TWI344820B - - Google Patents

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1344820 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關具有環{— 6) —α—D-吡喃葡糖基 一 （1— 4) — α— D — 卩比喃葡糖基—（1— 6) — a—D — 吡喃葡糖基—（1— 4) — α—D—吡喃葡糖基一（1— } 構造之.環狀麥芽糖基麥芽糖（以下在此說明書中簡稱環狀 麥芽糖基麥芽糖）及環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶與此等之 製造方法與用途，以編碼該酶之DNA，與含此所成組成 DNA，詳而言係有關環狀麥芽糖基麥芽糖及環狀麥芽糖基 麥芽糖生成酶與其製造方法，可產生環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶之微生物，編碼該酶之DNA與含其所成重組DNA與 轉形體，使用該酶生成環狀麥芽糖基麥芽糖的方法及製造 方法，以及含有環狀麥芽糖基麥芽糖之組成物者。 【先前技術】 做爲葡萄糖之構成糖的糖質，習知者有例如澱粉做爲 原料所製造之澱粉部份分解物的直鍵澱粉、澱粉糊精、麥 芽糖糊精、麥芽低聚糖、異麥芽低聚糖等。此等糖質通常 係在分子兩端具有非還原性末端與還原性末端，示有還原 性係爲人所知者。通常澱粉部份分解物係以右旋糖當量（ Dexitrose equivalent，DE)來表示其每單位固體物之還原 力大小。此値大者通常係分子小且低黏度，雖甜味強，但 反應性強，很容易與胺基酸或蛋白質等具有胺基之物質與 胺羰基起反應，起褐度，發生惡臭，具極易使品劣化之性 -5- (2) (2)1344820 質亦爲人所知。爲改善此缺點，以往均希望有不改變澱粉 部份分解物之構成糖的葡萄糖之情況下，可以減低或消滅 其還原力之方法。習知者有例如Journal of Americam Chemical Society，美國，1949 年，第 71 卷，353 至 358 頁 所揭示，使浸漬澱粉酶（macerans amylase)作用於源粉 ，以生成6至8分子之葡萄糖予以α — 1，4一糖苷結之α _ ，泠-或r-環糊精之方法係爲人所知者。現在則已用工 業規模自澱粉生產此等環糊精，此等環糊精已可以充分利 用此等所具有之非還原性，且爲無味，具有包含能特性被 使用於.各種用途。又，如本案申請人先前於特開平7· 1 43 8 76號公報、特開平7-2 1 3283號公報等所揭示，使非還 原性糖質生成酶及海藻糖游離酶作用於麥芽低聚糖等澱粉 部份分解物，以生成二分子之葡萄糖α，α — 1，1結合之 海藻糖的方法亦爲人所知。現今自澱粉可以工業規模生產 海藻糖，可充分利用其非還原性或溫和且高品質之甜味特 性使用於各種用途。另外，如先前本案申請人於國際公開 WO 0 1 /903 3 8 Α1 號說明書，WO 02/055708 Α1 號說明書， WO 02/4 0659 Α1號說明書等所揭示使α -異麥芽糖基葡萄 糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶作用於澱粉或其部份 分解物，以生成4分子之葡萄糖爲以α - 1，3糖苷結合及 α — 1，6糖苷結合交互地結合之構造，即具有環{— 6) —α - D-吡喃葡糖基一（1— 3) — α - D-吡喃葡糖基 一 （1—6) — α-D-吡喃葡糖基—（i->3) - a— D — 吡喃葡糖基-（1— }構造之環狀四糖的方法亦爲人所知 -6- (3) (3)1344820 。此環狀四糖因具有環狀構造，所以具有包含能力’具有 穩定化揮發性有機物之作用，同時因其爲非還原性糖質’ 不會引起胺基羰基反應，不必擔心褐變，劣化可充分地期 待其利用、加工。 如上述，做爲葡萄糖爲構成糖之非還原性糖質，葡萄 糖聚合度爲6至8之a — ’ yS - ’ 7 _環糊精、葡萄糖聚合 度爲2之海藻轉、以及葡萄糖聚合物爲4之具有環6) 一 α—D-吡喃葡糖基—（1— 3) — α—D —吡喃葡糖基 —(1— 6) — α — D—吡喃葡糖基 一 （1— 3) - α- D - 吡喃葡糖基-（1— }構造的環狀四糖雖可以分別充分利 用其特性被使用於各種領域，但仍希望除此等糖質以外如 果能提供以葡萄糖爲構成糖之非還原性糖質，則可選擇非 還原性糖質之範圍可以更廣泛，更可期待利用於各種用途 【發明內容】 本發明係以提供以葡萄糖爲構成糖之新穎非還原性糖 質爲課題提供可擴大非還原性糖質選擇範圍，同時可生成 該非還原性糖質之新穎酶，與此等之生成方法及製造方法 ，編碼該酶之DNA，含其之重組DNA及轉形體，以及含有 該還原性糖質之組成物與其用途爲課題者。 本發明人等係爲解決上述課題，期望找出自澱粉部份 分解物可生成新穎之非還原性糖質之全新的酶，對可以產 生這種酶之微生物廣泛地探索，結果發現自日本岡山縣岡 (4) (4)1344820 山市之土壤新分離之新穎微生物，屬於節桿菌（ Arthrobacter)屬之新穎微生物M6株可以產生新穎之酶’ 藉由此新穎酶之作用，可以自澱粉或其部份分解等之α -I’4聚葡糖可以大量生成具有環{— 6) — α-D -吡喃 葡糖基一（1-»·4) —a—D—D比喃葡糖基—（1—»·6) 一 D —吡喃葡糖基一(1— 4) — a—D -吡喃葡糖基—（1 —}構造之'新穎環狀糖質，即環狀麥芽糖基麥芽糖。又， 在此確認了環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之各種性質，同時 確立其製造方法，並且確立編碼該酶之DNA，與含其所成 重組DN A及轉形體，更確立了藉該酶生成環狀麥芽糖基麥 芽糖之方法，以及使用該酶製造環狀麥芽糖基麥芽糖或含 其之糖質的方法。更發現環狀麥芽糖基麥芽糖係可以極易 自其過飽和水溶液離析出結晶，並予採收，又發現環狀麥’ 芽糖基麥芽糖具有包含甲醇、乙醇或乙酸等揮發成份之作 用，不會引起胺基羰基反應，很少褐變或劣化，對熱或 pH極安定，難消化性、難發酵性等有用特性，發現可以 極容易地製造環狀麥芽糖基麥芽糖，或包含有含其糖的組 成物，例如風味極佳之高品質的食品、低熱量或減肥用食 品，安定且高品質之化粧品，甚至高活性且安定之醫藥品 等，逐而完成本發明。 本發明係以提供具有環6) — a— D —吡喃葡糖 基—（1—>4) —α—D - D比喃葡糖基—（1—>6) — α - D 一吡喃葡糖基一（1— 4) — α—D —吡喃葡糖基一（1 — }之構造的新穎環狀糖質，即環狀麥芽糖基麥芽糖與生成 -8- (5) (5)1344820 其之新穎環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶與此等生成方法以及 製造方法，更提供可編碼該酶之DNA與含其所成之重組 DNA及轉形體，以及含有環狀麥芽糖基麥芽糖或含其之糖 質所成的組成物與其用途而解決上述課題。 依本發明時不但可以擴大以葡萄糖爲構成糖之非還原 性糖質的選擇範圍，還可以大量供給以往未知之新穎環狀 糖質、環狀麥芽糖基麥芽糖，可以利用飮食物、化粧品、 醫藥品爲主之各種領域。 【實施方式】 本發明中所稱環狀麥芽糖基麥芽糖係指4分子之葡萄 糖爲α - 1 ’ 4糖苷鍵及α - 1，6糖苷鍵交互結合之環狀四 糖而言’即具有環{^6) - D-吡喃葡糖基一（1β 4) — a— D —毗喃葡糖基—（1—6) — α—D—吡喃葡糖 基_ (1— 4) 一 a— D —吡喃葡糖基_ (〗—丨構造之環 狀四糖。此糖質係自土壤所得微生物的培養液中，經由本 發明人首次發現之以往未爲人所知之新穎糖質，以葡萄糖 爲構成糖之環狀四糖只要爲具上述構造，不論其供給源' 形態、純度、製造方法爲何種者，均包含於本發明。 本發明中所稱環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶係指可對葡 萄糖聚合度3以上之α - 1，4聚葡糖作用，使麥芽糖進行 α — 1’ ό轉移於其他a- 1，4聚葡糖之非還原末端葡萄糖 之6位，藉此生成ό 一 α —麥芽糖基〇_1，4 一聚葡糖，繼 而錯由環狀化反應生成具有環{〜6) —α - D—Dtt喃葡 -9- (6) (6)1344820 糖基一（1—4) — α - D —吡喃葡糖基—（l— 6) - α-D—吡喃葡糖基_ (1— 4) — α—D —吡喃葡糖基-(1 — }構造之環狀麥芽糖基麥芽糖的全部酶而言者。可催化上 述反應之酶係不論其爲何種供給源、形態 '粗酶或精製酶 ，均可被包含於本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶。 本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的酶活性可依如 下測定。將可溶性澱粉溶解於含2 mM氯化鈣之50 mM乙酸 緩衝液（ρΗ6·0)，使其濃度爲2 w/v%成爲基質液，在 0.5 ml該基質液中加入0.5 ml酶液，於40°C酶反應30分鐘 ，於約1〇〇 °C加熱該反應液10分鐘，停止反應後，爲使殘 留之可溶性澱粉或夾雜低聚糖分解，對每g固體物添加 4000單位之α -苷酶與每1 g固體物添加250單位之葡糖澱 .粉酶，於50°C處理1小時，以後述之實驗1記載之HPLC法 定量該處理液中之環狀麥芽糖基麥芽糖量。1單位環狀麥 芽糖基麥芽糖生成酶活性以在上述條件下1分鐘可生成1 //莫耳之環狀麥芽糖基麥芽糖的酶量做爲其定義。 本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的具體例係例如具 有以下學化學上性質之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶者。 (1 )分子量 於SDS-凝膠電泳法中爲72,000±20,000達爾頓。 (2 )等電點 在含有ampholine (商品名，兩性電解質）的等電點 -10- (7) (7)1344820 電泳法中爲P1 3 ·6±0.5。 (3 )最適溫度 pH 6.0，30分鐘反應之條件下爲50 °C至55 °C。

(4 )最適pH 40 °C、3 0分鐘反應之條件下爲pH 5.5至6.5。 (5 )溫度安定性 保持於pH 6_0，60分鐘之條件下，30 °C爲止係安定者 〇 1 mM鈣離子存在下，50°C爲止係安定者- (6 ) pH安定性 保持4°C，24小時之條件下，至50°C爲止係安定者。 又，具上述理化學上性質之本發明環狀麥芽糖基麥芽 糖生成酶的一種係不僅上述理化學性質，還做爲其N末端 序列具有序列表中序列號碼1所示胺基酸序列者。 本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶係通常具有所定 之胺基酸序列，其中一例有例如序列表中序列號碼2所示 胺基酸序列或與其相同性之胺基酸序列。具有與序列表中 序列號碼工作所示胺基酸序列相同性之胺基酸序列的變異 體酶係對葡萄糖聚合度3以上之α —〗，4聚葡糖作用，具 有在可以保持生成環狀麥芽糖基麥芽糖的酶活性之範圍下 -11 - (8) (8)1344820 ，序列號碼2所示胺基酸序列中缺失，取代或添加一個或 二個以上胺基酸之胺基酸序列者，最好係對於序列號碼2 所示胺基酸序列通常有60%以上，較佳有70%以上，更佳 有80%以上，最佳有90%以上相同性胺基酸序列者。 惟具有上述理化學上性質或胺基酸序列之環狀麥芽糖 .基麥芽糖生成酶只是其一例而已，即使具有與上述不同之 理化學上性質或胺基酸序列的酶，只要可生成環狀麥芽糖 基麥芽糖，當然亦包含於本發明。 本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶雖不限定其供給 源，但其較佳之供給源可舉出爲微生物，尤其可適當地採 用本發明等自土壤單離之微生物M6株。以下示具有產生 環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶能力之微生物M6株的鑑定試 驗結果如下。又，鑑定試驗係依據「微生物之分類與鑑定 」（長谷川武治編、學會出版中心，1985年）進行者。 < A :細胞形態>

(1 )肉汁瓊脂培養，27°C 通常有0.4x1.0至0.8x3.Ο/zm之短桿菌〜球菌。具多 形性》 具運動性、無孢子、革蘭陽性。

(2) EYG瓊脂培養基，27°C 示桿菌-球菌之生育循環》 1344820 Ο) < B 培養性質>

(1 )肉汁瓊脂平板培養，27°C 形狀：圓形、3天後大小爲1〜2 mm 邊緣：全緣 隆起：半透鏡狀 光澤：不透光 表面：平滑 色調：不透明、淺黃色 (2 )肉汁瓊脂斜面培養，2 7 °C 生育：.中等程度 形狀：絲狀 (3 ):肉汁瓊脂穿刺培養，2 7 °C 不會液化。 <C:生理學上性質> (1 ) VP試驗：陰性 (2 )生成吲哚：陰性 (3 )對澱粉水解：陽性 (5) 生成色素：不會生成可溶性色素 (6) 尿素酶：陰性 (7 )氧化酶：陽性 (8 )過氧化氫酶：陽性 -13- (10) (10)1344820

(9)生育範圍：ρΗ5·5至10.0’溫度15至37°C (1 0 )對氧之態度：好氣性 (11) 細胞壁之主要二胺基酸：賴胺酸 (12) 細胞壁之肽聚糖型：賴胺酸一丙胺酸 (13) 細胞壁之N—醯基型：乙醯基 (14) 細胞壁之構成糖：半乳糖、葡萄糖、鼠李糖 (15) 維生素之要求性：無 (1 6 ) DNA之 GC含量：70% (17 ) DNA _ DNA同種性：與球形節桿菌（ ATCC8010 )間，示 69.3% 之 DNA- DNA同種性。 根據以上之菌學上性質，參考「Bergey's Manual of Sy.stematic Bacteriology」第 2卷（ 1986年），檢討與公知 菌時異同。結果，確知此菌係屬於球形節桿菌（ Arthrobacter globiformis)之微生物。由此等結果，本發 明人等乃命名此菌爲新穎之微生物球形節桿菌M6，於 1 993年8月6日寄存於日本專利生物寄存中心，授予FERM BP— 8448號寄存號碼。 本發明之具有環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶產生能力之 微生物係當然爲上述菌，除此外，其變異株，還有包含具 有環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶產生能力之重組微生物的其 他微生物，及此等之變異株亦包含在內。 本發明之DNA係指可編碼上述環狀麥芽糖基麥芽糖生 成酶之全部者。本發明之DN A係只要爲可編碼環狀麥芽糖 基麥芽糖生成酶，其爲來自天然者、人爲合成者均無妨。 •14- (11) (11)1344820 天然之供給源有例如含球形節桿菌M6 ( FERM BP - 8448 )在內之節桿菌屬微生，自此等菌體可得包含本發明之 DN A之基因DNA。即，將此微生物接種於營養培養基，在 好氣性條件下培養約1至3天後，自培養基採取菌體，以溶 菌酶或Θ -葡聚糖酶等紐胞壁溶解酶或超音波處理，即可 將含有該DN A之基因DN A自菌體溶離出。這時可倂用蛋白 酶等蛋白分解酶，或使其共存SDS等界面活性劑予以凍結 熔解。對此等所得處理物適用例如苯酚萃取、醇類沈澱、 離心分離、核糖核苷酶處理等常法，即可得目的之基因 DNA。人爲合成本發明DNA時，只要例如依據序列表中序 列2所示胺基酸序列進行化學合成即可。又，以含該DN A 之基因DN A爲模板，使用適當之引子的化學合成DNA合成 PCR亦可方便實施。 本發明之DNA係具有所定鹼基序列者，其一例可爲例 如序列表中序列號碼3所示鹼基序列或相當於其之鹼基序 列。具有與序列表中序列號碼3所示鹼基序列相同之鹼基 序列的變異體DN A，可爲在保持編碼之酶活性範圍，具有 序列號碼3所示鹼基序列中缺失，取代或添加一個或二個 以上鹼基之鹼基序列者，以具有對於序列號碼3所示鹼基 序列，通常具有60%以上，較佳爲70%以上，更佳爲80% 以上，最佳爲90%以上相同性之鹼基序列爲最佳。又，根 據基因編碼之退化性，在不變其編碼之酶的胺基酸序列下 ’將一個或二個以上鹼基以其他鹼基取代者，當然亦可包 含於本發明之DNA。 -15- (12) (12)1344820 將本發明之DN A插入可自主複製之適當載體，亦可以 極有利地實施成爲重組DNA。通常，重組DNA係由DNA與 可自主複製之載體所成，只要可取得DNA，即可依常法之 重組DN A技術較容易地調製。該載體之例有PBR 322、 pUC 18、Bluescript II SK ( + ) 、pUB 1 10、pTZ 4 ' pC 194 ' PHV 14、TRp 7、YEp 7、PBS 7質粒載體或 λ gt · λ C ' λ gt · λ Β、ρ11、（ρ1、φ1〇5 噬菌體載 體。 其中以大腸菌表現本發明之DNA時係以pBR 322、 pUC 18 ' Bluescript II SK ( + ) 、λ gt · λ C ' λ gt · λ B爲較佳，另一方面以枯草菌表現時係以 pUB 110' pTZ 4、PC 194、p 1 1 ' 沪1及 pl05 爲適宜。 pHV 14、TRp 7、YEp 7及pBS 7係使重組DNA在二種以上 宿主內複製時有用。將DNA插該DNA時，可採用斯業易中 通常一般之方法。具體言，首先藉由限制酶及/或超音波 切斷含DN A之基因DN A與可自行複製之載體，其次，連結 生成之DN A片段與載體片段。切斷基因DN A及載體時只要 使用可特異性地作用於該苷酸之限制酶，尤其爲II型之限 制酶，詳而言，可用 Sau 3AI、Eco RI、Hind ΙΠ、Bam HI 、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等，即極易連接DNA片段與 載體片段。視其需要退火二者後，於活體內或活體外使 DN A連接酶作用即可。如此所得之重組DN A係導入於適當 之宿主，使之成轉形體，經由培養即可無地複製。 如上述所得之重組DN A可以導入大腸菌' 枯草菌、放 -16- (13) (13)1344820 線菌 '酵母爲主之適當宿主微生物。欲取得轉形體時可適 用菌落雜交法、或在含有葡萄糖聚合度3以上之α - 1，4 -聚葡糖的營養培養基中培養，自該糖質生成之環狀麥芽 糖基麥芽糖中選擇即可。 本發明中包含具有環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶產生能 力之轉形體在內之微生物培養使用之培養基係只要可使微 生物生長，可產生環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之營養培養 基’其爲合成培養基及天然培養基的均無妨。碳源則只要 可使微生物生長上利用者，例如植物由來之澱粉或植物肝 糖 '動物或微生物由來之肝糖或支鏈澱粉、或此等之部份 分解物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖 醇、糖蜜等糖質、或檸檬酸、琥珀酸等有機酸亦可使用。 培養基中此等碳源之之濃度可配合碳源之種類予以適當地 選擇。氮源可適當地使用例如銨鹽、硝酸鹽等無機氮化合 物及例如尿素、玉米漿、酪蛋白、腺、酵母萃取物、肉萃 取物等含有機氮物。又，無機成份可適當地使用例如鈣鹽 、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽 、鉬鹽、鈷鹽等鹽類》更可視其需要適當地使用胺基酸、 維生素等。 培養係通常在溫度15至37°C、pH 5.5至10範圍，較佳 在溫度20至34乞、pH 5.5至8.5範圍中選出之條件，於好 氣下進行。培養時間係在該微生物可以增殖之時間，較佳 係10小時至150小時。又，培養條件中之培養液的溶存氧 濃度並不特別限制，惟通常係以0.5至20 ppm爲宜。爲此 -17- (14) (14)1344820 可適當地採用調節通氣量、或藉攪拌等手段。又，培養方 式可爲分次培養或連續培養之任一。 如上述培養具有環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶產生能力 .之微生物後，回收含本發明之酶的培養物。環狀麥芽糖基 麥芽糖生成酶活性係培養微生物爲球形節桿菌M6 ( FERM PB - 8448 )時，主要可以在培養物之除菌液中確認，可 做爲粗酶液採取除菌液，亦可以將全體培養物做爲粗酶液 使用。欲自培養物除去菌體時可採用常法之固液分離法。 例如離心分離培養物其本身之方法，或使用預塗物助濾劑 濾器等過濾分離之方法，藉由平膜、中空線膜等膜過濾分 離之方法等均可適當地採用。雖可以直接使用除菌液做爲 粗酶液，但通常係經濃縮使用。濃縮法可採用硫胺鹽析法 •、丙酮及醇沈澱法，用平膜、中空膜等之膜濃縮法等》 更可使用具有環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性之除菌 液及其濃縮液，以斯業界常用之適當方法固定化環狀麥芽 糖基麥芽糖生成酶》例如可適當地採用使之結合於離子交 換體之方法，與樹脂及膜等之共有結合法、吸附法，使用 高分子物質之包括法等》 如上述，本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶雖可以 直接或濃縮粗酶使用，但亦可視其需以斯業界被常用之適 當方法，再分離·精製予以利用。例如硫胺鹽培養液之上 澄液或軋碎處理物透析濃縮酶標品後，再以使用「DEAE Toyopearl 650S」樹脂予以陰離子交換管層析，使用「 Pheny-Toyopearl 650 M」樹脂之疏水層析予以精製，即可 -18- (15) 1344820 做爲電泳上示單一帶之精製酶獲得本發明之環狀 麥芽糖生成酶》 環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶爲重組型酶時， 宿主種類之不同而在菌體內蓄積酶。這時雖可以 菌體或培養物，但通常係在使用前視其需要藉由 擊或界面活性劑自菌體萃取出後，或藉由超音波 溶解酶軋碎菌體後，經由過濾、離心分離、自菌 軋碎物分離重組型酶予以使用亦可有利地實施。 如此所得之本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成 用於具有葡萄糖聚合度上爲3以上之α —1，4聚 生成爲具有環{—6) - a— D-吡喃葡糖基一 —α-D—吼喃葡糖基一(1->6) — a— D -吡 —(1—4) -α —D —吡喃葡糖基—（1— }構 麥芽糖基麥芽糖。據測此酶係可作用於葡萄糖i 以上之α _1，4聚葡糖，於分子間藉由α —麥芽 反應，而可能非還原性末端葡萄糖之6位生成α 基結合之6—麥芽糖基一 α—1，4聚葡糖，再將 ，即可生成具有環{— 6) - α—D-吡喃葡糖3 4) 一 a— D—吡喃葡糖基 一（1—6) — a— D-基一（1— 4) — α—D —吡喃葡糖基一（1— } 狀麥芽糖基麥芽糖。本發明之環狀麥芽糖基麥芽 言有時具有以下理化學上性質。 (1 )分子量 麥芽糖基 有時會因 直接使用 滲透壓衝 或細胞壁 體或菌體 酶係可作 葡糖而可 (1^4) 喃葡糖基 造的環狀 芝合度爲3 糖基轉移 -麥芽糖 之環狀化 | — ( 1 吡喃葡糖 構造之環 糖係具體 -19- (16) (16)1344820 於SDS—凝膠電泳法中爲72,000±20,000達爾頓。 (2 )等電點 在含有amph.oline (商品名’兩性電解質）的等電點 電泳法中爲pi 3.6±0.5。 (3 )最適溫度

pH 6.0，30分鐘反應之條件下爲50°C至55°C。 (4 )最適pH 4 0 °C、3 0分鐘反應之條件下爲pH 5.5至6.5。 (5 )溫度安定性 保持於pH 6.0，60分鐘之條件下，30 °C爲止係安定者 〇 1 mM鈣離子存在下，5CTC爲止係安定者。 (6 ) pH安定性 保持4°C，24小時之條件下，至50°C爲止係安定者。 (7) N末端胺基酸序列 具有序列表中序列號碼1所示胺基酸序列，即具有天 冬胺酸-脯胺酸-蘇胺酸-蘇胺酸-絲胺酸之胺基酸序列 -20- (17) (17)1344820 可成本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之基質的葡萄 糖聚合度3以上之α — 1，4聚葡糖可爲澱粉、直鏈澱粉、 支鏈澱粉、肝糖等、或以澱粉酶或酸等部份水解此等所得 澱粉糊精、麥芽糊精、麥芽低聚糖等部份分解物。以澱酚 酶分解之部份解物可用如Handbook of Anylases and Related Enzymes 1988 年 Pergamon· Press 公司（東京）戶if 記載之使用α —澱粉酶（EC 3.2.1.1)、麥芽四糖生成澱 粉酶（EC3.2.1.60)、麥芽五糖生成澱粉酶、麥芽六糖生 成澱粉酶（EC 3.2.1.98)等瀑粉酶、分解源粉、直鏈澱粉 、支鏈澱粉、肝糖等所得部份分解物。更可以在調製部份 解物時隨意使支鏈澱粉酶（EC 3.2.1.41) '異澱粉酶 (EC 3.2.1.68)等澱粉分支酶作用亦可。 做爲基質之澱粉可爲例如玉米、小麥、米等由來之地 上澱粉，亦可爲馬鈴薯、甘薯、樹薯等由來之地下澱粉， 較佳係使澱粉糊化及/或液化做爲溶液使用。其澱粉之部 份分解之程係愈低、環狀麥芽糖基麥芽糖生成率愈高，所 以DE約20以下，較佳爲約12以下，更佳爲約5以下之部份 分解物爲宜。另外，此說明書中所稱環狀麥芽糖基麥芽糖 生成率係指式、環狀麥芽糖基麥芽糖生成率（％) = {( 生成之環狀麥芽糖基麥芽糖之質量）/(反應液中之全糖 之質量} xl〇〇所算出之値而言者。 使本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶作用於基質時 ，其基質濃度不特別限制，例如使用基質濃度〇. 1 % ( W/ V)之較低濃度的溶液時，本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生 -21 - (18) (18)1344820 成酶的反應亦可進行生成環狀麥芽糖基麥芽糖。工業上係 以基質濃度1 % ( w / V )以上爲宜，此條件下即可有利地 生成環狀麥芽糖基麥芽糖。又，做爲基質溶液亦可爲含未 完全溶解之不溶性基質的高濃度基質溶液。較佳於30〜50 °〇附近之溫度使用。反應pH係通常調整爲5至9範圍，較 佳係pH 5至7範圍爲宜。酵素之使用量與反應時間有密切 關係’可由目的之酵素反應進行適當地選擇。 例如可藉由對基質濃度1% (w/v)之澱粉或其部分 解物或直鏈澱粉之水溶液，使本發明之環狀麥芽糖基麥芽 糖生成酶作用，而可以自澱粉或其部份分解物以約30%以 上，自直鏈澱粉以約44 %高環狀麥芽糖基麥芽糖生成率得 到本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖。此藉由環狀麥芽糖基麥 芽糖生成酶生成環狀麥芽糖基麥芽糖的機制係根據推測爲 如下者。' (1) 此酵素係作用於做爲基質之葡萄糖聚合度爲3以 上的α _1，4聚葡糖、以其非還原性末端之麥芽糖基殘基 轉移至其他分子之非還原性末端葡萄糖殘基之6位羥基的 分子間的6 — α _麥芽糖基轉移做爲觸媒，生成非還原末 端具有6— α -麥芽糖基之葡萄糖聚合度爲增加2的6 - α 一麥芽糖基一 α-1，4聚葡糖、與葡萄糖聚合度爲減去2 的α — 1，4聚葡糖。 (2) 此酵素更可以作用於6— α —麥芽糖基一 α - 1 ，4聚葡糖、催化環狀反應，而生成具有環{—6) — α — D-吡喃葡糖基一（1—4) _α— D —吡喃葡糖基一（1 — •22- (19) 1344820 6) - α — D —吡喃葡糖基—（1—4) — α - D—吡喃葡糖 基一（1—丨構造的環狀麥芽糖基麥芽糖、與自6— α —麥 芽糖基一 α —1，4聚葡糖算起葡萄糖聚合度減去4之α — 1 ，4聚葡糖。 (3)於（1)及（2)新生成之α - 1，4聚葡糖係再 次受到（1)至（2)反應，藉此生成環狀麥芽糖基麥芽糖 〇 又，此生成環狀麥芽糖基麥芽糖反應時更可以同時倂 用其他酵素有利地更提高環狀麥芽糖基麥芽糖生成率。 藉由上述反應所得反應液亦可以直接做爲含有環狀麥 芽糖基麥芽糖之糖液使用。又，可視其需要使α.-澱粉酶 、/5 -澱粉酶、葡糖澱粉酶及α -苷酶所選出之一種或二 種以上作用於含有環狀麥芽糖基麥芽糖之糖液，做爲水解 夾雜之低聚糖的含有環狀麥芽糖基麥芽糖使用。通常含有 環狀麥芽糖基麥芽糖之糖液係再精製後被使用。精製方法 可適當地採用精製糖時所用之一般方法即可，例如藉由活 性碳脫色，以Η型、ΟΗ型離子交換樹脂脫鹽、離子交換管 柱層析、活性碳管柱層析、矽膠管柱層析等管柱層析之分 餾，藉由醇及丙酮等有機溶劑之分離，以具有適度分離性 之膜離’更可藉由不必利用環狀麥芽糖基麥芽糖以可同化 、分解夾雜之糖質的微生物，例如酵母等發酵處理、或鹼 處理等分解除去殘留之還原性糖質等之一種或二種以上精 製方法均可適當地採用。 其中，工業上大量生產方法，較佳係採用離子交換管 "23 - (20) (20)1344820 柱層析，例如藉由特開昭5 8-23 799號公報、特開昭 5 8-725 98號公報等所揭示強酸性陽離子交換樹脂之管柱層 析除去夾雜糖類，即可有利地製造提高目的物含量之環狀 麥芽糖基麥芽糖或含其之糖質。這時亦可隨意採用固定床 方式、移動床方式、擬似移動床方式之任一方式。 如此所得含環狀麥芽糖基麥芽糖之水溶液、或提高其 含量之糖質水溶液係通常爲每一固體單位含有10質量％以 上’較佳含有40質量％以上環狀麥芽糖基麥芽糖之糖質水 溶液’通常將其濃縮，成爲糖漿狀製品。此糖漿狀製品可 隨意地再予乾燥成爲粉末狀製品。 欲製造環狀麥芽糖基麥芽糖之結晶時可以例如在助晶 罐中放入每一固體單位之環狀麥芽糖基麥芽糖純度約50% .以上’濃度約5至90質量％的含有環狀麥芽糖基麥芽糖液 體，在每一單位固體0.1至20質量％的種結晶存在下，於 溫度95 °C以下’較於10〜90 °C範圍，一邊攪拌一邊徐徐冷 卻’製造含有環狀麥芽糖基麥芽糖的糖膏。自糖膏製造環 狀麥芽糖基麥芽糖之結晶的方法可用分蜜。又，製造環狀 麥芽糖基麥芽糖之含蜜結晶的方法可用例如塊狀粉碎、流 動造粒、噴霧乾燥等公知方法。如此所製造之本發明環狀 麥芽糖基麥芽糖之結晶或含蜜結晶係高級且具低甜味之非 還原性白色粉末、安定之糖質、與其他原材料，尤其胺基 酸、低聚肽、蛋白質等具有胺基酸物質混合、加工亦不會 褐變 '或發生異臭，對混合之其他原材料亦不會有不良影 -24- (21) 1344820 力品 能、 合 包 有 具 係 糖 芽 麥 基 糖 芽 麥 狀 環 之 明 發 本 外 另 散 ΒΒ· 揮 之 等 份 成 效 有 ' 份 成 氣 香 之 含 包 所 止 防 以 可 者 份 成 氣 香 持 保 化 定 安 地 異 優 極 可 具 以 所 化 劣 之 質 效，a C 葡糊 有類 |-(喃環 精 > …吡、 - 類 糖 四 狀 I - 環 eD 3鍵 糊 環 歧 分 % 類 精 糊 環 用 併 要 需 其 視 可 時 這 ο 等 份 成本 示 揭 所 5 至 3 獻 文 利 專 在 人 請 甲 案

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基 糖 葡 喃 吼- D 支 、 糖 四 狀 環 之 造 構

D 精類、環果聚糖類等其他環狀糖質而可以更有利地強化包 合能力的安定化。環糊精類環狀糖質並不必限於高純度者 ，低純度之環狀糖質，例如與多量之麥芽糊精一起含有各 種環狀糖質之澱粉部份分解物等亦可有利地利用。 另外，由於本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖係實質上不 會被澱粉酶或α —苷酶所分解，所以經口攝取亦不會被消 化吸收，又很難藉由腸內細菌所發酵，係極低熱量之糖質 ，可做爲擬水溶性食物纖維之物質被利用。本發明之環狀 麥芽糖基麥芽糖爲粉末製品時，其本身之吸濕性低，不但 很難黏著、固結、還可以防止與其他粉末混合所得粉末狀 物黏著、固結。另外，環狀麥芽糖基麥芽糖本身係無毒、 無害之新穎甘味料。 又，環狀麥芽糖基麥芽糖係安定之甘味料，所以結晶 製品亦可以有利地併用支鏈澱粉、羥乙基澱粉、聚乙烯基 吡咯烷酮等結合劑做爲錠劑或糖衣錠利用。又，具備調節 滲透壓性、賦形性、賦光澤性、保濕性、黏性、防止與其 -25- (22) (22)1344820 他糖之結晶性、難發酵性等性質. 因此本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖、或含其之糖質係 可係做爲甘味料、呈味改良劑、品質改良劑、安定劑、防 變色劑、賦形劑等有利地利用於飮食物、嗜好品、飼料、 餌料、化粧品、醫藥品。 本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖、或含其之糖質亦可直 接使用做爲加甜味用之調味料。需要時亦可與例如粉糖膏 、葡萄糖、異構化糖、砂糖、麥芽糖、海藻糖、蜂蜜、椒 糖漿、山梨糖醇、麥芽糖醇、二氫查爾酮、甜菊苷、α-葡萄糖甘甜菊苷、羅漢果甘味物 '甘草素' 索馬甜、蔗糖 、L -天冬胺醯基苯丙胺酸甲酯、糖精、甘胺酸、丙胺酸 等其他甘味料、或糊精、澱粉、乳糖等增量劑混合使用。 又’本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖、或含其之糖質的 粉末狀製品可以直接、或視其需要與增量劑、賦形劑、結 合劑等混合，隨意成形爲顆粒、球狀、短棒狀、板狀、立 方體、錠劑等各種形狀使用。 又，本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖、或含其之糖質的 甘味料係可以與具有酸味、鹼味、澀味、鮮味、苦味等其 他味道的各種物質調和、耐酸性、耐熱性亦大，可以有利 地利用於一般飮食物之加甜味、改良味道、或品質改良之 用。 例如可以使用於醬油、粉末醬油、味噌、醪、醃鹽、 撒用加味美乃滋、沙拉醬、食醋、三杯醋、粉末壽司醋、 中式味精、沾醬、麵湯、香醋、番茄醬、烤肉醬、咖哩醬 -26- (23) (23)1344820 、牛肉醬味、高湯調味精、鮮味精、複合調味料、味啉、 新味啉 '糖包、咖啡用糖等各種調味料之甘味料，更可以 有利地使用於味道改良劑、品質改良劑塊。更可以做爲對 煎餅 '米菓 '米糕、麻薯、包子、飽類、羊羹、凍果、蛋 糕、糖果等各種和式點心、麵包、餅乾 '小餅乾、蘇餅、 派、布丁、奶油蛋糕、鮮奶油、油蛋糕、泡芙、海棉蛋糕 、甜甜圈、巧.克力、口香糖、牛奶糖 '糖果等各種西式點 心' 冰淇淋 '水果冰淇淋等冰果、水果糖潰、冰蜜等糖漿 類、花醬、花生醬、水果醬、等醬類、草莓醬、橘皮醬、 糖醬醃漬.、糖果等果實、蔬菜之加工食品類、醬瓜、醃蘿 蔔、醃蕗蒿等醃漬物類、醃蘿蔔粉、醃白菜粉等醃漬用調 味料、洋香腸、香腸等畜肉製品類、魚肉香腸、魚肉小 香腸、魚板、竹輪、甜布辣等魚肉製品、龍膽、烏賊之鹽 漬、醋海帶、鱿魚絲、河豚之味啉醃漬乾、鱈魚、鯛魚、 蝦等魚鬆等各種珍味類、海苔、山菜、魷魚、小魚、貝等 所製造之小菜類、煮豆、馬鈴薯沙拉、海帶捲等小菜食品 、乳製品、魚肉、畜肉、水果、蔬菜之罐裝、罐頭類、合 成酒、釀造酒、淸酒、果實酒、發泡酒 '啤酒等酒類、咖 啡、可可、果汁、汽水、乳酸飮料、乳酸菌飮料等淸涼飮 料、布丁粉、鬆餅粉、速食果汁、速食咖啡、速食紅豆湯 、速食湯等、速食品，更可以做爲斷奶食、治療食品、.飮 料劑、肽食品、冷凍食品等各種飲食物之加甜用、改味用 、品質改良用等。 又，可做爲家畜、家禽、.其他如蜜蜂蠶、魚等飼養動 -27- (24) (24)1344820 物用之飼料、餌料等提高嗜好之目的使用。其他還可做爲 香煙、牙膏、口紅、唇霜、內服液、錠劑、舌片、肝油糖 、口中淸涼劑'口中香劑 '漱口劑等各種固體物、糊狀、 液1狀等嗜好品、化粧品、醫藥品等各種組成物之甘味劑 ，更可有利地利用做爲改味劑、改良口味劑、品質改良劑 、安定劑等》 做爲品質改良劑、安定劑可以有利地適用於有效成份 、活性等易於失去之各種生理活性物質或含其之健康食品 、功能性食品、醫藥品等。例如干擾素一 α，一沒，一 7· 腫瘤壞死因子-α，一石、巨噬細胞游走阻斷因子、菌落 刺激因子 '轉移因子、-間白素II等含淋巴因子液、胰島 素、成長荷爾蒙、催乳激素、促紅血球生成素、卵細胞刺 激激素等含激素液、BCG疫苗、日本腦炎疫苗、痳疹疫苗 、小兒痳痺疫苗、痘苗、破傷風類毒素、毒蛇抗毒素、人 免疫球蛋白等含生物製劑液、青黴素、紅黴素、氯黴素、 四環素、鏈黴素、卡那黴素等含抗生素液、硫胺素、核黃 素、L一抗壞血酸、肝油、類胡蘿蔔素、麥角甾醇、生育 酚等含維生素液、EPA、DHA、花生四烯酸等高度不飽和 脂肪酸或其酯衍生物、脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、 /5 —澱粉酶、異澱粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等含酶液、藥 用人參萃取物、蕺萃取物、綠藻萃取物、蘆薈萃取物、蜂 膠萃取物等萃取物類 '病毒、乳酸菌、酵母等之生菌糊液 、蜂王漿等各種生理活性物質亦可以在不失去其有效成份 、活性之下，極容易地製造安定且高品質之液狀、糊狀或 • 28 - (25) (25)1344820 固體狀之健康食品、功能性食品或醫藥品等。 使環狀麥芽糖基麥芽糖、或含其之糖質含於上述各種 組成物之方法係只要在完成製品之前的步驟使其含有即可 ，例如可適當地選擇混溶、混揑、溶解 '熔解、浸漬、滲 透、撒佈、塗佈、被覆、噴霧、注入、晶析、固化等公知 之方法。其量係通常使其含0.1質量％以上，較佳係1質量 %爲宜。 以下經由實驗詳細說明本發明。 <實驗1 :調製非還原性糖質> 對12支5 00 ml容量之三角燒瓶分別裝入100 ml由1.5 W / v%澱粉部份分解物（商品名「PINDEX #4」、松谷化 學工業公司製造、0.5 w/v%酵母萃取物（商品名「 Polypepton」、日本製藥公司製造）、〇·1 w/v%酵母萃 取物（商品名「酵母萃取物s」、日本製藥公司製造）' 0.1 w/v%碟酸二鉀、0.06 w/v%磷酸一鈉· 2水合物、 0.5 w/v%硫酸鎂· 7水合物、〇·3 w/v%碳酸鉀及水所成 液體培養基’於121 Ό熱壓器中殺菌20分鐘’予以冷卻。 繼而接種球形節桿菌M6(FERM BP— 8448) ’於27°C， 以2 3 0 rp m旋轉振盪培養1 2 0小時。培養後離心分離（ 8,000 rpm，20分鐘）培養液，除去菌體，得約K1丨培養 上澄液。使用1 1所得培養上澄液做爲酶液’加入含有2 w /v%可溶性澱粉及2 niM氣化鈣之1 1 50 mM醋酸緩衝液’ 於40。(：反應24小時後，於約100 °C熱處理10分鐘’停止反 -29- (26) (26)1344820 應。 爲調查所得反應物中糖質，使用做爲展開溶媒之正丁 醇、吡啶、水、混液（容量比6:4:1)、以及做爲薄層 板之墨克公司製「Keezel gel 60」（錯板，10x20 cm) ，進行展開二次之矽膠薄層層析（以下稱爲TLC )、分離 糖質。以硫酸一甲醇法使其發色、檢測分離之糖質，結果 檢測出葡萄糖（Rg値爲1.00 )、麥芽糖（Rg値爲0.82 )之 外，還有Rg値爲〇·44之糖質及Rg値爲0.21之糖質。據測此 等糖質係球形節桿菌M6之培養上澄液中的酶作用於可溶 性澱粉而生成者。又，在此所稱之Rg値係指在TLC中對葡 萄糖之移動距離的溶.質移動距離之比所表示者，由式Rg値 =(自溶質之原點移動之距離）/(自葡萄糖之原點移動 的距離）予以算出者。 繼而以鹽酸調節上述反應物爲pH 5.0後，添加對固體 物（g.爲4000單位之α —苔酶.（商品名『Transglucosidase L「Amano」』、天野Enzyme公司製）及對固體物1 g爲 250單位之葡糖澱粉酶（長瀨生化學工業公司販售），於 50°C反應16小時。反應後於約100 °C熱處理10分鐘，停止 反應。以TLC分析所反應中之糖質，結果只檢測出葡萄糖 及Rg値約〇.44的糖質，並未檢出麥芽糖，Rg値約0.21之糖 質。由此等結果可知，麥芽糖及Rg値約0.21之糖質可被α 一苷酶與葡糖澱粉酶分解爲葡萄糖，但Rg値約0.44之糖質 無法被此等酶分解。 繼而在上述反應液中加入氫氧化鈉調節pH爲1 2，於 -30- (27) (27)1344820 98 eC保持1小時以分解環原糖。過濾不溶物予以除去後， 使用三菱化學製離子交換樹脂「Diya Ion SK—l B」與「 Diya Ion WA 30」及Organo製陰離子交換樹脂「IRA 411 」予以脫色、脫鹽、精密過濾後，以蒸發器濃縮、真空乾 燥得約4.0 g糖質粉末。 以高速液體層析法（以下稱爲HLPC )調查所得糖質 之組成檢測出如第1圖所示在溶離時間1 0.6 1分鐘檢測出峰 値，獲知純度爲97 %以上之極高純度者。又，HP LC係使 用「Shodex SUGAR KS— 80」（昭和電工公司製造）爲管 柱，使甩水做爲溶離液，於60 °C管柱溫度、0.5 ml/分鐘 流速之條件下進行，檢測係用示差折射計R1 — 8012 (東曹 公司製造）。以索默季·尼爾森測糖法測定所得糖質之還 原力時獲知其還原力係在檢測臨限以下，此標係實質上爲 非還原性糖質。 <實驗2:分析非還原性糖質之構造> <實驗2 — 1:質量分析> 使用質量分析裝置 「LCQ Advantage」（ 1'11”111(^1£；^〇11公司製）質量分析實驗1之方法所得非還原 性糖質，結果顯著地檢測出質量數67 1之鈉附加分子離子 ，獲知本發明之非還原性糖質之質量數係648。 <實驗2— 2:構成糖分析> 依常法使用硫酸對實驗1之方法所得非還原性糖質水 -31 - (28) (28)1344820 解至單糖爲止，以氮體層析法調查構成糖，結果僅檢測出 D-葡萄糖，獲知本發明之非還原性糖質的構成糖係D-葡萄糖。考慮上述質量數時可知本發明之非還原性糖質係 由4分子D -葡萄糖所成環狀糖質。 . <實驗2 — 3 :甲基化分析> 依常法對實驗1之方法所得非還原性糖質進行甲基化 分析，以氣體層析法調查甲基化物。結果如表所示。 表1 分析甲基化物之種類 比率 2，3，4 -三甲基化物 1.03 2,3,6-三甲基化物 1.00 由表1之結果可知，2，3，4一三甲基化物與2，3，6 -三甲基化物係大約等量，由此可知，構成本發明之非還 原性糖質之4分子D-葡萄糖中，2分子係在1位與6位、與 糖苷結合，又，其他2分子係於1位與4位、與糖苷結合。 <實驗2—4:核磁共振分析> 依常法核磁共振（NMR )分析實驗1之方法所得非還 原性糖質。將1H— NMR光譜示於第2圖、13C_NMR光譜示 於第3圖。由實驗2 - 1及2 — 2之結果雖獲知此非還原性糖 質係由4分子葡萄糖所成之糖値。但在13C — NMR光譜中只 -32- (29) (29)1344820 確1 2.條碳信號，所以可知此非還原性糖質係具有對稱構造 之環狀四糖。又，4 — NMR光譜中之約4.93 ppm信號及約 5.2 6 ppm之信號係歸屬於D—葡萄糖殘基之1位質子，求出 其自旋-自旋結合定數時係約3.3 09 Hz (約4.93 ppm之信 號）及約3.667 Hz (約5..26 ppm之信號），所以1，4糖苷 結合之D-葡萄糖殘基之1位的成苷異構物型及1，6-糖 苷結合之D-葡萄糖殘基之1位的成苷異構物型係獲知雙 均爲α型。 由以上結果可知，本發明之非還原性糖質係如第4圖 所示之環狀麥芽糖基麥芽糖，即具有環6) _ α - D 一吡喃葡糖基—（1— 4) 一 a— D-吡喃葡糖基一（1— 6 )一 α — D —吡喃葡糖基一（1— 4) — a— D—吡喃葡糖 基_( 1— }構造之環狀四糖。具有此構造之糖質係以往 完全不爲人所知，本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖係新穎之 環狀糖質。 <實驗3:生產環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶> 在2支5 00 ml容量之三角燒瓶中分別放入100 ml實驗1 記載之液體培養基’於121 °C熱壓器殺菌20分鐘’經冷卻 、接種球形節菌 M6(FERM BP- 8448) ’於 27°C、230 rpm旋轉振盪培養48小時’以此做爲種培養。 在容量30 1之發酵器中放入約20 1與種培養同組成之 液體培養基，加熱殺菌’冷卻使其爲27 °C溫度後’接種約 200 ml種培養液，保持於27 °C、pH 5.5至8.0’通氣攪拌培 -33- (30) (30)1344820 養96小時。培養後自發酵氣抽出培養液，經離心分離（ 8 000 rpm，20分鐘）除去菌體，得約18 1培養上澄液。針 對培養液及培養上澄液測定環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活 性，結果獲知培養液中含約0.0028單位/ ml該酶活性，上 澄液中含約0.026單位/ ml該酶活性，可知藉由球形節桿 囷M6所生產之本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶係其大 部份存在於菌體外。 + <實驗4:精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶> 在實驗3所得培養上澄液之約9.2 1(總活性約240單位 中添加硫胺使其最後濃度爲60%飽和，於4°C放置24小時 進行鹽析》以離心分離（11，〇〇〇 rpm 30分鐘）回收生成之 鹽析沈澱物，將其溶解於10 mM Tr is-鹽酸緩衝液（pH 7.5 )後，對該緩衝液進行透析，得約240 ml粗酶液。粗 酶液中之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性係約0.83單位 / ml (總活性約200單位）。以使用東曹公司製「DEAE-Toypearl 650S」凝膠之陰離子交換層析（凝膠容量100 ml )處理該粗酶液。環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性係吸附 於以lOmMTris —鹽酸緩衝液（pH7.5)平衡化之「DEAE Toyopearl 650S」凝膠，以食鹽濃度〇 Μ至0.4 Μ之直線梯 度溶離，結果在食鹽濃度約0.22 Μ附近溶離出。回收此活 性餾份，添加硫胺使最後濃度爲1 Μ’於4°C放置24小時後 離心分離除去不溶物，以使用東曹公司製「Phenyl· Toyopearl 650S」凝膠之疏水層析（凝膠容量10 ml)處理 -34- (31) (31)1344820 。本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性係吸附於以含 1 Μ硫胺之20 mM乙酸緩衝液（pH 6.0 )平衡化之「 Phenyl-Toyopearl 650M」凝膠，以自硫胺濃度1 Μ至0 Μ 之直線梯度溶離時，在硫胺濃度約〇·1 Μ附近溶離。此精 製之各步驟中的環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性量，環狀 麥芽糖基麥芽糖生成酶比活性及收率示於表2。 表2 步驟 環狀麥芽糖基麥芽糖生 環狀麥芽糖基麥芽糖生成 收率％ 成酶活性量(單位） 酶比活性(單位/mg蛋白） 培養上澄液 240 0.13 100 以硫胺鹽析後之透析液 200 0.66 83 離子交換管柱溶離液 140 7.3 58 疏水管柱溶離液 96 10 40 以5至20 w/ν%濃度梯度聚丙烯醯胺凝膠電泳檢定疏 水層析後精製之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶標品的純度， 結果蛋白帶係單一、爲純度極高之標品。 <實驗5:環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之性質> <實驗5—1:分子量> 以SDS—聚丙烯醯胺凝膠電泳法（5至20 w/v%濃度 梯度）處理實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生 成酶標品，與同時電泳之分子量標記（曰本BiO· RAD · -35- (32) (32)1344820 LAVORATORISE公司製）相比，測定分子量時獲知本發 明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的分子量係72,000 土 20,000達爾頓。 <實驗5-2:等電點> 以含有 2.2 w / v% Ampholine ( Amasham · Biosicence公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法處理 實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶標品’ 與同時電泳之等電點標記（Amasham Biosicence公司製） 相比較求出等電點，結果獲知本發明之環狀麥芽糖基麥芽 糖生成酶之等電點係 PI 3.6±0.5。 <實驗5_3:酶反應之最適溫度及最適pH> 使用實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成 酶標品，測定影響酶活性之溫度、pH 、分別在此酶之活 性測定法中使溫度PH做各種變化加以測定。將此結果示 於第5圖（最適溫度），第6圖（最適pH)。結果獲知本 發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶最適溫度係pH 6.0，反應 30分鐘之條件下爲50〜55°C，最適pH係40°C反應30分鐘 之條件下爲5.5至6 · 5。 <實驗5-4:酶之溫度安定性及pH安定性> 使用實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成 酶標品，調查本發明之溫度安定性及pH安定性。溫度安 -36- (33) 1344820 定性係在氯化鈣不存在下或1 mM存在下，使酶 mM乙酸緩衝液，pH 6.0)於各溫度保持60分鐘 測定所殘留之酶活性以求得者。將此等結果示方 溫度安定性），第8圖（pH安定性）。由第7圖 發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的溫度安定性 鈣不存在下係至30°C爲止，1 mM氯化鈣存在下 爲止，獲知可藉由鈣離子而提高此酶之溫度安定 由第8圖可知，本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生 安定性係pH 5.0至9.0範圍。 <實驗5— 5:金屬鹽對酶活性之影響> 使用賓驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥 酶標品，於各種金屬濃度1 mM存在下’依據活 方法調查並金屬鹽對酶活性之影響。結果示於表

溶液（1 0 ，水冷後 令第7圖（ 可知，本 係在氯化 係至5 0 °C 性。又， 成酶之pH 芽糖生成 性測定的 3 〇 -37- (34) 1344820 表3 金屬鹽 相對活件（％) 金屬鹽 相對活性（％) 無添加 1 00 NiCl2 90 MgCl2 — 98 CuCl2 1 A1C12 13 ZnCl2 73 CaCl2 99 SrCl2 90 MnCl2 97 BaCl2 90 FeCl2 95 HgCl2 2 FeCl3 32 PpCl2 36 CoCl2 95 EDTA 25 由表3之結果可知，本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生 成酶活性會顯著地受到Cu2+及Hg2+之阻礙，亦會被Al3 + 、Fe2+及Pb2 +離子所阻礙。又，還可被金屬離子鉗合劑 之EDTA所阻礙。 <實驗5- 6: N末端胺基酸序列> 使用實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成 酶標品，以蛋白質序列儀模式492 HT ( Aplidbiosystems公 司製）分析此酶之N末端胺基酸序列，結果獲知具有序列 表中序列號碼1所示之胺基酸序列，即，具有天冬胺酸-脯胺酸-蘇胺酸-蘇胺酸一絲胺酸之N末端胺基酸序列。 <實驗5 — 7 :部份胺基酸序列> -38- (35) (35)1344820 取適量之實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶標品，以10 mM Tris·鹽酸緩衝液（PH 9.0)於4 °C透析1 8小時後，加入該緩衝液，使之成蛋白濃度約1 mg /ml。取約1 ml此溶液’加入20 賴胺醯肽鏈內切酶（ 和光純藥公司販），於3 0 °C，保持1 6小時，水解酶蛋白。 將水解物灌入預先以含有8% (v/v)乙腈之〇.1 (v/v) 二氣化乙酸平.衡化之HPLC用管柱（商品名「Microbonda pack C 1 8 j ，直徑 3.9 mmx長 150 mm Watase 公司製）中 ，以流速0·9 ml/分鐘，室溫條牛下，通入自〇·ι% ( v/v )三Μ化乙酸一8% (v/v)乙腈溶液至0.1% (v/v)三 氟乙酸一40% (v/v)乙腈溶液之120分鐘的直線梯度、 分餾肽片段。自管柱溶離出之肽片段係測定波長210 nm之 吸光度予以檢測。將自通入液體開始約12分鐘，約18分鐘 ，約20分鐘，約36分鐘，約39分鐘及約66分鐘溶離之6種 肽片段的胺基酸序列，分別依實驗5 - 6—樣之方法分析， 結果分別具有序列表中序列號碼4至9所示胺基酸序列。 <實驗6:選殖編碼環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之DN A及 調製含此之重組DNA與轉形體> 自球形節桿菌M6(FERM BP- 8448)選殖編碼環狀 麥芽糖基麥芽糖生成酶之DNA，製作可以自行複製之重_.組 DNA，決定可編碼酶之DN A的鹼基序列，及調製轉形體。 <實驗6— 1 :調製染色體DNA> -39- (36) (36)1344820 在500 ml容積之三角燒瓶中，分別放入100 ml由2.0 w / v%薇粉部份解物（商品名「PINDEX #4」松谷化學工 業公司製），：1.0 w/v%酵母萃取物（商品名「 A.sahimeast」、Asahifood and helthcare公司販售）、0.1. w/v%磷酸二鉀、〇_〇6 w/v%磷酸—鈉· 12水合物鹽、 0.05 w/ v%硫酸鎂7水合物鹽·及水所成液體培養基、以 熱壓器於121 °C殺菌20分鐘、冷卻後，接種球形節桿菌M6 (FERM BP - 8448 )，於 27°C ' 230 rpm 旋轉振盪培養 24 小時。 將離心分離自培養物採取之菌體浮游於TES緩衝液（ pH 8.0)，加入0.05% ( w/v )溶菌酶，於37°C培養30分 鐘。於一 80°C冷凍1小時處理物後，加入TSS緩衝液（pH 9.0 )，加溫爲60°C，加入TES緩衝液/苯酚混合液，於冰 水中一邊冷卻，一邊用力振盪後，藉離心分離採取上澄液 。在此上澄液中加入2倍容量之冷乙醇，採取沈澱之粗染 色體DNA，溶解於SSC緩衝液（pH 7.1)後，分別加入7.5 eg與125m g核糖核酸酶與蛋白酶，於37 °C保持1小時予以 反應。反應物中加入氯仿/異戊醇混合液，萃取染色體 DNA，加入冷乙醇，採取生成之含有染色體DNA的沈澱。 將如此所得之精製染色體DNA溶解於SSC緩衝液（pH 7.1 )使其成濃度約1 mg/ml，冷凍爲- 80°C。 <實驗6—2:調製重組DNA pBMBl及轉形體BMB1> 採用0.1 ml實驗6—1調製之精製染色體DNA溶液，加 -40- (37) (37)1344820 入約100單位之限制酶Baml+1於其中，於37°c反應1小時 ，水解染色體DNA後，藉瓊脂糖電泳法，自約3,000至 6,000鹼基對採取DNA片段。另外，依常法使限制酶Bam HI作用於質粒載體（Staragin. Clonning· System製，商 標「Bluscript II SK( + )」）予以完全切斷後，使用市 販之組套（寶酒造製，商品名「DNA Ligation · Kit」） 依所附說明書採作該被切斷之0.5 g質粒載體與先前所得 之約5 g DNA片段，將其連結。使用所得重組DNA，依 一般之反應潛能細胞法、轉形1 00 // 1反應潛能細胞（商品 名「Epicurian coli XL2.— Blue j .、Stragin · clonning · system製）製作基因庫。 依常法調製之含10 g/1胰腺、5g/l酵母萃取物、5g / 1氯化鈉、1〇〇 mg/ 1胺苄青黴素鈉鹽、50 mg/ 1 5—溴 -4 一氯一 3 —吲哚基—石—半乳糖酶之瓊脂平板培養基（ ΡΗ 7.Ό )植菌上述所得做爲基因庫之轉形體，於37°C培養 24小時後，將約4000個培養基上所形成之白色菌落固定於 尼龍膜（商品名「Hybond-N+」、Amasham公司製）上》 另外化學合成在實驗5 - 7之方法已獲知之依據序列表中序 列號碼7所示胺基酸序列之第4至13爲止之胺基酸序列，具 有 5I-GACGTSGTSCCSAACCACACSGCSGACTAC-3·所示鹼 基序列的低聚核苷酸，依常法使用「r - 32P J ATP及T4 多核苷酸激酶進行同位素標識，得到做爲探針1之合成 DN A。適用一般之菌落融合法選擇先前尼龍膜上固定菌落 中與探針1示有顯著締合之菌落，得五種轉形體" -41 - (38) (38)1344820 繼而根據序列表中序列號碼8所示胺基酸序列之第丨至 第1〇之胺基酸序列，化學合成具有5，_ GACTGGGTSGACATGGGSTTCGACGGSATC-3,所示鹼基序 列之低聚核苷酸，與上述一樣同位素標識，得到做爲探劍_ 2的合成DNA。依常法自上述五種轉形體採取重組〇ΝΑ， 適用一般之Southern融合法，選擇與探針2具有顯著締合 之重組DNA，將此具有重組DNA的轉形體命名爲「BMBi 」。 依常法將此轉形體植菌於含有100" g/ml胺苄青黴素 鈉鹽之L 一肉汁培養基（pH 7.0)，於37 °C旋轉振盪培養 24小時，培養完後，以離心分離自培養物採取菌體，藉由 一般之鹼一 SDS法萃取重組DNA。以一般之二氧法分析此 重組DN A之鹼基序列，獲知該重組DNA係含有具球形節桿 菌M6 ( FERM BP- 8448 )由來之序列表中序列號碼10所 示鏈長4467鹼基對之鹼基序列的DNA。如第9圖所示，此 重組DNA中該DNA係被連結於藉由限制Bam H1辨識部位 之下游者。另一方面，由此鹼基序列所推定之胺基酸序列 係如該序列號碼1 〇—倂記載，此胺基酸序列係以實驗5 — 6 之方法所確認之本發明的環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之N 末端胺基酸序列及以實驗5 - 7之方法確認之部份胺基酸序 列。比較序列表中序列號碼1及序列號碼4至9所示胺基酸 序列時獲知序列表中序列號碼1所示胺基酸序列係與序歹1J 表中序列號碼10—倂記載之胺基酸序列中的第41至第45之 胺基酸序列完全一致。又，序列表中序列號碼4、5、6、7 -42 - (39) (39)1344820 、8及9所示胺基酸序列係分別與序列表中序列號碼ι〇所示 鹼基序列一倂記載之第323至第332、第164至第190、第 241至第265及第3 3 3至第362的胺基酸序列完全一致。由以 上可知’本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶係爲含有序列 表中序列表2所示胺基酸序列者，該酶係在球形節桿菌M6 (FERM BP — 8448 )中，藉由序列表中序列號碼3所示鹼 基序列DNA所編碼者。又，序列表中序列表1中一倂記載 之胺基酸序列中第1至第4〇之胺基酸序列係被推定爲該酶 之分泌信號序列。由此等可知，該酶之分泌前的前驅物質 係由序列表中序列號碼1 0所倂記之胺基酸序列所成，該胺 基酸序列係被序列表中序列號碼1 0所示鹼基序列所編碼者 。將如上述調製，確認鹼基序列之重組DN A命名爲「 ρ Β Μ B 1」。 <實驗7:藉由轉形產生環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶> 分別於500 ml容積之三角燒瓶放入1〇〇 ml由10 g/Ι澱 粉部份分解物（商品名「PINDEX #4」、松谷化學工業公 司販售）、20 g/Ι多腺、20 g/Ι酵母萃取物及1 g/丨磷酸 氫鈉· 12水合物鹽及水所成液體培養基，於熱壓器、121 °C殺菌20分鐘，經冷卻、調整爲無菌、pH 7.0，無菌下添 加1 〇 mg胺苄青黴素鈉鹽，調整爲液體培養基。在此液體 培養基中接種實驗6 - 2之方法所得轉形體BMB1，於27 X： 旋轉振盪培養約48小時。依常法，離心分離所得培養物、 分離爲培養上澄液與菌體予以回收。對菌體係以超音波軋 -43- (40) (40)1344820 碎法自細胞調製全萃取物。超音波軋碎法係將菌體懸濁於 10 mM磷酸緩衝液（pH 7.0 )後，於冰水中一邊冷卻該菌 體懸濁液，一邊以超音波勻漿器（模型UH — 600 MMT公 司製）予以細胞軋碎，以該軋碎物做爲全細胞萃取物。 針對如上述調製之培養上澄液與全細胞萃取物分別測 定環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性，將各活性値換算爲每 1 ml培養物數値。又，做爲對照，與上述轉形體一樣之條 件培養大腸菌XL2 — Blue株，自培養物調製培養上澄液與 全細胞萃取物，同樣測定環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性 。將此等結果示於表4。 表4 菌株 環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶活性 (單位/ m 1 _培養物） 培養上淸 全細胞萃取物 BMB1(本發明） 0.00 0.05 E.coli(對照） 0.00 0.00 表中之BMB1及E.coli係分別指轉形體BMB1及大腸菌XL2 -Blue株。 由表4可知’轉形體BMB1係可以在細胞內產生本發明 之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶。宿主之對照大腸菌則在培 養上澄液，全細胞萃取物中均無確認該酶活性。 在此再依實驗4所示方法、鹽析、透析此實驗7之方法 -44 - (41) (41)1344820 所得全細胞萃取物，以使用DEA-Toyopearl 6505凝膠， Phenyl Toyo Pearl 65 0 Μ凝膠之層析精製，再依實驗5所 示方法分析此精製酶製品。結果SDS -聚丙烯醯胺電泳法 之分子量係約72,000 ± 2 0,000達爾頓，等電點聚丙烯醯胺 電泳法之等電點係約3.6 ±0.5，環狀麥芽糖基麥芽糖生成 酶活性最適溫度係約50〜55 °C，最適pH係約5.5至6.5， 溫度安定性係氯化鈣非存在下爲30 °C、1 mM氯化鈣存在 下爲至約50 °C爲安定，pH安定性係約5.0〜9.0範圍爲安 定者。此等理化學上性質係實質上與實驗4所示方法所調 製之該酶相同。由以上結果可知，本發明之環狀麥芽糖基 麥芽糖生成酶係可適於藉由重組DN A技術製造，且酶之生 產效率亦顯著提高。 <實驗8 :對各糖質之作用> 使用各種糖質調査本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成 酶的基質特異性。調製含有麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖 、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、新海藻糖、海藻糖、 麴二糖、黑麴黴二糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、葡萄基麥 芽糖 '異葡萄基麥芽糖、麥芽糖醇、麥芽三醇、α —， 点一或7 -環糊精、直鏈澱粉、可溶性澱粉、肝糖、支鏈 澱粉或糊精之水溶液。在此等基質溶液中加入最終濃度20 mM乙酸緩衝液（pH 6.0)與最終濃度1 mM氯化鈣後，對 每1 g基質固體物分別加入1單位之實驗4之方法所得精製 環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶標品’調製爲基質濃度2 w/v -45- (42) (42)1344820 % ’於40°C ’ PH 6.0作用24小時。以實驗1記載之TLC法分 丰斤_反應後之反應液，確認對各糖質有無酶作用及其強度 。結果示於表5。 表5 基質 作用 基質 作用 麥芽糖 一 葡萄糖基麥芽糖 _ 麥芽三糖 + 異葡萄糖基麥芽糖 麥芽四糖 + + + 麥芽糖醇 _ 麥芽五糖 + + + 麥芽三醇 _ 麥芽六糖 + + + α _環糊精 _ 麥芽七糖 + + + 冷一環糊精 _ 新海藻糖 一 7 —環糊精 海藻糖 — 直鏈澱粉 + + + 麴二糖 _ 可溶性澱粉 + + + 黑麴黴二糖 _ 肝糖 + + 異麥芽糖 一. 支鏈澱粉 _ 異麥芽三糖 一 糊精 — 註）於酶反應前後 -係示「無變化」 +係示「基質之斑點稍有其他生成物」 + +係示「基質之斑點減少多其他生成物」 + + +係示「基質之斑點或平均消失，有其他生成物」 -46- (43) (43)1344820 由表5之結果可知’本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生 成酶係對試驗之糖質中之麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖 、麥芽七糖可充分地作用，對麥芽三糖可稍作用。另外， 對直鏈灑粉、澱粉、肝糖。本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶亦可充分作用。由此等結果可知，此酶係可對葡萄 糖聚合.度爲3以上之α - 1，4聚葡糖作用者》 <實驗9 :作用機制> <實驗9— 1:自麥芽四糖之生成物> 在最後濃度1 w/ ν%麥芽四糖水溶液中加入最後濃度 20 mM乙酸緩衝液（pH 6.0 )與最後濃度1 mM氯化鈣後， 於每1 g基質固體中加入1單位之實驗例4之方法所得精製 環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶，於40°C、pH 6.0下作用，經 時性地採樣，保持於l〇〇t 10分鐘’停止反應。使用 HPLC法測定該酶反應液之糖組成。HPLC係使用「YMC Pack ODS-AQ303」Y.M.C公司製）做爲管柱，使用水做溶 離水，於管柱溫度40°C，流速〇·5 ml/分鐘之條件進行， 檢測係使用示差折射計R 1 0 — 1 〇 A (島津製作所製造）進 行。結果示於表6。 (44) 1344820 表6 反應 時間 糖組成(％) 麥芽糖 麥芽糖基麥 芽糖 麥芽四 糖 麥芽糖基 麥芽糖 麥芽六糖 糖質X 其他 0 0.0 0.0 97.3 0.0 0.0 0.0 2.7 1 9.0 2.6 69.5 0.5 3.9 11.3 1.8 2 15.6 6.6 51.7 0.9 5.6 14.0 2.6 4 22.8 12.5 35.5 1.8 5.4 14.7 3.5 8 31.7 21.3 19.1 3.8 4.1 10.8 5.7 16 36.3 25.6 10.9 6.9 2.5 8.2 6.5 24 38.7 28.6 6.9 9.6 1.2 7.1 6.1 表中之麥芽糖基麥芽糖係指62 - Ο - α -麥芽糖基麥芽糖 糖質X係由後述實驗9 - 3可知爲α —麥芽糖基麥芽四糖 (別名、64 - 0 — α麥芽糖基麥芽四糖） 由表6可知，此酶之作用結果係自基質麥芽四糖，在 反應初期（反應1小時）可以顯著生成麥芽糖與糖質X。 又獲知雖爲少量亦可生成麥芽六糖、環狀麥芽糖基麥芽糖 及麥芽糖基麥芽糖（62 — ω —麥芽糖基麥芽糖、非環狀） 。另外，再進行反應後此等生成糖中，可以大量蓄積麥芽 糖與環狀麥芽糖基麥芽糖，雖爲少量但亦增加麥芽糖基麥 芽糖。另一方面糖質X及麥芽六糖之生成量係至反應時間 4小時雖可增加，但其後卻減少。由此等結果推測，反應 • 48 - (45) (45)1344820 初期中’本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶係作用於環 狀麥芽糖基麥芽糖，主要生成麥芽糖與糖質X，再進行反 應時’此酶會作用於糖質X，而可生成環狀麥芽糖基麥芽 糖’所以可以推想糖質XI自麥芽四糖反應生成環狀麥芽糖 基麥芽糖的中間體。又，由於可同時生成麥芽糖基麥芽糖 或麥芽六糖，而可推定此酶係可催化麥芽糖單位之糖轉移 的酶’糖質X亦爲麥芽糖基移所得生成物。 <實驗9 一 2:單離糖質X> 在此進行自麥芽四糖生成環狀麥芽糖基麥芽糖之反應 中，被推測爲反應中間體之糖質X的單離。在2 1最後濃度 1 w/v%麥芽四糖冰溶液中，加入最後濃度20 mM乙酸緩 衝液（pH 6.0)，與最後濃度1 mM氯化鈣後，對每1 g基 質固體物加入I單位之實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基 麥芽糖生成酶，於40 °C、pH 6.0作用4小時後，保持於1〇〇 °C 1〇分鐘，停止反應。繼而經由預備試驗，確認糖質X 不會被/5 -澱粉酶分解後，將上述所得反應液調整爲pH 5.5，對每1 g基質固體物添加5單位；S —澱粉酶（Sigma公 司製），於50°C處理16小時，將反應液中殘留之麥芽四糖 分解爲麥芽糖。保持反應液於】〇〇 °C 10分鐘，停止反應 ，過濾除去不溶物後，使用三菱化學製離子交換樹脂「 Daiya Ion WA30」脫色、脫鹽，再以三菱化學製陽離子交 換樹脂「Daiya Ion SK - 1 B」與Organo製陰離子交換樹脂 「IRA4 11S」脫色、脫鹽，精密過濾後，以蒸發器濃縮， -49- (46) (46)1344820 做爲分餾原料。以分離用HPLC管柱「YMC— Pack 0DS — A. R355- 15S — 15 12A」 （Y.M.C公司製）精製’自上述 麥芽四糖之反應物’以固體物收率約6.7%得純度99.3% 以上之糖質X標品。 <實驗9_3:分析糖質之構造> <實驗9- 3 - 1 :生成環狀麥芽糖基麥芽糖的試驗> 在實驗9 - 2之方法所得糖質X精製標品的水溶液（最 後濃度1 w/v%)中加入最後濃度20 mM乙酸緩衝液（pH 6.0)與最後濃度1 mM氯化鈣後，對每1 g基質固體物加入 1單位之實驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶 ，於40。(：，48.6.0作用24小時，於100 °C保持10分鐘，停 止反應後，以實驗1記載之TLC法及HPLC法分析’調查生 成物之結果，獲知主要生成麥芽糖與環狀麥芽糖基麥芽糖 ，由此可確認糖質X係爲環狀麥芽糖基麥芽糖生成反應之 中間體。 <實驗9— 3 — 2:質量分析> 以實驗2 - 1記載之方法質量分析實驗9 - 2之方法所得 糖質X精製標品，可顯著地檢測出質量數1013之鈉加成分 子離子，獲知糖質X之質量數爲990 ’由此質量數可知糖 質X係以6分子D -葡萄糖所構成。 <實驗9 — 3 - 3 + ':以支鏈澱粉酶分解試驗> -50- (47) 1344820 以支鏈澱粉酶（林原生物化學硏究所製造）作用於實 驗9 - 2的方法所得糖質X精製標品的水溶液（最後濃度1 w/ v% )進行分解試驗。對每1 g基質固體物加入1單位支 鏈澱粉酶，於40 °C、pH 6.0作用24小時’於100°C保持10 分鐘停止反應後’以實驗1記載之TLC法及HPLC法分析， 調查生成物，結果獲知生成麥芽糖與麥芽四糖。即可知’ 糖質X係具有麥芽糖與麥芽四糖分子爲α - 1，6糖苷結合 之構造者。 <實驗9 — 3 — 4 :甲基化分析> 使用實.驗9- 2之方法所得糖質X標品，依常法甲基化 分析，以氣相層析法調查甲基化物。結果示於表7。 表7 分析甲基化物之種類 比率 2,3,4-三甲基化物 1.00 2,3,6-三甲基化物 4.04 2,3,4,6·四甲基化物 0.85 由表7之結果可知，由於2，3，4 —三甲基化物與2，3 ，6 —三申基化物與2，3，4，6-四甲基化物爲約1: 4:. 1 比率，所以可知構成糖質X之6分子葡萄糖中，1分子係於 1位與6位爲糖苷結合之葡萄糖，4分子係於1位與4位爲糖 脊結合之葡甸糖，其他1分子係只有1位爲葡萄糖基結合之 -51 - (48) (48)1344820 葡萄糖。又，由此結果可知，麥芽糖與麥芽四糖爲α -1 ’ 6結合之糖質X中的1，6糖苷結合係存在於非還原末端 殘基者。 由以結果可知，藉由本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生 成酶，自麥芽四糖生成的糖質X係環狀麥芽糖基麥芽糖生 成反應之中間體，其構造係麥芽四糖之非還原末端葡萄糖 殘基約6位羥基α結合麥芽糖之6糖，爲構造式1所示α 一 麥芽糖基麥芽四糖（64 - α —麥芽糖基麥芽四糖）。 幸冓造式1 : 化1 0-0-0197-(1^4)-0-0-0107-(1-^6)-0-0-0107-(1-^4)-0-0-61(^-(1-^4)-a-D-Glg?-(l-M)-D-Glq3 由以上可推測由本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶 生成環狀麥芽糖基麥芽糖的反應機制係如下者。 (1) 此酶係作用於做爲基質之葡萄糖聚合度爲3以上 的a — 1，4聚葡糖，催化其非還原性末端之麥芽糖基殘基 轉移爲其他之a - 1，4聚葡糖分子之非還原性末端葡萄糖 殘基的6位羥基的分子間之6 - a -麥芽糖基轉移，藉此生 成非還原末端具有6- a -麥芽糖基葡萄糖聚合度增加2之 6 — —麥芽糖基一麥芽低聚糖、與葡萄糖聚合度減2之麥 芽低聚糖。 (2) 此酶係再作用於6— a —麥芽糖基-麥芽低聚糖 ，藉由分子內a -麥芽糖基轉移而環狀化，而生成具有環 {—6) — a:— D — π比喃葡糖基—（1—4) — a— D — 卩比'喃 -52- (49) 1344820 葡糖基一（1—6) - α - D —吡喃葡糖基一（l— 4) — α - D -吡喃葡糖基一（1θ}構造之環狀麥芽糖基麥芽糖 、與葡萄糖聚合度減4之麥芽低聚糖。 (3)此酶會稍爲催化分子間之4一 α —麥芽糖基轉移 ，可以自麥芽低聚糖會微量生成葡萄糖聚合度增加2之麥 芽低聚糖、與葡萄糖聚合度爲減2之麥芽低聚糖。 <實驗10:自各種基質生成環狀麥芽糖基麥芽糖> 使用各種糖質，進行藉由本發明環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶的作用生成環狀麥芽糖基麥芽糖的試驗。調製麥芽 三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、直鏈澱粉、可溶 性澱粉、澱粉部份分解物（商品名「PINDEX #100」松谷 化學工業公司製）、肝糖（玉米由來，Kewpie公司製）之 溶液。 在此水溶液（最後濃度1.0 w/ v%中）加入最後濃度 2 0 mM乙酸緩衝液（pH 6.0)與最後濃度1 mM氯化鈣後， 對每1 g固體物加入1單位實驗4之方法所得精製環狀麥芽 糖基麥芽糖生成酶標品，於40 °C、pH 6.0作用此等48小時 後，於100 °C加熱此反應液1〇分鐘，停止反應。與實驗1 — 樣經α -苷酶•葡糖澱粉酶處理後’以HPLC法定量環狀 麥芽糖基麥芽糖，求得環狀麥芽糖基麥芽糖生成率，結果 示於表8。 (50) 1344820 表8 基質 環狀麥芽糖基麥芽糖生成率％ 麥芽=糖 0.6 麥芽四糖 27.3 麥芽五糖 24.4 麥芽六糖 4 1.6 麥芽七糖 36.6 直鏈澱粉 4 1.8 可溶性澱粉 3 1.4 澱粉部份分解物. 32.6 肝糖 29,5 _ 由表8之結果可知，由參與試驗之各糖質均可藉由環 狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的作用而生成環狀麥芽糖基麥芽 糖。其生成率係基質爲麥芽三糖時爲較低之約〇·6% ’與 之相比，基質爲直鏈澱粉時爲最高之約42% ’其次依序爲 麥芽六糖、麥芽七糖。自可溶性澱粉、澱粉部份分解物及 肝糖亦有30%左右之生成率生成環狀麥芽糖基麥芽糖。 <實驗11:環狀麥芽糖基麥芽糖生成反應與反應產物之還 原力> 在可溶性澱粉之水溶液（最後濃度1.0 W/ V% )中加 入最後濃度20 mM乙酸緩衝液（48.6.0)與最後濃度1 mM 氯化鈣後，對每1 g固體物加入1單位之實驗4之方法所得 -54- (51) 1344820 精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶標品，於40°C、pH 6.0反 應，添加酶後立即取樣，立即於約1 00 °C加熱1 0分鐘，停 止反應’經水冷，得0小時反應之反應液。繼而反應1、2 、3、4小時’分別於各時間點取樣，立即於約1 〇〇 °C加熱 1 0分鐘停止反應，經水冷、得反應1小時、反應2小時 '反 應3小時、反應4小時之各反應液。以索默季測糖法測反應 液之還原糖量，以蒽酮法測全糖量，以百分率（％)表示 全糖量中所估還原糖量之比率，做爲還原力。又，與實驗 1一樣反應液以α -甘酶.葡糖澱粉酶處理後，以HP LC法 定量環狀麥芽糖基麥芽糖，求得環狀麥芽糖基麥芽糖之生 成率。將此等結果於表9。 表9 反應時間（小時） 還原力（％) 環狀麥芽糖基麥芽糖生成率（％) 0 0.3 0 1 0.3 4.7 2 0.4 8.4 3 0.5 1 1.2 4 0.5 13.7 由表9之結果可知，使本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶作用於可溶性澱粉，以生成環狀麥芽糖基麥芽糖時 ，即使環狀麥芽糖基麥芽糖之生成率爲10%以上，增加之 還原力僅爲0.2%左右。此種情況係表示本發明之環狀麥 -55- (52) (52)1344820 芽糖基麥芽糖生成酶係本質上爲一種催化轉移。環狀化反 應的酶，此等反應時幾乎不會伴隨著水解。由此可知，使 此酶作用於澱粉或其分解物等以生成環狀麥芽糖基麥芽糖 時，若降低反應前之澱粉或其分解物之還原力，即，降低 DE時，由於所增加之還原力僅些微而已，所以可得還原 力低之生成物。 <實驗12:添加異澱粉酶效果對環狀麥芽糖基麥芽糖生成 之影響> 調製澱粉部份分解物（商品名「PINDEX #100」松谷 化學工業公司製）水溶液（最後濃度1 w/v%)，加入最 後濃度20 mM乙酸緩衝液（pH 6.0 )與最後濃度1 mM氯化 鈣，對每1 g固體物加入1單位實驗4之方法所得精製環狀 麥芽糖基麥芽糖生成酶標品，與每1 g固體物分別加入〇、 125、250、500 ' 1250或2500單位之異澱粉酶（林原生化 硏究所製）。於40°C、pH 6.0，作用48小時後，於100°C 熱處理10分鐘，使酵素失活。繼而與實驗1—樣以α _苷 酶及葡糖澱粉酶處理反應液後，以HPL法定量環狀麥芽糖 基麥芽糖，求得環狀麥芽糖基麥芽糖之生成率，將其結果 示於表10。 (53) 1344820 表10 異澱粉酶添加量（單位） 環狀麥芽糖基麥芽糖生成率（％) 0 32.2 125 40.1 250 40.1 500 40.9 1 2 5.0 4 1.9 2500 4 1.7 由表10結果可知藉由添加異澱粉酶可增加環狀麥芽糖 基麥芽糖之生成率。 <實驗13:液化澱粉DE對環狀麥芽糖基麥芽糖生成的影 響〉 使玉米澱粉爲濃度2質量％澱粉乳，其中加入〇·1質量 %碳酸鈣，調整爲pH 6.0，每1 g澱粉加入0.2、0.4、0.6 、1.0、1.5或2.0質量％ α-源粉酶（商品名「Tamameal 60L」 、Nobo公司製），分別於95°C反應10分鐘，繼而於 120°(：熱壓後，急冷爲約40°(：，將表11所示〇£3」至20.4之 六種澱粉液化液。在此等澱粉液化液（最後濃度〗質量％ )中，對每1 g固體物加入1單位實驗4之方法所得精製環 狀麥芽糖基麥芽糖生成酶標品，於40 °C、pH 6.0之下反應 48小時後，煮沸反應液10分鐘，停止反應。.爲調查此等加 熱失活之反應液中的環狀麥芽糖基麥芽糖生成量，與實驗 -57- (54) (54)1344820 1 一樣添加α -糖苷及葡糖澱粉酶予以反應後，以HP LC法 定量環狀麥芽糖基麥芽糖，求得環狀麥芽糖基麥芽糖生成 率，將此等之結果示於表11。 表1 1 α -澱粉酶使用量 (質量％/g-澱粉） DE 環狀麥芽糖基麥芽糖生成率 (%) 0.2 3.1 32.6 0.4 4.8 30.3 0.6 7.9 26.2 1.0 12.6 23.1 1.5 17.4 2 1.2 2.0 20.4 20.9 由表11之結果可知，由本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生 成酶所得環狀麥芽糖基麥芽糖生成率係會受到液化澱粉之 DE的影響DE値愈低，環狀麥芽糖基麥芽糖之生成率愈 高’相反’ DE値愈高時環狀麥芽糖基麥芽糖生成率愈低 。具體言’以液化澱粉之DE爲約20以下，較佳爲DE約8以 下’更佳爲DE約5以下爲最適宜^ 〈實驗調製結晶環狀麥芽糖基麥芽糖> 在直鏈澱粉（林原生化學硏究所製）、乙酸緩衝液（ 48.6.0)、及氯化鈣爲含有各最後濃度1.25 w/v%、20 -58- (55) (55)j344820 mM、1 mM之1.6 1水溶液中’對每1 g固體物加入1單位實 驗4之方法所得精製環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶標品，於 、pH 6.0之下作用90小時後’於約98°C加熱反應液10 分鐘，停止反應°以實驗1記載之方法的葡糖殿粉酶處理 所得反應液’以氫氧化物經驗處理’以分解還原糖後’過 濾脫色、脫鹽，精密過濾、濃縮、真空乾燥’得到做爲固 體物80.5 g之環狀麥芽糖基麥芽糖粉末。以HPLC分析之結 果環狀麥芽糖基麥芽糖之純度係98.9% » 將做爲固體物爲36 g之上述所得環狀麥芽糖基麥芽糖 粉末加入144 g水中，加熱爲約90 °C使環狀麥芽糖基麥芽 糖完全溶解後，於約25 °C靜置2天，結果生成結晶狀之物 質。過濾所得含結晶狀物質之液體，在濾紙上回收結晶狀 物質，繼而以少量水洗淨後收集結晶狀物質，於常溫常壓 下風乾，得21.8 g結晶狀粉末。以HPLC法分析結果，獲知 環狀麥芽糖基麥芽糖之純度係9 9.9%以上，係極高純度者 〇 使用X射線繞射裝置RAD — IIX ( Ligakn公司製）對所 得環狀麥芽糖基麥芽糖結晶粉末進行粉末X射線繞射測定 ’結果如圖1 0所示’得到做爲主要繞射角（2 0 )以5 · 6。 ' 9·3。、16.5°及27.1。爲特徵之粉末X射線繞射圖。又 ’以卡爾-費歇法測定此結晶狀粉末之水份，獲知水份係 12·8質量％，係每1分子環狀麥芽糖基麥芽糖含有5分子水 之含水結晶。 又’熱重量測定此環狀麥芽糖基麥芽糖之結晶粉末時 -59- (56) (56)1344820 得圖1 1所示熱重量曲線，由該重量變化與溫度之關係確認 溫度約上昇至100°C時會有相當於5分子水之重量減少，另 外’還可看出溫度約280 °C左右開始即有可能爲環狀麥芽 糖基麥芽糖本身之熱分解。由此事可知，本發明之環狀麥 芽糖基麥芽糖含水結晶係於常壓下，上昇溫度至10(TC時 可以每分子結晶可脫離5分子水而成爲無水物。 乂實驗15:對於水之環狀麥芽糖基麥芽糖的飽和濃度> 爲調查溫度25 °C時對於水之環狀麥芽糖基麥芽糖的飽 濃度，在附密封栓蓋之玻璃製容器中放入10 m丨水，在其 中加入實驗14之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶至 可以完全溶解之量以上的量後，密封玻璃瓶，一邊保溫爲 溫度2S °C攪拌2天使其達到飽和爲止。精密過濾此環狀麥 芽糖基麥芽糖飽和溶液，除去未溶解之環狀麥芽糖基麥芽 糖後，以乾燥減量法調查此濾液之水份的飽和濃度，結果 獲知溫度25 °C下對水的環狀麥芽糖基麥芽糖之飽和濃度係 約8.0質量％。 〈實驗16:環狀麥芽糖基麥芽糖之甜味度〉 溶解實驗14之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶 粉末於脫離子水，使其成固體濃度5質量％之水溶液，以 此水溶液做爲甜味度試驗溶液。另一方面，調製〇.5至5質 量％蔗糖（市販顆粒糖）水溶液，做爲對照。以5名測試 者進行官能性試驗’結果推定環狀麥芽糖基麥芽糖之甜味 -60- (57) (57)1344820 度係蔗糖之約2〇% ’可知環狀麥芽糖基麥芽糖爲低甜味之 糖質。 〈實驗I7:環狀麥芽糖基麥芽糖之熱安定性〉 將實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉 末溶解於水調製爲濃度7 w/v%的環狀麥芽糖基麥芽糖水 溶液’將8 ml該溶液放入玻璃製試管，密封後於120 t加 熱3 0至90分鐘。放冷後測定該溶液之著色度，以及以 HPLC法測定環狀麥芽糖基麥芽糖的純度。著色度係以480 nm以下1 cm管的吸收度爲準。結果不於表12。 表12 加熱時間（分鐘） 著色度（A48 0 nm) 純度（％) 0 0 100 30 0 100 60 0 1 00 90 0 100 由表12之結果可知，環狀麥芽糖基麥芽糖水溶液係 120 °C之高溫加熱亦不會著色’亦未見因分解而降低其純 度’可見環狀麥芽糖基麥芽糖係對於熱極安定之糖質。 <實驗18:環狀麥芽糖基麥芽糖之pH安定性〉 將實驗Μ之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖水結晶粉末 -61 - (58) 1344820 溶解於各種緩衝液（20 mM)，調製爲將環狀麥芽糖基麥 牙糖濃度調整爲4 w/v% ' pH爲2至9之如表13記載的八 種環狀麥芽糖基麥芽糖水溶液。將8 ml之各種溶液放入玻 璃試管，密封後’於1 0 0 °C加熱2 4小時。放冷後與實驗i 7 一樣測定此等溶液之著色度’以及以Η P L C法測定環狀麥 芽糖基麥芽糖之純度，結果示於表13。 表13 pH 緩衝液之種類 著色度（A480nm) 純度（％) 2.0 乙酸 0 93 3.0 乙酸 0 100 4.0 乙酸 0 1 00 5.0 乙酸 0 100 6.0 Tris-鹽酸 0 100 7.0 Tri s -鹽酸 0 100 8.0 Tris-鹽酸 0 1 00 9.0 錢 0 100

由表13之結果可知，環狀麥芽糖基麥芽糖水溶液係於 100°C高溫加熱24小時，亦在pH 2至9廣泛範圍著色，ρΗ 2 時只有一些之環狀麥芽糖基麥芽糖被分解，純度稍降低， 但pH 3至9之範圍則完全不被分解，可知環狀麥芽糖基麥 芽糖係在廣泛之pH範圍煮沸亦爲極安定之糖質。 -62- (59) (59)1344820 〈實驗19:胺基羰基反應> 將實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉 末溶解於水，再加入市販試劑特級之甘胺酸及磷酸緩衝液 ，調製爲以50 mM磷酸緩衝液調整爲pH 8.0之含0.5 w/v %甘胺酸之2.5 w/v%環狀麥芽糖基麥芽糖水溶液。做爲 對照，代替環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉末使用麥芽糖 以外，與上述一樣調製麥芽糖水溶液。取4 ml之各溶液於 玻璃製試管，密封後，於1〇〇 °C加熱30至90分鐘。於室內 於冷後測定此等之著色度，調查胺基羰基反應性。著色度 係以1 cm管之4 8 0 nm吸光度爲準，結果示於表14» 表14 加熱時間（分鐘） 著色度（A480nm) 環狀麥芽糖基麥芽糖 麥芽糖（對照） 0 0.00 0.00 30 0.00 0.02 60 0.00 0.08 90 0.00 0.17 由表Μ之結果可知，對照之麥芽糖係甘胺酸共存下加 熱時即會著色，引起褐變。另一方面，本發明之環狀麥芽 糖基麥芽糖係甘胺酸存在下加熱亦不會著色，不會引起褐 變’可知係很難引起胺基羰基反應（梅納反應），極安定 之糖質。 -63- (60) (60)1344820 <實驗20:胺基羰基反應> 將實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉 末與市販多腺（日本製藥製）溶解於脫離子水，調製爲含 有5 w/v%多腺之5 w/v%環狀麥芽糖基麥芽糖溶液。做 爲對照，代替環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉末，使用麥 芽糖以外，其他均與上述一樣調製麥芽糖水溶液。將4 ml 各溶液放入玻璃製試管，密封後於120°C加熱30〜90分鐘 。於室內放冷後’測定各著色度調查基羰基反應性。同時 以只含多腺之溶液做爲空白試驗予以同樣加熱。著色度係 以480 nm下之1 cm管之吸光度爲準，減去空白試驗之吸光 度的値表示。結果示於表15。 表1 5 加熱時間（分鐘） 著色度（A480nm) 環狀麥芽糖基麥芽糖 麥芽糖（對照） 0 0.00 0.00 3 0 0.00 0.10 60 0.00 0.30 90 0.00 0.62 由表15之結果可知’對照之麥芽糖係在多腺存在下加 熱時即著色引起褐變。與之相比，環狀麥芽糖基麥芽糖係 在多腺存下加熱亦不會赛色，不會引起褐變，可知爲很難 -64 - (61) 1344820 引起胺基羰基反應之安定糖質。 <實驗21 :環狀麥芽糖基麥芽糖之包含作用> 將實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉 末溶於脫離子水，調製爲8質量％水溶液。對每1〇〇 g該水 溶液，做爲香氣成份之具體例分別加入1 .2 g甲醇、1 . 7 g 乙醇或2.2 g乙酸進行包合（丨ncluded)。其後將分別過濾 之濾液冷凍乾燥，除去未包合物。做爲對照，使用已知具 有包合能的支化環糊精（商品名〗soe丨eet P. Maruha公司販 賣）同樣.操作。爲測定冷凍乾燥包合物量，分別將1 g冷 凍乾燥粉末溶於5 ml水’加入5 m二乙醚於其中予以萃取 ，再次重覆萃取後以氣相層析法定量二乙醚中之萃取物。 結果示於表1 6。 表]6 包合物 包合量（mg/g -冷凍乾燥粉末） 環狀麥芽糖基麥芽糖 支化環糊精 甲醇 4.30 3.23 乙醇 4.20 8.67 乙酸 30.55 38.14 由表16之結果可知環狀麥芽糖基麥芽糖係具有包合能 力者，其包合能力係與支化環糊精相比，對甲醇而言係每 單位重量約1.3倍，對乙醇而言係約0.5倍，對乙酸而言爲 -65- (62) (62)1344820 約〇 · 8倍之強度。 <貫驗22:環狀麥芽糖基麥芽糖之消化性試驗〉 使用實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶 粉末’依據日本營養食糧學會誌，第43卷，第23至29頁（ 1 990 )記載之岡田氏等方法’調查在試管內對唾液澱粉酶 、人造胃液、胰臟液澱粉酶、小腸黏膜酶之環狀麥芽糖基 麥芽糖消化性。對照則使用做爲難消化性糖質爲人所知之 麥芽糖醇。結果示於表17。 表17 消化酸 分解率（％) 環狀麥芽糖基麥芽糖 麥芽糖醇（對照） 唾液澱粉酶 0 0 人造胃液 0 0 胰臟澱粉酶 0 0 小腸黏膜酶 0 由表17可知，環狀麥芽糖基麥芽糖係藉由唾液澱粉酶 、人造胃液、胰藏液澱粉酶及小腸黏膜酶之任一均無法完 全消化，係極難於消化之糖質。 <實驗23:環狀麥芽糖基麥芽糖之發酵性試驗> 使用實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶 -66- (63) (63)1344820 粉末’依據「】0 u r n a 1 of Nutritional Science and Vitaminology」第37卷，529至544頁（1991年）記載之方 法，調查老鼠肓腸內容物的環狀麥芽糖基麥芽糖之發酵性 。盲腸內容物係使用於乙醚麻醉下屠殺Wister系雄鼠，嫌 氣性地採取，懸浮於4倍量之〇. 1 Μ碳酸氫鈉水溶液者。環 狀麥芽糖基麥芽糖係添加肓腸內容物單位重量之約7質量 %，以氣相層析定量添加後立即及1 2小時後殘存之環狀麥 芽糖基麥芽糖量。結果添加後立即之環狀麥芽糖基麥芽糖 濃度係每1 g盲腸內容物爲68.5 mg，12小時後之環狀麥芽 糖基麥芽糖濃度係每1 g盲腸內容物爲63.0 mg，可知有約 92%未被發酵而殘留下來，獲知環狀麥芽糖基麥芽糖係極 難發酵糖質。 <實驗24 :急性毒性試驗> 使用小鼠，經口投予實驗1 4之方法所得環狀麥芽糖基 麥芽糖，進行急性毒性試驗。結果環狀麥芽糖基麥芽糖係 低毒性物質，即使投予可投予最大投予量亦未見死亡例， 其LD5G値係5 g/ kg小鼠體重以上。 由以上實驗22至24之結果可知，環狀麥芽糖基麥芽糖 係經口攝取亦很難消化、被吸收，做爲不具熱量至低熱量 之可食用材料可以有利地利用做減肥甜味料、高甜味度甜 味料之賦形劑、減肥飮食物之增黏劑、增量劑、賦形劑， 更可做爲食物纖維、脂肪代替食品材料利用。 以下，將本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖及含其之糖質 -67- (64) (64)1344820 內製造方法示於實施例1至6’將含有環狀麥芽糖基麥芽糖 及含其之糖質的組成物示於實施例7至23。 實施例1 依實驗3之方法種培養球形節桿菌M6(FERM BP -8 448 )。繼而於容量3 1之培養器中放約20 1之由3.0 w/ v %.殿粉份分解物（商品名「PINDEX #100」松谷化學工業 公司製）、3_6 w/v%大豆肽（商品名「Hynuite SMS」 不二製油公司製）、〇.1 w/v%磷酸二鉀、0.6 w/v%碟 酸—鈉· 2水合物鹽、〇·〇5 w/ v%硫酸鎂7水合物鹽、0.3 W / V %碳酸鈣及水所成之液體培養基 '加熱殺菌，經冷 卻爲2 7 °c.溫度後，接種1 V / V %種培養液，保持於2 7 °c、 pH 5.5至8.0，通氣培養96小時》培養後使用SF膜除菌過 據，回收約1 8 1，培養濾液，再以UF膜濃縮該濾液，回收 約1 I含有3.8單位/ml本發明環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶 的濃縮酶液。 實施例2 使馬鈴薯澱粉乳爲濃度約1質量％澱粉乳，加入最後 濃度可爲]mM之氯化鈣’調整爲pH 6.0，加熱爲95 °C約20 分鐘進行糊化，繼而冷卻爲約40 °C、加入實施例1之方法 所得之含環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶之濃縮酶液，使之成 每1 g澱粉固體物爲〇·26 ml (約1單位）比率，pH 6.0、溫 度40°C下反應48小時。加熱該反應液爲95 °C ’保持30分鐘 -68- (65) (65)1344820 後，冷卻、過濾所得濾液係依常法以活性碳脫色、以Η型 、ΟΗ型離子交換樹脂脫鹽予以精製，再予濃縮以每單位 固體收率約90%得含濃度65質量％之含環狀麥芽糖基麥芽 糖糖漿。本品係每單位固體含有31 .4質量％環狀麥芽糖基 麥芽糖、2.2質量％麥芽糖、丨.5質量％麥芽三糖及65.9質 量％其他糖，係低還原性，且具溫和之甜味、適度黏度、 保濕性’具包合性’可做爲甜味料、呈味改良劑、品質改 良劑、防離水劑、安定劑、防變色劑' 賦形劑、包合劑、 粉末化基材等有利地用於各種飲食物、化粧品、醫藥品等 各種組成物。 實施例3 使樹薯殿粉成爲濃度約1質量％澱粉乳，加入碳酸鈣 使其濃度爲0.1質量％ ’調整爲pH 6.0，於其中加入α — 锻粉酶（Nobo公司製商品名「Tamameal 60L」）使其成 爲每1 g澱粉固體物爲〇·2質量％，於95 °C反應10分鐘，繼 而於120 °C熱壓20分鐘，再急冷爲約40 °C，得DE約3之液 化溶液，在其中加入每1 g澱粉固體物爲0.26 ml (約1單位 )之實施例1之方法所得將含環狀麥芽糖基麥芽糖生成'酶 之濃縮液與每1 g澱粉固體物爲100單位比率之異澱粉酶（ 林原生化硏究所製造），於pH 6.0、溫度40°C反應48小時 。加熱該反應液爲95 °C，保持30分鐘後，冷卻、過濾所得 濾液係依常法以活性碳脫色、以Η型、OH型離子交換樹脂 脫鹽予以精製，再予濃縮以每單位固體含41.1%之環狀麥 -69- (66) 1344820 芽糖基麥芽糖的濃度60質量％之糖漿。所得糖漿做爲糖 ，使用強酸性陽離子交換樹脂（Anberlite CR - 1310’ 型’ 〇rgano公司製）進行管柱分餾。將樹脂塡充於4支 內徑5.4 cm套管的不銹鋼製管柱，直排連結使樹脂層爲 長20 m。一邊維持管柱內溫度60°C，一邊加入對樹脂而 爲5 v/ v%的糖液，以SV 0.13灌入60°C之熱水進行分 ’以HPLC法監視溶離液之糖組成，採取含有含環狀麥 糖基麥芽糖餾份之低分子餾份，經精製、濃縮、噴霧、 燥’以每單位固體物收率約54%得含環狀麥芽糖基麥芽 粉末。本品係每單位固體含有63.2質量％環狀麥芽糖基 芽糖、7.4質量％麥芽糖、6.2質量％麥芽三糖及23.2質 %其他糖，係低還原性，且具溫和之甜味、適度黏度、 濕性，具包含性，可做爲甜味料、呈味改良劑、品質改 劑、防離水劑、安定劑 '防變色劑' 賦形劑 '包合劑' 末化基材等有利地用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等 種組成物。 實施例4 使玉米澱粉成爲濃度約1質量％澱粉乳，加入碳酸 使其濃度爲0_1質量％，調整爲pH 6_0，於其中加入α 源粉酶（商品名「Neospitase」長瀨生化學工業公司製 使其成爲每1 g澱粉固體物爲0.2質量％，於85〜90 °C反 20分鐘’繼而於】20°C熱壓20分鐘，再急冷爲約4〇 °c， DE約3之液化溶液’在其中加入每1 g澱粉固體物爲〇 液 N a 附 全 营 餾 乾 糖 麥 量 保 良 粉 各 鈣 ) 應 得 -70- 26 (67) (67)1344820 ml (約1單位）之實施例1之方法所得將含環狀麥芽糖基麥 芽糖生成酶之濃縮液與每1 g澱粉固體物爲100單位比率之 異澱粉酶（林原生化硏究所製造），於pH 6.0、溫度40°C 反應4 8小時。加熱該反應液爲9 5 °C，保持3 0分鐘後，使其 爲pH 5.0，溫度50°C，加入每1 g澱粉可成爲100單位比率 之葡糖澱粉酶（商品名「Glucoteam」長瀨生化學工業公 司製），於pH 5.0、溫度50°C下反應16小時。加熱該反應 液爲95 °C，保持30分鐘後，冷卻、過濾所得濾液係依常法 以活性碳脫色、以Η型、OH型離子交換樹脂脫鹽予以精製 ，再予濃縮以每單位固體收率約95%得濃度60質量％之含 環狀麥芽糖基麥芽糖糖漿。本品係每單位固體含有4 2.6質 量％環狀麥芽糖基麥芽糖、53.0質量％葡萄糖' 4.4質量 %其他糖，係具溫和之甜味、適度黏度、保濕性，具包合 性，可做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑、防離水劑 、安定劑、防變色劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等有 利地用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等各種組成物。 實施例5 依常法氫化實施例4之方法所得含有環狀麥芽糖基麥 芽糖糖漿，使還原性糖質予以糖醇化，經精製、濃縮、真 空乾燥、粉碎 '以單位固體物收率約90%得含環狀麥芽糖 基麥芽糖之粉末。本品係每單位固體含有42.6質量％環狀 麥芽糖基麥芽糖、53.2質量％山梨煻醇、及4.2質量％其 他糖質，實質上不具還原力，很難引起胺基羰基反應，係 -71 - (68) (68)1344820 低還原性且具溫和之甜味、適度黏度' 保濕性，具包合性 ’可做爲甜味料 '呈味改良劑、品質改良劑、防離水劑、 安定劑、防變色劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等有利 地用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等各種組成物。 實施例ό 以實施例4之方法所得含有環狀麥芽糖基麥芽糖之糖 漿爲原糖液’爲提高環狀麥芽糖基麥芽糖之含量，依實施 例3之方法進行使用鹽型強酸性陽離子交換樹脂之管柱層 析’採取高含環狀麥芽糖基麥芽糖餾份，經精製，以單位 固體物收率約40%得含有固體單位約90質量％環狀麥芽糖 基麥芽糖的高含環狀麥芽糖基麥芽糖液。一邊濃縮此溶液 ’ 一邊連續晶析，以籃型離心分離機分蜜所得糖膏，以少 量水噴霧洗淨結晶’熱風乾燥，以單位固體物約2 5 %之收 率得高純度之環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶。此產品係純 度99%以上之極高純度環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶，還 原性極低很難引起胺基羰基反應，亦不具吸濕性、極易處 理’具溫和之甜味 '適度黏度、保濕性，具包含性，可做 爲甜味料、低熱量食品原材料、呈味改良劑、品質改良劑 '防離水劑' 安定劑 '防變色劑、賦形劑、包合劑、粉末 化基材等有利地用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等各種 組成物，更可做爲工業試劑、化學原料等利用。 實施例7 -72- (69) (69)1344820 <甜味料> 在0.8質量份實施例6之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖 含水結晶中均勻地混合0 · 2質量份海藻糖含水結晶（林原 商業公司販售，商標「Toreha」）、〇.〇1質量份α —糖基 甜菊苷（東洋精糖公司販售，商品名「aGSWeet」）及 0.0〗質量份L -阿斯巴基一L 一苯丙胺甲酯（商品名「阿斯 巴甜」）、以顆粒成形機處理得顆粒狀甜味料。此產品係 甜味品質優，具有約2倍蔗糖之甜味度。此產品之熱量係 因環狀麥芽糖基麥芽糖爲難消化性、難發酵性之故，實質 上爲極低熱量者。除此外，在室溫保存時不必擔心變質劣 化，極爲安定。所以此產品極適於做爲高品質之低熱量、 低蛀牙性甜味料.。 實施例8 <硬糖果> 在100質量份濃度55%之蔗糖溶液中加熱混合50質量 份實施例4之方法所得含有環狀麥芽糖基麥芽糖之糖漿， 繼而於減壓下加熱濃縮至水份未達2%爲止，再混溶〇.6質 量份檸檬酸及適量之檸檬香料與著色料、依常法成形，得 製品。此產品咬勁佳、味道、風味極佳，不會有鹿糖結晶 、吸濕性低，亦不會滴重，爲極安定的高品質硬糖果。 實施例9 < 口香糖> -73- (70) (70)1344820 加熱熔融3質量份膠基質至柔軟之程度，加入2質量份 無水麥芽糖醇、2質量份木糖醇、2質量份實施例6之方法 所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶、及1質量份海藻糖含 水結晶，再混合入適量之香料與著色料，依常法以滾筒加 以昆揑、成形包裝後得製品。此製品係組織、味道、風味 均佳，極適於做爲低蚜牙性、低熱量之口香糖。 實施例1 0 <加糖練乳> 在1 0 0質量份原乳中溶解4質量份實施例2之方法所得 含環狀麥芽糖基麥芽.糖之糖漿及2質量份蔗糖，以加熱板 予以加熱殺菌，繼而濃縮爲70%濃度，無菌狀態下罐裝得 製品。此製品係具溫和甜味且風味佳，可以有利地利用於 水果、咖啡、可可、紅茶等之調味用。 實施例1 1 <乳酸菌飲料> 將175質量份脫脂奶粉、100質量份實施例3之方法所 得含環狀麥芽糖基麥芽糖粉末及高含乳蔗糖粉末（林原商 事公司販售，商標「乳果Oligo」）溶解於1，5 00質量份水 ’於6 5 t：殺菌3 0分鐘，冷卻爲4 0 °C後，再依常法接種3 〇質 量份乳酸菌的菌元，於3 7 r培養8小時，得乳酸菌飮料。 此產品係風味極佳，含有低聚糖，環狀麥芽糖基麥芽糖， 不但可安定地保有乳酸菌，還可以促進雙岐菌增殖作用， -74 - (71) (71)1344820 極適於做爲具有整腸作用之乳酸菌飲料。 實施例1 2 <粉末果汁> 對於經由噴霧乾燥製造之3 3質量份橘子果汁粉末、混 合攪拌入5 0質量份實施例6之方法所得環狀麥芽糖基麥芽 糖含水結晶粉末、10質量份無水結晶麥芽糖醇、0.65質量 份無水檸檬酸、0.1質量份蘋果酸、0.2質量份2 — 〇 — α -葡萄糖基一 L-抗壞血酸、〇.1質量份檸檬酸鈉、〇.5質量 份支鏈锻粉及適量之粉末香料，加以粉碎使其成微粉末， 將其倒入流動層造粒機，以4 0 °C排風溫度，以實施例2之 方法所得含有環狀麥芽糖基麥芽糖之糖漿做爲結合劑、噴 霧適量，造粒3 0分鐘，秤量、包裝得製品。此製品係含有 約3 0 %果汁之粉末果汁。又，此產品無異味、異臭、做爲 高品質，且低熱量之果汁具有極高商品價値者。 實施例】3 <鮮奶油> 充分地混合1〇〇質量份玉米澱粉、質量份含有實施 例2之方法所得含環狀麥芽糖基麥芽糖之糖漿' 60質量份 之海藻糖含水結晶、4 0質量份蔗糖、及1質量份食鹽、加 入2 8 0質量份雞蛋予以攪拌，在其中慢慢地加入煮沸之 1000質量份牛奶’再放在爐火上繼續攪拌，待玉米澱粉完 全糊化，整體半透明時關火，經冷卻加入適量之香精香料 -75- (72) (72)1344820 、坪量、塡充、包裝後得製品。此製品係具有潤滑光澤、 風味佳 '可抑制澱粉老化、爲高品質之鮮奶油。 實施例1 4 <米糕粉> 在90質量份米粉末中，均一地混合20質量份玉米澱粉 、7 0質量份無水結晶麥芽糖醇、5 〇質量份實施例5之方法 所得含有環狀麥芽糖基麥芽糖粉末、及4質量份支鏈澱粉 ’製造爲米糕粉。混揑米糕粉與適量之抹茶與水，放入容 器中蒸6 0分鐘製造抹茶米糕。此製品係光澤、口感均極佳 '風味亦佳。又’可以抑制澱粉之老化，可以放置多曰、 極適於做爲低熱量之米糕。 實施例1 5 <紅豆餡> 依常法在1 〇質量份原料紅豆中加水煮沸、去澀味、除 去水溶性雜質，得約2 1質量份之紅豆粒餡。在此紅豆粒餡 中加入1 4質量份蔗糖、5質量份實施例2之方法所得含有環 狀麥芽糖基麥芽糖之糖漿、與4質量份水，加入少量沙拉 油於其中，注意不要軋碎粒餡下混揑，得約3 5質量份餡製 αα。此產品不會有焦味，亦不會脫水、極安定、口感、風 味佳，做爲紅豆麵包、包子、湯圓、甜餡餅、冰果等點心 材料即適宜。 (73) (73)1344820 實施例1 6 <麵包> 依常法以水混揑100質量份麵粉、2質量份酵母菌、5 質量份蔗糖、1質量份實施例3之方法所得含有環狀麥芽糖 基麥芽糖粉末及0.1質量份無機食物，於26 °C使麵團發酵2 小時，其後再熟成3 0分鐘，烘烤。此產品係色相、發泡均 極佳，具適度之彈力，溫和甜味之高品質麵包。 實施例1 7 <火腿> 對1000質量份豬腿肉均勻地搓入15質量份食鹽及3質 量份硝酸鉀，放在冷房中堆積一畫夜。在冷房中將其浸漬 於由5 00質量份水' 100質量份食鹽、3質量份硝酸鉀、40 質量份實施例5之方法所得含有環狀麥芽糖基麥芽糖粉末 及香辛料所成鹽醃漬液7天’繼而依常法以冷水洗淨，以 子束緊、薰煙、煮熟、冷卻包裝得製品。此製品係色 澤極佳，且風味之尚品質火腿。 實施例1 8 <粉末肽> 在1質量份4 〇 %食品用大豆肽溶液（不二製油公司販 售，商品名「Hinewto S」）中，混合2質量份實施例6之 方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶，放入塑膠方形淺 盤中，於5 0 °C減壓乾燥、粉碎後得粉末肽。此產品係風味 -77- (74) (74)1344820 極佳’做爲預製粉、冷果等低熱量製點心材料極有用，做 爲經口流質食物，灌食之流質食物之難消化性食物纖維、 整腸材料亦極有用。 實施例1 9 <化粧用面霜> 依常法加熱溶解2質量份-硬脂酸聚氧化乙二醇、5質 量份自行乳化型-硬脂酸甘油酯、2質量份實施例6之方法 所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉末、1質量份α -葡 萄糖基芸香苷（林原公司販售，商品名ctG Rutin )、1質 量份流動石蠟、1〇質量份三辛烷酸甘油酯及適量防腐劑， 在其中2質量份L -乳酸、5質量份1，3 - 丁二醇及66質量 份精製水、以勻漿器使之乳化，再加入適量之香料攪拌混 合’製造爲化粧用面霜。如產品具有抗氧化性、安定性高 ’可利用做爲高品質之防曬面霜、美膚劑、色白劑等。 實施例2 0 <牙膏> 混合4 5質量份磷酸氫鈣、1 . 5質量份月桂基硫酸鈉、 25質量份甘油、0.5質量份聚氧化乙烯山梨聚糖月桂酸酯 、]0質量份實施例5所得含有環狀麥芽糖基麥芽糖粉末、 0.02質量份糖精 '與18質量份水，得牙膏。此產品不會傷 失界面活性劑之洗淨力，可改善怪味、使用起來極舒爽。 -78- (75) (75)1344820 實施例2 1 <流質食物固體製劑> 調製由100質量份實施例3之方法所得含有環狀麥芽糖 基麥芽糖粉末' 200質量份海藻糖含水結晶、2〇〇質量份高 含麥芽四糖之粉末、2 70質量份粉末蛋黃、209質量份脫脂 奶粉、4.4質量份氯化鈉' 〇.〇1質量份硫胺素' 〇」質量份l -抗壞血酸鈉、0.6質量份維生素E乙酸鹽、及〇.〇4質量份 煙鹼醯胺所成配合物，將此分別以2 5 g配合物裝在防濕性 層疊小袋中’熱封後得製品。此產品係可藉由環狀麥芽糖 基麥芽糖強化難消化性之食品纖維、做爲整腸作用極佳之 灌食用劑、經口 '或藉由經導管之方法經鼻、胃腸等灌食 、可有利用做爲身體補給能源用。 實施例2 2 <錠劑> 在50質量份阿斯匹靈中充分地混合入]4質量份實施例 6之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖含水結晶粉末、4質量份 玉米澱粉後，依常法用打錠機製錠，得厚度5.2 5 nm、680 mg重之錠劑。此產品係利用環狀麥芽糖基麥芽糖之賦形 性者’不具吸濕性、物理強度亦佳’且在水中散解極佳者 實施例2 3 <外傷治療用膏藥> -79- (76) (76)1344820 在100質量份實施例6之方法所得環狀麥芽糖基麥芽糖 含水結晶粉末及300質量份麥芽糖中加入混合溶解有3質量 份碘之50質量份甲醇、再加入200質量份10 w/v%支鏈澱 粉水溶液予以混合，得到具有適度延展性，附著性之外傷 治療用膏藥。此產品係可藉由環狀麥芽糖基麥芽糖防止碘 、甲醇.揮發，經久極少變化之商品價値高之膏藥。又，此 製品;ί系不具有确之殺菌作用’還可藉麥芽糖具有補給能量 予細胞之作用，所以可縮短治癒時間、傷口亦可以順利地 治癒。 產業上之可利用性 依本發明時可提供具有環{—6) — α—D — n比喃葡 糖基-(1— 4) - a— D -吡喃葡糖基-(1— 6) - α — D—吡喃葡糖碁一（1— 4) — a_D—吡喃葡糖基-(I — }構造的新穎環狀糖質，即可以使用環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶大量地製造環狀麥芽糖基麥芽糖。此糖質係非還原 性者，所以不會與胺基化合物引起胺基羰基反應（梅蘭尼 反應）而產生褐變，又，因其爲環狀糖質，所以具有包合 能力，可抑制包合之化合物揮發，極安定。可提供新穎環 狀麥芽糖基麥芽糖之本發明，可貢獻予飮食物、化粧品、 醫藥品等各種利用領域、其產業上意義極大。 【圖式簡單說明】 第I圖係示非還原糖質標品之HPLC溶離圖型圖。 -80- (77) (77)1344820 第2圖係示單離之非還原性糖質之1Η— NMR光譜圖。 第3圖係示單離之非還原性糖質之l3C- NMR光譜圖。 第4圖係示本發明之環狀麥芽糖基麥芽糖的構造圖。 第5圖係示環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的最適溫度圖 〇 第6圖係示環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的最適PH圖 〇 第7圖係示環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的溫度安定性 圖。 第8圖係示環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶的PH安定性 圖。 .第9圖係示重組DNA，pBMBl圖’圖中以粗線表示之 部份係可編碼球形節桿菌M6 ( Arthrobacter gl〇biformis M6, ferm BP- 8448 )由來之本發明環狀麥芽糖基麥芽糖 生成酶的DNA。 第10圖係示結晶環狀麥芽糖基麥芽糖之粉末的X射線 繞射圖。 第11圖係示結晶環狀麥芽糖基麥芽糖之熱重量曲線圖 [&要元件符號說明】 a: 1位爲α — 1 ’ 4一糖甘結口鍵之 b: 1位爲α _1，6-糖苷結合鍵之 Π ( + ) 〇ri: fl噬菌體複製起點 -81 - (78) (78)1344820

Amp :胺爷青黴素耐性基因 ColEl ：大腸桿菌素El複製起點 -82- 1344820

SEQUENCE LISTING <Π〇>林原生物化學硏究所公司 <120>環狀麥芽糖基麥芽糖，環狀麥芽糖基麥芽糖生成酶，與此等之製造方法用途 <130〉 10102802 . <160> 10 <210> 1 <211〉 5 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400〉 1

Asp Pro Thr Thr Ser 1 5 <210> 2 〈211〉 583 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400〉 2

Asp Pro Thr Thr Ser Pro Gly Pro Leu Ala Glu Gly Asp Val lie Tyr 1.5 10 15

Gin Val Leu Val Asp Arg Phe Glu Asp Gly Asp Pro Thr Asn Asn Asp 20 25 30

Gin Gly Asp Gly Glu Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Gly Phe Tyr His Gly 35 40 45

Gly Asp Trp Ala Gly Leu Thr Asp Arg Leu Asp Tyr lie Ala Asp Leu 50 55 60

Gly Val Thr Ala lie Trp Leu Ser Pro Val Ser Glu Gin Gin Pro Leu 1344820 65 70 75 80

Ser Arg Asp Gly Leu Glu Ala Ser Tyr His Gly Tyr Phe Thr Arg Asp 85 90 95

Phe Ala Thr Pro Asn Glu His Phe Gly Asp Arg Ala Glu Leu Gin Glu 100 105 110

Leu lie Asp Thr Ala His Asp Leu Gly Leu Lys Met lie Leu Asp Val 115 120 125

Val Pro Asn His Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Thr Thr Tyr 130 135 140

Ser Pro Ser Thr Tyr Lys Pro Ala Ser Pro Leu Asp Asp Ala Ser Tyr 145 150 155 160

Phe His His Ala Gly Asp Cys Leu Phe Asn Gly Leu Glu Thr Gin Thr 165 170 175

Gin He Glu Asn Cys Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Leu Asp Gin Ser 180 185 190

Asn Pro Val Val Ser Ser His Leu Met Ser Thr Tyr Lys Asp Trp Val 195 200 205

Asp Met Gly Phe Asp Gly lie Arg Val Asp Ala Ala Arg Ser Val Pro 210 215 220

Lys Pro Trp Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Met Gly Val Pro Thr Phe 225 230 235 240

Gly Glu Val Phe Val Gly Asp Val Asp Tyr Val Ser Glu Tyr Gin Asp 245 250 255

Tyr Glu Trp Gly Val Leu Asp Phe Pro Tyr Phe Phe Thr Val Arg Glu 260 265 270

Ala Phe Ser Ala Asp Thr Asp Met Asn Lys Leu Gly Asp Leu Phe Asp 275 280 285

Gin Asp Ser Lys Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp 290 295 300

Asn His Asp Arg Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gin 305 310 315 320

Arg Leu Arg Ser Gly Leu Thr Phe Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro 325 330 335

Val lie Tyr Tyr Gly Thr Glu Gin Ala Asp Asp Gly Asn Gly Asn Pro 340 345 350 -2- 1344820

Tyr Glu Val Pro lie Ala Asn Lys Asp Asn Arg Lys Asp Met Glu Ser 355 360 365

Phe Asp Gin Asn Ser Asn Leu Tyr Lys His lie Gin Arg Leu Thr Ala 370 375 380 lie Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Leu Gin Val Gly Thr Gin Arg Glu Met 385 390 395 400

Trp Ser Asp Thr Ser Val Tyr Gly Phe Ser Arg Arg Val Asp Ser Thr 405 410 415

Gly Ala Glu Ala Met Thr Phe Ser Ser Asn Ser Trp Thr Thr Gin Thr 420 425 430

Arg Thr Val Pro Leu Arg Ala Glu Ser Ser lie Thr Val Gly Thr Thr 435 440 445

Leu Thr Asn Leu Met Asn Thr Gly Asp Thr Val Thr Val Thr Ala Gly 450 455 460

Gly Val Thr Gly Lys Gin lie Thr Val Ser Leu Gly Glu His Glu Ser 465 470 475 480

Lys Val Tyr Ala Pro Gly Thr Pro Val Ser Ala Tyr Ser Pro Glu Ala 485 490 495

Arg Asn Thr Thr Lys lie Arg Val His Tyr Asn Val Gly Leu Gly His 500 505 510

Ser lie Ala lie Arg Gly Asp Glu Tyr Pro Phe Thr Trp Thr Ser Gly 515 520 525

Arg Gly Ala Arg Asn Val Ala Ser Asp Val Trp Glu Phe Glu Val Glu 530 535 540

Arg lie Pro Asp Gly Glu Thr Phe Gin Phe Lys Pro Leu lie Asp Asp 545 550 555 560

Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Asn Phe Thr Gly Thr Gly Gly Asp Val 565 570 575 lie Asp lie Tyr Pro Thr Phe 580 583

<210〉 3 <211> 1749 <212> DNA 球形節桿菌 1344820 <400〉 3 gaccccacca cgtcgcccgg cccgctggcc gagggcgacg tgatctacca ggtgctcgtc 60 gaccggttcg aagacggcga ccccaccaac aacgaccagg gcgacggaga glacgatccg 120 tccgacctcg gtttctacca cggcggcgac tgggcgggcc tgacggaccg gclcgaclac 180 atcgccgatc tgggtgtgac ggcgatctgg ctctcgcccg tctccgagca gcagccgctc 240 tcgcgcgacg ggctggaggc cagctaccac ggctacttca clcgggactt cgcgacgccg 300 aacgagcatt lcggcgaccg agccgagctg caggagctga tcgacacggc gcacgatctc 360 ggactcaaga tgatcctcga cgtcgtgccg aaccacacgg ccgactacct cgcgggcaca 420 tcgacgacct attcgccgag cacctacaag ccggcgagtc cgctcgatga cgcgtcgtac 480 ttccatcacg ccggcgactg cctgltcaac gggctcgaga cgcagaccca gatcgagaac 540 tgcgacctcg gcgggctcga cgacctcgat cagtcgaacc cggtcgtctc gtcgcacctg 600 atgagcacgt acaaggactg ggtcgacatg ggcttcgacg gcatccgggt cgatgcggcg 660 cgctcggtgc cgaagccgtg gctcgccgac ttcgaagccg agatgggcgt gccgaccttc 720 ggcgaggtgt tcgtcggcga tgtcgactac gtctcggagt accaggacta cgagtggggc 780 gtgctcgact tcccctactt cttcacggtg cgcgaggcgt tctcggccga taccgacatg 840 aacaagctcg gcgacctctt cgaccaggac agcaagtacg cgaacccgaa ccggctggag 900 acgttcctcg acaaceacga tcgggcgcgg ttcctcacct gggccgatga caactatcag 960 cggctgcgct caggactgac gttcctccta acctcccggg gcgtgcccgt gatctactac 1020 ggcaccgagc aggccgacga cggcaacggc aacccctacg aggtaccgal cgcgaacaag 1080 gacaaccgca aggacatgga gagcttcgal cagaactcga acctctacaa gcacatccag 1140 cggttgaccg cgatcaaggc cgcttacccg gctctgcagg tcggcacaca gcgcgagatg 1200 tggtccgaca cctccgtcta cgggttctcg cgacgcgtcg acagcacggg tgccgaggcg 1260 atgaccttct cgtcgaaclc gtggacgacg cagacgcgca cggtgccgct gcgcgccgag 1320 agctcgatca cgglcggtac gacgctgacg aacctcatga acacgggcga cacggtgacc 1380 gtgaccgccg gcggtgtcac ggggaagcag atcaccgtcl ccctcggcga gcacgagagc 1440 aaggtctatg cgcccggcac cccggtatcg gcatacagcc ccgaagcgcg caacaccacg 1500 aagatccgcg tgcactacaa cgtgggcctc gggcacagca tcgcgatccg cggcgacgag 1560 tacccgttca cctggacctc cggccgaggc gcgcgcaacg tcgcgtccga cgtctgggag 1620 ttcgagglcg agcgcatccc cgacggtgag accttccagt tcaagcctct gatcgacgac 1680 gtcacctggt cgaccggcgg caac丨tcacc gggacgggcg gcgacgtgat cgacatctac 1740 cccaccttc .1749 <210〉 4 <211> 9 4- 1344820 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400> 4

His lie Gin Arg Leu Thr Ala lie Lys 1 5 <210> 5 <211〉 13 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400> 5

Asp Met Glu Ser Phe Asp Gin Asn Ser Asn Leu Tyr Lys 1 5 10 <210〉 6 <211> 10 <212> PRT <213>球形節桿菌 <400> 6

Leu Gly Asp Leu Phe Asp Gin Asp Ser Lys 1 5 10 <210> 7 <211〉 27 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400〉 7

Met lie Leu Asp Val Val Pro Asn His Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly 1 5 10 15

Thr Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Thr Tyr Lys 20 25 -5- 1344820 <210〉 8 <211〉 20 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400> 8

Asp Trp Val Asp Met Gly Phe Asp Gly He Arg Val Asp Ala Ala Arg 1 5 10 15

Ser Val Pro Lys 20 <210〉 9 <211〉 30 <212> PRT <213〉球形節桿菌 <400> 9

Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp Asn His Asp Arg 15 10 15

Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gin Arg Leu 20 25 30 <210〉 10 <211> 4467 <212〉 DNA <213〉球形節桿菌 <400> 10 ggatccctga gctggatggg catggctcac gcgctcgatc tcgagggggc ggcgaaggag 60 ctggcgaccg cagccggcga ggcacctctc ctccgcccgg ccgacctcgl clacctcggc 120 gtcgalctcg cgcagacgac ggagggagaa cggtcgcagc gggaggcgct cgggctcgct 180 gtcgtcgagc agaacgctct cgtcgccgat cctcggcgag ctgctcggac cgcacgagcc 240 cacclcgccc caggaccgtt catcgtgcac ctggacgtcg atgtgctgga cttcctcgac 300 gcacccctlg ccgagaacgt gaacggccga aacagcgggc cgaccgtcga gcagctgcgg 360 -6 - 1344820 glcgcactcg ccgagcltct gcagcatccg gaclgctggg cgatgtccat cggccaggtg 420 gtccccgcgc acgcggcggc cgacccgacc tccalcccgc ggctcatcgg cgccctggcc 480 gtgagctcca cgtagccgga cgtcgctcct ggagcggagc cgctccggca ggaacggcgt 540 cgcaccccgt cgagcggggg cgtcgccctc ttcgacgggg tctgcggcgc ggctacccgc 600 gcggcagcgt gagccgccac cgaccagatc tcalgcattl ggacgaactt cgccgtccaa 660 ttctctccgc gcctcaagca ggtatacatc gctcgaacgc gtcttcactg gcctgacggt 720 ccgcgatcac gtcgtgcagt gaagcatcct gccgcgaagg gtcttgatgc gcatgcagta 780 cgggagtcga aicactttca cgggcacggc cggtgtcagt acttgacaaa acgcatttat 840 acatgttgca tcgatccagt aaaccgtgca gctcgcggac cgatgcgcat ccgacaacga 900 agtcaggaga gagtc atg aga acg aca gtt cgt acc get ege gtc tee geg 951

Met Arg Thr Thr Val Arg Thr Ala Arg Val Ser Ala 1 5 10 cgt acg ggc etc geg atg gga gca gee gtc geg ctg geg gee ggc geg 999

Arg Thr Gly Leu Ala Met Gly Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Ala 15 20 25 etc acc tgg ggc acc ggc ccc gca ccc geg agt gee gac ccc acc acg 1047

Leu Thr Trp Gly Thr Gly Pro Ala Pro Ala Ser Ala Asp Pro Thr Thr 30 35 40 teg ccc ggc ccg ctg gee gag ggc gac gtg ate tac cag gtg etc gtc 1095

Ser Pro Gly Pro Leu Ala Glu Gly Asp Val lie Tyr Gin Val Leu Val 45 50 55 60 gac egg ttc gaa gac ggc gac ccc acc aac aac gac cag ggc gac gga 1143

Asp Arg Phe Glu Asp Gly Asp Pro Thr Asn Asn Asp Gin Gly Asp Gly 65 70 75 gag tac gat ccg tee gac etc ggt ttc tac cac ggc ggc gac tgg geg 1191

Glu Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Gly Phe Tyr His Gly Gly Asp Trp Ala 80 85 9〇 ggc ctg acg gac egg etc gac tac ate gee gat ctg ggt gU acg geg 1239

Gly Leu Thr Asp Arg Leu Asp Tyr lie Ala Asp Leu Gly Val Thr Ala 12871344820 95 100 105 ate tgg etc teg ccc gtc tee gag cag cag ccg clc teg ege gac ggg lie Trp Leu Ser Pro Val Ser Glu Gin Gin Pro Leu Ser Arg Asp Gly 110 115 120 1335 ctg gag gee age tac cac ggc tac ttc act egg gac ttc geg aeg ccg

Leu Glu Ala Ser Tyr His Gly Tyr Phe Thr Arg Asp Phe Ala Thr Pro 125 130 135 140 1383 aac gag cat ttc ggc gac ega gee gag ctg cag gag ctg ate gac aeg

Asn Glu His Phe Gly Asp Arg Ala Glu Leu Gin Glu Leu lie Asp Thr 145 150 155 1431 geg cac gat etc gga etc aag atg ate etc gac gtc gtg ccg aac cac

Ala His Asp Leu Gly Leu Lys Met lie Leu Asp Val Val Pro Asn His 160 165 170 1479 aeg gee gac tac etc geg ggc aca teg aeg acc tat teg ccg age acc Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Thr 175 180 185 tac aag ccg geg agt ccg etc gat gac geg teg tac tic cat cac gee Tyr Lys Pro Ala Ser Pro Leu Asp Asp Ala Ser Tyr Phe His His Ala 190 】95 200 ggc gac tgc clg ttc aac ggg etc gag aeg cag acc cag ate gag aac Gly Asp Cys Leu Phe Asn Gly Leu Glu Thr Gin Thr Gin lie Glu Asn 205 210 215 220 tgc gac etc ggc ggg etc gac gac clc gat cag teg aac ccg gtc gtc Cys Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Leu Asp Gin Ser Asn Pro Val Val 230 235 aeg tac aag gac tgg gtc gac alg ggc ttc 1527 1575 1623 teg teg cac clg alg age 1671 1344820

Ser Ser His Leu Met Ser Thr Tyr Lys Asp Trp Val Asp Met Gly Phe 240 245 250 gac ggc ate egg gtc gat geg geg ege teg gtg ccg aag ccg tgg etc 1719

Asp Gly lie Arg Val Asp Ala Ala Arg Ser Val Pro Lys Pro Trp Leu 255 260 265 gee gac ttc gaa gee gag atg ggc gtg ccg acc ttc ggc gag gtg ttc 1767

Ala Asp Phe Glu Ala Glu Met Gly Val Pro Thr Phe Gly Glu Val Phe 270 275 280 gtc ggc gat gtc gac tac gtc teg gag tac cag gac tac gag tgg ggc 1815

Val Gly Asp Val Asp Tyr Val Ser Glu Tyr Gin Asp Tyr Glu Trp Gly 285 290 295 300 gtg etc gac ttc ccc, tac ttc ttc aeg gtg ege gag geg ttc teg gee 1863

Val Leu Asp Phe Pro Tyr Phe Phe Thr Val Arg Glu Ala Phe Ser Ala 305 310 315 gat acc gac atg aac aag etc ggc gac etc ttc gac cag gac age aag 1911

Asp Thr Asp Met Asn Lys Leu Gly Asp Leu Phe Asp Gin Asp Ser Lys 320 325 330 tac geg aac ccg aac egg ctg gag aeg ttc clc gac aac cac gat egg 1959

Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp Asn His Asp Arg 335 340 345 geg egg ttc clc acc tgg gee gat gac aac lat cag egg ctg ege tea 2007

Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gin Arg Leu Arg Ser 350 355 360 gga ctg aeg ttc etc eta acc tee egg ggc gtg ccc gtg ate lac lac 2055

Gly Leu Thr Phe Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Val lie Tyr Tyr 365 370 375 380 -9- 1344820 ggc acc gag cag gcc gac gac ggc aac ggc aac ccc tac gag gta ccg 2103

Gly Thr Glu Gin Ala Asp Asp Gly Asn Gly Asn Pro Tyr Glu Val Pro 385 390 395 ate geg aac aag gac aac ege aag gac atg gag age ttc gat cag aac 2151 lie Ala Asn Lys Asp Asn Arg Lys Asp Met Glu Ser Phe Asp Gin Asn 400 405 41〇 2199 teg aac etc tac aag cac ate cag egg ttg acc geg ate aag gcc get Ser Asn Leu Tyr Lys His lie Gin Arg Leu Thr Ala lie Lys Ala Ala 415 420 ' 425 lac ccg get ctg cag gtc ggc aca cag ege gag atg tgg tee gac acc 2247

Tyr Pro Ala Leu Gin Val Gly Thr Gm Arg Glu Met Trp Ser Asp Thr 430 435 440 tee gtc tac ggg ttc teg ega ege gtc gac age aeg ggt gcc gag geg 2295

Ser Val Tyr Gly Phe Ser Arg Arg Val Asp Ser Thr Gly Ala Glu Ala 445 450 455 460 atg acc ttc teg teg aac teg tgg aeg aeg cag aeg ege aeg gtg ccg 2343

Met Thr Phe Ser Ser Asn Ser Trp Thr Thr Gin Thr Arg Thr Val Pro 465 470 475 ctg ege gcc gag age teg ate aeg gtc ggt aeg aeg ctg aeg aac etc 2391

Leu Arg Ala Glu Ser Ser lie Thr Val Gly Thr Thr Leu Tlir Asn Leu 480 485 490 aac acS ggc gac aeg gtg acc gtg acc gcc ggc ggt gtc aeg ggg 2439

Met Asn Thr Gly aSp Thr Val Thr Val Thr Ala Gly Gly Val Thr Gly 500 505 495 aag cag ate acc gtc tcc etc ggc gag cac gag age aag gtc tat geg Lys Gin lie Thr Val ser Leu Gly Glu His Glu Ser Lys Val Tyr Ala 510 2487 515 520 -10- ccc ggc acc ccg gta teg gca tac age ccc gaa gcg cgc aac acc acg 2535

Pro Gly Thr Pro Val Ser Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Arg Asn Thr Thr 525 530 535 540 aag ate cgc gtg cac tac aac gtg ggc etc ggg cac age ate gcg ate 2583

Lys lie Arg Val His Tyr Asn Val Gly Leu Gly His Ser lie Ala lie 545 550 555 cgc ggc gac gag tac ccg ttc acc tgg acc tee ggc ega ggc gcg cgc 2631

Arg Gly Asp Glu Tyr Pro Phe Thr Trp Thr Ser Gly Arg Gly Ala Arg 560 565 570 aac gtc gcg tee gac gtc tgg gag ttc gag gtc gag cgc ale ccc gac 2679

Asn Val Ala Ser Asp Val-Trp Glu Phe Glu Yal Glu Arg lie Pro Asp 575 580 585 ggt gag acc ttc cag ttc aag cct ctg ate gac gac gtc acc tgg teg 2727

Gly Glu Thr Phe Gin Phe Lys Pro Leu lie Asp Asp Val Thr Trp Ser 590 595 600 acc ggc ggc aac ttc acc ggg acg ggc ggc gac gig ate gac ate tac 2775

Thr Gly Gly Asn Phe Thr Gly Thr Gly Gly Asp Val lie Asp lie Tyr 605 610 615 620 ccc acc ttc tga acccatccct cccgggactc caccgaaagg atgcttgtga gccac 2832 Pro Thr Phe accatcgaac ggccclctcg cctcgacacg gcaaggcgcg ccltctcctg gcgcgacgcg 2892 gtcgtctacc aggtctacct gcggtcgttc cgcgacgcga aeggegaegg catcggcgac 2952 ctcggcggcc tgagccaggg tctcgacgcg atcgccgcac teggetgega cgccatctgg 3012 ctgaacccct gctacgcctc gccccagcgc gaccacgggt acgacatcgc cgactacctg 3072 acgalcgatc eggegtaegg caccctcgag gagttcgacg aggtggttcg ccgagcgcac 3]32 gagclcgggc tgcgcgttct gatggacatg glcgcgaacc actgctcglc cgaccacgcc 3192 1344820 tggttccagg cggcgttggc cgccgagccc ggcagcgacg agcgggcgcg cttcalcttc 3252 cgcgacggcc tcggccccga tggcgaactg ccgccgaaca actgggacag cgtcttcgga 3312 gggctcgcct ggacccgcgt caccgagcgc gacggacgcc ccgggcagtg gtacclccac 3372 tcctttgata cgagccagcc cgacttcgat 丨ggcggcacc ccgcggtggc cgagcacttc 3432 gagaacgtgc tgcggttctg gttcgagcgg ggagtcgacg gcttccgcat cgacgtcgcg 3492 cacggccact tcaaggacgc cgccctgccc gaccacccgg gtggccgggg gcctgacgcc 3552 ggccacaacc acggcatgtg ggaccagccc gaggtgcacg acclctatcg ctcgtggcga 3612 gcgctcggcg atgcctacga gcccgagaag tacttcgtgg gcgagatclg ggtcccctcc 3672 cccgaccggc tggccgacta cctgcgaccc gacgagctgc acaacgcctt ctcgttcgat 3732 ctgctcgtgc agccgtggaa cgccgaccgg ttccggaagg cgatcgagac cggactcgcc 3792 gtcggacgcg ggtggccggc ctggacactg gccaaccacg acgtgcatcg tgcggicacc 3852 cgctacggcc aggagcagcc gttggatgaa gccctgccga ccgacatgat cgccgcggcg 3912 cgacgcaggg gcccggccga tctggatcgc ggtcttcgcc gtgcgcgcgc ggcagccgcc 3972 ctcgccctcg cgctcccggg gtcgatgtac ctctatcagg gcgaagaact cgggtlgccc 4032 gaggltctgg atctcccgga tgctgcgcgc caagacccga tctggacccg ctcgaacggc 4092 accgagctcg gccgggacgg gtgccgcatc cccctcccct ggacgcgaga gggccgcacc 4152 ttcggattca gcgacgcggc cgccgccacg acctggctcc cgcagcccgc gtggttcggc 4212 gcgttcgccc gggcgacgca ggcggccgat cccgactcga tgctctcgct gcatcgcgal 4272 ctcclcgcca cgcgccgcac ccacclccgc ggaacggagc cgatcgtctg gctglccccg 4332 gcagglgccg aggtgctcgc cttccgacgc ggggacgtcg tggtcgtcac gaacttcggc 4392 tccgcaccct tcacgccgcc gtccgcctgg ggcgcgctct cgccgctcci ggcctcccag 4452 ccgctgacgg gatcc 4467 -12-

Claims (1)

1344820

⑽年冬月㈠修(气}正衣 第093125845號專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國100年4月6日修正 十、申請專利範圍 1. 一種環狀麥芽糖基麥芽糖，其特徵爲具有環{—6 )一 a— D—吡喃葡糖基一（1— 4) — α—D-吡喃葡糖 基—（1-^6) — a— D — U比喃葡糖基—（1—·4) — a—D 一吡喃葡糖基一（1— }之構造者。 2. —種含有具環{—6) — a— D —吡喃葡糖基_ ( 1—4) — — D —吡喃葡糖基—（1—6) — α-D—吡喃 葡糖基—（1-4) - α- D-吡喃葡糖基一（1— }構造 的環狀麥芽糖基麥芽糖之糖質，其特徵爲每單位固體含有 1質量％以上具有環{ — 6) - a_D_吡喃葡糖基—（1 —4) 一 α—D —吡喃葡糖基_ (1— 6) — α—D —吡喃葡 糖基_ (1— 4) - α—D—吡喃葡糖基—（1—丨之構造 的環狀麥芽糖基麥芽糖者。 . 3- 一種具有環{— 6) - α— D—吡喃葡糖基一（1 —4) — a— D — Π比喃葡糖基 _ (1->6) — a— D—Bji 喃葡 糖基—（1— 4) — a— D —卩比喃葡糖基—（1— }之構造 的環狀麥芽糖基麥芽糖、或含其之糖質，其特徵爲呈糖漿 、糖膏、非晶質粉末、非晶質固體物、結晶或結晶固體狀 物之任一形態者。 4.—種組成物，其特徵含有具有環{->6) — α - D —吡喃葡糖基一（1— 4) — a— D—吡喃葡糖基_ (1— 6 )一 α - D —吡喃葡糖基—（1— 4) - a— D —吡喃葡糖 1344820 基-（I—}之構造的環狀麥芽糖基麥芽糖或含其之糖質 者。 5. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中組成物爲飲 食物、化粧品或醫藥品者。 6. 如申請專利範圍第4項或第5項之組成物，其中含 每單位固體0.1質量％以上具有環{— 6) — α—D —吡喃 葡糖基-(1—4) 一 α-D —吡喃葡糖基一（1— 6) — α φ 一 D —吡喃葡糖基—（1—4) — a_D_吡喃葡糖基_ (1 —}之構造的環狀麥芽糖基麥芽糖者。