TW426736B - Non-reducing saccharide and its production and use - Google Patents

Description

4 2673 6 A7 B7____ 五、發明説明（1 ) 本發明的相關資料_ 1 ,本發明的領 本發明是關於非還原醣的製法及其用途。所謂非還原 醣包括海藻糖和在醣類的末端或分子內含有海藻糖結構的 醣類，並利用澱粉和包含非還原醣或低還原性醣類的組成 份以製造非還原醣。 2 先前枝藝的描述 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 海藻糖（α，α —海藻糖）是一種由葡萄糖組成的非 還原醣。（描述於 Advances in Carbohydrate Chemistry ，published by Academic Press Inc., New York, New York, USA, Vol . 18, pp. 2 0 1 - 22 5 ( 1 96 3 )和 Ant) 1 ΐ eri and Environmental Microbiology. Vo 1. 5 6, pp. 3213-3215 (1990)。它廣泛存在於微生物，菇類和昆蟲內，但含量極 少。非還原醣（如：海藻糖）和含有胺基團的物質（如： 胺基酸和蛋白質）並不會產生胺基一羥基反應，因此不會 有變質、褐、變現象發生。基於此原因，建立一大規模生產 非還原醣的方法是被大家所期待的。 有許多爲大家熟知製備海藻糖方法，例如：刊載於曰 本專利公開公報No . 154，4 8 5/7 5使用微生物 生產法和利用麥芽糖磷酸酶和海藻糖磷酸酶轉化麥芽糖的 方法。前者利用微生物製造的方法並不適於大規模量產， 因爲微生物內的海藻糖含量低於1 5w/w% (除非有特 別註明•以後的百分率都表示w/w%)，而且萃取和純 本度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐) -4 - 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 426736 A7 _B7__五、發明説明（2 ) 化步驟非常繁複。而後者利用麥芽糖磷酸酶和海藻糖磷酸 酶的製造方法也不適合大規模生產，因爲這二種酵素一般 催化經由形成葡萄糖-1一磷酸鹽而阻礙提高受質的濃度 ;而且此二種酵素傾向於逆向反應使得海藻糖的產率很低 *且反應系統呈現不穩定狀態》 Gekkan Food Chemical (Monthly Food Chemical ). 'Recent Aspects and Issues in Utilization and De-v e 1 o p m e n t o f S t a r c h ’，A u g u s t，p p，6 7 - 7 2 ( 1 9 9 2 )在' 寡糖I章節評註：雖然海藻糖有廣泛用途，但利用澱粉爲 原料，以醣類轉移或水解反應的酵素作用來製造海藻糖仍 被認爲不可行。 部份澱粉水解物，如：液化澱粉、糊精和麥芽寡醣類 ，由於含有還原基因此具有還原力。基於此原因，因此本 部份澱粉水解物將定義爲"還原性部份澱粉水解物'。而 其所具有的還原力一般以葡萄糖當量〃或'D E 〃表示 〇還原性部份澱粉水解物具有極高的葡萄糖當量值且一般 爲小分子、、具有低黏稠度和強烈甜味；而且和帶有胺基團 的物質如：胺基酸和蛋白質有高度反應性，產生胺羰反應 ，形成褐變、不好氣味和變質。 還原性部份澱粉水解物的特性決定於其葡萄糖當量， 因此還原性部份澱粉水解物和其葡萄糖當量之間相關性非 常重要《 —般相信，要切斷它們二者之間關聯性是不可能 的。 唯一的方法即是改變還原性部份澱粉水解物成爲非還 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4現格（2丨0X297公釐） 426736 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明 ( 3 ) 原 醣 1 例 如 利 用 高 壓 氫 化 法 將 還 原 基 團 轉 化 成 醇 基 9 然 而 此 方 法 需 要 使 用 iSj 壓 蒸 汽 鍋 安 全 設 施 和 監 控 系 統 以 防 災 難 A|C 發 生 > 並 且 消 耗 大 量 氫 氣 和 能 量 〇 而 且 得 到 的 醣 醇 產 物 是 由 葡萄糖和 山 梨 糖 醇 組成 不 同 於 還 原 性 部 份 澱 粉水 解 物 是 由 葡萄 糖 所 構 成 > 使得 其 有 短 暫性 難 消 化和 腹 瀉 現 象 0 因 此 巨 刖 最 需 要 建 立 的 方 法 是 降 低或 消 除 還 原 性 部 份 澱 粉水解 物 的 還 原 力 而 不 改 變 葡萄糖 組成 部 份 〇 爲 了 解 決 這 些 問 題 本 發 明 者 利 用 種 可 催 化 葡 萄 糖 聚 合 度 3 以 上 的 原 性 部 份 厥 粉 水 解物 產 生 末 端 W 有 海 藻 糖 結 構 的 非 還 原 醣 的 新 型 非 gat 還 原 醣 生 成 酵 素 ( 以 後 本 文 稱 之 爲 非 還 原 醣 生 成 酵 素 jf ) 以 得 到 分 子 末 端 帶 有 海 藻 糖 結 構 的 非 還 原 醣 和 低 還 原 醣 然 後 再 利 用 非 還 原 醣 生 成 酵 素 催 化 醣 類 以 產 生 海 藻 糖 9 ( 此 方 法 刊 載 於 曰 本 專 利 公 開 公 報 N 0 3 4 9 2 1 6 / 9 3 ) 〇 然 而 後 來 發 現 以 相 當 大 分 子 的 還 原 性 部 份 澱 粉 水 解 物 爲 原 料 經 'SI m 本 製 造 方 法 得 到 的 非 還 原 醣 具 有 低 還 原 力 但 黏 稠 度 太 tSJ, 同 而 以 小 分 子 還 原 性部 份 澱 粉 水 解 物 爲 原 料 得 到 的 非 還 原 醣 的 還 原 力 下 降 不 顯 著 0 而 以 澱 粉 爲 原 料 9 經 過 非 還 原 醣 生 成 酵 素 和 葡 萄 糖 澱 粉 酶 催 化 得 到 的 海 藻 糖 產 率 太 低 不 足 以 大 量 生 產 海 藻 糖 9 爲 了 改 善 這 些 問 題 > 有 必 要 立 一 從 還 原 性 部 份 澱 粉 水 解 物 產 生 大 量 小 分 子 非 還 原 醣 的 方· .法 0 而 本 發 明 者 於 曰 本 專 利 公 開 公 報 N 0 7 9 2 9 1 / 9 4 發 表 的 方 法 ♦ 則 是 利 用 —. 種 可 專 一 性 水 解 位 於 葡 萄 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ' 4 2 67 3 6 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) 糖聚合度3以上非還原醣的海藻糖和其他部份之間的水解 的新型海藻糖釋放酵素（以後皆稱爲、海藻糖釋放酵素〃 )與非還原醣生成酵素組合使用，而得到高產率的海藻糖 。爲了大規模製造海藻糖，期盼能建立任何製造方法以真 正改善海藻糖的產率。 本發明的概要： 本發明是建立一種利用低成本和易於取得的澱粉做爲 原料，以製造提高非還原醣和包含非還原醣的低還原醣產 量的方法。而非還原醣包括：非還原醣末端帶有海藻糖結 構的分子（以後本文中稱之爲-葡萄糖基海藻糖"） 、__在非還原醣二_端_..氤.塞結構的分(以後本文中稱 之爲"α -葡萄糖基α —醣替"）和海藻糖。 爲了解決此問題，本發明者積極研究後發現：利用澱 粉分支酵素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶與非還原醣 生成酵素或非還原醣生成酵素和海藻糖釋放酵素組合使用 ，催化液化、澱粉溶液，可提高非還原醣的產率。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 最特別的是，本發明者發現：利用非還原醣生成酵素 催化葡萄糖當量小於1 5的液化澱粉溶液得到的低還原醣 ，如果進一步以澱粉分支酵素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖 轉移酶進行催化•則可得到低分子量和黏稠度的低還原醣 ，並且由於降低其還原力•因此更容易操作此醣類。當此 低還原醣再以葡萄糖澱粉酶水解時•則可提高α—葡萄糖 基海藻糖或低還原醣內海藻糖含量。而且當葡萄糖當量小 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )Α4規格（210X 297公釐） 一 7 - 第84105765號專利申請案^中文説明t修正頁 民ϋ 86年2月修正 426736 A 7 修正

II 年 80: 五、發明説明（5 於1 5的液化澱粉溶液利用非還原醣生成酵素和海藻糖釋 放酵素水解後’再以澱粉分支酵素和/或環麥芽糖糊精葡 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 萄糖轉移酶進行反應，則海藻糖產生的量將明顯高於僅使 用非還原醣生成酵素和海藻糖釋放酵素二種酵素進行催化 反應。非還原醣和低還原醣由於具有極佳安定性和易於操 控，因此可廣泛應用於食品 '化粧品和醫藥品上β 圖的簡述: 圖1 ·顯不溫度對於根瘤菌(Rhizobium sp. ) Μ — 1 1 (寄存於台灣食品工業發展研究所，寄存日： 1 9 94年6月21日，寄存編號：CCRC 9 1 0 0 02 )產生的 非還原醣生成酵素活性的影響。 圖2 :顯示酸鹸值對於根瘤茼Μ - 1 1產生的非還原醣生 成酵素活性的影響》 圖3 :顯示根瘤菌Μ _ 1 1的非還原醣生成酵素的熱安定 性。 圖4 :顯示根瘤菌Μ - 1 1的非還原醣生成酵素的酸鹼值 安定性· 經濟部中央標準局員工消費合作杜印焚 圖5 :顯示溫度對分節芽抱桿菌(Arthrobacter sp.) Q3 6 (寄存於台灣食品工業發展研究所*寄存日 :1994年6月21日，寄存編號：CCRC 9 1 0 0 0 1 )的非 還原醣生成酵素活性的影響。 圖6 :顯示酸鹼值對分節芽孢桿菌Q 3 6的非還原醣生成 酵素活性的影響。 圖7 :顯示分節芽孢桿菌Q 3 6的非還原醣生成酵素的熱 本紙張足度適用中國國家標丰（CNS ) Λ·!规洛（2丨0:<297公釐） 4 2 A7 B7 五、發明説明（6 ) 安定性。 圖8 :顯示分節1抱袢满_Q 3 6的非還原醣生成酵素的酸 鹼值安定性。 圖9 :顯示以DEAE TOYOPEARL分離海藻糖釋放酵素和非還 原醣生成酵素的沖提型態。 圖10 :顯示溫度對於根瘤茴Μ 一1 1的海藻糖釋放酵素 活性的影響。 圖11 :顯示酸鹼值對於根瘤菌Μ 一 1 1的海藻糖釋放酵 素活性的影響。 圖1 2 :顯示根瘤菌Μ _ 1 1的海藻糖釋放酵素的熱安定 性。 圖1 3 :顯示根瘤菌Μ - 1 1的海藻糖釋放酵素的酸鹼值 安定性= 圖.1 4 :顯示溫度對於分節芽孢捍茼〇 3 6的海藻糖釋放 酵素活性的影饗》 圖15 :顯示酸鹸值對於分節芽孢桿菌Q 3 6的海藻糖釋 酵素活性的影響。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1 6 :顯示分節芽孢桿菌Q 3 6的海藻糖釋放酵素的熱 安定性。 圖1 7 :顯示分節芽孢桿菌Q 3 6的海藻糖釋放酵素的酸 驗值安定性 主的詳紬柄加： t先：本發明中的非還原醣生成酵素可以催化低葡萄 糖當量液化澱粉溶液中的葡萄糖聚合度3以上的還原部份 各紙張尺度it财關家鮮（㈤）从移（21Gx297公疫） -9 - 67¾ 6; m2. 2(1 / f-r Ύγ>^ fr A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印賢 五、發明説明（7 ) 澱粉水解物形成α —葡萄糖基海藻糖。日本專利公開公報 No.349,216/93中列舉了可產生此種酵素的微生物’如： 粮瘤茼靥(Rh i zoh i urn ) '分節芽孢桿菌屬(Ar throbact:— er ) 、 _ 稈菌屬(Brevibacterium) ' 黃質菌屬(F 1 a b.Q.~ harterium)、球菌牖(Micrococcus) 、( Curtobacter- i um )、分枝榉菌臑（Mycobacter ium )和 Terrabacter ° 也可利用日本專利公開公報No. 166,011/94報導的硫化葉 菌靨(Sii 1 f n1 nbns )所產生的抗熱性非還原醣生成酵素β 海藻糖釋放酵素，則可專一性水解由非還原醣生成酵素催 化液化澱粉溶液產生的α -葡萄糖基海藻糖中海藻糖與其 他部份之間的鍵結。這種酵素可從刊載於日本專利公開公 報No. 79. 291/fU的根瘤菌靥（Rhizobium )，分節芽孢捍 菌屬(Arthrobacter )、短桿菌屬 C Brevibacterium)和 球茴騸(Mirrnrnnrns)中萃取•也可選用日本専利公開 公報No. 166, 126/94的抗熱性海藻糖釋放酵素，應用於本 發明。爲了製備非還原醣生成酵素和/或海藻糖釋放酵素 ，必須培養可產生此二種酵索的微生物* 我們可利用合成或天然培養基培養這些微生物•可爲 微生物同化利用的碳源物質包括：葡萄糖、果糖、乳糖、 蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、糖漿和還原部份澱粉水解物、 有機酸和其鹽類（例如：檸檬酸、琥珀酸和其鹽類）。培 養基的碳源濃度則依碳源種類而決定。例如：還原部份澱 粉水解物的濃度一般宜低於等於2 0%，或考慮微生物的 生長和繁殖宜低於等於5% »以無機鹽類如：銨鹽和硝酸 本紙張尺度適用中国围家標準（CNS ) Λ·4现格（210x：29?公噔） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 唏 -10 - 4267 3 6 Α7 Β7 五、發明説明（8 ) 鹽和有機氮化合物如：尿素、玉米浸液、酪蛋白、多腩' 酵母萃取物和肉萃取物做爲氮源。礦物質類如：鈣鹽、鎂 鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鉬 鹽和鈕鹽》如果有需要，也可添加胺基酸和維生素。 一般在 4_40°C (宜爲 20 — 37 °C)和 pH4_ 10 (宜爲PH5-9)的通氣條件下進行培養*而產生 抗熱性酵素的微生物，則一般在40 — 90 °C (宜爲50 -80°C)和ρΗ2 — 10 (宜爲PH3-9)的條件下 培養*培養時間則設定在1 0 - 1 00小時。而氧氣供應 並無特別限制，一般約〇 . 5 — 2 0 p pin。因此可利用 控制通氣、攪拌、供應氧氣和/或提高發酵瓶的壓力方式 ，而使其在氧氣狀況下進行培養。可利用單槽或連續方式 進行培養。 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 (請先閏讀背面之注^^項再填寫本頁) 將微生物經由上述方式培養，然後收集產生的酵素· 由於菌體和培養菌液的上清液都有酵素活性，因此可回收 各別部份或整個完整的培養菌液做爲製備粗酵素。利用固 體/液體分、離方法可將菌體從培養液中去除，例如：離心 法、過濾器過濾法和使用膜和中空纖維的膜過濾法。無細 胞的菌液可直接進行粗酵素製備，但一般會先行濃縮β濃 縮法包括：硫酸銨沈澱法、丙酮/酒精沈澱法和利用膜、 中空繊維的膜濃縮法。 無細胞菌液和其濃縮物可以一般方法進行固化，如： 結合至離子交換，共價或吸附於樹脂和膜及使用聚合物進 行包埋。分離自培養液的菌體可直接製備粗酵素或先行固 本紙伕尺度遑用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） -11 426736 A7 _ B7___ 五、發明説明（9 ) 化。例如：細菌體與精胺酸鈉混合，於氯化鈣溶液進行膠 化，形成顆粒狀。然後再以多乙烯亞胺或戊二醛處理。我 們可從菌體萃取酵素並利用此萃取物做爲粗酵素液。例如 :利用超音波分解法、使用玻璃珠和鋁的機械式分解法或 法式壓搾分解法·以萃取酵素·然後經過離心或膜過濾而得 到透明狀粗酵素液體》 將此酵素液體利用硫酸銨進行鹽析，透析法進行濃縮 ’然後通入、DEAE T0Y0PEAR1/的陰離子交換管柱層析儀 ’ 1UTYL TOYOPEARI/的忌水管柱層析儀和、TOYOPEARL HW-55#的凝膠過濾層析儀（以上的產品皆購自1〇3〇}1(：〇-rp.，Tokyo, Japan)，而得到均質化的酵素。 非還原醣生成酵素一般具有下列特性： (1 )作用機制 催化葡萄糖聚合度3以上的還原部份澱粉水解 物形成α -葡萄糖基海藻糖。 (2) 分子量 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、以硫酸+二酯鈉凝膠電泳法分析爲7 6 0 0 0 一87000道頓。 (3) 等電點 以Ampholine電泳分析爲p I 3 . 6-4 . 6 (4 )最適溫度 於PH7反應60分鐘時，爲3 5 — 40 °C。 (5 )最適酸鹼值 於40°C反應60分鐘時，爲pH6 . 4 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -12 - '426736 A7 B7 五、發明説明（l〇 ) 7.2° (6 )熱安定性 置於PH7，反應6 0分鐘時，穩定性可達 3 5 - 4 0 °C C 7 )酸鹼值安定性 於25 °C反應16小時時，pH爲5 . 5 — • 11 ° 非還原醣生成酵素的酵素活性測定方式如下：取4 溶於5 OmM磷酸鹽緩衝液（pH7)的2 5 w/v%麥芽五糖做爲受質，加入1 mj?酵素液體。於 40°C反應60分鐘；於1 00°C加熱1 0分鐘破壞酵素 活性，以去離子進行1 0倍稀釋，然後利用Somogyi-Ne卜 son方法測定其還原力。對照組的酵素則先以1 0 0 °C加 熱1 0分鐘使其失去活性，然後與實驗組相同的實驗條件 進行反應》1單位的酵素定義爲：每分鐘減少1微克麥芽 五糖還原力所需的酵素量。 而海藻、糖釋放酵素的物化特性如下： 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (1 )作用機制 專一性水解α —葡萄糖基海藻糖的海藻糖部份 與其他部份之間的鍵結。 (2)分子量 以硫酸十二酯鈉凝膠電泳分析爲5 7 0 0 〇 -6 8 0 0 0道頓 (3 )等電點 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2〖0X297公釐） -13 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 4 2 6 7 3 6 a? B7 五、發明説明（11 ) 以Ampholine電泳分析爲P 1 3 - 3 · 4 · 6 〇 (4 )最適溫度

於PH7、反應30分鐘，約爲35 — 45 °C 9 (5 )最適酸鹼值 於40°C、反應30分鐘，約爲PH6 -7.5« (6 )熱安定性 置於PH7、60分鐘，安定性達30 — 45 °C · (7 )酸鹼值安定性 置於25°C、16小時，約爲PH5 — 10 * 海藻糖釋放酵素的酵素活性測定方法如下：取4m j? 溶於50mM磷酸鹽緩衝液（pH 7)的1 . 25 w / v %麥芽三糖基海藻糖或a —麥芽四糖基α _ D -醣 苷做爲受質、，加入1 mj?酵素液體，於4 0°C反應3 0分 鐘，加入Somogyi’s銅液終止酵素反應，然後依照Sooiogyi -N el son方法測定其還原力。對照組則先將酵素在1 0 0 °c加熱1 0分鐘，使酵素失去活性，然後依照實驗組相同 的方法進行反應。1單位的酵素定義爲：每1分鐘增加1 微莫耳葡萄糖所需的酵素量。 本發明中的澱粉分支酵素可作用於葡萄糖當量小於 1 5的液化澱粉，水解澱粉內的分支。而一般的分支澱粉 本紙浪尺度適用中國國家標隼（CNS ) Μ規格（210 X 297公釐） (请先閱讀背面之注意事項再填寫本f ) -s

T 14 - A7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 bh. J. lid _ B7五、發明説明（12 ) 酶，異澱粉酶和商業化的酵素皆可使用。而環麥芽糖糊精 葡萄糖轉移酶則可增加葡萄糖當量小於15的液化澱粉的 澱粉轉移反應和不對稱性。可自由的選用來自於桿苗靥( Bacillus)和克萊勃士桿菌靨(Klebsiella)所產生的酵 素或商業化的酵素。 使用澱粉分支酵素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶 時可伴隨使用具有催化低葡萄糖當量液化澱粉而產生葡萄 糖3以上的寡醣類的其他種澱粉酶，例如：α —澱粉酶、 麥芽三糖生成澱粉酶、麥芽四糖生成澱粉酶、麥芽五糖生 成澱粉酶、麥芽六糖生成澱粉酶和麥芽七糖生成澱粉酶。 地上澱粉，如：玉米澱粉、稻米澱粉和小麥澱粉和地 下澱粉，如：馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉和樹薯澱粉皆可使用 在本發明。爲了液化這些澱粉，通常配成10%以上，宜爲 20— 50%的懸濁液，然後加熱，以機械式、酵素或酸進行 液化β液化程度宜低於葡萄糖當量15,最好低於葡萄糖當 量10。利用鹽酸、磷酸或草酸進行液化•然後再以碳酸鈣 、碳酸鋁或氧化鈣中和其酸鹼值。酵素液化的方法，則可 利用α —澱粉酶，而抗熱性液化α -澱粉酶之效果更好。 使用非還原醣生成酵素和澱粉分支酵素和/或環麥芽 糖糊精葡萄糖轉移酶或非還原醣生成酵素、海藻糖釋放酵 素、澱粉分支酵素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶催化 液化澱粉溶液時的溫度爲1 0 - 8 0°C (宜爲3 0 — 7 0 °C )、酸鹼值爲pH4 — 10 (宜爲PH5 — 8)。酵素 使用的次序並無限制|可以連續或同時使用。 本纸張尺度適用中國國家標绝·（ CNS ) A4ASL格（210 x 297公趁） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -15 - 426736 B7 經濟部中夬標準局貝工消費合作杜印製 五、 發明説明 ( 13 ) 酵 素 的 使 用 量 決 定 於 包 括 溫 度 的 反 應 條 件 〇 — 般 液 化 澱 粉 溶 液 使 用 0 0 1 一 1 0 0 u η i t s/g固體的非還原 醣 生 成 酵 素 和 海 藻 糖 釋 放 酵 素 1 一 1 0 0 0 0 u η 1 t S / S 固 體 的 澱 粉 分 支 酵 素 和 0 0 5 — 5 0 0 u η it s/ g固 體 的 環 麥 r t» 牙 糖 糊 棺 葡 萄 糖 轉 移 酶 0 利 用 澱 粉 分 支 酵 素 和 / 或 環 麥 芽 胜 糖 糊 稩 葡 萄 糖 轉 移 酶 與 非 還 原 醣 生 成 酵 素 或 非 還 原 醣 生 成 酵 素 和 海 藻 糖 釋 放 酵 素 催 化 液 化 澱 粉 溶 液 可 得 到 含 有 大 量 小 分 子 a — 葡 萄 糖 基 海 藻 糖 或 a — 葡 萄 糖 基 a ' 醣 甘 或 海 藻 糖 的 非 還 原 醣 的 低 還 原 性 醣 類 0 而 a — 葡 萄 樹 基 a — 醣 +4* 甘 包 含 a — D — 寡 葡 萄 糖 基 a — D — 寡 醣 -μ-μ 甘 〇 此 項 說 明 已 刊 載 於 曰 本 專 利 公 開 公 報 Ν 0 5 4 3 7 7 / 9 4 把 此 反 應 混 合 物 以 過 濾 法 和 離 心 法 去 除 不 溶 性 物 質 活 性 碳 脫 色 氫 和 氫 氧 離 子 型 的 離 子 交 換 法 進 行 去 除 離 子 和 純 化 然 後 濃 縮 成 糖 漿 產 物 Q 此 產 品 可 再 乾 燥 成 粉 末 狀 〇 我 們 可 進 步 利 用 一 種 以 上 的 方 法 純 化 此 继 樹 漿 製 品 以 提 高 非 還 原 醣 的 純 度 〇 例 如 使 用 離 子 交 換 管 柱 層 析 法 活 性 rtJ-r m 管 柱 僧 析 法 和 砂 膠 管 柱 層 析 法 進 行 分 層 法 使 用 酒 精 和 丙 酮 等 有 機 溶 劑 進 行 部 份 沈 澱 法 利 用 適 當 膜 進 行 分 離 法 利用 酵 母 和 鹼 處 理 的 發 酵 處 理 法 以 去 除 或 分 解 殘 餘 的 還 原 醣 〇 當 大 規 模 生 產 非 還 原 醣 我 們 可 利 用 刊 載 於 曰 本 專 利 公 開 公 報 N 0 S 2 3 7 9 9 / 8 3 和 7 2 5 9 8 / 8 3 的 方 法 即 使 用 強 酸 性 陽 離 子 交 換 管 柱 層 析 法 去 除 污 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210 X 297公釐} 16 - 4267 3 6 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明 ( 14 ) 染 的 醣 類 並 增 加 非 還 原 醣 含 量 〇 此 時 ， 我 們 可 白 由 選 擇 固 定 床 方 法 > 移 動 床 方 法 和 假 移 動 床 方 法 0 如 果 有 需 要 9 我 們 可 利 用 如 ； a — 澱 粉 酶 > β 一 澱 粉 酶 和 葡 萄 糖 澱 粉 酶 的 a — 醣 甘 酶 或 搬 粉 酶 ， 將 含有海 薄 糖 的 非 還 原 醣 或 低 us 原 醣 進 行 分 解 y 以 控 制 其 甜度 和 還 原 力 和 / 或 降 低 黏 稠 度 或 者 將 殘 餘 的 還 原 醣 氫 化 形 成 醣 醇 以 消 除 其 還 原 力 〇 特 別 是 利 用 葡 萄 糖 澱 粉 酶 或 a — 醣 甘 酶 催 化 帶 有 傅 藻 糖 的 非 還 原 醣 或 低 還 原 醣 將 非 常 容 易 形 成 海 藻 糖 將 非 還 原 醣 或 低 還 原 醣 以 葡 萄 糖 澱 粉酶 或 a — 醣苷 酶 進 行 催 化 形 成 海 藻 糖 和 葡 萄 糖 的 混 合 溶 液 將 此 溶 液 通 過 離 子 交 換 管 柱 儀 進 行 純 化 以 去 除 葡 萄 糖 然 後 回 收 富 含 海 藻 糖 的 液 體 部 份 0 將 此 回 收 部 份 經 ·?Μ m 純 化和 濃 縮 步 驟 形 成 糖 漿 產 物 並 進 一 步 濃 縮 至 過 飽 和 狀 態 然 後 結 晶 化 成 含 水 海 藻 糖 結 晶 或 Art 撕 水 海 藻 糖 結 晶 0 爲 製 造 含 水 海 藻 糖 結 晶 將 純 度 6 0 % 或 更 高 濃 度 約 6 5 ——S 9 0 % 的 高 海 藻 糖 含 量 液 體 置 於 結 晶 器 逐 漸 冷 卻 到 9 5 °C 或 更 低 溫 ( 宜 設 定 在 1 0 — 9 0 V ) 〇 如 果 有 需 要 可 加 入 0 • 1 — 2 0 % 結 晶 種 而 得 到 含 水 海 藻 糖 結 晶 的 糖 膏 0 在 本 例 中 可 運 用 減 壓 濃 縮 的 連 續 結 晶 法 而 從 糖 膏 製 備 含 水 海 藻 糖 結 晶 或 含 此 結 晶 的 醣 類 混 固 體 的 方 法 包 括 一 般 結 晶 分 離 法 I 塊 狀 粉 碎 法 液 atm 體 床 顆 粒 法 和 噴 霧 乾 燥 法 Q 結 晶 分 離 法 適 合 做 爲 製 造 高 純 度 含 水 海 藻 糖 結 晶 0 將 本紙張尺度適用中國國家橾準（CMS ) A4規格（210X 297公釐） -17 - '4267 3 6 at Β7 五、發明説明（15 ) 糖胥經過籃式離心分成含水海藻糖結晶和母液；然後將結 晶部份進行噴霧乾燥並以少量冷水進行沖洗。噴霧噴燥法 的濃度爲70 - 85%、結晶率達到20 — 60%。將糖 資通過高壓幫浦推動的管口進行噴霧，以不會使結晶粉末 溶化溫度的熱氣流進行乾燥（如60 — 100 °C)，然後 以3 0 — 6 0°C的熱氣流進行熟成（大約需1 — 2 0小時 )，而製得非或低吸溼性結晶混合物固體。塊狀粉碎法的 糖膏含水率爲1 〇 — 20%，結晶率達1 0 — 60%。本 法一般是將糖膏置放0.1-3天形成塊狀固體，然後磨 碎、乾燥，而製得非或低吸溼性結晶混合物固體。 而無水海藻糖結晶之製備|則是將含水海藻糖結晶乾 燥或將高海藻糖含量濃縮液（含水率低於1 〇%)置於結 晶器，在結晶種存在下於5 0 — 1 6 0°C攪拌（宜爲8 0 -1 4 0°C)而得到糖育，然後利用塊狀粉碎法、液體床 顆粒法和在相當熱和乾燥條件下反應的噴霧乾燥法進行濃 縮與磨碎。 經濟部中央橾準局—工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 非還原、醣和低還原醣與胺基酸、寡胜肽和蛋白質一起 混合或加工時，由於醣類的低還原力使其非常安定，因此 不會有褐變和不悅的氣味產生，也不會造成胺基酸物質的 損害。而且這些醣類具有低還原力、黏稠度和低葡萄糖聚 合度使其具有高純度和適中甜度。 而且這些醣類易消化、吸收並做爲能量來源》因爲它 們可被澱粉酶，特別是胰α —澱粉酶分解成小分子非還原 醣寡糖和小分子麥芽寡醣，然後被α -醣苷酶和小腸酵素 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） -18 - 4 2 b /426736 Α7 Β7 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 五、發明説明（16 ) 分解成葡萄糖和海藻糖；而海藻糖再被海藻糖酶分解成葡 萄糖。由於這些醣類難被牙齒骨疽形成微生物所發酵，因 此適合做爲甜味劑。其他的特性包括：具有控制滲透能力 、塑形性、光澤性、保溼性、黏稠性、防止其他醣類結晶 化、減少發酵能力和防止膠化澱粉的退化" 根據本發明得知：海藻糖以管灌或輸送液形式輸入時 不會有任何毒性、副作用且易於代謝與利用，因此適合做 爲能量補充劑。高海藻糖含量的結晶也可和黏合劑如：支 鏈澱粉、羥乙基澱粉、多乙烯基四次甲基亞胺共同組合使 用做爲錠劑的包衣》 而且本發明的海藻糖可做爲化粧乳、頭髮潤絲精、乳 液和臉部化粧水的保溼劑、填充劑以及黏稠劑。海藻糖可 與其他保溼劑，如：丙烯乙二醇、1 ，3 — 丁烯乙二醇、 甘油、山梨糖醇和多羥乙烯油醇和α -葡萄糖基一 L 一抗 壞血酸、酵素處理的芸香醇等維生素一起使用，使化粧品 具有極佳保溼力，防止紫外線輻射造成的斑點和雀斑以及 美白皮虜。、 而無水海藻糖結晶可做爲食品、化粧品、醫藥品、原 料和中間物等含水物質的乾燥劑，促進粉末、顆粒和錠劑 等高品質固體產品的安定性。 因此非還原醣和低還原醣可做爲包括：食品、煙草、 香菸、飼料、化粧品和藥品的甜味劑、味道改良劑、品質 改良劑、安定劑、塑形劑和乾燥劑。 非還原醣和低還原醣可做爲增加甜度的調味料。如果 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -19 - 4 2 67 36 A7 B7 五、發明説明（17 ) 有需要，在使用前它們可和其他甜味劑和/或填充劑相混 合，例如：澱粉糖漿粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、異化糖 、蜂蜜、楓葉糖、異麥芽寡醣、半乳糖寡醣、果糖寡醣、 乳蔗糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、二氫查耳酮、甜 菊精、d —葡萄糖基甜菊精、rhebaudioside'甘草酸、 L -天冬胺醯_L-苯丙胺酸甲基酯、糖精、甘胺酸、糊 精、澱粉和乳糖。 非還原醣和低還原醣可與填充劑、媒介物和黏合劑一 起使用塑造各種不同形狀，例如：顆粒狀、球形、棒狀、 板狀、立方形和片狀。 非還原醣和低還原醣可做爲增加甜度和/或改善食品 味道及品質。因爲它們與含有其他味道如：酸、鹹、澀、 芳香、苦味的物質具有很好調和性* 經濟部中央標準局貝工消賢合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如它們可應用於許多種調味料上，如：胺基酸：胜 肽、醬油、醬油粉、味噌、味噌粉、酒精'鹹魚、魚香鬆 ，美乃滋、沙拉作料、醋、三杯醋、壽司所用的醋粉、中 菜佐料、炸物沾醬、涼麵沾料、醬汁、蕃茄醬、烤肉醬、 咖哩粉 '燉湯汁、肉汁、調味料、核酸調味料 '混合調味 料、甜酒、新甜酒、糖和咖啡糖。 而且它們可做爲甜味劑和/或改善味道及品質，例如 一些日式點心，如：煎胼，、米蓽、糕點小米茱、糖栗、豆 沙包子 '米稞、豆醬、年羹、水羊羹、米稞、杲子凍和糖 果；西式點心，如：麵包、餅乾、蘇打胼、小酥胼、派' 布丁、奶油、卡士達、泡芙、蛋奶餅、海棉蛋糕、甜甜圈 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（210X297公夔〉 -20 - 426736 A7 _ B7 五、發明説明（18) 、巧克力、口香糖、牛奶糖和糖果；冷凍點心，如：冰淇 淋和冰凍果子露；糖漿如：蜜餞果實和刨冰糖水；醬如： 小麥醬、花生醬和水果醬；加工水果和蔬菜如：果醬、橘 子醬、蜜餞果實、監漬蔬菜和醣杲；醃漬物及產品如：什 錦醬菜、醃蘿蔔、醃薄片蘿荀、薤醬；醃漬物原汁，如： 醃薰蘿蔔佐料，醃白菜佐料；肉類產品，如：火腿和臘腸 :魚·肉產品，如：魚肉火腿，魚肉臘腸、板魚、竹輪和甜 不辣；佐料，如：海膽醬、烏賊醬、酸昆布、魷魚絲和醃 甜酒河豚干：a煮熟魚貝〃如：海草、山菜、小魚和貝； 每餐菜如：煮豆、馬鈴薯沙拉和昆布捲；乳製品，如：優 格和乳酪；罐頭和瓶裝食品，如：魚肉、肉、水果和蔬菜 :酒精類飲料，如：清酒，合成清酒 '酒和西式酒精飮料 ;清涼飮料，如：咖啡、茶、可可'果汁'碳酸飮料、乳 酸飲料和含乳酸菌飲料；簡便食品，如：布丁混合物、熱 蛋糕混合物、速食紅豆湯和簡便湯；和其他種類食品，如 :嬰兒食品、治療食品、瓶裝飮料、胜肽食品、冷凍食品 和乾燥食品>。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 t請先閱讀背面之注意事項再填寫本I) 而且這些醣類可應用於家畜、家禽、蜜蜂、蠶和魚的 飼料內，做爲甜味劑、味道改良劑、味道掩飾劑 '品質改 良劑和安定劑，以改善其品質。它們也可應用於固體、糊 狀或液體組成物內，例如菸草、香菸、化粧品和藥品中， 包括：牙粉、口紅、唇膏、內服藥、藥片、錠劑、鳕魚肝 油、口腔芳香劑和嗽口藥水。 這些醣類也可做爲生物活性物質、健康食品和醫藥內 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 '426736 B7 _ 五、發明説明（19 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的品質改良劑或安定劑。生物活性物質中的淋巴因子’例 如：干擾素α、干擾素点、干擾素7、腫瘤壞死因子α、 腫瘤壞死因子jS、吞噬細胞游走抑制因子、菌落刺激因子 、轉移因子和內白血球溶菌素2 ;荷爾蒙，例如：胰島素 、生長激素、催乳激素、造血素和促卵泡激素；生物製劑 ，例如：BCG疫苗、日本腦炎病毒疫苗、破傷風毒素、 TrinTeresurus抗毒素和人類免疫球蛋白；抗生素，例如： 青徽素、紅黴素、可羅酚尼克（chroramphenicol)、四 環素、鏈徽素和康那徽素：維生素，例如：硫胺素、核黃 素、L-抗壞血酸 '鯖魚肝油、類胡蘿蔔素、麥角固醇和 生育素：酵素，例如：脂解酶 '彈性蛋白酶、尿激酶、蛋 白酶、-澱粉酶、異澱粉酶、聚葡萄酶和乳酸酶；萃取 物，例如：人參》似蕺的烏龜、綠藻、aroe和蜂膠；微生 物，例如：病毒、乳酸菌和酵母菌；和包括蜂王漿的生物 活性物。因此我們將相當容易製造固體、糊狀或液體狀具 安定性、高品質的健康食品和醫藥品，而不會損失其中活 性或有效組、成份。 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 利用加工過程中的混合、溶解、熔化、浸泡、滲入、 塗抹、包裹、噴霧、注射、結晶和固化等步驟，可將此非 還原醣和低還原醣溶入組成物內。而這些醣類的含量一般 約估0·1%或更高，宜爲1%以上。 本發明將提出幾個參考例，以做爲更詳細解說的參考 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22 - 426736 A7 B7 a— fi -1 * ^ Ά Λ 、 明 Hf 20 ) ψ m 1 ρ枏瘤菌μ_ 1 1製備非還原醣生成酵素 將含2W/V%麥芽糖、0 . 5w/v%多腩、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇 . lw/v%酵母萃取物、〇 . Iw/v%磷酸氫二納 、0 . lw/v%磷酸二氫鉀的液體培養基（PH7) 1 00mJ2置於5 OOmJ?三角錐瓶’於1 20°C滅菌 20分鐘，冷卻，接種單—菌落的根瘤菌M-11C CCRC 910002)於 27°C、13〇rpm 振還 培養2 4小時* 取2 0 32與上述相同的培養液置於3 0又發酵器內， 滅菌、冷卻到3 0°C，然後接種1 w/v%上述的菌液， 於攪拌逋氣狀況、3 0°(：、〇116_8條件下培養2 4小 時。此菌液的酵素活性爲1 5units/mj?。取一小部 的菌液做爲樣本，然後離心’分開菌體和上清液*將菌體 懸浮於50mM磷酸鹽緩衝液（PH7)，調整其體積與 樣本相同》然後分別測上清液和菌體懸浮液的酵素活性， 分別爲 0 . 9units/mj?和 0 . Gunits/m^。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 窗賒2 :酵素純化 取由實驗1得到的1 8 β菌液，利用高壓細胞分解器 ' Μ I Ν I L A Β 0 ’ （購自 D a i n i ρ ρ ο η P h a r m a c e u t i c a 1 C 〇 ·， Ltd., Tokyo, Japan)將細胞打破。經過 1 0 0 0 0 r pm離心30分鐘，得到16ί的上清液，加入硫酸錢 至飽和度爲0 · 2，置於4 °C 1小時，離心，取得上清液 衣紙張尺度適用中國國家標旅（CNS ) A·；現格UIOXIM公釐> —23 - A26736 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7______ 五、發明説明（21 )

將上清液加入硫酸銨至飽和度爲0 . 6，置於4 °C 2 4小時，離心取得沈澱物*然後溶於1 OmM磷酸鹽緩 衝液（pH7)，並以相同的緩衝液進行24小時透析。 離心去除不溶性物質，將大約3 6 OmJ?的透析液分成二 次注入填充3 0 0 mi2 lEAE T0Y0PEARI/的離子交換層 析管。利用新鮮製備含有氯化鈉的相同緩衝液將吸附於 DEAE' T0Y0PEARI/的酵素沖提下來。再以含有2Μ硫酸銨 的相同緩衝液對具酵素活性部份的液體進，行透析，離心去 除不溶性物質，然後把上清液通入填充300m交^ BUTYL TOYOPEARL 6 5(Τ的忌水層析管柱。以含2 Μ - 0 Μ硫酸銨直線梯度溶液將吸附於管柱上的酵素沖提下來 ，收集具酵素活性的部份。再把收集的濾液，通入填充 3 0 0 m j ’TOYOPEARL HW-55"的凝膠過濾層析管柱， 並收集具酵素活性部份β純化過程中所測得的酵素活性、 比活性和產率列於表1 » 經過凝膠過濾法所收集得到的濾液，以7. 烯醯胺凝膠‘電泳法分析，爲一單一蛋白質帶，顯示本酵素 具高純度且均質化。 本紙張尺度通用中國國家標羋（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-24 - A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 426736 B7 五、發明説明（22 ) 表 1 純化階段 酵素活性 比活性（單位/ 產率 (單位） 毫克蛋白質） (% ) 完整菌液 26,800 - 100 破裂培養菌的上清液 20,300 0.10 76 以硫酸銨鹽析得到的 16, 100 0.32 60 液體 經離子交換管柱層析 11,300 5. 5 42 法得到的濾液 經忌水管柱層析法得 5,730 98 21 到的濾液、 經凝膠過濾法得到之 3,890 195 15 據液 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25 - 426736 A7 ____B7_ 五、發明説明（23 ) 實驗3 :酵素特件 將實驗2得到的純化酵素以1〇%硫酸十二酯鈉聚丙 烯醯胺凝膠電泳法決定其分子量，並與購自：fapan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan 的標準蛋白 相比較 ，而 得知其分子量約爲7 7 0 0 0_8 7 0 0 0道頓。 利用2% Ainpholine的聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析， 其等電點爲3 . 6 — 4 . 6。 酵素作用的最適溫度和酸鹼值顯示在圖1和2。當酵 素在PH7 ·反應60分鐘時，其最適溫度爲40 °C;當 酵素在4 0°C反應6 0分鐘時，其最適酸鹼值爲7。酵素 的熱安定性則以下列方法測定：將酵素置於5 ΟτηΜ磷酸 鹽緩衝液（ΡΗ7)於不同溫度下反應6 0分鐘，冷卻， 然後測定殘餘的酵素活性。而酵素對酸鹼安定性的測定方 法如下：將酵素置於2 5 °C，不同酸鹼值的5 OmM磷酸 鹽緩衝液反應1 6小時，然後調整PH = 7並測其殘餘酵 素活性》其結果分別顯示在圖3和4。其熱安定性可到達 4 0 °C，酸、鹼值安定性爲p Η 6 — 9。 經濟部中央榡隼局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗4 :非還原醣的製備 以2 0 %葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥 芽五糖，麥芽六糖或麥芽七糖水溶液做爲受質，加入2 units/g受質固體的由實驗2得到的純化酵素，於pH 7、4 0 °C反應4 8小時。去除離子’利用高效能液體層 析儀 'WAKO BEADS WB-T-33IT (購自 Wako Pure Chemic-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 - 4267 3 6 A7 B7 五、發明説明（24 ) a 1 I n d u s t r i e s, L t d · , 0 s a k a, J a p a η )分析反 I 應產物。 將此儀器保持在室溫，水的流速爲〇 · 5mi/mi η， 利用^ Mod el RI-8012#這種微分反射儀（differential reflactometer )(購自 Tosoh Cqrρ , Tokyο，Japaη )進 行分析。其結果顯示在表2。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27 - 426736 A7 B7 五、發明説明（25 ) 表 2 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 受質 反應產物 以高效能液相層析儀 分析的流出時間（分） 組成份 (% ) 葡萄糖 葡萄糖 33. 4 100.0 麥芽糖 麥芽糖 28.5 10 0.0 P I 23.3 35. 0 麥芽三糖 麥芽三糖 25.9 65.0 Ρ Π 21.6 85. 6 麥芽四糖 麥芽四糖 24.1 14. 4 pm 19.7 9 2.7 麥芽五糖 '麥芽五糖 22.6 7. 3 P IV 18.7 93.5 麥芽六糖 麥芽六糖 21.4 6.5 P V 17.8 93.4 麥芽七糖 麥芽七糖 2 1.0 6.6 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 426736 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（26 ) 註：表中的p I ，pn，pm，Piv和pv分別代表以麥 芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖，麥芽七糖 爲受質時，新生成的醣類。 由表2可知：反應產物包含殘餘的受質和新生成的醣 類P I ，PH，，PIV和PV，除此之外並無偵測到 其他醣類。其中葡萄糖聚合程度爲3的醣類p I產率相當 低；而葡萄糖聚合程度4以上的醣類ρ π，pm，p IV和 p v則有非常高產率，佔8 5%以上。而以葡萄糖或麥芽 糖爲受質，則不會生成其他種類的醣類》 爲了純化新生成的醣類，我們將反應產物脫色、去除 離子、濃縮並注入交叉鍵結程度4 %的強酸性鈉離子的陽 離子交換樹脂（購自 Tokyo Orgamic Chemical Industries, Ltd.， Tokyo, Japan) 。 此樹 脂填充於內徑 2 cm， 長度1 m的夾套式不銹鋼管柱。將管柱內部溫度保持5 5 °C，然後注入5v/v%的反應產物，以55°C水、空間 速度0 . 1、3的條件下，將樣品沖提下來，可回得得到 9 7%以上的高純度新生成醣類。再把此回收濾液經真空 冷凍乾燥，可得到佔受質乾重9%、純度97.5%的醣 類PI;佔受質固體乾重65%、純度98.6%的醣類 ΡΠ;佔受質固體乾重82%、純度99.5%的醣類 Pm:佔受質固體乾重80%、純度98.4%的醣類 PIV和佔受質固體乾重7 7%、純度9 8 . 4%的醣類 P V · 本纸張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐) —-29 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

426736

7 7 A B 經濟部中央橾準局舅工消費合作社印製 五、發明説明（27 ) 利用Somogyi-Nelson的方法測定新生成醣類的還原力 (以葡萄糖當量表示）•結果列於表3。 從表3明顯看出，製備得到的醣類的葡萄糖當量數值 皆很小"其所具有的微弱還原力，可能是殘餘的還原性麥 芽寡醣所造成：而所有新生成醣類則不具有還原性。 表 3 製備的醣類 純度（％ ) 葡萄糖當量 P I 97.5 0. 83 Ρ Π 98.6 0. 35 Ρ ΙΠ 99.5 0. 10 P IV 98. 4 0.27 P V 98.4 0.23 實_驗5 :梅納反應 取1 0%濃度的醣類P I ，P Π ， pm ，P IV 或 P V 與溶於5 OmM磷酸鹽緩衝液（ρ Η 7 )的 1 %甘胺酸， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） -30 - 426736 A7 B7 _ 五、發明説明（28 ) 於1 00 °C反應90分鐘，冷卻，然後以1 cm比色管於 4 8 0 nm測其吸光值。對照組則取麥芽三糖、麥芽四糖 、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖，經過上述相同的處理 並測4 8 0 ηπι的吸光值。結果顯示於表4 ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4C格（210 X 297公釐） 426736 Α7 Β7 五、發明説明（29 ) 表 4 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 醣類組別 吸光值（4 8 0 η m ) 組別 Ρ I 0.027 實驗組 P H 0.018 實驗組 pm 0.012 實驗組 P IV 0.016 實驗組 P V 0.015 實驗組 麥芽三糖 0. 623 對照組 麥芽四糖 0.475 對照組 麥芽五糖 0. 369 對照組 麥芽六糖 0.318 對照組 麥芽七糖 0.27 1 對照組 本紙張尺度適用中國國家橾李（CMS ) A4洗格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -32 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4267 3 6 A7 _B7_ 五、發明説明（30 ) 由表4結果可知：新生成醣類p I ，ρπ，pm， PIV或P v發生梅納反應的比率，僅爲麥芽寡醣的3 — 6 %。因此經由本發明的新型酵素所生成的醣類，並不易產 生梅納反應。 實驗6 :利用葡萄糖澱粉涵推行酵素水解 取5 Omg由賁驗4得到的非還原醣P I 、ΡΠ、pm 、PIV或PV溶解在lmj? 5 OmM磷酸鹽緩衝液（ PH7)，加入1單位的葡萄糖澱粉酶（購自Seikagaku Corp_，Tokyo, Japan)於4 Ο ΐ反應6小時進行酵素水 解反應。利用高效能液相層析法分析分解產物，而偵測到 葡萄糖和海藻糖二種成份。其結果列於表5。 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2IOX2W公釐） (請先閱讀背面之注項再填寫本頁)

A7 426736 B7 五、發明説明（31 ) 表 5 醣類種類 葡萄糖 C % ) 海藻糖 C % ) 莫耳比 (葡萄糖/海藻糖） P I 36. 2 63.8 1.07 P Π 52. 0 48.0 2.06 P m 61.4 38.6 3. 02 P IV 68.3 31.7 4. 09 P V 72.9 27. 1 5.11 從表5>結果得知：非還原醣P I 產生1分子的葡萄糖和1分子海藻糖 產生2分子葡萄糖和1分子海藻糖： 以葡萄糖澱粉酶水解 :非還原醣Ρ Π水解 非還原醣ρ ΙΠ水解產 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作杜印裝 生3分子葡萄糖和1分子海藻糖；非還原醣PW水解產生 4分子葡萄糖和1分子海藻糖；非還原醣PV水解產生5 分子葡萄糖和1分子海藻糖。 考慮葡萄糖澱粉酶催化反應的特性，這些醣類可能是 藉由α — 1，4或a — 1 ，6鍵結方武將葡萄糖與海藻糖 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（2丨0X297公釐） -34 - 4267 3 6 at ___B7 五、發明説明（32 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 相結合：非還原醣P I的葡萄糖聚合度爲3 ，是由1分子-蔔萄糖和1分子相結合；非還原醣ρ Π的葡萄糖聚合度爲 4 ’是由2分子葡萄糖和1分子海藻糖相結合；非還原醣 Pm的葡萄糖聚合度爲5，是由3分子葡萄糖和1分子海 藻糖相結合；非還原醣PIV的葡萄糖聚合度爲6，由4分 子葡萄糖和1分子海藻糖相結合；非還原醣PV的葡萄糖 聚合度爲7 ’由5分子葡萄糖和1分子海藻糖相結合。非 還原醣Ρ I 、ΡΠ、Pm、PIV和卩乂與万-澱粉酶進行 反應，結果如下：非還原醣P I和ΡΠ不被分解；非還原 醣Pm分解成1分子麥芽糖和1分子非還原醣PI;非還 原醣PIV分解成1分子麥芽糖和1分子非還原醣ΡΠ ;非 還原醣PV分解成2分子麥芽糖和1分子非還原醣ΡI。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 從以上結果顯示：本發明的非還原醣生成酵素進行分 子內轉化反應，並不會分解或聚合受質，即不改變葡萄糖 聚合度。因此非還原醣ρ I 、ρπ、pm、ριν和pv可 能是葡萄糖基海藻糖，a —麥芽糖基海藻糖、α-麥 芽三糖基#藻糖，α -麥芽四糖基海藻糖和α -麥芽五糖— 基海藻糖。這些分子可以簡式-葡萄糖基海藻糖"表 示之（Gn-T，其中G，η和Τ代表葡萄糖基、糖基數 目和α -海藻糖）。 實驗7 :以其他酵素進行分解反應 將實驗4得到的非還原醣ρ I 、p n、p in、p iv和 P v做爲受質，與豬胰臟α —澱粉酶、玉米α -葡萄糖苔 本紙張尺度適用中國國家標ΐ ( CNS ) Α4规格（2i〇X297公釐） 426736 . A7 B7 __ 五、發明説明（33 ) 酶或丙酮粉末老鼠小腸酵素（皆購自512〇13(：1^1^〇31_(：〇.-，St Louis, Missouri, USA)反應，然後以高效能液相 層析法分析組成份。取1 0 mg受質溶解在lmj?的5 0 mM磷酸鹽緩衝液（pH6 . 9)中，加入1單位的α — 澱粉酶，於3 7°C反應1 8小時。而α —葡萄糖苷酶和丙 酮粉末化老鼠小腸酵素組的反應則在5 0 m Μ醋酸鹽緩衝 液（ΡΗ4)和5 OmM失水蘋果酸緩衝液（ρΗ6)條 件下進行。反應產生的醣類分解產物組成份分列於表6 ' 7和8 。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央操準局員工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標牟（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 426736 A7 B7 五、發明説明（34 ) - 表 6 醣類 以α -澱粉酶進行分解反應的產物組成份 (% ) Ρ I Ρ Π G 3 G 2 G 1 P I 97.3 0 2.3 0. 4 0 Ρ Π 0 98.8 0.4 0. 8 0 ρ κι 61.0 4.8 0 33.0 1 . 2 P IV 47. 2 3.3 40.4 7.5 1.6 P V 10.2 44. 9 35. 3 8,6 1.0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 註：表中昀G3，G2和G 1分別表示麥芽三糖，麥芽糖 和葡萄糖> 由表6結果顯示：ΡI和ΡΠ醣類難被α-澱粉酶水 解，而pm、PIV和PV醣類則被水解成較小分子的寡醣 類，即：PI和ΡΠ醣類、麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ο X 297公釐） -37 - 4267 3 6 A7 B7 五、發明説明（35 ) - 表 7 以α-葡萄糖苷酶進行分解反應的產物組成份（％) 醣類 葡萄糖 海藻糖 其他 P I 36.5 6 3.0 0.5 Ρ Π 52. 1 47.6 0. 3 p m 61.7 38.1 0. 2 P IV 69. 5 30.2 0.3 ρ ν 71.4 28.3 0.3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -38 - 426736 A7 B7 五、發明説明（38 ) - 表 8 减粧 以丙酮粉末老鼠小腸酵素進行分解 反應的產物組成份（％) 酷類 葡萄糖 海藻糖 其他 P I 3 7.2 62.4 0.4 Ρ Π 52.5 47. 1 0.4 pm 62.0 37.6 0.4 P IV 68.8 30.8 0.4 P V 73.4 ♦ 26.5 0.1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

由表7和8結果顯示：葡萄糖苷酶和丙酮粉末化 老鼠小腸酵素與實驗6的葡萄糖澱粉酶都可水解醣類Ρ I 、ΡΠ、pm、PIV和PV成爲葡萄糖和海藻糖。 將經α -葡萄糖苷酶和丙酮粉末老鼠小腸酵素水解的 產物進一步與豬腎藏海藻糖酶（購自Sigma Chemical Co. ，St·，Louis, Missouri, USA)於 pH5 · 7、37°C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -39 - 年月曰二 c V. )备正1 4 2 6 7 3 6 A7 B7 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 五、發明説明（37 ) 反應1 8小時|然後以高效能液相層析法分析醣類產物的 組成份β結果顯示〇：—葡萄糖苷酶或丙酮粉末老鼠小腸酵 素水解醣類ρ I 、ρπ、pm、Piv和pv生產的海藻糖 ，可被海藻糖酶進一步分解成葡萄糖。 如上述： (1 )非還原醣生成酵素可催化葡萄糖聚合度3以上的還 原性部份澱粉水解物，形成〇£ -葡萄糖基海藻糖， 但不改變葡萄糖聚合度。. (2) α -澱粉酶催化非還原醣PV、主要產生非還原醣 Ρ Π和麥芽三糖；而葡萄糖澱粉酶催化非還原醣 PV產生1分子海藻糖和2分子葡萄糖。 因此本發明的非還原醣生成酵素提供了一個完全新的 作用機制，即：將還原性部份澱粉水解物末端的還原基經 過分子內轉化方式變成非還原性海藻糖結構。 實驗8 :急件毒件 非還原醣ρ I 、ρπ、pm、Piv和pv的急性毒性 試驗*則是將這些醣類以經口投予方式給7週大的小老鼠 *由結果顯示：當給予小老鼠接受最高劑量時，並無觀察 到任何動物死亡，因此這些醣類可能是低毒性物質。其致 死半劑量（LD5。）爲50g/kg或更高量。 窗驗9 :從分節芽孢桿菌Q 3 6製備非還原醣生成酵素_ 以分節芽孢捍菌Q 36CCCRC 910001) 冢纸张尺度適用中國國家榡準（CNS ) Λ4規格（2丨0X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -40 - 年 426736 A7 B7 五、發明説明（卵） 取代實驗1的根瘤茼Μ -11 ( C C R C 9 1 0 0 0 2 )，進行72小時培養。培養液內的非還原醣生成酵素活 性爲1 . 2units/me。菌體懸浮液和上清液的酵素活 性分別爲 0 · 5units/m 芡和 〇 · 7units/mj?。 眚験1 0 :酵素純化 由實驗9方法得到的1 8 菌液，經過與實驗2相同 的步驟純化，結果顯示在表9 β 將經過凝膠過濾法得到的純化酵素，以電泳法分析其 純度發現：僅有單一蛋白質帶，顯示此酵素已達均質化且 具高純度。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印敦 -41 - 6 2 4 6 3 五、發明説明（39 ) 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 表 9 純化階段 酵素活性 比活性（單位/ 產率 (單位） 毫克蛋白質） (% ) 完整菌液 21,600 — 100 分裂細胞的上清液 17,500 0.14 8 1 以硫酸銨鹽析得到的 液體 15,700 0.41 73 經離子交換管柱層析 法得到的濾液 12,600 6.5 58 經忌水管柱層析法得 到的濾液Γ 8,820 98 41 經凝膠過濾法得到的 濾液 5,290 201 24 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-'° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X29*7公釐） -42 -

五、發明説明（40 ) 實驗1 1 :酵素特性 將實驗1 0得到的純化酵素’利用實驗3相间的方法 測定其性質，結果如下：分子量76，000~ (锖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 86，000道頓，等電點Pl = 3 . 6 — 4 · 6，酵素 最適溫度爲40°C (圖5) ’最適酸鹼值爲6 . 5__ 7 ( 圖6)，溫度穗定性可達40 °C (圖7)，酸鹸值穩定性 約 6 — 9 . 5 (圇 8 ) 9 實驗1 2 :非還原醣製備 將實驗1 0得到的純化酵素，利用實驗4和6方法製 備與分析其醣類產物發現：本酵素與根瘤菌Μ - 1 1產生 的非還原醣酵素一樣，具有催化葡萄糖聚合度3以上的還 原性部份澱粉水解物生成α —葡萄糖基海藻糖6 經濟部中央標準局员工消费合作社印" 實驗_1 3 :從一般微牛物製備非還原醣牛成醅素及茸特件 將已知可產生非還原醣生成酵素的微生物依實驗1的 條件：2 7 °C，培養7 2小時，除了恥垢分桉桿菌( Mycobacterium smegmat i s, ATCC19420)培養 在37 °C»然後純化，分析其特性（表l〇)。 本纸張尺度〔4用中國國苳標毕（CNS ) Λ4現格（210X297公履） -43 - 426736 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印策 五、發明説明（41 ) 表 10 一 微生物 離子交換管柱濾出液 最適雛 最適酸鹸値 驗定性 酸鹼値安定性 微黃短桿菌 (ATCC11822) 2,700單位 約 35°C 約6.5 最高動5°C 約5.5-11 水生黃桿菌 (IF03772) 216單位 約35V 約6.5-6.9 最高至約35。。 約6_0-9.5 藤黃微球菌 (IF03064) 1，730單位 約 35°C 約6.4-6.8 最高至約350C 約6.5-8.0 薔薇色球菌 (ATCC186) 1,340單位 約 35。。 約6.8-7.2 最高至約35。。 約6.0-11 Curtobacteriuin 1,290 單位 citreum . (IF015231) 約 30°C 約6.4-6.8 最高至約35°C 約6.5-7.8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2517公釐） -44 - 426736 A7 B7 五、發明説明（42 表10 (繼續） 微生物離子交換管柱濾出液最適溫度最適酸瞼値熱安定性 酸鹼値安定性 恥垢分枝桿菌 358單位約35。。約6.5 最高至約35°C 約6.0-9.0 (ATCC19420) Terrabacter 1,050 單位 約35°C 約6,5-7,0 最高至約35°〇約6.0-9.0 turaescens (IF012960) 根麵 11,300單位 約40°C 約7.0 最高至約40Ό 約6.0-9.5 Μ— 1 分節芽孢桿菌-12別0單位 約40°C 約6.5-7.0 最高至約4(TC 約6.0-9.5 Q 3 6 ^ 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210X297公釐） 6 2 4 6 3 8Γ ,'π

7 B 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（43 ) 測定其生成的非還原醣組成物發現：每一種微生物產 生的非還原醣生成酵素與根瘤菌Μ — 1 1產生的酵素一樣 ’皆可催化葡萄糖聚合度3以上的還原性部份澱粉水解物 生成α-葡萄糖基海藻糖。 mt-1 4 :從根瘤菌Μ - 1 Ί製備海蓮糖糎放酵宏 將含有2w/v% HNEDEX W的部份澱粉水解物 (購自 Matsutani Chemica 1 Industry，C〇.，Ltd., Kyoto, Japan) ' 0 . 5w/v% 多脎、 〇 . lw/v% 酵 母萃取物、0 _ lw/v%磷酸氫二鈉、〇 _ lw/v% 磷酸二氫鉀的液體培養基（pH7) lOOmj?置於 500mj?三角錐瓶，於120°C消毒20分鐘，冷卻， 接種單一菌落的根瘤菌Μ—11( CCRC 9 1 0 0 0 2 )，於 27°C，13〇rpm 振 盪培養2 4小時。 取2 0 的新鮮製相同培養基於3 0 P發酵瓶、滅菌 、冷卻到2 7°C，然後接種1 w/v%上述培養菌液，於 27°C、pH6_8、通氣攪拌條件下培養72小時。 此菌液含有的非還原醣生成酵素活性爲1 . 5un its /mj?，海藻糖釋放酵素活性爲2linits/mj2。其中菌 體懸浮液含有0 · 6units/mi?的非還原醣生成酵素和 0 . 8Units/mJ2的海藻糖釋放酵素，上清液則含有 0 9units/mj?的非還原醣生成酵素和1 . 2units/ m又的海藻糖釋放酵素。 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS )八4吡格（21ϋ:-<：!97公聲-j • - 46 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 訂 426736 經濟部中央榇準局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（44 ) 實驗1 5 :酵素純化 將實驗1 4得到的1 8 j?菌液’利用超高壓細胞分解 器’MINI LABO〃把細胞打破，然後以1 〇 〇 〇 〇 r pm 離心3 0分鐘得到約1 6 J2的上清液。再加入疏酸鈉至飽 合度0 . 2，於4°C靜置1小時，以lOOOOrpm離 心30分鐘而取得上清液》 上清液加入硫酸銨至飽合度0 · 6，於4°C靜置2 4 小時，離心，回收沈澱物。然後再把沈澱物溶於1 OmM 磷酸鹽緩衝液（PH7) *以新鮮製備相同的緩衝液進行 2 4小時透析，離心去除不溶性物質。將約3 6 〇m j?的 透析液分成二次注入填充3 0 'DEAE T0Y0PEAR1/ 的離子交換管柱層析儀。 本發明的非還原醣生成酵素和海藻糖釋放酵素二種酵 素都會吸附在"DEAE T0Y0PEARI/上，因此利用含有不同 氯化鈉濃度的相同緩衝液將二種酵素沖提下來。結果顯示 在圖9 還原醣生成酵素和海藻糖釋放酵素分別在氯化 鈉濃度爲0 . 2M和〇 . 3M時，被沖提下來，然後收集 並純化具酵素活性的部份。 含有非還原醣生成酵素的沖提液以含有2M硫酸銨的 新鮮製備緩衝液進行透析，離心去除不溶性物質，然後注 入填充300mj? ' BUTYL T0Y0PEARL〃的忌水管柱層析 儀，再以2 — 0M硫酸鹽直線梯度將吸附的酵素沖提下來 。收集此酵素活性的部份，然後再通入含3 0 Omj? * 本紙張尺度適用中Ϊ國家標準(CNS ) A4規格（2丨0X29V>i ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

™ 47 - 經濟部中央橾準局負工消f合作社印裝 426736 A7 _B7_____ 五、發明説明（45 ) TOYOPEARL· HW-55^的凝膠過濾層析儀，回收具非還原醣 _ 生成酵素活性的部份。 海藻糖釋放酵素的純化步驟如下：把從'"DEAE TOYO-PEARL"沖提下具海藻糖釋放酵素活性的部份，以含有2 Μ硫酸銨的新鮮製備相同緩衝液進行透析，然後與非還原 醣生成酵素相同的方法利用忌水和凝膠過濾管柱層析法進 行純化。 非還原醣生成酵素和海藻糖釋放酵素純化過程中的酵 素活性、比活性和產率，分別列於表1 1和1 2。 利用7·5%聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析非還原n生 成酵素和海藻糖釋放酵素的純度發現：二者都爲胃_胃白 質帶。顯示製備的二種酵素都已均質化且具高純$ ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

—48 - 426736 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 五、發明説明（46 ) - 表 11 純化階段 酵素活性 比活性（單位/ 產率 (單位） 毫克蛋白質） (% ) 完整菌液 2 8, 5 0 0 - 100 破裂培養菌的上清液 22,900 0.12 80 以硫酸銨鹽析得到的 液體 21,100 0.43 74 經離子交換管柱層析 法得到的濾液 15, 200 6. 2 53 經忌水管柱層析法得 到的濾液f 7,950 10 1 28 經凝膠過濾法得到的 濾液 5, 980 197 21 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4思格（21 OX2P7公釐） 一 49 一 6 2 4 6 3 Β7 五、發明説明（47 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表 12 純化階段 酵素活性 比活性（單位/ 產率 (單位） 毫克蛋白質） (% ) 完整菌液 37, 40 0 ~ 100 破裂培養菌的上清液 31,500 0. 1 Τ 84 以硫酸銨鹽析得到的 液體 29,200 0. 60 78 經離子交換管柱層析 法得到的濾液 25,400 5. 3 68 經忌水管柱層析法得 到的濾液^ 18,700 98.5 50 經凝膠過濾法得到的 濾液. 11,600 240 31 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（2! Ο X 297公釐） -50 - 426736 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印衷

五、發明説明（48 ) 音驗1 6二海藻糖釋放酵素的_特性 將實驗1 5得到的純化海藻醣釋放酵素，以10%硫 酸十二酯鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，並與標準蛋白（購 自 Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo，Japan)相比較 ，得知：本酵素的分子量約爲58000-68000道 頓。等電點爲3 . 3 — 4 . 3。 酵素反應時的溫度和酸鹼值效應，則依下列方法測定 。當酵素於P Η 7反應3 0分鐘時’最適溫度爲4 5 °C ; 酵素於4 0 °C反應3 0分鐘時，最適酸鹼值爲6 — 7 . 5 。（結果顯示於圖10和11)。而酵素的熱安定性測定 方法如下：將酵素置於5 OmM磷酸鹽緩衝液（pH7) 於不同溫度下反應6 0分鐘，冷卻，然後測定殘餘的酵素 活性。酵素的酸鹼值安定性測定方法如下：將酵素置於 2 5°C，不同酸鹼值的5 OmM磷酸鹽緩衝液反應1 6小 時，然後調整pH=7並測其殘餘酵素活性° (結果分別 顯示在圖12和13)。本酵素的熱安定性可達40 °C’ 酸鹼值安f性爲pH5 — 10〇 宭驗1 7 ：從α _葡萄糠某海藻糖製備海藻1 根據日本專利公開公報Ν 〇 . 3 4 9 ’ 2 1 6 / 9 -3 的方法製備α -葡萄糖苷海藻糖。取含2 0%麥芽三糖、 麥芽四糖 '麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的水溶液做爲 還原部份澱粉水解物，加入由實驗1 5方法得到的純化非 還原醣生成酵素2 units/ g固體受質，於4 0°C ’ pH (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -φ.

本紙張尺度適用中國國家揉隼（CNS ) Ad規格（210X297公釐） -51 - 426736 A7 B7 五、發明説明（49 ) 7反應4 8小時，加熱破壞酵素活性，過濾’去除離子、一 濃縮 '注入強酸性鈉離子的陽離子交換樹脂'XT-1 0 1 6 ^ 。將此離子交換樹脂填充於內徑2 cm，長度 1 m的3個夾套式不銹鋼管柱。取5 v/v%反應物注入 管內，保持管柱內部溫度5 5 °C，以空間速度0 . 1 3、 5 5 °C水將樣品沖提出來，而得到葡萄糖聚合度3以上的 非還原醣。製備得到的葡萄糖基海藻糖純度爲9 7 _ 6% :麥牙糖基海藻糖純度爲9 8 * 6% ;麥芽三糖1基海藻糖 的純度爲9 9 . 6% ;麥芽四糖基海藻糖的純度爲 98·3%:麥芽五糖基海藻糖的純度爲98,1%β (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央操準局貝工消費合作社印製 本紙张尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

P 6 3

B 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（ 50 ) .·_： 表 ] L 3 受質 反應產物 以高效能液相層析法 組成份 分析的沖提時間（分） { % ) 葡萄糖基海藻糖 海藻糖 27.4 17.5 葡萄糖 33.8 6.5 葡萄糖基海藻糖 23,3 76.0 麥芽糖基海藻糖 海藻糖 27.4 44.3 麥芽糖 28.7 44.4 麥芽糖基海藻糖 21.6 11.3 麥芽三糖海藻糖 海藻糖 27.4 39.5 麥芽三糖 25.9 60.0 麥芽三糖基海藻糖 19.7 0.5 麥芽四糖海藻糖 海藻糖 27.4 34.2 麥芽四糖 24.1 65.5 麥芽四糖基海藻糖 18.7 0.3 麥芽五糖海薄糖 海藻糖 27.4 29.1 麥芽五糖 22.6 70.6 • 麥芽五糖基海藻糖 17.8 0.3 ^ 麥芽三糖 麥芽三糖 25.9 100 麥芽四糖 麥芽四糖 24.1 100 麥芽五糖 麥芽五糖 22.6 100 麥芽六糖 麥芽六糖 21.8 100 麥芽七糖 麥芽七糖 21.0 100. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家榡牟{ CNS ) A4規格（210X297公釐） -53 - 經濟部中央標準局—工消費合作杜印裝 426736 A7 _B7_ 五、發明説明（51 ) 取含2 0%的α _葡萄糖基海藻糖水溶液，加入由實 驗1 5方法得到的純化海藻糖釋放酵素2units/g固體 受質，於40 °C、pH7反應48小時，去除離子，以高 效能液相層析儀lAKO BEADS WB-T-33(T分析反應產物 。對照組則以麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖 或麥芽七糖爲受質，進行相同的反應。結果列於表1 3。 從表13的結果可知： (1 )海藻糖釋放酵素可專一性水解α -葡萄糖基海 藻糖的海藻糖和葡萄糖基之間鍵結，而形成海藻糖和具葡 萄糖聚合度1以上的還原醣。 (2 )麥芽寡醣無法被海藻糖釋放酵素水解。 根據此結果，我們下一結論：本發明的海藻糖釋放酵 素具有新的作用機制可將位於£1 —葡萄糖基海藻糖內海藻 糖和葡萄糖基之間鍵結水解，而釋放出海藻糖。 爲了從反應產物純化海藻糖，將反應產物經脫色、去 除離子、濃縮、注入強酸性鈉離子型的陽離子交換樹脂〃 X τ - 1 〇 1 6 "，然後收集含97%海藻糖以上的高純 度濾液部份。將收集的濾液濃縮至6 5%，真空乾燥並結 晶，而得到含9 9 %海藻糖以上的髙純度含水海藻糖結晶 。相對於原料乾重，海藻糖的產率如下：葡萄糖基海藻糖 組—9 · 5%;麥芽糖基海藻糖組—14 . 9%;麥芽三 糖基海藻糖組—1 6% ;麥芽四糖基海藻糖組一 1 8 . 5 % ;麥芽五糖基海藻糖組一 1 7 . 7%。將實驗得到的海 藻糖分別測定其熔點、熔解熱、旋光性、紅外線吸收光譜 本紙張λ度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁)

-54 - "426736 經濟部t央橾準局員工消費合作杜印製 A7 B7 .五、發明説明（52 ) 、X —射線繞射形態和以萃取自豬腎臟的海藻糖酶（購自一 Sigma Chemical Co·， St., Louis， Missouri, USA)進 I 行分解反應。結果如下：此海藻糖的熔點爲97.0土 丨 0.5°C，熔解熱爲 57.8±1.2KJ/m〇5，旋 I 光性+182±1° 。這些結果與購自WakoPure (^βιηί- ο a 1 I n d u s t r i e s , L1; d. ， 0 s a k a, J a p a η 的標 準海藻 糖試劑 有一致性。因此從海藻糖釋放酵素催化α —葡萄糖基海藻 糖所形成的醣類，確實是屬於海藻糖。 實驗18:從還原件部份澱粉水解物製備海藻糖 將含5 %蠟質玉米澱粉的懸濁液加熱成膠化，調整 ρΗ = 4_5，加入4000 Units/g固體澱粉的異澱 粉酶（購自 Hayashibara Biochemical Laboratories，

Inc.，Okayama, Japan)於 5 0°C 反應 2 0 小時。將此反 應溶液於1 2 0°C消毒1 0分鐘，冷卻至6 0°C，然後通 入7 5 Omi "T0Y0PEARL HW-50S"的凝膠過濾層析儀（ 購自Tosoh· Corp.，Tokyo, Japan)，而得到葡萄糖聚合 度1 0 - 3 5的還原性部份澱粉水解物。 將得到的還原性部份澱粉水解物和葡萄糖聚合度3的 麥芽三糖以1 OmM磷酸鹽緩衝液（pH7)成1%濃度 ，加入4 units/ g固體受質由實驗1 5方法製得的純化 非還原醣生成酵素和海藻糖釋放酵素，於4 0°C反應2 4 小時。然後取一小部份的反應物經去除離子後，以高效能 * 液相層析法分析其組成份。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 55 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

鋰濟部中央標隼局貝工消費合作社印製 426736 A7 __ B7 五、發明説明（53 ) 剩餘的反應混合物調整pH = 4 . 5，加入5 0 units/g固體受質的葡萄糖澱粉酶（購自36丨1^231^(：〇-rp.，Tokyo，Japan)，於5 0°C反應2 4小時。然後去 除離子，以高效能液相層析法分析其組成份。結果列於表 14° - 從表14得知：利用非還原醣生成酵素和海藻糖釋放 酵素催化麥芽三糖產生海藻糖的產率僅有4.2%:而從 葡萄糖聚合度10-34.1的還原性部份澱粉水解物產 生海藻糖的產率則相當高，爲66 . 1 - 80 . 8%。而 且以高葡萄糖聚合度的還原性部份澱粉水解物做爲原料， 可得到較高純度的海藻糖。同時，添加葡萄糖澱粉酶於經 過二種酵素催化的反應混合物後，藉由分解葡萄糖聚合度 3以上的殘餘α -葡萄糖基海藻糖成爲海藻糖和葡萄糖， 使得海藻糖的純度更加提高。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

-56 - 426736 A7 五、發明説明（54 ) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 表 14 還原性部份澱粉 水解物的葡萄糖 聚合度 反應產物 組成物 (% ) 以N R S F和 T R酵素催化 以葡萄糖 澱粉酶催化 海藻糖 80.8 83.5 34.1 葡萄糖 0.2 16.5 還原寡醣 14.4 0.0 葡萄糖替海藻糖 4.6 0.1 海藻糖 79.7 82.5 26.2 葡萄糖 0.2 17.5 還原寡醣 15.3 0.0 葡萄糖苷海藻糖 4.8 0.0 海藻糖 77.7 80.7 18.1 - 葡萄糖 0.2 19.3 還原寡醣 17.0 0.0 葡萄糖苷海藻糖 5.1 0.0 海藻糖 75.0 78.5 15.2 葡萄糖 0.3 21.5 還原寡醣 18.6 0.0 葡萄糖苷海藻糖 6.1 0,0 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^ 、-° -57 - 426736 A7 B7 五、發明説明（55 ) 表 14 (繼續） 還原性部份澱粉 水解物的葡萄糖 聚合度 反應產物 組成物 (% ) 以N R S F和 T R酵素催化 以荀萄糖 澱粉酶催化 海藻糖 66.1 70.1 10.0 葡萄糖 0.3 29.9 還原寡醣 27.6 0.0 葡萄糖旮海藻糖 7.7 0.0 海藻糖 4.2 20.8 3 葡荀糖 2.1 79.2 (麥芽三糖） 麥芽三糖 65.0 0.0 葡萄糖苷海藻糖 28.7 0.0 註：表中的NRSF和TR分別表示非還原醣生成酵素和海藻糖釋放 • 酵素。葡萄糖苷海藻糖表示葡萄糖聚合度3以上的非還原醣。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（2I0X297公釐） -58 - 426736

7 B 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（56 )· 實驗1 9 — 反應 取濃度1 0%，純度9 9 . 5舛，由實驗1 5得到的 高純度海藻糖與1%甘胺酸於5 鱗酸鹽緩衝液（ ΡΗ7)，於1 00°c反應9 0分鐘’然後冷卻’以1 c m比色管測量波長4 8 0 nm時的吸光值°以葡萄糖和 麥芽糖做爲對照組。結果列於表1 5 ° 表 15 醣類 吸光值（48〇nm) 組別 海藻糖 0.006 實驗組 葡萄糖 1.671 對照組 麥芽糖 0.926 對照組 由表1 5的結果可知：海藻糖造成的梅納反應僅爲葡 萄糖和麥芽糖組的0 · 4 — 0 . 6%。因此此種醣類不易 造成梅納反應，使胺基酸產生破壞》 窗驗2 0 :活體內同化作用測試 根據Atsuji et al的實驗方法〔刊載於Rinsh〇 Eiy〇 本紙張尺度適用中國國家棵芈（CNS ) A4规格（210>〇97公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -59 - A7 B7 67 3 if..：.( 年 S Η 86.2. 22 ! 五、發明説明（57 ) (Clinical Nutrition), Vol.41t No.2, pp.200-208 (19 72 )〕，取3 0 g依實驗17方法製備，純度爲 99·5%的高純度海藻糖，使成爲2Ow/v%水溶液 ，以經口方式給予26、27、28、29、30或31 歲健康男性，然後測其血糖和胰島素濃度·以葡萄糖做爲 對照組。如同葡萄糖、海藻糖在食後〇.5—1小時，其 血糖和胰島素濃度達到最高。因此由此確認：海藻糖是相 當容易被消化 '吸收、代謝和利用，而成爲一能量來源。 窗驗2 1 :急件毒件試賒 利用實驗17方法製備得到9 9 · 5%純度的海藻糖 ，經口方式投予小老鼠，然後測定本醣類的急性毒性試驗 。由結果顯示：海藻糖即使給予相當高劑量，仍不會造成 任何老鼠的死亡。因此其致死半劑量濃度可能爲5 0 g/ kg或更高》 實驗22:從分節芽抱稈菌Q 3 6製備海藻糖釋放酵素 以分筘芽孢桿菌Q 36CCCRC 9 1 0 0 0 1 )取代實驗1 4中的根瘤菌M -11( CCRC 910002)，培養72小時《本菌液中的 非還原醣生成酵素活性爲1 . 3units/m)? ’而海藻糖 釋放酵素活性爲1 8units/miZ a菌體懸浮液的非還 原醣生成酵素活性爲0 . ’海藻糖釋放酵 素活性爲0 · 5units/mj?:而上清液的非還原醣生成 本紙張尺度通用中國圃家標準（CNS )A4规格（2丨().<297公;| ) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（58 ) 酵素活性爲0 . 8units/ 1 . 3units/mi? « J? ’海藻糖釋放酵素活 爲 眚賒2 3 :酵素純化 取寊驗2 2得到的1. 85菌液，依實驗1 5相同的方 法進行純化*非還原醣生成酵素的純化階段結果列於表 1 6，海藻糖釋放酵素的純化結果列於表1 7。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本纸張尺反通τ_家操华（CN 4规格(2】0X 2()7公廣 -61 - 426736 A7 B7 五、發明説明（59 經濟部中央標準局貝工消費合作社印轚 表 16 純化階段 酵素活性 (單位） 比活性（單位/ 毫克蛋白質） 產率 (% ) 完整菌液 23, 70 0 - 100 破裂培養菌的上清液 22, 40 0 0.15 95 以硫酸銨鹽析得到的 液體 20,200 0.51 85 經離子交換管柱層析 法得到的濾液 15,100 6.5 64 經忌水管柱層析法得 到的濾液f 8,450 115 36 經凝膠過濾法得到的 濾液 6,120 217 26 將純化得到的二種酵素以電泳法分析其純度發現：此 二種酵素皆呈單一蛋白質帶。因此道二種酵索已達均質化 且具有髙純度》 紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（2丨Ο X 297公嫠） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -62 ~ 6 3 7 6 2 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印袋 五、發明説明（60 ) 表 17 純化階段 酵素活性 比活性（單位/ 產率 (單位） 毫克蛋白質） (% ) 完整菌液 32,500 - 100 破裂培養菌的上清液 30, 100 0.19 93 以硫酸銨鹽析得到的 液體 25,400 0.72 78 經離子交換管柱層析 法得到的濾液 22,700 22. 3 70 經忌水管柱層析法得 到的濾液f 15,200 2 15 47 經凝膠過濾法得到的 濾液 11,600 497 36 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -63 - 經濟部中央標隼局員工消费合作社印" T2T7:3[’.a： Λ 1 - -V r: '4 ί JB6. 2. 22 ' .Β7 五、發明説明（61 ) mm 9. λ 酵素特件 把實驗23得到的酵素，利用實驗16、3的方法測 定本酵素的特性如下：分子量約5 7 0 0 0 - 6 7 0 0 0. 道頓，等電點3 _ 6 - 4 · 6，最適溫度4 5’°C (圖14 )，最適酸鹼值6 - 7,5 (圖15)，熱安定性達45 °C (圖16)，酸鹸值安定性約5 - 10 (圖17)。 實驗2 5 :從α -葡萄糖某海蕕糖製備沲蓬糖 由實驗2 3得到的純化酵素，經過實驗1 7的方法證 實：其與根瘤菌Μ - 1 1產生的海藻糖釋放酵素一樣具有 將海藻糖從α -葡萄糖基海藻糖釋放出來的酵素活性。 實驗2 6 :從一般微生物製備海蓬耱趙协酸表及其特件 取已被證實可產生海藻糖釋放酵素的微昔铕桿苗( Brev i bac ter i um he 1obo1ua, ATCC1 1822)和薔 薇色球菌(Micrococcus r oseus， ATCC186)，依 實驗1 4相同的方法培養7 2小時，然後純化測定其特性 •結果列於表1 8。 再根據實驗2 5的方法，測定此純化酵素是否可從葡 萄糖聚合度3以上的α -葡萄糖基海藻糖釋放出海藻糖》 結果顯示：它們與根瘤菌Μ - 1 1產生的海藻糖釋放酵素 一樣皆可將海藻糖由cr 一葡萄糖基海藻糖釋出。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國园家標隼（CNS ) Λ4規洛（2丨οχπ7公筚） "-64 - 426736 A7 B7 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 五、發明説明（62 ) _ 表 18 微生物 經離子交換管柱濾液 最適雛 最適酸鹼値 熱安定性 酸鹼値安定性 微黃短桿菌 (ATCC12822) 6,070單位 約 40eC 約6.5-6.8 最高至約40°C 約5.5-9.5 薔薇色球菌 (ATCC186) 3,010單位 約 35°C 約6.8 最高至約30V 約6.5-7.2 根瘤菌 Μ- 1 1 25,400單位 約 45SC 約6.0-7.5 最高至約40oC 約5.0-10.0 分節芽孢桿菌 Q 3 6 22,700單位 約 45°C 約6.0-7.5 最高至約45°C 約5.0-10.0 (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（2IOX297公釐} -65 - 426736 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（63 ) 實驗2 7 ：-殿粉液化程度和酵素種類對於高海藻糖含量醣-類製備的影響 爲了從澱粉製造高海藻糖含量的醣類，因此本實驗主 要在探討澱粉液化程度和酵素組合所造成的影響。取含 20%玉米澱粉的懸濁液，以0 . 1%碳酸鈣調整pH = 6 . 5，加入0 . 1 — 2%抗澱粉固體化的' TERMAMY1/ (爲一種 α-澱粉酶，購自 Novo Industri AS, Copenhagen, Denmark) ， 於 95 °C 反應 15 分鐘 ，然後保持在 1 20 °C1 0分鐘以消毒此葡萄糖當量2 . 5 — 20 . 5 的液化澱粉溶液。冷卻，加入5unitS/g澱粉固體由實 驗2方法製得的純化非還原醣生成酵素，1 Oun its/g 澱粉固體由實驗15方法製備的純化海藻糖釋放酵素， 5 0 Ounits/g澱粉固體的異澱粉酶（一種澱粉分支酵 素），和5Units/g澱粉固體的環麥芽糖糊精葡萄糖轉 移酶（後面二種酵素購自 Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan )，於 P H 6 、4 5 °C反應2 4*小時《然後於9 5 °C加熱1 0分鐘、冷卻、加_ 入5units/g澱粉固體的葡萄糖澱粉酯，於p Η 5反應 10小時。最後以高效能液相層析儀分析反應物的海藻糖 含量（％)»對照組則只使用非還原醣生成酵素和海藻糖 釋放酵素二種酵素進行催化反應。結果列於表1 9。 由表1 9結果可知：當澱粉液化程度相當低，即葡萄 糖當量低於1 5 ，最好低於1 0時，可產生較大量含海藻 糖澱粉。而利用非還原醣生成酵素、海藻糖釋放酵素、澱 本&張尺度適用中國國家揉隼（CNS ) Α4規格（210xl97公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 —66 _ Λ26736 A7 B7 五、發明説明（64 ) 粉分支酵素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶組合時，可~ 大量產生海藻糖，其產率爲只使用非還原醣生成酵素和海 '藻糖釋放酵素的2 — 4倍。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央梯準局員工消費合作社印裂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 ΟΧ 297公釐） 426736 A7 B7 五、發明説明（65 ) 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 表 19 a -澱粉酶 葡萄糖當量 酵素組合 佔澱粉比例 D E (% ) N + T N + T N + T N + T + D + C + C + D 0. 1 2.5 21.3 79.6 76. 2 84.3 0.4 4. 8 22.5 69.7 67.7 76. 9 0. 6 7.8 23.3 63.2 59.1 68.2 1.0 12.5 23.7 56.0 51.3 62.5 1. 2 14. 8 25.3 50.3 44.7 58.4 1. 5 17.3 22. 4 44. 2 39.2 48.3 2,0 20.5 18. 6 38. 4 34. 9 46. 1 註：表中的N，T，D，C分別代表非還原醣生成酵素、 海藻糖釋放酵素、澱粉分支酵素和環麥芽糖糊精葡萄 糖轉移酶。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2丨OX29*7公麓） 一 68 — 426736 A7 B7 經濟部中央橾準扃員工消費合作社印取 五、發明説明（66 ) 接下來的實施例A將說明非還原醣、低還原性醣的製-備方法，實施例B則說明含非還原醣、低還原性醣類和/ 或海藻糖的組成份的製備法" 窗施例A — 1 將含20%馬鈴薯澱粉懸濁液加入0.3%草酸，滅 菌、冷卻、以碳酸鈣調整pH=6 . 5，而得到葡萄糖當 量1 2的液化澱粉溶液。將此溶液加入由實驗2得到的純 化非還原醣生成酵素2 units/ g澱粉和3 0 0 units/ g 澱粉的異澱粉酶（購自 Hayashibara Biochemical Laboratories， Inc. ， Okayama, Japan) 於 4 5°C 反應 2 4 小 時。再把此溶液於9 5 °C加熱以使酵素失活性，然後冷卻 、過濾、活性碳脫色，氫離子和氫氧離子形式的離子交換 樹脂去除離子以純化和濃縮而得到的糖漿產品。以乾固體 重爲基準其產率爲9 0%，濃度7 0% 〇此產品爲一種含 有α -醣苷海藻糖的低還原性醣類，葡萄糖當量約爲8。 由於它具有緩和甜度、低黏稠度和適宜的保溼性，因此可 應用於食品、化粧品、醫藥用品上做爲甜味劑、味道改良 劑、品質改良劑、安定劑和塑形劑。 實施例A - 2 將含25%樹薯澱粉懸濁液加入〇.2%抗澱粉固體 的1E0-SPITASE* (爲一種α —澱粉酶，購自Nagase Biochemicals，Kyoto, Japan)於 8 5 — 9 0 °C 反應 2 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） ~ -69 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 426736 B7 五、發明説明（67 ) (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 分鐘，1 2 0°C滅菌，然後立即冷卻而得到葡萄糖當量爲 4的液化澱粉溶液。加入從實驗9純化得到的非遼原醣生 成酵素5 units/ g澱粉' 1 0 0 units/ g激粉的支鏈澱 粉酶和5units/g澱粉的麥芽四糖一生成酵素（此二種 酵素購自 Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ，01^5^111&，]3?311)，於口1^6.5'40°(：反應3 6小 時。將此反應物加熱以使酵素失活性，依實施例A_ JL的 相同步驟純化、濃度成6 0%。爲了提高此濃縮物的非還 原醣含量，取5 v/v%溶液通過填充於4個夾套不銹鋼 管柱且總長度爲2 0 m的鈉離子型酸性陽離子交換樹脂。 保持管柱內部溫度爲5 5°C，以空間速度0 . 2的5 5 °C 水注入管柱1然後回收含葡萄糖聚合程度4 - 6的非還原 醣部份。將回收部份的溶液純化、濃縮、真空乾燥、磨成 粉末、而得到高濃度非還原醣的粉末產品，其產率以乾固 體重量計算約爲6 3 %。此產品爲含有α -醣苷海藻糖、 葡萄糖當量等於5 . 4的非還原醣。由於它具有緩和甜度 、低黏稠ΐ和適當的保溼性，因此可用於食品、化粧品和 醫藥用品上做爲甜味劑 '味道改良劑、品質改良劑、安定 劑和塑形劑。 實施例A _ 3 將含3 0%玉米澱粉的懸濁液加入0 · 1 %碳酸鈣’ 調整pH = 6 . 5，然後加入0 . 3%抗澱粉固體化的* TERMAMYL 601/ (爲一種 α -澱粉酶，購自 Novo Indust- 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210X297公釐） -70 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 Λ26”6 Α7 _Β7___五、發明説明（68 ) ri AS, Capenhagen, Denmark)，於 9 5°C 反應 15 分鐘- ，然後1 2 0°C滅菌並立即冷卻，而得到葡萄糖當量爲4 的液化澱粉溶液。然後加入由實驗2純化得到的非還原醣 生成酵素 4 units/ g 搬粉和購自 Hayashibara ΒίοοΙ^πή- ε a 1 L a b o r a t 〇 r i e s, I n c · ， 0 k a y a m a ， J a p a η 的 3 0 0 units/ g澱粉的異澱粉酶和5 units/ g澱粉的環麥芽糖 糊精葡萄糖轉移酶，於pH6 . 3、45 °C反應48小時 。然後將反應物9 5 °C加熱1 0分鐘、冷卻，加入1 0 units/g澱粉的>9 -澱粉酶於pH5 · 5、55°C反應 1 6小時將此反應物加熱以破壞酵素活性，以一般方法進 行脫色、去鹽，純化、濃度，而得到7 0 %濃縮度、產率 爲9 0%的糖漿產品。此產品爲一種包含α —醣替海藻糖 和α -醣轻α —配糖體等非還原醣的低還原性醣類。由於 它具有緩和甜度、低黏稠度和適當的保溼性，因此可應用 於食品、化粧品和藥品上，做爲甜味劑、甜道改良劑、品 質改良劑、安定劑和塑形劑。 • ^ 實施例Α - 4 將實施例A - 3得到的糖漿稀釋成5 5%，然後通過 如實施例A — 2的酸性陽離子交換樹脂，以增加非還原醣 °收集葡萄糖聚合程度3 - 6的非還原醣部份，經過 '濃縮、噴霧乾燥而得到髙濃度的非還原醣，其產率 爲3 8%。本產品具有大量的非還原醣如· α —醣苷海藻 糖和α〜醣苷α —配糖體，它是一種葡萄糖當量8的低還 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） I ^1. {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 426736 A7 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 __ _B7_五、發明説明（69 ) 原性醣*由於其具有適中甜度、低黏稠度和適當的保溼性一 ’因此可應用於食品、化粧品和醫藥上，作爲甜味劑、味 道改良劑 '品質改良劑、安定劑和塑形劑。 管施例A _ 5 將含3 0%玉米澱粉的懸濁液與α -澱粉酶依照實施 例Α - 3的實驗條件反應，而得到一液化澱粉溶液，其葡 萄糖當量爲4。然後加入從實驗1 5得到的純化非還原醣 生成酵素5units/g澱粉和5 0 Ounits/g澱粉的異澱 粉酶，於pH6 ' 4〇°C反應48小時，而得到含有 76.3%海藻糖的反應物。然後加熱破壞酵素活性，依 一般方法進行脫色、去鹽，以純化、並濃縮成8 5%濃度 。再將反應物置於塑膠浸盤，於攪拌，逐漸冷卻條件下、 保持在室溫進行老化以達到完全結晶化，形成塊狀產品， 再利用切割儀器而得到海藻糖水合物結晶粉末，其產率爲 9 2%。由於本產品不具有吸壯性，易於操控，因此可應 用於食品Γ化粧品、醫藥用品上*做爲甜味劑、味道改良^ 劑、品質改良劑 '安定劑和塑形劑。 實施例Α - R 將含3 0%樹薯澱粉的懸濁液加入α -澱粉酶，依照 實施例Α - 2的反應條件製造葡萄糖當量爲5的液化澱粉 溶液。加入由實驗1 0得到的純化非還原醣生成酵素3 units/g澱粉、實驗2 3純化得到的海藻糖釋放酵素5 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~-72 - (锖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

鲤濟部中央標準局貝工消費合作社印製 426736 A7 _____B7_'_ 五、發明説明（70 ) units/ g-澱粉、2 0 〇 units/ g澱粉的支鏈澱粉酶和3 -units/g澱粉的環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶，於p Η 6 、45 °C反應48小時。此反應物含84 . 7%海藻糖。 將此反應物加熱破壞酵素、然後脫色、去鹽 '純化、濃縮 、結晶。在結晶時，將糖膏利用籃狀式離心法分離，以少 量水進行噴霧清洗，而得到一高純度的海藻糖水合物結晶 。其產率爲5 5%。本產品的純度非常高，因此可做爲食 品、化粧品、醫藥品，工業上或化學試劑之用。 實施例Α - 7 將實施例A - 6得到的熱破壤反應物加入1 0 un i t.s /g受質的葡萄糖澱粉酶，於pH5、50°C反應10小 時。然後加熱破壤酵素活性、脫色、去鹽、純化、濃縮成 7 0%。置於結晶器，於攪拌、逐漸冷卻條件下進行結晶 化’而得到結晶程度約40%的糖膏。將此糖膏以1 50 kg / c iri條件通過乾燥塔的高壓管進行噴霧乾燥，並將 8 5 °(：空_由乾燥塔的頂端由上往下方式輸送，然後收集~ 位於金靥網輸送帶上的結晶粉末。再把此結晶粉末置於熟 成塔’利用熱空氣流進行熱成，使粉末完全結晶與乾燥。 而得到含水海藻糖結晶，產率爲8 7%。由於本產品不具 有吸溼性’易於控制，因此可應用於食品、化粧品和醫藥 用品上，做爲甜味劑、味道改良劑、品質改良劑、安定劑 和塑形劑。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本莧)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } Α4规格（210X297公釐） -73 -

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（71 ) 窨施例A - 將梅癖茼牖Μ 一 11欒異株（CCRC 910002)根據實驗1的方法培養70小時，然後通 過s F膜去除菌體，得到1 0 〇升的過濾液：再將此濾液 通過UF膜，而得到含4 1 Ounits/mJ?非還原醣生成 酵索和4 9 Ounits/mi海藻糖釋放酵素的5升濃縮液 。將含3 3%玉米澱粉的懸濁液依照實施例A - 3的方法 製備一葡萄糖當置爲4的液化澱粉溶液，加入0 . 〇 2 miZ/g澱粉的上述濃縮液、5 0units/g澱粉的異澱 粉酶和5 units/ g澱粉的環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶， 於pH6 . 2、40eC反應48小時。然後加熱使酵素失 去活性，加入1 Ounits/g受質的葡萄糖澱粉酶，於 pH5、50 °C反應10小時。此反應混合物乾重約含 85.6%海藻糖。然後再加熱使酵素失去活性、進行脫 色、去鹽等純化步驟及濃縮結晶*將存在糖資內的結晶以 籃狀式離心法分離，於噴霧乾燥時以少量水進行清洗工作 ，而得到一高純度的含水海藻糖結晶，其產率爲6 4%。 此產品具有極高純度，因此可應用於食品、化粧品、醫藥 用品上，及做爲工業、化學之試劑和原料。 啻施例A — 9 將依實施例A - 8方法得到的反應物加熱破壞酵素活 性’脫色和去鹽進行純化然後濃縮，得到5 5%糖漿產品 *把此產物通過連結程度6%，鈣離子形式的強酸性陽離 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X 297公f ) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 4267 36 A7 _B7____五、發明説明（72 ) 子交換管柱 ^DOWEX 99"(爲 The Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA的商業化產品），以提高海藻糖 濃度’並收集富含海藻糖的部份。將收集到的液體脫色與 去鹽，然後置於蒸發器，真空加熱以得到含水量3 %的糖 漿。再把此糖漿置於結晶器並加入1 %無水海藻糖結晶做 爲結晶種，於1 20 °C利用攪拌法進行結晶，然後i 〇〇 °C 6小時進行熟成，而得到塊狀的固體成品。將此固體利 用切割器切割 '並乾燥，而得到含水率〇 . 3 %的無水海 藻糖結晶粉’其產率爲富含海藻糖濾液固體重的7 5% » 此產品可做爲含水物質如食品、化粧品、醫藥品和其原料 及中間物的乾燥劑，由於其具有適當甜度也可應用於食品 、化粧品和醫藥品，做爲甜味劑。 實施例B — 1 ：甜味劑 取由實施例A — 7得到的含水海藻糖結晶粉1份，加 入α —醣苷甜菊精，ALPHA G SWEET，0 . 0 1份（購自 ♦ Toyo Sug^r Refining Co·， Ltd·， Tokyo, Japan)，混 合並均質化，然後加入一種L -天冬胺酸- L -苯丙胺酸 甲基 *阿斯巴甜#(購自Ajinomoto Inc.，Tokyo, Japan) 〇 . 〇1份Μ將此混合物製成粒狀甜味劑。此種 產品的甜度爲蔗糖的2倍而熱量僅是其一半。因爲此甜味 劑有極佳安定性且組成物不易分解，因此適合做爲需要限 制熱量患者（糖尿病和肥胖）的低熱量食物的低熱量甜味 劑。而且造成牙齒骨疸的微生物，對於本產品不易產生酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -75 - 4267 36 A7 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製 B7五、發明説明（73 ) 和不溶性聚葡萄糖，因此可減少牙齒肉芽性骨疽發生，而 做爲食品甜味劑。 眚施例B — 2 :硬糖 含5 5%蔗糖溶液1 0 0份，加入由實施例A - 1得 到的含非還原醣糖漿3 0份，混合、真空加熱濃縮，使其 含水量低於2%，然後加入1份檸檬酸和適當量的檸檬香 料及色素並製成成品。本產品爲一種高品質硬糖，具有易 碎、味道超卓*免於蔗糖結晶化和變形的特性。 管施例B - 3 :巧京力 取可可醬40份、可可奶油10份、蔗糖30份和由 實施例A - 8得到的高品質含水海藻糖結晶2 0份，混合 並置於提煉器以降低顆粒大小，然後於5 0°C的精磨機進 行搓揉2天。在搓揉過程時，加入0.5份卵磷脂並均質 化·然後利用溫度控制器調整反應物於3 1 °C並在奶油固+ 化前立刻俥]入模型內，以振盪器脫氣，通過1 〇°c冷卻管 2 0分鐘進行固化，而得到成品。本產品不具吸溼性，但 在顏色、光澤和組織方面表現優越且口感十足，有適中的 甜味、香味和味道。 實施例B — 4 ： 口香糖 取3份的膠，加熱軟化|然後加入4份蔗糖和3份從 實施例A - 5得到的含水海藻糖結晶粉，混以適當量的香 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) -76 - 426736 A7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 B7___五、發明説明（74 ) —ϊ 料和色素，以滾筒揉搓、塑形 '包裝，而得到在組織、香-味和味覺表現.卓越的口香糖製品。 實施例B — 5 ：加糖煉乳 取1 0 0份鮮乳、加入依實施例A - 3得到含非還原 醣的糖漿3份和1份蔗糖，低溫殺菌並濃縮成7 0%。然 後製成罐頭並滅菌。此產品在香味和味覺表現卓越且有適 中甜度，因此可做爲嬰兒食品、水果、咖啡、可可粉和茶 的調味料。 實. . .施例Β - 6 ·舍乳酸菌的飲料 取1 7 5份的脫脂乳、8份依實施例A — 2方法得到 高含量非還原醣的粉末、5 0份含高濃度乳蔗糖的粉末（ 刊載於日本專利公開公報No · 281 ，795/92) 和1 2 0 0份水，於6 5 °C低溫殺菌3 0分鐘，冷卻到 4 0 °C，加入3 0份菌，於3 7 °C培養8小時，而得到 含乳酸菌^飲料。本產品在味覺和香味方面表現+分優越= 。存在此產品中的寡醣不僅可維持乳酸菌穩定性，並刺激 雙叉桿菌生長。 實施例B _ 7 ：果汁粉 取3 3份經噴霧乾燥得到的柳丁汁粉末，加入依實施 例A - 6方法得到的髙純度含水海藻糖結晶5 0份，蔗糖 10份、無水檸檬酸〇 . 65份、蘋果酸0 . 1份、L型 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS }八4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-77 - 426736 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 _____B7_五、發明説明（75 ) 抗壞血酸Θ . 1份、檸檬酸鈉0 , 1份、支鏈澱粉〇 · 5 -份和適當量的粉狀香料劑，混合均勻並切割成細的粉末。 然後置於流動層顆粒形成器，以實施例A - 6得到的高海 藻糖含量的糖漿當做爲結合料，於4 Οΐ進行噴霧|並進 行顆粒化3 0分鐘’而得到製品。本果汁粉產品含有3 〇 %的水果汁含量且具有長時間安定性，但不會有不好味道 出現》 眚施例Β — 8 :卡士逹 取1 0 0份的玉米澱粉，1 〇 〇份包含依實施例Α -1得到的非還原醣糖漿、麥芽糖8 0份、蔗糖2 0份和氯 化鈉1份，混合均勻'然後邊攪拌邊加入2 8 0份雞蛋和 1 0 0 0份熱牛奶’隨即以慢火繼續攪拌直到玉米澱粉完 全膠化、組成份變成半透明狀。然後冷卻，加入適當量的 香草香料’而製成成品。本產品具有光滑光澤、適中甜度 和極佳味道。 脅 官施例B — 9 ：米漿髁佐料 取米粉9 0份、玉米澱粉20份、蔗糖40份，由實 施例A — 5方法得到的含水海藻糖結晶粉末8 0份和支鏈 澱粉4份’均勻混合’而得到’uiro-no-moto〃. β將此產 品與適當量的抹茶〃或綠茶粉於水中進行搓揉，然後蒸 發6 0分鐘，而得到，抹茶米漿稞〃。此產吊有極佳的光 澤、組織、味覺和香味；且澱粉老化現象被抑制，因此本 本紙張尺度適用中國國家椟準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 426736 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印¾ 五 '發明説明（76 ) 產品具有較長的使用期限。 實_施例B - 1 〇 ："豆沙（豆醬）y 取1 0份的甜小紅豆爲原料，加水煮熟，然後去除具 澀味、粗糙的水溶性物質，而得到2 1份生的甜小紅豆醬 。將此豆醬加上蔗糖1 4份、依實施例A - 3方法製備的 非還原醣糖漿5份和水4份，煮熟，然後加入少量沙拉油 並小心搓揉以免使甜小紅豆的顆粒狀分裂，而可得到3 5 份的豆醬產品。本產品不會有變色的現象發生，且有極佳 的組織性、味道和香味，因此適合做爲製造豆沙麵包、豆 沙包、湯圓、紅豆酥餅和冷凍點心。 實施例B - 1 1 ：麵包 取麵粉1 0 0份，酵母2份、蔗糖5份，依實施例A -5方法製備的非還原醣1份和無機食品0 · 1份，混合 均勻、搓揉並於2 6 °C發酵2小時，熟成3 0分鐘，然後 烘焙。得一具有極佳色澤、味道，適當彈性和適宜甜度 的高品質麵包。 實施例B — 1 P!：火腿 取1 0 0份豬腿上部肉、氯化鈉1 5份、硝酸鉀3份 混合均勻，然後置於冷藏1天。再將此豬肉浸泡於由水 5 0 0份、氯化鈉1 〇 0份、硝酸鉀3份和依實施例A — 4方法製備的非還原醣粉4 0份和香料所組成的鹽類溶液 (诗先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -1° r 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -79 - 426736 A7 B7 經濟部中央標準爲員工消費合作社印製 五、發明説明（77 ) 7天。然後以冷水沖洗、燻製、烹調、冷卻、包裝，而得-到一具有極佳色澤、味道和香味的高品質火腿》 眚施例B — 1 3 :胖肽粉 取含4 0%黃豆胜肽溶液、HIMUTE S" 1份、（爲食品 用胜肽、購自 Fuji Oil Co·, Ltd·，Osaka, Japan)和依 實施例A-6方法製備得到的高純度含水海藻糖結晶2份 ’均勻混合’於5 0°C真空乾燥，然後粉碎得到胜肽粉產 品。此產品具有極佳的味道和香味，因此可做爲製造如速 煮食品和冰淇淋點心等西點，或嬰兒食品及經口、經腸道 液體治療食品的原料。 實施例B _ 1 4 :味噌粉 取1份味噌與3份依實施例A - 9方法製得的無水海 藻糖粉，均勻混合，置於室溫隔夜進行固化。可得到約4 g的味噌固體，然後粉碎此製品而得到味噌粉。此產品可 做爲中國^麵條和清湯'"suimono 〃的調味料。而味噌固 " 體則可做爲糕餅的固體調味料》 實施例B — 1 5 ·蛋黃粉 將生蛋黃以6 0 - 6 4°C低溫殺菌而製備液化蛋黃。 然後取1份的液化蛋黃與4份依實施例A - 9方法製備的 無水海藻糖結晶粉均勻混合，置放隔夜使海藻糖轉化爲含 水結晶型態，而得到塊狀固體成品。然後將此固體成品粉 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐} 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 426736 A7 _ B7 五、發明説明（78 ) 碎製成粉末狀。此產品可做爲冰武點心、乳化劑等糕餅製一 品的原料’也可用於製造嬰兒食品和經口、腸道液體治療 食品。 例B ~ 1 6 :化粧品面霜 取2份多羥乙烯乙二醇單硬脂酸鹽、自我乳化甘油單 硬脂酸鹽5份、依實施例A - 2方法製得的高含量非還原 醣粉末2份、α —葡萄糖芸香醇1份、液體石蠟1份、甘 油三八脂酸鹽1 0份和適當量防腐劑，均勻混合、加熱溶 解，然後加入2份L 一乳酸、5份1 ，3_ 丁基甘油和 δ 6份精製水，置於均質機內進行乳化，然後邊攪拌邊加 入適當量香料，而得到乳液製品。此產品具有抗氧化活性 和高的穩定性，因此可做爲防曬劑，皮膚滋潤 '美香劑。 實施例Β - 1 7 ：頭髮涠絲糟 取1份由實施例Α — 6方法製得的海藻糖、2份 葡萄糖—L _抗壞血酸（購自Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.，Okayama, Japan) 、2 份酵素處理 的芸香醇 'ALPHA G RUTir (購自 Toyo Sugar Refining Co.，Ltd., Tokyo, Japan) 、2份雙硬脂酸甲基氣化銨 ，2份鯨醇、2份矽油、1份多羥乙烯油酸乙醇醚和適當 量的香料’均勻混合、加熱溶解，再加入3份1 ，3 —丁 基甘油，8 9份精製水和適當防腐劑，然後攪拌' 冷卻、 靜置，而得到頭髮潤絲精。本產品含有ct -葡萄糖—L - 本紙張尺度適用中國國家榇箄（cns ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Τ'· -81 ~ 426736 A7 _ _B7 五、發明説明（79 ) 抗壞血酸和酵素處理的芸香醇，因此可刺激人類和動物的-頭髮增長和再生，並且可治療和預防頭皮屑、頭皮癢和掉 髮的問題。 啻施例B — 1 8 :乳狀化粧7k 乳狀化粧水依下列配方製備： P〇E(20)鯨基乙醇醚 1份 ' S I LI C 0 N E K F 9 6 ’（購自 S h i η - e t s u C h e m i c a 1

Industry Co. , Ltd. , Tokyo, Japan ) 2份 液體石蠟 5份 丙烯乙二醇 1份 甘油 1份 由實施例A _ 7得到的海藻糖 1份 乙醇 1 5份 羧乙烯基聚合物 0 3份 氫氧丙基纖維素 0 • 1份 2基甲基丙醇 0 - 1份 P 〇 E海貍油 0 1份 α -葡萄糖一 L 一抗壞血酸 1份 紅色色素No. 106 0. .00 0 1份 防腐劑 少量 香料 0 * 1份 蒸餾水 7 0份 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4*l格（210X297公釐） -82 - 4 2 6 7 3 6 Α7 Β7 五、發明説明（80 ) 本產品由於含有α _葡萄糖-l 一抗壞血酸成份，因 此具有極佳的潤庸效果和安定性，且香味持久。 實施例Β - 1 9 :臉部化粧水 依據下列配方製造臉部化粧水： 山梨醇 2份 依實施例A-8方法製備海藻糖 .0.5份 液體胎盤 0 . 5份 α —葡萄糖—L 一抗壞血酸 0.5份 二甲基硬脂酸基胺氧化物 0.05份 月桂酸鈉鹽 0.01份 乙醇 2 0份 防腐劑 少量 香料 少量 蒸餾水 7 5份 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本產g含有α —葡萄糖-L_抗壞血酸成份，因此有 極佳的潤膚效果、穗定性和安全性。 實—施例Β - 2 0 ··人參萃取粉 將0 . 5份人參萃取物與1 . 5份依實施例Α — 9方 法製得的無水海藻糖結晶粉相互搓揉•靜置2天，使海藻 糖轉化爲含水結晶型式，而得到塊狀固體產品。再磨成粉 末|過篩，而得到人參萃取粉。再把此產品與適量的維生 -*

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐} -83 - 426736 A7 經濟部中央標準扃員工消費合作社印策 B7五、發明説明（81 ) 素B 1和維生素B 2粉末混合，製成顆粒狀，而做爲補藥-或頭髮修復劑。 實施例B — 2 1 :錠劑 將購自 H a y a s h i b a r a B i 〇 c h e m i c a I L a b 〇 r a t o r i e s, Inc.，Okayama, Japan的天然人類干擾素-a:，注入以抗 人類干擾素-a抗體固定化的管柱，然後通入牛血清白蛋 白做爲安定劑，再利用包含由實施例厶_ 6製得的5%高 純度含水海藻糖結晶的生理食鹽水，改變不同p Η條件下 ，將吸附於管柱上的天然人類干擾素-a沖提下來。把此 液體通過膜，加入2 0倍無水麥芽糖結晶""FINET0SE〃 （ 購自 Hay ashibara Biochemical Laboratories， Inc., 0 k a y a m a, J a p a n )，經過乾燥、磨成粉末、製銘器，而得 到每錠2 0 0呢含有1 5 0 units天然人類干擾素一 α的 錠劑。此產品可做爲治療病毒感染疾病、過敏症、風溼病 、糖尿病和惡性腫瘤的舌下錠劑。其口服劑量爲1 - 1 0 顆/天人。本產品也可用於治療愛滋病和肝炎。由於 本產品含有非還原醣和無水麥芽糖結晶二種成份做爲安定 劑，因此在室溫下保存一段時間後仍有活性。 會施例Β — 2 2 :糖衣錠 取每頼1 5 0呢無包衣的錠劑爲原料，先以由4 0份 的依實施例A — 8方法製得的高純度含水海藻糖結晶' 2 份平均分子量爲200 ’ 000道頓的支鏈澱粉、30份 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^

-、1T -84 - 4267 3 6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（82 ) 水、2 5份滑石和3份鈦氧化物組成的內層包袠液進行包-裹，而得到每顆2 3 Omg的錠劑。然後再以由6 5份相同 的含水海藻糖結晶、1份支鏈澱粉和34份水組成的包裹 液進行最後包裹。然後利用液化蠟打亮，而得到具有光澤 的糖衣錠。本產品具有抗震盪性，且長時間仍保有高品質 〇 眚施例B - 2 3 :牙粉 配方如下： 磷酸氫鈣 4 5份 支鏈澱粉 2.9 5份 硫酸月桂鈉 1 . 5份 甘油 2 0份 多氧乙烯山梨醇月桂酸 0 . 5份 防腐劑 0 . 0 5份 依實施例A - 5方法得到的含水 海藻^結晶粉 1 2份 麥芽醇 5份 水 1 3份 將上述配方混合，依一般方法製造而可得到牙粉製品 °由於本產品有適宜甜度，因此適合做爲孩童牙粉。 施例B — 2 4 :製備液體食品之固體物 本紙浪尺度適用_國國家揉準（€灿）人4規格（210><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-85 - 426736 經濟部中央標隼局I工消费合作社印裂 五、發明説明（83 ) 將由依實施例A-7方法製得的含水海藻糖結晶粉 -500份、蛋黃粉270份、氯化鈉4.4份、氯化鉀 1 . 8份、硫化鎂4份、維生素B1 0 . 01份、抗壞 血酸鈉0.1份、維生素A醋酸鹽0.6份和菸鹼醯胺 0 _ 04份組成的組成物。每25g爲一份，置於防潮積 層帶並加熱封口，而製成產品。將一包的產品溶於1 5 0 -300mi?水中，然後以經口、鼻腔、胃或腸方式輸入 體內以補充能量。 實施例B — 2 5 :輸注液 將實例A - 8方法製得之高純度之結晶海藻糖水合物 溶於水而得約1 Ow/ν%，令其通過濾膜而除去熱原， 無菌操作而將其裝入塑膠瓶中，以習知方法封口。此產物 是安定的輸注液，其在一段時間內不改變且適合血管內及 腹腔內注射》此產物在1 Ow/v%時，與血液等張，因 此能夠以使用葡萄糖時2倍以上能量的濃度予以施用。 實施例B - 2 6 :輸换液 將依實施例A - 8方法製得的高純度含水海藻糖結晶 和依下列配方製備的胺基酸混合物混合。溶解於水中，並 使其濃度分別爲5w/v%和3 Ow/v%。然後依實施 例8 _ 2 5方法純化，並去除熱原，置於塑膠帶並封口 * 胺基酸混合物配方（mg/1 0 Omj?) L型異亮胺酸 180 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -5 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -86 - 426736 A7 B7 五 '發明説明（84 ) L型亮胺酸 L型離胺酸氯化氫 L型甲硫胺酸 L型苯丙胺酸 L型蘇胺酸 L型白胺酸 L型纈胺酸 L型精胺酸氯化氫 L型組織胺酸 甘胺酸

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 本產品由於海藻糖不具有還原力，不會有任何化學反 應發生，因此爲一安定的輸送液，適合以靜脈或腹膜內注 射方式輸入，且做爲能量和胺基酸補充劑。 實施例B - 2 7 ··外傷軟眘 將侬f施例A - 5方法製備的含水海藻糖結晶粉 200份、麥芽糖300份、碘3份、甲醇50份、10 w / v%支鏈澱粉水溶液2 0 0份，均匀混合'而得到一 具有適當伸展性和黏性的軟膏。由於本產品含有碘和海藻 糖成份，對於活細胞可提供抗感染和提供能量，因此可做 爲短期療效的外用軟育。 本發明的影饗 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 426736 A7 __B7五、發明説明（85 ) 由上面的說明可知：利用非還原醣生成酵素和澱粉分-支酵素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶催化液化澱粉溶 液，可改善含有海藻糖結構如：α -葡萄糖基海藻糖和α -葡萄糖基α -醣苷的非還原醣和低還原性醣的產率。而 且結合非還原醣生成酵素、海藻糖釋放^素和澱粉分支酵 素和/或環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶催化澱粉，可改善海 藻糖的產率及促進工業化規模生產。包含α -葡萄糖基海 藻糖和α -葡萄糖基α —醣苷的非還原醣和低還原性醣具 有極佳安定性、高品質適中的甜度，而且可做爲熱量來源 〇海藻糖由於易代謝和固化，因此可應用於非經腸道食品 。所以非還原醣和低還原性醣可應用於食品、化粧品和醫 藥用品，做爲甜味劑、味道改良劑、品質改良劑、安定劑 和塑形劑。 本發明同時提供了一個工業化規模生產方法*利用低 廉易於取得的澱粉製造不易取得的非還原醣和低還原性醣 »因此本發明對於農業、魚業、畜牧業、化學業、食品、 化粧品和^藥業所造成的影響力將無法評估。 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) Α4规格（210X2W公釐） -88 -

Claims (1)

1. 六、申請專利範圍 附件一（A): 第84105765號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國89年1 1月修正 1 . 一種產製非還原糖或含有該非還原糖之糖組成物 的方法，該非還原糖具有分子內海藻糖結構，該方法包含 令非還原糖生成酶 '澱粉脫支酶及環麥芽糖糊精葡萄 糖轉移酶·或令非還原糖生成酶、海藻糖釋出酶、澱粉脫 支酶及環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶，作用於液化澱粉溶液 以生成該非還原糖：及 收集該非還原糖或含有該非還原糖之糖組成物。 2 . —種產製非還原糖或含有該非還原糖之糖組成物 的方法，該非還原糖具有分子內海藻糖結構，該方法包含 令非還原糖生成酶、澱粉脫支酶及環麥芽糖糊精葡萄 糖轉移酶，或令非還原糖生成酶，海藻糖釋出酶、澱粉脫 支酶及環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶，作用於液化澱粉溶液 以生成該非還原糖； 可選擇地令生成物與一澱粉酶、葡糖澱粉酶或α -葡糖苷酶相接觸，以生成含有該非還原糖及污染糖類之溶 液； 令該溶液通過管柱層析：及 收集包含該非還原糖或包含該非還原糖及其他糖類之 本纸乐尺度適用中國國家標窣（CNS ) Α4規格（210x29?公釐） ABCD 426736 夂、申請專利範圍 分液。 --------r衣— (請先M1*背面之注意事項再填寫本頁> 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該其他糖類 係海藻糖和終端具有海藻糖結構之非還原糖類β 4.一種產製具有分子內海藻糖結構之非還原糖的方 法，其中係令非還原糖生成酶或令非還原糖生成酶與海藻 糖釋出酶作用於液化澱粉溶液以生成該非還原糖，，該方法 之改良處包含提局該非還原糖之產量，其包括令源粉脫支 酶及環麥芽糖糊精葡萄糖轉移酶與該非還原糖生成自|及海 藻糖釋出酶兩者或之一作用於該溶液》 5 .如申請專利範圍第4項之方法，其中該糖組成物 包含該非還原糖及一種或多種選自海藻糖或終端具有海藻 糖結構之非還原糖類的糖類* 6 .如申請專利範圍第5項之方法，其中該海藻糖係 結晶海藻糖水合物或無水結晶海藻糖。 木坟法疋度適用中國餌家揉準（CNS ) A4C格（2丨0X297公釐）