CN102676474B

CN102676474B - 一种提取梨果实蔗糖转化酶及其活性测定方法

Info

Publication number: CN102676474B
Application number: CN 201210178966
Authority: CN
Inventors: 吴俊�; 杨志军; 张绍铃; 齐开杰; 陶书田; 吴巨友
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2032-06-01
Also published as: CN102676474A

Abstract

本发明属于植物生理学领域，涉及一种提取梨果实蔗糖转化酶及其活性测定方法。本发明通过在蔗糖转化酶提取过程中增加盐析和透析步骤，常能够将初提取酶液中的糖分和离子等小分子物质除去，从而更能够精确地测定果实中转化酶的活性，为揭示果实内糖分的积累差异提供生理基础，进一步为果实甜度风味品质的改良提供理论依据。

Description

一种提取梨果实蔗糖转化酶及其活性测定方法

技术领域

本发明属于植物生理学领域，涉及一种提取梨果实蔗糖转化酶及其活性测定方法。

背景技术

梨果实中糖的种类和含量是果实品质的重要决定因素之一，直接影响着果实的风味口感、营养价值、色泽等。梨果实中糖分主要有蔗糖，葡萄糖，果糖，山梨醇等，其中，蔗糖是影响梨果实风味品质的重要成分，其在不同品种中的变异系数大。因此，蔗糖组分的比例对梨果实的风味品质形成起到重要的作用。

果实中糖分的积累跟果实中糖代谢酶有着密切的关系，尤其是蔗糖代谢酶中的酸性转化酶和中性转化酶。转化酶参与光合作用的调节，保持蔗糖和库组织之间蔗糖浓度梯度，对光合产物的运输有着重要的影响。同时液胞中可溶性酸性转化酶在成熟的库器官蔗糖积累中起着重要的作用。另一方面，转化酶在信号转导中也有着非常关键的作用，在许多果实的生长发育过程中，蔗糖的积累以转化酶活性下降为前提。因此，准确测定转化酶的活性对于进一步了解糖分的积累特征有着重要作用，同时也是联系生理品质和分子水平的重要桥梁。

目前，国内外有不少测定梨果实中转化酶活性的方法，但是，由于处理方法的不科学性，应用范围的局限性，造成转化酶活性的测定不准确或低效，已经发表的方法甚至无法测定出相应酶的活性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提取梨果实蔗糖转化酶的方法。

本发明的另一目的是提供一种梨果实蔗糖转化酶活性的测定方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，准确称取梨果肉，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入提取缓冲液，充分匀浆后，0～4℃条件下180000～20000g离心30～40min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，静置20～30min后，0～4℃条件下180000～20000g离心20～30min，去除上清液，加入脱盐缓冲液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脱盐得蔗糖转化酶，所述的提取缓冲液配方为200mmol·L^-1的磷酸钾缓冲液，5mmol·L^-1MgCl₂，0.1%β巯基乙醇，0.05%Triton-X 100，0.05%BSA，2%PVPP，pH 7.5；提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是3～10ml：1g；所述的脱盐缓冲液的配方为20mmol·L^-1磷酸钾缓冲液，0.25mmol·L^-1MgCl₂，0.01%β-巯基乙醇，0.05%BSA，pH 7.5；脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液为稀释10倍的不含PVPP的提取缓冲液。

所述的梨果实中蔗糖转化酶的整个提取过程在0～4℃的条件下进行。

所述的提取缓冲液与梨果肉的体积质量比优选5ml：1g。

所述的脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比优选3ml：1g。

所述的透析时间优选6～10小时，进一步优选8小时。

一种测定梨果实中蔗糖酸性转化酶活性的方法，包括如下步骤：

（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖转化酶；

（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在490μL的反应液中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却至室温，在波长540nm下测定OD₅₄₀值，对照为通过沸水浴失活的酶液，再通过标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为80mmol·L^-1醋酸-磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH4.5。

一种测定梨果实中蔗糖中性转化酶活性的方法，包括如下步骤：

（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖转化酶；

（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在490μL的反应液中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却至室温，在波长540nm下测定OD₅₄₀值，对照为通过沸水浴失活酶液；再通过标准曲线可计算相应酶的活性；获得所述的反应液配方为80mmol·L^-1醋酸-磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH7.5。

转化酶活性测定原理：根据转化酶能够将果实中的蔗糖转化成葡萄糖和果糖的特性，通过测定其转化量的多少可反应酶活性的高低。酶提取液能够将反应液中的蔗糖转化成葡萄糖和果糖，再与DNS显色反应，通过分光光度计测定的OD₅₄₀值，即可反映转化糖的含量。OD值越高，表示转化成果糖和葡萄糖的含量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次测酶之前，必须制定相应的标准曲线，根据标准曲线回归方程，将OD值代入公式可以算出转化成的果糖和葡萄糖含量，从而反应酶活性的高低。当OD值为负值时，不能用于计算相应酶的活性。

有益效果：

本发明针对现有技术测定梨果实中转化酶活性是因处理方法不当造成转化酶活性的测定不准确或低效的问题，提供了一种有效的梨果实中蔗糖转化酶提取方法，在初提取酶液中逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，能够有效地将酶蛋白充分的盐析出来，减少初提取液中所含的糖分对测定结果的影响；再对初酶液进行充分地透析，能够有效地将酶液中的离子等小分子物质过滤掉，从而较少对酶活性的影响，有利于酶活性测定结果的准确性。以此梨果实中蔗糖转化酶为基础，能够更加准确、有效地测定转化酶的活性，对深入糖风味形成的生理机制，改善果实品质有着重要的意义。

具体实施方式

实施例1

（一）实验方法

1、供试材料为鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd‘yali’）。

2、样品采集：采取鸭梨花后60天时的果实，采样时按照树冠的上，东，南，西，北的5个方向随机选取无病害的果实5个，置于冰盒中，带回实验室处理。

3、样品的处理：将采集的果实清洗干净，去皮去核，将果肉混匀后四分法取样，在液氮中速冻后，置于-70℃冰箱中，用于蔗糖转化酶活性的测定。

4、转化酶的提取：

酶液的提取均在0～4℃的条件下进行。准确称取梨果肉1g，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入5mL提取缓冲液（200mmol·L^-1的磷酸钾缓冲液，5mmol·L^-1MgCl₂，0.1%β-巯基乙醇，0.05%Triton-X 100，0.05%BSA，2%PVPP,pH 7.5），充分匀浆，4℃条件下20000g离心30min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，静置30min后，4℃条件下20000g离心20min，去除上清液，加入3mL脱盐缓冲液（20mmol·L^-1磷酸钾缓冲液，0.25mmol·L^-1MgCl₂，0.01%β-巯基乙醇，0.05%BSA，pH 7.5）重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋脱盐，透析液为稀释10倍的提取液（不含PVPP），脱盐后的酶液用于酶活性分析。

5、转化酶的测定：

a)酸性转化酶（AI）活性的测定：在490μL的反应液（80mmol·L^-1醋酸磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH4.5）中加入210μL的脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，准确沸水浴5min，冷却后测定OD₅₄₀值，对照为杀死的酶液（沸水浴使酶液失活）。

b）中性转化酶（NI）活性的测定：在490μL的反应液（80mmol·L^-1醋酸-磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH7.5）中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，准确沸水浴5min，冷却后测定OD₅₄₀值，对照为杀死的酶液（沸水浴使酶液失活）。

（二）结果分析

表1中经过盐析和透析方法提取的AI和NI酶液测定的OD值，分别为0.08和0.026，说明在经过盐析和透析的情况下，酶液得到纯化，酶活性比较高，测定结果较好。表1中不经过盐析的酶液AI和NI酶活性的OD值，分别是-0.037和-0.01，由于测定样品为花后60天的果实，转化酶的活性是比较高的，能够将蔗糖转化成果糖和葡萄糖，测定结果不应该出现负值，这说明在粗提取的酶液没有经过盐析时，果实中本身所含有的糖在测定时与DNS发生了反应，导致结果呈现负值。表1中不经过透析的酶液AI和NI酶活性的OD值，AI酶活性的OD值是负值，说明在没有经过透析的情况下，果实中所含有的一些小分子物质，离子等对OD值的测定也有很大的影响，而NI酶活性的OD值只有0.002，对照和实验组之间的颜色差异几乎相同，这可能是由于分光光度计在比色时所形成的误差。

表1AI和NI粗酶液经过不同处理后测定的OD值

标准曲线的制定：

1）将分析纯的果糖和葡萄糖在80℃下烘至恒重，精确称取果糖和葡萄糖各0.5g，加水溶解，定容到100mL，形成果糖和葡萄糖的标准液。

2）取7支具有25mL刻度的试管，编号，按照表2所示的量精确加入溶液。

表2制作标准曲线的试剂量

3）将各试管摇匀，在沸水浴中加热5min，冷却至室温，在540nm的波长下测定OD₅₄₀值。以吸光度为纵坐标，果糖和葡萄糖总毫克数为横坐标，求得回归方程(y=1.52x-0.094)。

酶活性的计算：

酶活性（μmol·h^-1·g^-1FW）=[根据标准曲线算出果糖和葡萄糖总含量（mg）/180.17(摩尔质量)×脱盐缓冲液的体积（mL）×酶提取液的总体积(mL)]/[样品鲜重（g）×反应时所加的酶液体积(mL)×第一次离心所取上清液的体积(mL)×反应时间（hr）]×1000

根据以上公式计算出相应的酶活性表3。

以实例1中测定AI酶的OD₅₄₀为0.08，NI酶的OD₅₄₀为0.026，其相应的酶活性计算如下：

AI酶活性=(0.08+0.094)÷1.52÷180.17×3×5/[1×0.21×3.5×0.5]×1000=25.933（μmol·h^-1·g^-1FW）；

NI酶活性=(0.026+0.094)÷1.52÷180.17×3×5/[1×0.21×3.5×0.5]×1000=17.885（μmol·h^-1·g^-1FW）。

Claims

1.一种提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，其特征在于准确称取梨果肉，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入提取缓冲液，充分匀浆后，0～4℃条件下180000～20000g离心30～40min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，静置20～30min后，0～4℃条件下180000～20000g离心20～30min，去除上清液，加入脱盐缓冲液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脱盐得蔗糖转化酶，所述的提取缓冲液配方为200mmol·L^-1的磷酸钾缓冲液，5mmol·L^-1MgCl₂，0.1%β‐巯基乙醇，0.05%Triton‐X100，0.05%BSA，2%PVPP，pH7.5；提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是3～10ml：1g；所述的脱盐缓冲液的配方为20mmol·L^-1磷酸钾缓冲液，0.25mmol·L^-1MgCl₂，0.01%β‐巯基乙醇，0.05%BSA，pH7.5；脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液为稀释10倍的不含PVPP的提取缓冲液。

2.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，其特征在于所述的梨果实中蔗糖转化酶的整个提取过程在0‐4℃的条件下进行。

3.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，其特征在于所述的提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是5ml：1g。

4.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，其特征在于所述的脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是3ml：1g。

5.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖转化酶的方法，其特征在于所述的透析时间为6～10小时。

6.一种测定梨果实中蔗糖酸性转化酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）按照权利要求1所述的方法提取梨果实中蔗糖转化酶；

（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在490μL的反应液中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却至室温测定OD₅₄₀值，对照为通过沸水浴失活的酶液；通过标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为80mmol·L^-1醋酸‐磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH4.5。

7.一种测定梨果实中蔗糖中性转化酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）按照权利要求1所述的方法提取梨果实中蔗糖转化酶；

（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在490μL的反应液中加入210μL脱盐后的酶液，37℃反应30min，加入490μL的DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却至室温测定OD₅₄₀值，对照为通过沸水浴失活的酶液；再通过标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为80mmol·L^-1醋酸‐磷酸钾，100mmol·L^-1蔗糖，pH7.5。