  • Beispiel B-18
  • Lotionsmilch
  • Eine Lotionsmilch wurde in herkömmlicher Weise mit der folgenden Zusammensetzung (Gewichtsanteile) hergestellt:
    POE-(20)-Cetylalkoholether 1
    „SILICONE KF96", vertrieben von der Shin-etsu Chemical Industry Co., Ltd., Tokio, Japan 2
    Flüssiges Paraffin 5
    Propylenglykol 1
    Glycerin 1
    Trehalose, erhalten in Beispiel A-7 1
    Ethylalkohol 15
    Carboxyvinylpolymer 0,3
    Hydroxypropylcellulose 0,1
    2-Aminomethylpropanol 0,1
    POE in Rizinusöl 0,1
    alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure 1
    Red Pigment No. 106 0,0001
    Antiseptikum Spur
    Aromamittel 0,1
    Destilliertes Wasser 70
  • Das Produkt mit alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure wies ein besonders gutes Hautreinigungsvermögen, eine besonders gute Stabilität und ein besonders gutes Aromabewahrungsvermögen auf.
  • Beispiel B-19
  • Gesichtslotion
  • Eine Gesichtslotion wurde in herkömmlicher Weise mit der folgenden Zusammensetzung (Gewichtsanteile) hergestellt:
    Sorbit 2
    Trehalose, erhalten in Beispiel A-8 0,5
    Plazentaflüssigkeit 0,5
    alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure 0,5
    Dimethylstearylaminoxid 0,05
    Natriumlaurat 0,01
    Ethylalkohol 20
    Antiseptikum Spur
    Aromamittel Spur
    Destilliertes Wasser 75
  • Das Produkt mit alpha-Glucosyl-L-ascorbinsäure besaß ein besonders gutes Hautreinigungsvermögen, eine besonders gute Stabilität und war besonders sicher.
  • Beispiel B-20
  • Ginsengextrakt in Pulverform
  • 0,5 Gewichtsanteile Ginsengextrakt wurden zusammen mit 1,5 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-9 erhaltenen wasserfreien kristallinen Trehalosepulvers verknetet, in Wannen gefüllt und 2 Tage stehen gelassen, um die Trehalose in seine kristalline Hydratform zu verwandeln, so daß blockförmige feste Produkte erhalten wurden. Diese festen Produkte wurden dann einer Zerkleinerungsmaschine zur Pulverisierung zugeführt und danach gesiebt, so daß ein Ginsengextrakt in Pulverform erhalten wurde. Dieses Pulver wurde dann zusammen mit entsprechenden Mengen an Vitamin B1 und Vitamin B2, beide in Pulverform, einer Granulierungsapparatur zugeführt, wobei ein vitaminhaltiger Ginsengextrakt in Granulatform entstand. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise als Tonikum einsetzen. Weiterhin läßt sich das Produkt auch zur Wiederherstellung von Haar verwenden.
  • Beispiel B-21
  • Feststoff
  • Eine von der Firma Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vertriebene Präparation von natürlichem menschlichem Interferonalpha wurde in herkömmlicher Weise auf eine Säule mit einem immobilisierten anti-Mensch-Interferon-alpha-Antikörper aufgetragen, um das menschliche Interferonalpha zu adsorbieren und ebenfalls Rinderserumalbumin als Stabilisator durchzuleiten, und das adsorbierte natürliche menschliche Interferon-alpha wurde dann mit einer physiologischen Kochsalzlösung mit 5% eines aus dem Verfahren in Beispiel A-6 erhaltenen hochreinen kristallinen Trehalosehydrats eluiert, wobei der pH-Wert in der Kochsalzlösung geändert wurde. Die erhaltene Flüssigkeit wurde durch eine Membran filtriert, mit der etwa 20fachen Menge an „FINETOSE®", einer von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vertriebenen wasserfreien kristallinen Maltose, zur Trocknung versetzt, pulverisiert und einer Tablettiermaschine zugeführt, so daß Tabletten von jeweils etwa 200 mg mit etwa 150 Einheiten von natürlichem humanen Interferon-alpha pro Tablette erhalten wurden. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise als sublinguale Tablette bei der Behandlung von Viruserkrankungen, allergischen Erkrankungen, Rheumatismus, Diabetes und bösartigen Tumoren einsetzen, wobei das Produkt in einer Dosis von 1–10 Tabletten/Tag/Erwachsener oral verabreicht wird. Das Produkt läßt sich vor allem bei der Behandlung von AIDS und Gelbsucht, deren Auftreten sich in den letzten Jahren rapide erhöht hat, vorteilhafterweise einsetzen. Das Produkt behält seine Aktivitäten über einen ausgedehnten Zeitraum bei, selbst wenn es bei Umgebungstemperatur stehen gelassen wird, weil sowohl das erfindungsgemäße nichtreduzierende Saccharid als auch die wasserfreie kristalline Maltose als Stabilisatoren wirken.
  • Beispiel B-22
  • Dragee
  • Als Kernmaterial wurden unbeschichtete Tabletten von jeweils 150 mg mit einer Grundierungsflüssigkeit aus 40 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-8 erhaltenen hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, 2 Gewichtsanteilen Pullulan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 200.000 Dalton, 30 Gewichtsanteilen Wasser, 25 Gewichtsanteilen Talkumpulver und 3 Gewichtsanteilen Titanoxid beschichtet, so daß sich etwa 230 mg pro Tablette ergaben, weiter mit einer Flüssigkeit zur abschließenden Beschichtung aus 65 Gewichtsanteilen des gleichen kristallinen Trehalosehydrats, einem Gewichtsanteil Pullulan und 34 Gewichtsanteilen Wasser beschichtet und mit Bienenwachs poliert, so daß Dragees mit einem besonders glänzenden Aussehen erhalten werden. Das Produkt ist besonders widerstandsfähig gegenüber Stößen und behält eine hohe Qualität über einen ausgedehnten Zeitraum bei. Beispiel B-23 Zahnpflegemittel Zusammensetzung (Gewichtsanteile)
    Calciumhydrogenphosphat 45,0
    Pullulan 2,95
    Natriumlaurylsulfat 1,5
    Glycerin 20,0
    PolyoXyethylensorbitanlaurat 0,5
    Antiseptikum 0,05
    Kristallines Trehalosehydratpulver, erhalten durch das Verfahren in Beispiel A-5 12,0
    Maltit 5,0
    Wasser 13,0
  • Die obenbeschriebenen Materialien wurden in herkömmlicher Weise zu einem Zahnpflegemittel vermischt. Das Produkt, welches eine angemessene Süße aufweist, ist als Zahnpflegemittel für Kinder geeignet.
  • Beispiel B-24
  • Feststoff für Flüssignahrung
  • Eine Zusammensetzung aus 500 Gewichtsanteilen eines durch das Verfahren in Beispiel A-7 hergestellten kristallinen Trehalosehydratpulvers, 270 Gewichtsanteile Eigelbpulver, 4,4 Gewichtsanteile Natriumchlorid, 1,8 Gewichtsanteile Kaliumchlorid, 4 Gewichtsanteile Magnesiumsulfat, 0,01 Gewichtsanteile Thiamin, 0,1 Gewichtsanteile Natriumascorbat, 0,6 Gewichtsanteile Vitamin-E-acetat und 0,04 Gewichtsanteile Nicotinamid wurde in Aliquots von jeweils 25 g aufgeteilt, die dann in feuchtigkeitsdichte Folientaschen eingefüllt und zur Erhaltung eines Produkts eingeschweißt wurden. Eine Tasche mit diesem Produkt wird in etwa 150–300 ml Wasser zu einer Flüssignahrung gelöst, die dann in der Mund- oder Nasenhöhle, dem Magen oder Dünndarm zur Energiezufuhr an lebende Organismen verabreicht wird.
  • Beispiel B-25
  • Infusionsmittel
  • Ein durch das Verfahren in Beispiel A-8 hergestelltes hochreines kristallines Trehalosehydrat wurde in Wasser zu etwa 10% (w/v) gelöst, zur Entfernung von Pyrogenen durch eine Membran geleitet, in Plastikflaschen steril abgefüllt und in herkömmlicher Weise versiegelt. Bei dem Produkt handelt es sich um ein stabiles Infusionsmittel, das sich im zeitlichen Verlauf nicht ändert und zur intravenösen und intraperitonealen Verabreichung geeignet ist. Das Produkt ist bei 10% (w/v) isotonisch zu Blut und kann daher bei dieser Konzentration doppelt so viel Energie liefern wie bei der Verwendung von Glucose.
  • Beispiel B-26
  • Infusionsmittel
  • Ein durch das Verfahren in Beispiel A-8 erhaltenes hochreines kristallines Trehalosehydrat und eine Aminosäuremischung mit der unten beschriebenen Zusammensetzung wurden gemischt und in Wasser zu 5% (w/v) bzw. 30% (w/v) gelöst, zur Entfernung von Pyrogenen ähnlich wie in Beispiel B-25 gereinigt, in Plastiktaschen verteilt und versiegelt. Zusammensetzung der Aminosäuremischung (mg/100 ml):
    L-Isoleucin 180
    L-Leucin 410
    L-Lysin-hydrochlorid 620
    L-Methionin 240
    L-Phenylalanin 290
    L-Threonin 180
    L-Tryptophan 60
    L-Valin 200
    L-Arginin-hydrochlorid 270
    L-Histidin-hydrochlorid 130
    Glycin 340
  • Bei dem Produkt handelt es sich um ein stabiles Infusionsmittel, das sich im zeitlichen Verlauf nicht verändert und vorteilhafterweise über den intravenösen und den intraperitonealen Weg verabreicht werden kann, da die Trehalose, selbst in dieser Art von Zusammensetzung aus Saccharid und Aminosäure, kein Reduktionspotential aufweist. Das Produkt läßt sich vorteilhafterweise zur Zufuhr von sowohl Energie als auch Aminosäuren an lebende Organismen einsetzen.
  • Beispiel B-27
  • Salbe zur Behandlung äußerer Verletzungen
  • Zweihundert Gewichtsanteile eines durch das Verfahren in Beispiel A-5 hergestellten kristallinen Trehalosehydratpulvers und 300 Gewichtsanteile Maltose wurden zunächst mit 3 Gewichtsanteilen Iod in 50 Gewichtsanteilen Methanol und danach mit 200 Gewichtsanteilen einer 10%igen (w/v) wäßrigen Pullulanlösung versetzt, so daß eine Salbe mit einer angemessenen Ausdehnungsfähigkeit und Haftfähigkeit erhalten wurde. Durch die Anwendung dieses Produkts werden äußere Verletzungen über eine verkürzte Behandlungsdauer besonders gut geheilt, da das in dem Produkt vorhandene Iod bzw. die in dem Produkt vorhandene Trehalose als Desinfektionsmittel bzw. Energielieferant für lebensfähige Zellen wirkt.
  • Auswirkung der Erfindung
  • Wie aus der obigen Erläuterung ersichtlich ist, werden bei der Herstellung nichtreduzierender Saccharide mit Trehalosestrukturen, wie z. B. alpha-Glycosyltrehalosen und alpha-Glycosyl-alpha-glycosiden, sowie von diese enthaltenden weniger reduzierenden Sacchariden aus Stärke durch eine Kombination von nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Stärkeentzweigungsenzym und/oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase die Ausbeuten an nichtreduzierenden Sacchariden aus verflüssigten Stärken in Lösung verbessert, und ebenso wird die großtechnische Herstellung relativ kleiner, weniger reduzierender Saccharide mit verringerter Viskosität und besonders guter Handhabung erleichtert. Weiterhin wird bei der Herstellung von Trehalose aus Stärke durch eine Kombination aus nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym, Trehalose freisetzendem Enzym und entweder Stärkeentzweigungsenzym oder Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase die Ausbeute an Trehalose aus Stärke extrem verbessert und seine großtechnische Herstellung erleichtert. Die nichtreduzierenden Saccharide, einschließlich alpha-Glycosyltrehalose und alpha-Glycosyl-alpha-glycosid und Trehalose, und die diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide weisen eine besonders gute Stabilität und hohe Qualität sowie leichte Süße auf. Weiterhin werden sie ebenfalls bei oraler Aufnahme verdaut und als Energiequelle resorbiert. Trehalose könnte auch parenteral zum Einsatz kommen, wobei es leicht metabolisiert und assimiliert wird. Somit lassen sich die erfindungsgemäßen nichtreduzierenden Saccharide und die erfindungsgemäßen diese enthaltenden weniger reduzierenden Saccharide vorteilhafterweise als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbesserer, Stabilisator und Formgebungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Medikamenten, einsetzen.
  • Die vorliegende Erfindung könnte einen vollkommen neuartigen Weg zur großtechnischen Produktion für die kostengünstige Bereitstellung gewünschter Mengen an nichtreduzierenden Sacchariden und diese enthaltende weniger reduzierenden Sacchariden, für die zwar ein großer Bedarf besteht, die sich aber nicht leicht gewinnen lassen, aus Stärke als billige und unbegrenzte Quelle eröffnen. Somit könnte sich die vorliegende Erfindung auf die Agrar-, Fischerei- und Tierzuchtindustrie sowie auf die chemische Industrie ebenso wie auf die Lebensmittel-, kosmetische und pharmazeutische Industrie auswirken, und ihre industrielle Bedeutung könnte unschätzbar sein.

Claims (6)

  1. Verfahren zur Herstellung eines nichtreduzierenden Saccharids oder einer dasselbige enthaltenden Zusammensetzung, wobei das nichtreduzierende Saccharid durch die allgemeine Formel Gn-T, worin G, n bzw. T Glucose, eine ganze Zahl größergleich 1 bzw. Trehalose bedeuten, dargestellt ist, wobei das Verfahren A die Behandlung einer 20–50% (w/w) Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem DE kleiner 15 mit: (a) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym zusammen mit (i) Stärkeentzweigungsenzym und/oder (ii) Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase; oder mit (b) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym zusammen mit (i) und/oder (ii); und B das Sammeln des nichtreduzierenden Saccharids oder einer das nichtreduzierende Saccharid enthaltenden Zusammensetzung umfaßt.
  2. Verfahren zur Herstellung eines ein durch die allgemeine Formel Gn-T, worin G, n bzw. T Glucose, eine ganze Zahl größergleich 1 bzw. Trehalose bedeuten, dargestelltes nichtreduzierendes Saccharid enthaltenden Nahrungsmittels, wobei das Verfahren A die Behandlung einer 20–50% (w/w) Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem DE kleiner 15 mit: (a) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym zusammen mit (i) Stärkeentzweigungsenzym und/oder (ii) Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase; oder mit (b) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym zusammen mit (i) und/oder (ii); und B das Sammeln des nichtreduzierenden Saccharids oder einer das nichtreduzierende Saccharid enthaltenden Zusammensetzung; und C den Einbau des nichtreduzierenden Saccharids oder der Saccharidzusammensetzung in ein Nahrungsmittelmaterial umfaßt.
  3. Verfahren zur Herstellung eines ein durch die allgemeine Formel Gn-T, worin G, n bzw. T Glucose, eine ganze Zahl größergleich 1 bzw. Trehalose bedeuten, dargestelltes nichtreduzierendes Saccharid enthaltenden kosmetischen Mittels, wobei das Verfahren A die Behandlung einer 20–50% (w/w) Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem DE kleiner 15 mit: (a) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym zusammen mit (i) Stärkeentzweigungsenzym und/oder (ii) Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase; oder mit (b) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym zusammen mit (i) und/oder (ii); und B das Sammeln des nichtreduzierenden Saccharids oder einer das nichtreduzierende Saccharid enthaltenden Zusammensetzung; und C den Einbau des nichtreduzierenden Saccharids oder der Saccharidzusammensetzung in ein kosmetisch unbedenkliches Material umfaßt.
  4. Verfahren zur Herstellung eines ein durch die allgemeine Formel Gn-T, worin G, n bzw. T Glucose, eine ganze Zahl größergleich 1 bzw. Trehalose bedeuten, dargestelltes nichtreduzierendes Saccharid enthaltenden Arzneimittels, wobei das Verfahren A die Behandlung einer 20–50% (w/w) Lösung aus verflüssigter Stärke mit einem DE kleiner 15 mit: (a) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym zusammen mit (i) Stärkeentzweigungsenzym und/oder (ii) Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase; oder mit (b) nichtreduzierendes Saccharid bildendem Enzym und Trehalose freisetzendem Enzym zusammen mit (i) und/oder (ii); und B das Sammeln des nichtreduzierenden Saccharids oder einer das nichtreduzierende Saccharid enthaltenden Zusammensetzung; und C den Einbau des nichtreduzierenden Saccharids oder der Saccharidzusammensetzung in ein pharmazeutisch unbedenkliches Material umfaßt.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Schritt B des Sammelns des nichtreduzierenden Saccharids das Auftragen des Produkts aus Schritt A auf eine Chromatographiesäule und das Sammeln einer Fraktion mit erhöhtem Gehalt an nichtreduzierendem Saccharid umfaßt.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Schritt A weiterhin den Schritt der Behandlung des Produkts aus Schritt A mit β-Amylase, Glucoamylase oder α-Glucosidase zu einer ein nichtreduzierendes Saccharid und kontaminierende Saccharide enthaltenden Lösung umfaßt.
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