KR100545108B1

KR100545108B1 - β-프룩토푸라노시다아제, 그 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR100545108B1
Application number: KR1019960066794A
Authority: KR
Inventors: 데쓰야 나카다; 히로토 차엔; 도시유키 스기모토
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 2006-07-06
Also published as: TW494137B; EP0780470B1; US5952204A; US5837527A; CA2192150A1; CA2192150C; AU7541296A; US5753469A; DE69613200T2; AU717490B2; KR970043040A; EP0780470A2; EP0780470A3; DE69613200D1

Abstract

SDS-PAGE 에서의 분자량이 49,000± 5,000 달톤, 등전점이 4.5± 0.5, 최적 pH가 약 5.5∼6.0, 칼슘 이온 존재하에서의 최적 온도가 약 50℃인 β -프룩토푸라노시다아제.

이 효소는 β -프룩토푸라노시드 결합을 가진 당류와, 기타의 당류, 당 알코올류 및 알코올류를 비롯한 기타의 물질에 작용하여 프룩토실 전이 당을 생성한다.

Description

β -프룩토푸라노시다아제, 그 제조방법 및 용도

본 발명은 비교적 높은 프룩토실 전이 활성을 가진 신규의 β -프룩토푸라노시다아제, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

크실로실프룩토시드 및 락토수크로오스 등의 프룩토실 전이 당류(fructosyl-transferred saccharides)는 β -프룩토푸라노시다아제(EC 3.2.1.26) 또는 프룩토실트란스페라아제를 사용하여 기질인 수크로오스 또는 기타 당(류)에 작용시키는 당 전이 반응에 의해 생산되는 것인데, 난(難) 충치 유발성과 비피드균 생육촉진 작용 등의 성질을 가지고 있기 때문에 이들 올리고당은 식품 및 의약품 분야에서 많은 주목을 받고 있다.

종래부터 프룩토실 전이 당류를 생성하는 것으로 알려진 β -프룩토푸라노시다아제는 아르드로박터(Arthrobacter) sp. K-1 및 바실루스 메가테륨(Bacillus megaterium(IFO 13498)) 등의 미생물로 부터 유래된다.

문헌 [Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 54, No. 4, pp. 913∼919 (1990)]에 의하면 아르드로박터 sp. K-1의 β -프룩토푸라노시다아제는 그 최적 pH가 6.5∼6.8이라고 보고되어 있다. 그러나 이 pH 영역에서는 공업적 규모의 효소반응에 사용되는 온도에서 당류의 갈변반응이 쉽사리 일어나기 때문에 적당하지 않다. 특히, 이 경향은 프룩토오스 생성반응에서 더욱 현저하므로 반응 혼합물중의 당류의 정제를 위한 탈색단계에 부담을 가중시킬 수도 있다. 일본국 특허공개 제200,386/92호 공보에 개시된 바와 같이 바실루스 메가테륨 IFO 13498의 β -프룩토푸라노시다아제의 최적 pH는 6.0이다. 이 pH 조건에서는 반응 혼합물의 탈색이 불량해진다. 그러나 최적 온도가 40∼45℃로서 낮으므로 이 온도 부근에서 효소반응을 실시할 경우 세균 오염이 발생할 수도 있다.

본 발명은 프룩토실 전이 활성이 비교적 높고, 공업적 규모로 적절히 사용되는 β -프룩토푸라노시다아제와 이 효소를 사용한 프룩토실 전이 당의 제조방법 및 이들 당류의 용도를 제공한다.

본 발명자들은 당 전이 활성과 최적 온도가 비교적 높고 당류를 안정화하는 다소 산성인 pH의 최적 pH를 가진 신규의 β -프룩토푸라노시다아제를 생성하는 미생물을 널리 검색하여 왔다.

그 결과, 일본국의 오카야마의 토양으로 부터 분리한 신규의 미생물인 바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)이 소요의 β -프룩토푸라노시다아제를 생성한다는 것을 발견하여, 수크로오스와 기타 당류를 함유한 용액에 이 효소를 작용시켜 프룩토실 전이 당류를 함유한 당질의 제조방법과 이 당질을 함유하는 조성물을 확립하였다.

본 발명자들은 신규의 β -프룩토푸라노시다아제를 생산하는 미생물을 널리 검색한 결과, 소요의 β -프룩토푸라노시다아제를 생성하는 신규의 미생물인 바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)를 일본국의 오카야마의 토양으로 부터 분리하였다.

본 발명자들은 문헌[Takeji Hasegawa 편저, "미생물의 분류와 동정(同定)", 일본국 동경 Japan Scientific Societies Press 출판 (1985)]에 기재된 방법에 준하여 바실루스속(屬)에 속하는 미생물을 동정하여 이것을 바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)로 명명하였다. 그 결과는 다음과 같다.

A. 형태

(1) 육 엑스 한천 평판에서 27℃에서 1일간 배양시의 세포의 특징

통상적으로 1.0∼1.5× 3.0∼7.5㎛의 간균(稈菌)으로 존재;

단일형으로 존재하나 드물게는 연쇄(連鎖)한 세포로도 존재;

원형의 편모를 가진 운동성;

비(非)내산성;

그람 부정 (不定);

폴리-β -히드록시부티레이트 축적 않음;

경우에 따라서는 4일간 배양시 내생포자를 생성함.

(2) 감자 엑스, 펩톤 및 글루코오스의 한천 평판에서 27℃에서 1일간 배양시의 세포의 특징

통상적으로 0.9∼1.5× 2.7∼6.0㎛의 간균으로 존재;

단일형으로 존재하나 드물게는 연쇄한 세포로도 존재;

운동성 : 양성;

그람 부정;

내생포자를 생성함;

팽윤하지 않고 세포 가장자리에서 포자를 생성함;

포자크기 : 0.8∼1.0× 1.0∼1.6㎛의 타원형;

토양 추출 배지에서 배양시 포자를 생성함.

B. 배양특성

(1) 육엑스 한천 평판에서 27℃에서 배양시 생성한 콜로니의 특징

형상 : 원형 콜로니, 크기는 1일간 배양시 직경 약 1.0∼1.5㎜, 그리고 3일간 배양시 직경 약 1.5∼3㎜;

주연(周緣) : 전연(全緣)

융기 : 위로 융기;

광택 : 흐릿함;

표면 : 평활하거나 사마귀 모양;

투명성 : 반투명 또는 불투명;

색 : 크리임색

(2) 육 엑스 한천 경사배지에서 27℃에서 배양시 생성한 콜로니의 특징

생육 : 양호;

형상 : 실형상; 약간 융기; 표면은 평활하고 습광(濕光) 또는 둔광(鈍光); 반투명; 크리임 색.

(3) 육 엑스 젤라틴중에서 27℃에서 천자 배양시 액화.

C. 생리학적 성질

(1) 질산염의 환원 : 양성

(2) 탈질 반응 : 음성

(3) 메틸 레드 시험 : 음성

(4) VP-시험 : 음성

(5) 인돌 생성 : 음성

(6) 황화수소 생성 : 음성

(7) 전분 가수분해 : 양성

(8) 카제인 가수분해 : 음성

(9) 폴리-β -히드록시부티레이트 축적 : 음성

(10) 프로카테크산 가수분해 : 음성

(11) 시트르산 이용 : 음성

(12) 무기질소원 이용 : 암모늄염 및 질산염을 이용

(13) 색소 생성 : 음성

(14) 형광 색소 생성 : 음성

(15) 우레아제 : 양성

(16) 옥시다아제 : 양성

(17) 카탈라아제 : 양성

(18) 생육조건 : pH 5∼8 및 온도 15∼45℃에서 생육

(19) 산소에 대한 태도 : 호기성

(20) 탄소원 이용 및 산의 생성

(21) 아미노산에 대한 디카르복실라아제 시험

L-리신, L-아르기닌 및 L-오르니틴에 대해 음성;

(22) 아미노산의 이용

L-글루탐산 나트륨, L-아스파르트산 나트륨, L-아르기닌, L-트립토판, L-히스티딘, L-발린 및 D-알라닌을 이용함;

(23) DNase : 음성;

(24) 3-케토락토오스 생성 : 음성

(25) DNA의 구아닌(G) + 시토신(C) 몰% : 41％

(26) 세포벽의 디아미노산 : 메소-디아미노피멜산,

문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (1986)]을 참고로 하여 이들 생리학적 성질을 가진 미생물과 종래의 공지 미생물을 비교한 결과, 그람균은 부정(不定)이었으나 이 미생물은 산소를 필요로 하고 내생포자를 생성하므로 바실루스속의 미생물의 1종인 것으로 확인됨이 판명되었다. 이 미생물은 이들 특성에 근거하여 바실루스 메가테륨(Bacillus megaterium)의 것과 유사하지만, 그 세포 가장자리에서 내생포자를 생성하고, 카제인을 가수분해하지 않으며 시트르산을 이용하지 않고 10℃에서는 생육하지 못한다는 사실에 의해 이들 미생물과는 다르다.

이들 데이터에 근거하여 본 발명자들은 이 미생물을 "바실루스 sp. V230"으로 명명하고 1995년 3월 24일자로 기탁기관(일본국의 이바라키 소재 공업기술원 Fermentation Research Institute)에 기탁하였다. 이 미생물의 기탁은 상기 기관에 접수되어 수탁번호 FERM BP-5054호로 유지되고 있다.

이 미생물과 그 변이주를 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 미생물이 생육하고 본 발명의 효소를 생산하는 영양배지이면 어떠한 것이라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 예컨대, 합성 영양배지 및 천연 영양배지를 영양배지로서 사용할 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 탄소함유 물질이면 어떠한 것이라도 본 발명에서 탄소원으로 사용할 수 있다. 예컨대, 수크로오스, 락토오스, 말토오스, 덱스트린 및 전분 등의 당류와 당밀, 효모 추출물 등의 당질 함유물을 탄소원으로 사용할 수 있다. 영양배지중에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 선택적으로 선정된다. 예컨대 미생물의 생육과 증식의 면에서 추천할 수 있는 수크로오스 농도는 통상적으로 20w/v% 이하, 보다 특히 5w/v% 이하이다.

본 발명에서 사용되는 질소원의 예로서는 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소함유 화합물 및 우레아, 코온 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 추출물 및 육 추출물 등의 유기 질소함유 화합물이 있다. 본 발명에서 사용되는 무기성분의 예로서는 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물의 배양은 통상적으로 온도 15∼45℃, 바람직하게는 25∼37℃ 및 pH 5∼8, 바람직하게는 5.5∼7.5에서 호기성 조건하에 실시한다. 본 발명에서 사용되는 미생물의 배양 시간은 미생물의 증식에 필요한 시간보다 긴시간인데, 바람직하게는 5∼100시간이다. 영양액중의 용존(溶存) 산소(dissolved oxygen : DO)의 농도는 특히 한정되지 않는데, 바람직하게는 0.5∼20ppm의 범위내이다.

통기량(通氣量), 교반 속도, 보충 산소량을 조절하고 발효기의 내부압력을 증가시킴으로써 이 농도를 상기 범위내로 유지할 수 있다. 배양은 뱃치식(batch-wise) 또는 연속식으로 한다.

미생물의 배양을 종료한후 본 발명의 효소를 채취한다. 본 발명의 효소의 활성은 세포 무함유 영양배지중에서 발견되므로 이 배지를 회수하여 조효소(crude enzyme)로 사용할 수 있다. 배양물을 그대로 조효소로 사용해도 좋다. 종래의 액-고 분리법을 사용하여 배양물로 부터 세포를 제거할 수 있다. 예컨대 배양물을 직접 원심분리하는 방법 및 배양물을 프리코우트 필터(pre-coat filter)로 여과하는 방법 또는 평 필터(plain filter) 또는 중공사를 사용하는 멤브레인(membrane) 여과법으로 세포를 분리하는 방법을 선택적으로 사용할 수 있다. 수득한 세포 무함유 배양물을 그대로 조효소액으로 사용할 수 있는데, 바람직하게는 농축한후에 사용한다. 본 발명에서 사용되는 농축법으로서는, 예컨대 황산암모늄을 사용하는 염석법, 아세톤 및/또는 알코올을 사용하는 침강법 및 평 필터 및 중공사 등의 멤브레인을 사용하는 농축법 등이 있다.

세포 무함유 배양액 형태의 조효소 및 그 농축물은 이온 교환 수지를 사용하는 수지체에의 결합법, 수지 및/또는 멤브레인을 사용하는 공유 결합·흡착법 및 고분자 물질을 사용하는 포접법 등의 종래의 방법에 의해 고정시킬 수 있다.

조효소를 그대로 사용하거나 정제하여 사용한다. 예컨대 세포 무함유 배양액을 황산 암모늄으로 염석하고 농축한 조효소를 투석한 다음, "DEAE-TOYOPEARL"(일본국의 Tosoh사 판매의 음이온 교환 수지)을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, "BUTYL-TOYOPEARL"(일본국의 Tosoh사 판매의 소수성 수지)을 사용하는 소수성 칼럼 크로마토그래피 및 "DEAE-TOYOPEARL"을 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 연속적으로 정제하여 전기 영동적으로 단일 단백질 밴드를 나타내는 효소를 얻는다.

이렇게 하여 수득한 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제는 다음과 같은 물리화학적 성질을 가지고 있다.

(1) 작용

수크로오스, 라피노오스 및 에를로오스의 β -프룩토푸라노시드 결합을 가수분해하여 프룩토오스를 유리함; β -프룩토푸라노시드 결합을 가진 이들 당을 공여체로 하여 이들 당으로 부터 β -프룩토푸라노실 잔기를 기타의 당류, 당알코올류 및 알코올류에서 선택되는 수용체에다 전이시키는 작용을 촉진함;

(2) 분자량 : SDS-PAGE에서 49,000± 5,000 달톤;

(3) 등전점(pI)

양성(兩性) 전해질(ampholyte)을 사용하는 등전점 전기영동에서 4.6± 0.5;

(4) 최적 pH

40℃에서 10분간 유지할 경우 약 5.5∼6.0;

(5) 최적온도

pH 6.0에서 10분간 유지할 경우 칼슘이온 부재시에는 약 45℃, 칼슘 이온 존재시에는 약 50℃;

(6) pH 안정성

4℃에서 24시간 유지할 경우 약 5.0∼8.0;

(7) 열적 안정성

pH 6.0에서 1시간 유지할 경우 약 45℃까지 안정함;

(8) 저해작용

Cu⁺⁺, Pb⁺⁺, Fe⁺⁺, Fe⁺⁺⁺ 또는 Hg⁺⁺1mM에 의해 저해됨.

본 발명에 의한 β -프룩토푸라노시다아제의 활성은 다음과 같이 측정한다. 즉, 1.0w/v% 수크로오스, 20mM 아세테이트 완충액 및 5mM 염화 칼슘으로 된 수용액(pH 6.0) 5ml에 효소액 0.2ml을 가하고, 이 혼합물을 40℃에서 10분간 유지한후, 소모기(Somogyi) 구리용액을 가하여 반응을 정지시킨 다음 소모기-넬슨법으로 환원력을 측정한다. 대조로서 100℃에서 10분간 예열하여 효소를 실활시킨 효소액을 만들어 위와 마찬가지로 환원력을 측정한다. 이 효소의 활성 1단위는 위와 같은 측정법으로 측정시에 1분당 글루코오스 2μ mol에 상당하는 환원력을 증가시키는 효소의 양으로 정의된다.

본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제는 수크로오스에 작용하여 글루코오스와 프룩토오스 성분으로 분해하지만, 수크로오스의 고농도에서도 수크로오스 분자 사이의 분자간 전이반응을 실질적으로 유발하지 않고 수크로오스 보다 분자량이 많은 올리고당류를 실질적으로 생성하지 않는다. 수크로오스를 당 공여체로 하고, 기타 당질, 예컨대 크실로오스, 갈락토오스, 락토오스, 말토오스 및 이소말토오스를 비롯한 환원당을 수용체로 하여 이 효소를 작용시킬 경우, 프룩토실 잔기를 환원당에 전이시켜 크실로실프룩토시드(xylosylfructoside), 갈락토실프룩토시드, 락토실프룩토시드(락토수크로오스), 말토실프룩토시드(에를로오스; erlose) 및 이 소말토실프룩토시드를 생성한다.

기타의 당질로서 트레할로오스와 네오트레할로오스 등의 글루코오스 단위로 구성된 비환원성 이당류를 당질 수용체로 사용할 경우 본 발명의 효소는 각각 프룩토실트레할로오스와 프룩토실네오트레할로오스를 생성한다.

단당류 및 이당류외에도 크실로올리고당류, 갈락토올리고당류, 말토올리고당류 및 이소말토올리고당류 등의 고급 올리고당류 및 소르비톨, 말티톨 등의 당 알코올류를 수용체로 사용할 수 있다. 이들 수용체중 두가지 이상을 선택적으로 병용할 수 있다. 수크로오스외에도 라피노오스, 에를로오스 등의, β -프룩토푸라노시드 결합을 가진 기타 올리고당류를 당수용체로 사용할 수 있다.

본 발명의 β - 프룩토푸라노시다아제를 사용하여 당류를 생성시키기 위해 프룩토실 전이반응에 사용되는 기질의 농도는 특히 한정되는 것은 아니며, 10w/w%(이하, 별달리 명시하지 않는한 "w/w%"을 간단히 "%"로 표기함) 이상, 바람직하게는 20∼60%의 농도를 적절히 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 반응온도는 본 발명의 효소를 실활하지 않는 온도, 즉 약 60℃ 이하, 바람직하게는 약 50∼55℃이다. pH를 약 3.5∼8.0, 바람직하게는 약 4.5∼6.5으로 조절한다. 반응시간은 효소반응에 따라 선택적으로 택한다. 통상적으로 본 발명의 효소의 사용량은 기질 고형물 1g당 약 0.1∼50단위이고, 반응시간은 약 0.1∼100시간이다.

프룩토실 전이 당류의 수율은 본 발명의 효소에 대한 반응 조건, 기질농도, 수용체의 종류에 따라 달라지는데, 예컨대 20% 수크로오스 및 20% 락토오스를 사용했을 경우의 락토수크로오스의 최고 가능한 수율은 약 40%이다.

수득한 반응 혼합물을 종래방법으로 여과하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고, 이 혼합물을 활성탄에 의한 탈색, H형 및 OH형의 이온 교환수지에 의한 탈염 등으로 정제한다. 정제된 용액을 시럽상으로 농축하고, 필요에 따라 더 건조하여 분말상 제품을 얻는다.

전이 당류의 함량을 증대시키기 위해 반응 혼합물로 부터 이들을 분리하고, 정제하여 프룩토실 전이 당류의 함량이 많은 조성물을 얻는다.

이러한 목적으로 적절히 사용되는 방법으로서는 전화효소(invertase) 결손 효모를 사용하는 단당류 제거를 위한 효모 발효법, 반응 혼합물을 알칼리화한 후 가열하여 환원당을 분해시키는 알칼리 처리법 및 멤브레인 여과법과 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡 당류를 제거하는 분리법 등이 있다. 특히 일본국 특허공개 제23,799/83호 및 제72,598/83호에 개시된 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로 부터 협잡 당류를 제거함으로써 목적으로 하는 프룩토실 전이 당류 고함유의 획분을 공업적 규모로 유리하게 얻을 수 있다.

이 경우에 있어서 고정상 방법, 이동상 방법 및 의사 이동상 방법 등의 종래의 방법을 사용할 수 있다.

협잡 당류가 함유되지 아니한 용액을 종래방법으로 여과하고 원심분리하여 불순물을 제거한 상청액을 활성탄을 사용하는 탈색법 및 H형과 OH형 이온 교환수지를 사용하는 탈염법으로 정제한후, 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 필요에 따라 시럽상 제품을 분무건조하여 분말상 제품을 얻는다.

통상적으로 당조성물중에는 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제에 의해 생성된 프룩토실 전이 당류를 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상 함유한다.

이렇게 하여 수득한 당조성물은 양호한 맛과 감미도, 삼투압 조절성, 보습성, 광택 부여성, 결정화 방지성, 열화(劣化) 방지성, 충치방지성, 비피드균의 생육 촉진성, 미네랄 흡수 촉진성 등의 만족스러운 성질을 가지고 있다. 따라서 이 당조성물을 식품, 담배, 사료, 이료, 화장품, 의약품 등의 조성물과 성형물에 마음데로 사용할 수 있고, 또한 가정 일상품, 농산물, 수산물, 화공약품, 화학공업용 제품 등에도 마음데로 사용할 수 있다. 프룩토실 전이 당류를 함유한 본 발명의 당조성물을 그대로 감미용 조미료로 사용할 수 있다.

필요에 따라서는 이 조성물을 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 트레할로오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, a -글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸 L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린. 글리신 및 알라닌 등의 기타 감미료의 1종 이상 및/또는 덱스트린, 전분, 락토오스 등의 증량제 적당량과 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 당 조성물은 신맛, 산, 짠맛, 떫은 맛, 단 맛, 쓴 맛을 가진 기타의 물질과 잘 조화하는 맛을 가지고 있으므로 일반적인 음식물의 감미료, 맛 개선재 및 품질 개량제 등으로서 마음데로 사용할 수 있다.

본 명의 당 조성물은 예컨대 간장, 분말 간장, 미소(된장), 훈마츠 미소(분말 된장), 모로미(정제술), 히시오(정제 간장), 후리카케(어육 조미품), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 주(설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 훈마츠 스시 수(초밥용 분말 식초), 츄가 노 모토(중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유(일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유(일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 타쿠앙 즈케 노 모토(일본 무우의 인스탄트 믹스), 하쿠사이 즈케 노 모토(배추 겉절임용 인스탄트 믹스), 야구니쿠 노 타레(일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토(인스탄트 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린(감미나는 술), 신미린(합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 당 조성물은 예컨대 각종 일본식 과자류[예 : 센베이(쌀 크래커), 아라레모치(입방체의 쌀떡), 오코시(기장과 쌀로 된 케이크), 모치(쌀풀), 만주(팥 잼 넣은 만두), 우이로(단맛의 젤리), 안(팥 잼), 요캉(단맛의 팥 젤리),미즈 요캉(연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠(요캉의 일종), 젤리, 파오드 카스텔라, 아메다마(일본식 토피)]; 양과자류[예 : 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디]; 빙과류[예 : 아이스 크리임, 셔어벳]; 시럽류[예 : 카지츠 노 시럽 츠케(과실의 시럽 절임), 코리미츠(빙수용 설탕 시럽)]; 페이스트류[예 : 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드]; 과실과 야채의 가공 식품류[예 : 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케 (과실 피클류), 토카 (당과)]; 절임 및 절임 제품[예 : 푸쿠진 즈케(적색의 무우 피클), 베타라 즈케(통무우 피클의 일종), 센마이 즈케(갖썰은 무우 절임의 일종), 라쿄 즈케(파 절임)]; 축육 제품류[예 : 햄, 소오세지]; 어육제품류[예 : 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와(어묵의 일종), 튀김]; 각종 진미류[예 : 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미린으로 조미된 말린 복어]; 츠쿠다니(간장에 끓인 음식)[예 : 김, 산채, 말린 오징어, 소어(小魚), 조개의 것들]; 평상시 식품[예 : 볶은 팥, 감자 샐러드, 다시마 말이]; 우유 제품; 통조림, 병조림[예 : 축육, 어육, 과실, 야채 등]; 주류[예 : 술, 합성주, 와인, 양주, 소주 등] 소프트 드링크류[예 : 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등]; 즉석 식품[예 : 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 핫 케이크 믹스, 즉석 시루코(아즈키팥 수우프에 떡을 혼합한 안스탄트 믹스), 즉석 수우프 믹스]; 기호음료[예 : 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등]에 대한 감미 부여, 맛 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.

그리고 본 발명의 당 조성물은 가축, 가금, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 개선하고 성장을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 또한 이들 조성물을 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복약, 정제, 트로치, 대구 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제, 가아글제, 화장품 및 의약품 등의 각종 고형물, 각종 페이스트상 또는 액상의 기타 각종 제품에 있어서 감미제, 맛 개량제, 은폐제 및 품질 개량제 등으로서 임의로 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물은 유효 성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질의 용액 및 이것을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 있어서 품질 개량제와 안정제로서 사용할 수 있다. 이러한 생리활성 물질의 예를 들자면, 림포카인류[예 : α -, β - 및 γ -인터페론, 종양괴사 인자-α (TNF-α ), 종양 괴사인자-β (TNF-β ), 대식세포 유주(遊走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨2 등]; 호르몬류[예 : 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 단세포 자극 호르몬, 태반 호르몬 등], 생물제제[예 : BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 유구열도산 반시뱀 항사독소, 인간 면역 글로불린 등]; 항생물질[예 : 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등]; 비타민류[예 : 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 대구 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등]; 효소류[예 : 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β -아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등]; 엑스류 [예 : 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등]; 생균류[예 : 바이러스, 유산균, 효모 등]; 기타 생리활성 물질[예 : 로얄젤리 등] 등이 있다. 본 발명의 비환원성 당류, 이들을 함유하는 비교적 저환원성의 당류 및 이들 당류로부터 제조한 트레할로오스를 사용함으로써 위에 나온 생리활성 물질들을 그 유효 성분, 활성을 상실함이 없이 안정성이 높은 고품질의 건강 식품이나 의약품 등으로 용이하게 제조할 수 있게 된다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명의 당 조성물은 경구 또는 비경구 투여되는 음식물을 포함하며, 화장품, 가정용품, 농림수산품, 화공 시약 및 화학공업 원료 등에도 사용할 수 있다.

이상 설명한 각종 조성물에 본 발명의 프룩토실 전이 당류를 함유하는 당 조성물을 함유시키는 방법은 예를 들자면 혼합, 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정화 및 고화 등 공지의 방법을 포함한다. 그리고 이들 조성물에 대한 본 발명의 당조성물의 첨가량은 프룩토실 전이 당류에 대해 고형분당 0.1％ 이상, 바람직하게는 0.5％ 이상이다. 이하, 아래의 실험에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(실험 1 : 효소 제조)

500ml 삼각 플라스크에 수크로오스 1.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 효모 추출물 0.1w/v%, 인산 2 수소 칼륨 0.1w/v%, 인산 수소 2 나트륨 2 수화물 0.06w/v%, 황산 마그네슘 7 수화물 0.05w/v%, 탄산 칼슘 0.3w/v% 및 물로 된 액상의 영양배지 100ml을 넣고, 이 플라스크를 121℃에서 15분간 오토클레이브 처리하여 멸균한 다음 냉각하여 여기에 바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)의 원배양물을 접종한후, 200rpm의 회전 진탕 조건하에 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 이 배양물을 한데모아 종배양물로 사용하였다.

동일한 신선한 영양배지 약 7리터를 10리터 용량의 발효기에 넣고 가열하여 멸균한후 30℃로 냉각한 다음, 여기에 위에 나온 종배양물 1v/v%을 접종하고 교반통기 조건하에서 30℃에서 약 20시간 동안 배양하였다.

수득한 배양물 약 6.5리터를 15,000× g에서 20분간 원심분리하여 β -프룩토푸라노시다아제의 활성이 3.6단위/ml인 배양 상청액 약 6.3리터를 얻었다.

(실험 2 : 효소 정제)

실험 1에서 얻은 배양 상청액중에 포화도 0.8이 되도록 황산 암모늄을 가해 용해한 용액을 4℃에서 하룻밤 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 채취하였다.

이 침전물을 5mM 염화칼슘을 함유한 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)중에 용해하고, 이 용액을 동일한 완충액에 대해 하루동안 투석한 다음 15,000× g에서 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 상청액(210ml)을 "DEAE-TOYOPEARL 650"(일본국의 Tosoh사 판매의 겔) 380ml을 사용하는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리하였다.

이 겔에 흡착된 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제를 0.1M 식염 용액으로 용리하고, 용리된 획분을 모아 다음의 방법으로 정제하였다. 즉, 1M 황산 암모늄 함유의 동일한 신선한 완충액에 대해 이 용액을 투석하고, 투석된 내부용액을 15,000× g에서 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 상청액을 "BUTYL-TOYOPEARL"(일본국의 Tosoh사 판매의 겔) 100ml을 사용하여 소수성 칼럼 크로마토그래피 처리하였다. 이 겔에 흡착된 β -프룩토푸라노시다아제를 1M로 부터 0M까지 감소하는 황산 암모늄의 직선 기울기 용액으로 칼럼으로 부터 용리하여 효소활성 획분을 채취하였다.

이들 획분을 모아 "DEAE-TOYOPEARL 650" 10ml을 사용하여 이온교환 칼럼 크로마토그래피 처리하여 효소활성을 가진 용리획분을 채취하였다.

이렇게 하여 수득한 효소의 수율은 배양물 상청액중의 전체 활성에 대해 약 13% 이었다. 이 효소의 비활성은 250단위/단백질㎎이었다. 단백질 함유량을 표준 단백질로서 소 혈청 알부민을 사용하는 로오리법(Lowry method)으로 측정하였다.

정제 β -프룩토푸라노시다아제의 순도를 7.5w/v% 폴리아크릴아미드 겔로써 겔 전기 영동법으로 측정한 결과, 비교적 고순도의 단일 단백질 밴드를 얻었다.

(실험 3 : 효소의 성질)

실험 2의 방법으로 얻은 β -프룩토푸라노시다아제를, 일본국의 Japan Bio-Rad Laboratories사 판매의 마아커 단백질(marker protein)을 사용하여 10w/v% 소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드(SDS)겔로써 전기 영동처리한 다음, 마아커 단백질의 분자량과 비교한 결과, 이 효소의 분자량은 49,0001± 5,000 달톤임이 판명되었다.

'TSKgel G3000SW" 칼럼(일본국의 Tosoh사 판매, 직경 7.8㎜, 길이 300㎜)을 사용하여 겔 여과법으로 측정한 이 효소의 분자량은 37,000± 3,000 달톤이었다.

정제 β -프룩토푸라노시다아제를 2w/v% "AMPHOLINE" 겔 (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechechnology AB 판매의 등전점 전기영동용 폴리아크릴아미드 겔)로써 등전점 전기영동 처리를 한 다음, 겔중의 단백질을 염색하여 겔의 pH를 측정함으로써 이 효소의 pI를 확인한 결과, pI는 4.6± 0.5이었다.

위에 나온 효소활성 측정시에 사용된 방법에 준하여 5mM 염화 칼슘 존재하에 또는 부재하에 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제 활성에 미치는 pH와 온도의 영향을 조사하였다. pH와 온도에 대한 이들 결과는 제1도와 제2도에 각각 나와있다. 이 효소의 최적 pH는 칼슘이온 존재하 및 부재하에 40℃에서 10분간 유지하였을 때 약 5.5∼6.0인 반면 이 효소의 최적 온도는 pH 6.0에서 10분간 유지하였을때 칼슘이온 존재하에서는 약 50℃이었고 칼슘 이온 부재하에서는 약 45℃이었다. 이 효소의 pH 안정성은 각기 상이한 pH에서 4℃에서 24시간 동안 50mM 완충액중에서 유지한 다음 완충액의 pH를 6으로 조정한 후의 잔존효소의 활성을 측정함으로써 결정하였다. 이 효소의 열적 안정성은 각기 상이한 온도에서 20mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)중에서 유지한 다음, 이 완충액을 냉각한 후 각 완충액중에서의 잔존 효소의 활성을 측정함으로써 결정하였다. 본 발명의 효소의 pH 안정성 및 열적 안정성의 결과는 제3도와 제4도에 각각 나와 있다. 이 효소의 pH 안정성은 약 5.0∼8.0이었고, 열적 안정성은 약 45℃이었다. 칼슘 이온의 존재는 pH 안정성과 열적 안정성에 영향을 주지 않았다. Cu⁺⁺, Pb⁺⁺, Fe⁺⁺, Fe⁺⁺⁺ 또는 Hg⁺⁺ 1mM에 의해 효소활성이 저해되었다.

(실험 4 : 기질 특이성)

최종농도가 2w/v%인 기질인 수크로오스, 라피노오스, 에를로오스, 스타키오스, 락토오스, 크실로실프룩토시드, 말토오스, 셀로비오스, 락토오스, 이눌린 또는 레반의 용액에 실험 2의 방법으로 얻은 β -프룩토푸라노시다아제를 기질 1g당 2단위 혼합하고 40℃ 및 pH 5.5에서 24시간 동안 효소반응 시켰다. 이 반응 혼합물을 "KIESEL GEL 60"(미합증국의 Merck사 판매의 20× 20㎝의 알루미늄판)을 사용하여 박층 크로마토그래피(이하, 간단히 "TLC"라 함)를 하여 이들 당에 이 효소가 작용하는지를 확인하였다.

TLC에 사용된 용매계는 1-부탄올, 피리딘 및 물(= 7 : 3 : 1, 체적비)로 된 것이고, 각 시료를 실온에서 1회 전개하였다. 구성당으로서 프룩토오스를 함유하는 각각의 당에 0.2w/v% 나프토레조르시놀을 함유한 0.5N 인산 용액을 분무하고 110℃에서 약 5분간 가열함으로써 발색시킨 반면, 기타의 당에 대해서는 20w/v% 황산을 함유한 메탄올 용액을 분무하고 110℃에서 약 10분간 가열함으로써 발색시켰다.

그 결과, 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제가 수크로오스, 라피노오스, 에를로오스, 스타키오스, 락토수크로오스 및 크실로실프룩토시드에 작용하여 특이하게 프룩토오스를 유리하지만, 말토오스. 셀로비오스, 락토오스, 이눌린 및 레반에는 작용하지 않음을 확인하였다.

(실험 5 : 수용체 특이성)

고형분 기준으로 표 1에 나온 단당류, 올리고당류 및 알코올류 중의 1종과 등량의 공여체인 수크로오스로 되어 있는 최종농도 10%의 당용액에 실험 2의 방법으로 얻은 정제 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 2단위 혼합하고 40℃ 및 pH 5.5에서 24시간 효소반응 시켰다. 효소반응 전후의 각 혼합물을 실험 4와 마찬가지로 TLC 처리하고, 각각의 당에 0.2w/v% 나프토레조르시놀을 함유한 0.5N 인산을 분무하여 110℃에서 약 5분간 가열하고 발색시킴으로써 전이된 당의 생성 여부를 확인하였다. 그 결과는 표 1에 나와 있다.

표 1에 나온 바와 같이 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제는 D-크실로오스, D-갈락토오스, 말토오스, 이소말토오스, 셀로비오스, 말토트리오스, 파노오스, 락토오스 및 멜리비오스 등의 환원성 당류와 트레할로오스 등의 비환원성 당류에 프룩토실 잔기를 효과적으로 전이함이 판명되었다. 그리고 이 효소는 D-크실리톨, D-소르비톨 및 말티톨 등의 당 알코올류와 글리세롤, 에틸렌 글리콜 등의 알코올류에 프룩토실 잔기를 효과적으로 전이하여 프룩토실 전이 당류를 생성함이 확인되었다.

(실험 6 : 수크로오스 및 환원성 당류로 부터의 프룩토실 전이당)

본 발명의 β -프룩토푸라노시드를 사용하여 당전이 반응에 의해 생성된 프룩토실 전이 당류를 확인하고자 확인시험을 하였다. 기질로서 수크로오스와 락토오스를 사용하여 실험 5에서 얻은 반응 혼합물의 일부를 당농도가 2% 되도록 20mM아세테이트 완충액(pH 4.5)으로 희석하고 이 회석용액 0.5ml에 전화효소 또는 β -갈락토시다아제(이들은 모두 일본국의 生化學 공업 주식회사 판매임)를 0.1단위 혼합한 다음 40℃에서 20시간 효소반응시켰다. 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제를 사용하여 얻은 반응 혼합물 및 전화효소 또는 β -갈락토시다아제로 반응 혼합물을 처리하여 얻은 기타의 반응 혼합물에 대해 가스 크로마토그래피 (GLC)로 당성분을 분석하였다. 각 반응 혼합물의 일부를 건조하여 피리딘에 용해한 다음 트리메틸실릴화하여 GLC 분석용 시료를 제조하였다. 이 분석에 사용된 조건과 장치는 다음과 같다.

GLC 칼럼 : 직경 3㎜, 길이 2ｍ의 스테인레스 스틸제, 2% "SILICONE OV17/CHROMOSOLVE W"(일본국의 GL Science사 판매) 충전;

캐리어 가스 : 질소 가스, 유속 40ml/min;

칼럼 오븐 온도 : 160∼320℃, 승온 속도 7.5℃/min;

검출기 : 수소염 이온화 검출기

그 결과, 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 작용에 의해 수크로오스와 락토오스로 부터 생성된 프룩토실 전이 당에 대한 피이크의 체류시간은 순수한 락토수크로오스 또는 락토실프룩토시드의 것과 일치하였음이 확인되었다. 그리고 이 당은 전화효소의 작용에 의해 프룩토오스와 락토오스로 분해되거나 β -갈락토시다아제의 작용에 의해 갈락토오스와 수크로오스로 분해되었기 때문에 전화효소 또는 β -갈락토시다아제로 처리했을 때 프룩토실 전이 당의 피이크가 검출되지 않았음도 확인되었다. 전화효소와 β -갈락토시다아제의 효소반응을 고려하면 프룩토실 전이 당은 락토수크로오스인 것으로 결론지을 수 있다.

전화효소 처리전후의 반응 혼합물과 순수한 당류에 대한 GLC 분석으로 부터 얻은 데이터에 근거하여 수용체인 크실로오스, 말토오스 및 이소말토오스로 부터 생성된 프룩토실 전이 당류는 각각 크실로실프룩토시드, 에를로오스(말토실프룩토시드), 및 이소말토실프룩토시드인 것으로 확인되었다. 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 작용에 의해 수용체인 이들 환원성 당류로 부터 생성된 프룩토실 전이 당류는 환원성 당의 잔기의 C-1에 β -프룩토푸라노시드 결합을 가지고 있는 것으로 판단된다.

(실험 7 : 프룩토실트레할로오스)

프룩토실트레할로오스를 분리하여 트레할로오스에 전이된 당을 확인하고자 구조에 대해 검토를 하였다. 수크로오스와 트레할로오스를 각각 20% 함유하는 당용액을 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 실험 2의 방법으로 얻은 정제 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 4단위 혼합하여 55℃에서 20시간 효소반응시킨 다음, 100℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활하였다. 프룩토실트레할로오스를 고형분당 약 23% 함유하는 이 반응 혼합물을 활성탄에 의한 탈색, 여과 및 H형 및 OH형 이온 교환수지에 의한 탈염에 의한 정제, 약 50% 까지의 농축 및 칼럼 크로마토그래피 처리를 함으로써 프룩토실트레할로오스 고함유 획분을 채취하였다.

이 분획에 사용된 수지는 "XT-1016"(Na형, 중합도 4%, 강산성 양이온 교환수지, 일본국의 東京 유기 화학 공업 주식회사 판매)이었다. 사용시에는 이것을 먼저 물에 현탁한 다음, 직경 3㎝, 길이 1m인 자켓부 스테인레스 스틸제 칼럼 두개에 충전하여 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이가 약 2m되게 하였다. 분획 방법은 다음과 같이 하였다. 즉, 칼럼의 내부온도를 40℃로 유지하면서 칼럼에다 수지에 대해 5v/v%의 양으로 당용액을 가한 다음 40℃의 물을 SV(공간속도) 0.15로 하여 가함으로써 이 용액을 분획하여 프룩토실트레할로오스 고함유 획분을 채취하였다. 이들 획분을 모아 탈염한 다음 정제하고 농축하여 약 40% 농도의 용액을 얻었다. 이 농축액을 "YMC-PACK ODS" 충전칼럼(일본국의 YMC사 판매의 옥타데실실리카 겔 칼럼)에 가하여 프룩토실트레할로오스 고함유 획분을 채취하였다. 이들 과정을 반복하여 얻은 용액을 모아 탈염하고 정제하여 농축한 다음 농축액을 진공 건조하여 고형분당 프룩토실트레할로오스 고함유 분말을 약 10%의 수율로 얻었다. 이 분말의 고형분당 프룩토실트레할로오스 함유량은 약 98% 이었다.

이 분말을 사용하여 부분 메틸헥시톨아세테이트에 대해 효소적 방법과 GLC 분석법으로 부분 프룩토실트레할로오스의 구조를 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 작용에 의해 생성된 프룩토실트레할로오스가 전화 효소 처리에 의해 분해되어 프룩토오스와 트레할로오스를 1 : 1의 몰비로 생성하였음이 확인되었다. 프룩토실트레할로오스를 메틸화하고, 메틸화된 생성물을 산으로 가수분해하여, 가수분해 생성물을 환원한 다음, 환원 생성물을 아세틸화하여 제조한 부분 메틸헥시톨아세테이트에 대한 GLC 분석결과, 1,5,6-트리-0-아세틸-2,3,4-트리-0-메틸글루시톨 및 1,5-디-0-아세틸-2,3,4,6-테트라-0-메틸글루시톨이 등몰비(equimolar ratio)로 검출되었다. 이들 결과로 부터 프룩토실트레할로오스는 트레할로오스가 β -2,6 결합에 의해 프룩토실 잔기에 결합한 3당인 것임이 확인 되었다.

(실험 8 : 급성독성 시험)

7주령의 dd계 마우스를 사용하여 아래에 나오는 실시예 A-4의 방법으로 제조한 락토수크로오스 고함유 분말을 경구 투여하여 급성독성 시험을 하였다. 15g/마우스㎏의 투여량 까지에서는 마우스의 사망이 없었고, 그 이상의 투여량 시험은 불가능하였다. 따라서 락토수크로오스의 독성은 비교적 낮다. 위와 마찬가지로 아래에 나오는 실시예 A-6의 방법으로 제조한 에를로오스 고함유 분말, 아래에 나오는 실시예 A-8의 방법으로 제조한 크실로실프룩토시드 고함유 시럽, 실시예 A-11의 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스 고함유 시럽 또는 아래에 나오는 실시예 A-12의 방법으로 제조한 이소말토실프룩토시드 고함유 시럽을 7주령 되는 dd계 마우스에게 경구 투여하여 급성독성 시험을 한 결과, 15g/마우스kg의 투여량 까지에서는 마우스의 사망이 없었고, 그 이상의 투여량 시험은 불가능하였다. 이들 결과로 부터 이들 당은 그 독성이 비교적 낮음을 알 수 있다.

아래에 나오는 실시예 A 및 B는 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제 및 프룩토실 전이 당을 함유한 당조성물의 제조방법을 설명하는 것이다.

(실시예 A-1)

바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)의 종배양물을 영양배지에 접종하고 30리터 용량의 발효기 및 배지로서 2w/v% 수크로오스 함유 영양배지 약 20리터를 사용한 것 외에는 실험 1과 마찬가지로 하여 통기교반 조건하에서 약 24시간 배양하였다. 배양 상청액중의 β -프룩토푸라노시다아제 활성은 7.3단위/ml이었다. 이 배양물을 MF 멤브레인으로 여과하고, 여액을 UF 멤브레인으로 농축하여 배양물의 전체 효소활성에 대해 약 130단위/ml의 활성을 가진 β -프룩토푸라노시다아제를 약 80%의 수율로 얻었다.

(실시예 A-2)

수크로오스와 락토오스를 각각 20%의 양으로 함유한 수용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 1단위 혼합하고 55℃에서 16시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.

이 시럽은 고형분 기준으로 락토수크로오스를 약 37% 함유하며 상쾌한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약에 있어서 감미제, 맛 개선제, 증량제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-3)

수크로오스 22%와 락토오스 18%을 함유한 수용액의 pH를 6.0으로 조정하고, 여기에 내용물에 대해 고형분 기준으로 실시예 A-1의 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 1단위와 전화효소 결손 효모 5%을 혼합한후, 1N 수산화 나트륨을 첨가하여 이 혼합물의 pH를 6∼7로 유지하면서 35℃에서 20시간 효소반응시켰다. 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한 다음, 통상의 방법으로 활성탄에 의항 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 70%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 락토수크로오스를 약 65% 함유하며 상쾌한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-4)

실시예 A-2의 방법으로 제조한 락토수크로오스를 약 37% 함유한 원료 당액으로서의 용액을 약 45% 농도의 용액으로 농축하고, 락토수크로오스 함유량을 증대시키기 위해 이 농축액을 "XT-1016"(Na형, 중합도 4%, 강산성 양이온 교환수지, 일본국의 東京 유기 화학 공업 주식회사 판매)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다. 그 방법은 다음과 같다. 즉, 수지를 내경 5.4㎝의 자켓부 스테인레스 스틸제 칼럼 4개에 충전하고 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이가 20m되게 하였다. 칼럼 내부 온도를 40℃로 유지하면서 이 칼럼에 상기 농축액을 5v/v% 가하고, 이 칼럼에 40℃의 물을 SV 0.2로 가하여 락토수크로오스 고함유 획분을 얻었다. 이들 획분을 모아 정제하고 농축하여 진공건조한후 분쇄하여 락토수크로오스 고함유 분말을 고형분 기준으로 약 30%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 락토수크로오스를 약 90％ 함유하며, 환원성과 충치 유발성이 비교적 낮고 상쾌한 맛과 감미 및 양호한 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 증량제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-5)

수크로오스와 말토오스를 각각 20%의 양으로 함유한 당용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 1단위 혼합하고 50℃에서 24시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고, 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 에를오스를 약 28% 함유하며 양호한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-6)

실시예 A-5의 방법으로 제조한 에를로오스를 약 28% 함유한 원료 당액으로서의 용액을 약 45% 농도의 용액으로 농축하고, 에를로오스 함유량을 증대시키기 위해, "DOWEX 50WX4"(Ca형) (미합중국의 Dow Chemical사 판매의 이온 교환수지)을 사용한 것 외에는 실시예 A-4의 방법에 따라 상기 농축액을 칼럼 크로마토그래피 처리를 한 다음, 에를로오스 고함유 획분을 얻었다. 이들 획분을 모아 정제하고 농축하여 진공건조한후 분쇄하여 에를로오스 고함유 분말을 고형분 기준으로 약 25%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 에를로오스를 약 84% 함유하며, 환원성과 충치 유발성이 비교적 낮고 상쾌한 맛과 감미 및 양호한 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-7)

수크로오스 30%와 크실로오스 15%을 함유한 당용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 0.5단위 혼합하고 50℃에서 40시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고, 더욱 정제하여 농도 약 75％의 시럽을 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 크실로실프룩토시드를 약 35% 함유하며 양호한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지며 충치 유발성이 비교적 낮으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-8)

수크로오스 30%와 크실로오스 15%을 함유한 당용액을 pH 6.0으로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 0.5단위 혼합하고 50℃에서 40시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물에 수산화 나트륨을 가해 pH를 10 이상으로 유지하면서 100℃에서 가열하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고, 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 55%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 크실로실프룩토시드를 약 60% 함유하며 양호한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-9)

수크로오스와 트레할로오스를 각각 20%의 양으로 함유한 당용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 A-l의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 4단위 혼합하고 55℃에서 16시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고, 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 프룩토실트레할로오스를 약 24% 함유하며 상쾌한 맛과 감미, 적당한 점도와 보습성 및 비교적 낮은 충치 유발성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-10)

수크로오스와 트레할로오스를 각각 20%의 양으로 함유한 당용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 고형분 기준으로 내용물에 대하여 전화효소 결손 효모를 습중량으로 5%와 실시예 A-1의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 4단위 혼합하고, 1N 수산화 나트륨을 가하여 pH 6∼7로 유지하면서 35℃에서 20시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고, 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 70%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 프룩토실트레할로오스를 약 34% 함유하며 양호한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-11)

실시예 A-9의 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스를 약 24% 함유한 원료 당액으로서의 수용액을 약 45% 농도의 용액으로 농축하고, 프룩토실트레할로오스 함유량을 증대시키기 위해, "DOWEX 50WX4"(Ca형)을 분획용 수지로 사용한 것 외에는 실시예 A-4의 방법에 따라 상기 농축액을 칼럼 크로마토그래피 처리를 한 다음, 프룩토실트레할로오스 고함유 획분을 얻었다. 이들 획분을 모아 정제하고 농축하여 진공건조한후 분쇄하여 프룩토실트레할로오스 고함유 분말을 고형분 기준으로 약 20%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 프룩토실트레할로오스를 약 80% 함유하며, 상쾌한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 증량제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 A-12)

수크로오스 30%와 이소말토오스 15%을 함유한 당용액을 pH 5.5로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 β -프룩토푸라노시다아제를 수크로오스 1g당 0.5단위 혼합하고 50℃에서 40시간 효소반응시킨 다음, 이 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염으로 정제하고, 농축하여 농도 약 75%의 시럽을 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형분 기준으로 이소말토실프룩토시드를 약 25% 함유하며 양호한 맛과 감미 및 적당한 점도와 보습성을 가지며 충치 유발성이 비교적 낮으므로 식품, 화장품 및 의약 등의 각 조성물에 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 비피드균 생육 촉진제 및 미네랄 흡수촉진제로서 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-1 : 혼합 감미제)

실시예 A-4의 방법으로 제조한 락토수크로오스 고함유 분말 1중량부에 "α -G SWEET"(일본국의 東洋精糖 주식회사 판매의 α -글리코실스테비오시드) 0.05중량부를 균일히 혼합하여 감미제 분말을 얻었다. 이 제품은 고품질의 감미도를 가지며 수크로오스보다 약 2.5배 정도 높은 감미력을 가지고 있다. 이 제품은 비피드균에 대해 양호한 생육촉진 작용을 발휘하며 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진 및 고암모니아혈증과 간성 뇌질환의 치료 및/또는 예방에 선택적으로 사용할 수 있다. 또한 이 제품은 가축과 가금의 감염성 질환의 예방, 설사 예방, 식욕증진, 성장촉진 및 분변 냄새 억제 등에도 사용할 수 있다.

(실시예 B-2 : 하아드 캔디)

실시예 A-12의 방법으로 제조한 이소말토실프룩토시드를 함유한 시럽 30중량부를 환원 맥아당 물엿(수분 함유량 25%) 80중량부에 용해하고, 이 용액을 진공농축하여 수분 함유량 2% 이하로 하였다. 이 농축액에 시트르산 1중량부와 적당량의 레몬 향료 및 색소를 혼합하여 종래 방법으로 성형하여 하아드 캔디를 제조하였다.

이 제품은 고품질의 감미와 난(難)충치 유발성을 가지고 있다. 이 제품은 비피드균 생육촉진 작용과 미네랄 흡수촉진 작용을 나타내므로 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진 및 각종 질환의 치료 및/또는 예방에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-3 : 츄잉 검)

검 베이스 2중량부를 가열하여 연화하고, 여기에 실시예 A-4의 방법으로 제조한 락토수크로오스 고함유 분말 4중량부, 글루코오스 3중량부 및 적당량의 박하향료와 색소를 혼합한 다음, 종래 방법으로 로울에서 반죽하고 성형하여 츄잉 검을 제조하였다.

이 제품은 양호한 텍스쳐와 감미를 가지며 비피드균 생육촉진 작용을 나타내므로 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진 및 각종 질환의 치료 및/또는 예방에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-4 : 초콜렛)

카카오 페이스트 40중량부, 카카오 버터 10중량부, 실시예 A-6의 방법으로 제조한 에를로오스 고함유 분말 15중량부, 수크로오스 10중량부 및 분유 15중량부를 혼합한 다음 리파이너를 통과시켰다. 입자크기를 작게한 후 이 혼합물을 콘체(conche)에 넣고 레시틴 0.5중량부를 혼합한 다음 50℃에서 2일 동안 반죽하였다. 반죽된 혼합물을 성형기에 부어 넣고 성형하여 고화하였다.

이 제품은 실질적으로 패트 블루움(fat bloom)과 슈거 블루움(sugar bloom) 현상이 없어 맛이 양호하고 혀에 잘 녹는 성질이 있다.

(실시예 B-5 : 우유 음료)

커피 추출물 70중량부, 우유 100중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 락토수크로오스 고함유 시럽 24중량부 및 적당량의 커피 향료와 색소를 균질하게 혼합하여 종래의 방법으로 멸균하고 냉각한후 주입, 포장하여 우유 음료를 제조하였다.

이 제품은 상쾌한 향기와 맛을 가진 커피 혼합 우유이다. 이 제품은 비피드균 생육촉진 작용과 미네랄 흡수촉진 작용을 나타내므로 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-6 : 커스타드 크리임)

옥수수 전분 500중량부, "SUNMALT"(일본국의 林原상사 판매의 말토오스 제품) 400중량부 및 식염 5중량부를 체(sieve)를 통과시켜 충분히 혼합하고, 이 혼합물에 날계란 1,400중량부와 실시예 A-10 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스 고함유 시럽 600중량부를 교반,혼합한 후, 다시 여기에 끓는 우유 5,000중량부를 서서히 혼합하였다. 수득한 혼합물을 교반하면서 서서히 가열하고, 내용물이 모두 완전히 호화(糊化)하여 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각한 후 적당량의 바닐라향을 혼합하여 커스타드 크리임을 제조하였다.

이 제품은 평활한 표면과 적당한 감미가 있는 상쾌한 맛을 가지고 있다. 이 제품은 비피드균 생육촉진 작용을 나타내므로 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-7 : 옥수수 포타아즈 수우프(potase soup) 프리믹스)

예비 호화된 옥수수 분말 30중량부, 예비 호화된 전분 5중량부, 예비 호화된 감자 전분 4중량부, 예비 호화된 찰옥수수 전분 12중량부, 실시예 A-11의 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스 고함유 분말 8중량부, 글루탐산 나트륨 5중량부, 식염 8.5중량부, 탈지 분유 7중량부 및 양파 분말 0.5중량부를 충분히 혼합분쇄하고, 이 혼합물에 소르비탄 지방산 에스테르 0.5중량부와 식물성 경화유 9중량부의 가열용융 혼합물을 가하여 혼합한후, 여기에 락토오스 10중량부를 혼합하였다. 수득한 혼합물을 유동층 조립기(granulator)에 넣고 소량의 물을 분무하여 조립한후 70℃의 온풍으로 건조한 다음 체질(sieving)하여 소요의 제품을 얻었다.

이 제품은 뜨거운 물에 쉽사리 용해, 분산하여 맛있는 수우프로 된다. 이 제품은 비피드균 생육촉진 작용과 미네랄 흡수촉진 작용을 나타내므로 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-8 : 밀키 로우션)

폴리옥시 에틸렌 베헤닐 에테르 0.5중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올레에이트 1중량부, 유용성 글리세릴 모노스테아레이트 1중량부, 베헤닐 알코올 0.5중량부, 아보카도 오일 1중량부. 실시예 A-5의 방법으로 제조한 에를로오스 시럽 3.5중량부, 알파-글리코실 루틴 1중량부 및 적당량의 비타민 E와 방부제를 통상의 방법으로 가열용해하고, 여기에 1,3-부틸렌글리콜 5중량부, 카르복시비닐 중합체 0.1중량부 및 정제수 85.3중량부를 가하여 이 혼합물을 호모지나이저(homogenizer)에서 에멀젼화하여 밀키 로우션을 제조하였다.

이 제품은 양호한 보습성이 있는 밀크 로우션이어서 일광 차단제 및 피부 색백제로서 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 B-9 : 스킨 크리임)

폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 2중량부, 자기 유화형 글리세릴 모노스테아레이트 5중량부, α -글리코실 루틴 2중량부, 유동 와셀린 1중량부, 글리세릴 트리-2-에틸헥사노에이트 10중량부, 실시예 A-9의 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스를 함유한 시럽 4중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법에 따라 가열용해하였다. 이 용액에 1,3-부틸렌 글리콜 5중량부 및 정제수 66중량부를 가하여 얻은 혼합물을 오모지나이저로 에멀젼화하고, 향료를 적당량 가하여 교반 혼합하여 화장 크리임을 제조하였다.

이 제품은 퍼짐성이 충분하여 고품질의 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

(실시예 B-10 : 치약)

제2인산 칼슘 45중량부, 소디움 라우릴 술페이트 1.5중량부, 글리세린 25중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 0.5중량부, 실시에 A-8의 방법으로 제조한 크실로실프룩토시드 15중량부, 사카린 0.02중량부 및 방부제 0.05중량부를 물 13중량부와 혼합하여 치약을 제조하였다. 이 제품은 치아에 양호한 광택을 부여하고 세척력이 우수하므로 양호한 치약이다.

(실시예 B-11 : 경관 급식(Intubation Feeding)용 영양제)

실시예 A-6의 방법으로 제조한 에를로오스 고함유 분말 20중량부, 글리신 1.1중량부, 글루탐산 나트륨 1중량부, 락트산 칼슘 0.4중량부, 탄산 마그네슘 0.1중량부, 티아민 0.01중량부 및 리보플라빈 0.01중량부를 혼합하여 영양용 조성물을 제조하였다. 이 영양용 조성물중 24g씩을 소형 라미네미트 알루미늄제 백(bag)에 주입하여 가열 밀봉함으로써 소요의 제품을 제조하였다. 이 제품의 백(bag) 하나를 물 300∼500ml에 용해하여 영양용 액체로 한 후 비강(nasal cavity) 및 위에다 경관 급식법으로 투여한다. 이 제품은 사람 및 가축에 대해 비경구용 영양용 액체로 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 B-12 : 경관 급식용 영양제)

실시예 A-4의 방법으로 제조한 락토수크로오스 고함유 분말 580중량부, 건조 난황 190중량부, 탈지 분유 209중량부, 식염 4.4중량부, 염화 칼륨 1.85중량부, 황산 마그네슘 4중량부, 티아민 0.01중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6중량부 및 니코틴아미드 0.04중량부를 혼합하여 영양용 조성물을 제조하여, 소형 라미네이트 알루미늄제 백(bag)에 25g씩 넣고 가열 밀봉하여 경관 급식용 고형 영양제를 제조하였다. 이 제품은 보존기간이 비교적 길고 용해성과 분산성이 충분하다. 사용시에 이 백(bag) 하나를 물 약 150∼300ml에 용해하여 영양용 액체로 한 후 비강, 위 또는 장에 투여한다.

이 제품은 비피드균 생육촉진 작용과 미네랄 흡수촉진 작용을 나타내므로 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진 및 각종 질환의 치료 및/또는 예방에 임의로 사용할 수 있다. 더욱이 이 제품은 가축과 가금의 성장을 촉진하고 병중 및 병후의 건강회복을 촉진하는데 유리하게 사용할 수 있다.

(실시예 B-13 : 정제(tablet))

실시에 A-11의 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스 고함유 분말 40중량부, 말토오스 10중량부, 제3인산 칼슘 1중량부, 당 에스테르 1중량부 및 적당량의 향료 분말을 균일하게 혼합하고, 이 혼합물을 타정기에서 타정하여 한 개의 중량이 350㎎인 정제를 제조하였다. 이 제품은 삼키기가 쉽고 균열이 없는 안정한 정제이다. 성인 하루에 약 1∼40정, 바람직하게는 약 2∼20정을 투여하면 비피드균 생육촉진 작용이 양호하고 미네랄 흡수촉진 작용이 효과적이다. 따라서 이 제품은 건강과 미용의 유지촉진, 노인병 예방, 병중 및 병후의 건강회복 촉진 및 각종 질환의 치료 및/또는 예방에 임의로 사용할 수 있다.

(실시예 B-14 : 인터페론 정제(錠劑))

천연형 인간 인터페론-α 제제(일본국의 주식회사 林原 생물 화학 연구소 제조, 일본국의 Cosmo Bio사 판매)를 종래의 방법으로 고정 항인간 인터페론-α 항체 칼럼에 가하여 인터페론-α 를 흡착시켰다. 소 혈청 알부민을 안정제로서 함유한 완충액을 이 칼럼에 가한 다음 이 칼럼으로 부터 과잉량의 알부민을 제거하였다. 이어서 실시예 A-4의 방법으로 제조한 락토수크로오스 고함유 분말 5%을 함유한 생리 식염수를 사용하여 칼럼으로 부터 인터페론-α 를 용리하였다. 용리액을 멤브레인으로 여과하고, 여액을 약 20배 체적의 "FINETOSE"(일본국의 주식회사 林原商事 판매의 무수 결정질 말토오스 분말)를 가하여 탈수한 다음 탈수물을 분쇄하고, 수득한 분말을 타정기에서 타정하여 250㎎ 정제 하나당 천연형 인간 인터페론-α 를 약 150단위 함유한 정제를 제조하였다.

이 제품을 설하정(sublingual tablet)으로 하여 성인 하루에 1∼10개의 투여량으로 환자에게 경구투여할 수 있고, 바이러스성 질환, 알레르기, 류마티즘, 당뇨병 및 악성종양 치료에 유리하게 사용할 수 있다. 특히 이 제품을 그 환자수가 현저하게 증가하고 있는 AIDS, 간염 등의 치료제로 적절히 사용할 수 있다. 이 제품에 함유된 락토수크로오스와 말토오스는 천연형 인간 인터페론-α 를 안정화하므로 주위온도에서 보관하더라도 그 보관기간이 비교적 길다.

(실시예 B-15 : 배합 사료)

밀기울 분말 40중량부, 탈지 분유 38중량부, 실시예 A-11의 방법으로 제조한 프룩토실트레할로오스 고함유 분말 12중량부, 비타민제 10중량부, 어분 5중량부, 제2인산 칼슘 5중량부, 액상 유지 3중량부, 탄산 칼슘 3중량부, 식염 2중량부 및 미네랄제 2중량부를 혼합하여 배합 사료를 제조하였다.

이 제품은 가축 및 가금, 특히 어린 돼지 새끼에 대한 기호성이 개선된 맛을 가진 것이다. 이 제품은 양호한 비피드균 생육성장촉진 작용과 효과적인 미네랄 흡수촉진 작용이 있기 때문에 동물의 감염성 질환 예방, 설사 예방, 식욕증진, 비육(肥肉)촉진 및 불쾌한 분변냄새 방지 등에 유리하게 사용할 수 있다. 필요한 경우, 이 제품에 곡류, 밀가루, 전분, 깻묵 가루, 왕겨, 밀기울을 비롯한 농후원료 등의 기타 사료재료와 볏짚, 밀짚, 건초, 버개스 및 옥수수 속대 등의 사료원료 등을 혼합하여 사용할 수도 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 프룩토실 전이 활성이 비교적 높고 공업적 규모로 이용할 수 있는 신규의 박테리아성 β -프룩토푸라노시다아제, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 이 β -프룩토푸라노시다아제는 수크로오스를 공여체로 이용하여 환원성 및 비환원성 당류를 생성한다. 생성된 프룩토실 전이 당류는 상쾌한 맛과 감미, 삼투압 조절성, 보습성, 광택 부여성, 결정화 방지성, 열화 방지성, 난(難)충치 유발성, 비피드균 생육성장 촉진성 및 미네랄 흡수 촉진성 등의 성질을 가지고 있다. 이러한 성질로 인하여 이들 당류는 식품, 화장품 및 의약에 선택적으로 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 식품, 화장품 및 의약 공업에 크게 기여하게 된다.

제1도는 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프.

제2도는 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 그래프.

제3도는 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 pH 안정성을 나타내는 그래프.

제4도는 본 발명의 β -프룩토푸라노시다아제의 열적 안정성을 나타내는 그래프.

Claims

아래의 성질을 가진, 바실루스(Bacillus) sp. V230 (FERM BP-5054)로 부터 수득되는, 분리된 β-프룩토푸라노시다아제;

(1) 작용

수크로오스, 라피노오스 및 에를로오스의 β-프룩토푸라노시드 결합을 가수분해하여 프룩토오스를 유리함; β-프룩토푸라노시드 결합을 가진 이들 당을 공여체로 하여 이들 당으로 부터 β-프룩토푸라노실 잔기를 기타의 당류, 당알코올류 및 알코올류에서 선택되는 수용체에다 전이시키는 작용을 촉진함;

(2) 분자량 : 소디움 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서 49,000 ± 5,000 달톤;

(3) 등전점 (pI)

양성(兩性) 전해질(ampholyte)을 사용하는 등전점 전기영동에서 4.6 ± 0.5;

(4) 최적 pH

40℃에서 10분간 유지할 경우 5.5 ~ 6.0;

(5) 최적온도

pH 6.0에서 10분간 유지할 경우, 칼슘이온 부재시에는 45℃, 칼슘 이온 존재시에는 50℃;

(6) pH 안정성

4℃에서 24시간 유지할 경우 5.0 ~ 8.0;

(7) 열적 안정성

pH 6.0에서 1시간 유지할 경우 45℃까지 안정함;
제1항의 β-프룩토푸라노시다아제를 생산하는 바실루스 sp. V230(FERM BP-5054).
β-프룩토푸라노시다아제를 생산하는 미생물을 영양배지에서 배양하고, 생산된 β-프룩토푸라노시다아제를 배양물로 부터 채취하는 단계를 포함하는 제1항의 β-프룩토푸라노시다아제의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 미생물이 바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)인 제조방법.
제3항에 있어서, 배양단계를 pH 5 ~ 8 및 온도 15 ~45℃에서 5 ~ 100시간 동안 실시하는 제조방법.
제3항에 있어서, 배양단계를 호기성 조건하에서 실시하는 제조방법.
(가) β-프룩토푸라노시드 결합을 가진 당을 공여체로 함유하고 기타의 당류, 당 알코올류 및 알코올류로 된 군으로 부터 선택되는 1종을 수용체로 함유하는 용액에 제1항의 β-프룩토푸라노시다아제를 작용시켜 프룩토실 전이 당을 생산하고,

(나) 생산된 프룩토실 전이 당을 채취하는 단계를 포함하는 프룩토실 전이 당의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 공여체는 수크로오스, 라피노오스, 에를로오스 및 이들의 혼합물로 된 군으로 부터 선택되는 1종이고, 상기 기타의 당은 단당류, 이당류 및 올리고당류로 된 군으로 부터 선택되는 1종인 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 β-프룩토푸라노시다아제가 바실루스 sp. V230 (FERM BP-5054)로부터 유래하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 프룩토실 전이 당이 크실로실프룩토시드, 에를로오스, 이소말토실프룩토시드, 락토수크로오스, 프룩토실트레할로오스, 갈락토실프룩토시드 및 이들의 혼합물로 된 군으로 부터 선택되는 1종인 제조방법.
제7항에 있어서, 채취단계 (나)가 프룩토실 전이 당 함유량을 증대시키는 칼럼 크로마토그래피, 효모를 사용하는 발효법 및 알칼리 처리로 된 군으로 부터 선택되는 한가지 이상의 방법인 제조방법.
제7항에 있어서, (가) 단계를 0℃ ~ 60℃의 온도 및 pH 3.5 ~ 8.0에서 실시하는 제조방법.
제7항에 있어서, (가) 단계에서의 상기 공여체와 상기 수용체의 농도가 고형분 기준으로 10w/w% 이상 50w/w% 이하인 제조방법.
제7항, 내지 제13항 중의 어느 한 항에 기재된 제조방법에 의해 제조되는 프룩토실 전이당을 식품재료에 배합하는 단계를 포함하는 식품의 제조방법.