CN102747055A - 一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性测定方法 - Google Patents
一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物生理学领域，公开了一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性测定方法。本发明通过在蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶提取过程中增加盐析和透析步骤，常能够将初提取酶液中的糖分和离子等小分子物质除去，从而更能够精确地测定果实中果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的活性，为揭示果实内糖分的积累差异提供生理基础，进一步为果实甜度风味品质的改良提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于植物生理学领域，涉及一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶及其活性测定方法。
背景技术
梨果实中的可溶性糖是直接影响果实品质的关键因素，在果实品质风味的形成中有着重要的作用，因而成为衡量果实品质优劣的重要标准之一。梨果实中糖分主要有蔗糖，葡萄糖，果糖，山梨醇等。果实中糖分的积累跟果实中糖代谢酶有着密切的关系，尤其是蔗糖代谢酶中的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶。在蔗糖积累的库组织中，蔗糖磷酸合成酶对蔗糖的积累有着重要的作用，梨、桃、橙、甜瓜、香蕉等果实中蔗糖磷酸合成酶活性的上升有利于蔗糖的积累；而蔗糖合酶催化蔗糖形成果糖的反应是可逆的，分解方向形成的果糖为果实的形态建构提供物质基础，同时也是呼吸作用的能量来源，蔗糖合酶合成方向的活性能够通过保持蔗糖的浓度，进一步影响果实中糖分的积累。因此，准确测定蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的活性对于准确了解糖分的积累特征有着重要作用，同时有利于了解糖风味形成的生理机制。
目前，国内外有测定梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法报道，但是，由于处理方法的不科学性，应用范围的局限性，造成转化酶活性的测定不准确或低效，按照已经发表的方法步骤甚至无法测定出相应酶的活性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提取梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法。
本发明的另一目的是提供一种梨果实蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的测定方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种提取梨果实中蔗糖合酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）的方法，其特征在于准确称取梨果肉，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入提取缓冲液，充分匀浆后，0～4℃条件下180000～20000g离心30～40min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，静置20～30min后，0～4℃条件下180000～20000g离心20～30min，去除上清液，加入脱盐缓冲液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脱盐得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取缓冲液配方为200mmol·L-1Hepes-NaOH,5mmol·L-1MgCl2,0.1%β-巯基乙醇（体积百分比，下同），0.05%Triton-X 100,0.05%BSA（质量体积百分比，g/100ml,下同），2%PVPP（质量百分比，下同）,1mmol·L-1EDTA,1mmol·L-1EGTA,10mmol·L-1抗坏血酸钠,10mM半胱氨酸-盐酸，2%甘油（体积百分比，下同），pH 7.5；提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是3～10ml：1g；所述的脱盐缓冲液的配方为20mmol·L-1Hepes-NaOH，0.25mmol·L-1MgCl2，1mmol·L-1EDTA,1mmol·L-1EGTA，0.01%β-巯基乙醇，0.05%BSA，0.2%甘油，pH 7.5；脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液为稀释10倍的不含PVPP的提取缓冲液。
所述的梨果实中蔗糖转化酶的整个提取过程在0～4℃的条件下进行。
所述的提取缓冲液与梨果肉的体积质量比优选5ml：1g。
所述的脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比优选3ml：1g。
所述的透析时间优选6～10小时，进一步优选8小时。
一种测定梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步骤：
（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；
（2）蔗糖合酶（分解方向）活性的测定：在490μL的反应液中加入490μL的脱盐后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，30℃反应30min后，加入490μL的DNS,准确沸水浴5min，冷却后至室温，在波长540nm下测定OD540值，对照为不含底物的反应液；通过制定果糖标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为80mmol·L-1Mes缓冲液，5mmol·L-1NaF，100mmol·L-1蔗糖，5mmol·L-1UDP,pH 5.5。
一种测定梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步骤：
（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；
（2）蔗糖酸性转化酶活性的测定：在50μL的反应液中加入50μL的脱盐后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34℃反应1h后加入0.2mL的30%KOH，准确沸水浴10min终止反应，冷却至室温，加入3mL蒽酮（0.15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中），40℃温浴20min，冷却至室温后，在波长620nm下测定OD620值。对照为不含底物的反应液；再通过制定蔗糖标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为0.1mmol·L-1磷酸缓冲液4mmol·L-1UDP-葡萄糖，0.06mmol·L-1果糖，15mmol·L-1MgCl2,pH 8.0。
一种测定梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的方法，包括如下步骤：
（1）按照上述的方法提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；
（2）蔗糖磷酸合成酶活性的测定：在50μL的反应液中加入50μL脱盐后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34℃反应1h后加入0.2mL的30%KOH，准确沸水浴10min终止反应，冷却至室温，加入3mL蒽酮（0.15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中），40℃温浴30min，冷却至室温后，在波长620nm下测定OD620值。对照为不含底物的反应液；再通过制定蔗糖标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为0.1mol·L-1硼酸缓冲液，10mmol·L-1UDP-葡萄糖，5mmol·L-1果糖-6-磷酸，15mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸，15mmol·L-1MgCl2,mmol·L-1EDTA
蔗糖合酶（分解方向）活性测定原理：根据蔗糖合酶（分解方向）能够将果实中的蔗糖转化成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖的特性，通过测定其果糖转化量的多少可反应酶活性的高低。酶提取液能够将反应液中的蔗糖转化成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖，再与DNS显色反应，通过分光光度计测定的OD540值，即可反映转化糖的含量。OD值越高，表示转化量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次测酶之前，必须制定相应的标准曲线，根据标准曲线回归方程，将OD值代入公式可以算出转化成的果糖含量，从而反应酶活性的高低。当OD值为负值时，不能用于计算相应酶的活性。
蔗糖合酶（合成方向）活性测定原理：根据蔗糖合酶（合成方向）能够将果糖和尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）转化成蔗糖的特性，通过测定其蔗糖转化量的多少可反应酶活性的高低。酶提取液能够将反应液中的尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖转化成蔗糖，再与蒽酮显色反应，通过分光光度计测定的OD620值，即可反映转化糖的含量。OD值越高，表示转化量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次测酶之前，必须制定相应的标准曲线，根据标准曲线回归方程，将OD值代入公式可以算出转化成的蔗糖含量，从而反应酶活性的高低。当OD值为负值时，不能用于计算相应酶的活性。
蔗糖磷酸合成酶活性测定原理：根据蔗糖磷酸合成酶能够将UDPG和6磷酸果糖形成蔗糖磷酸，并进一步形成蔗糖和磷酸。通过测定其蔗糖转化量的多少可以反应酶活性的高低。酶提取液能够将反应液中UDPG和6-磷酸果糖转化成蔗糖，再与蒽酮显色反应，通过分光光度计测定的OD620值，即可反映转化糖的含量。OD值越高，表示转化量越高，酶的活性就越高，反之，酶的活性越低。每次测酶之前，必须制定相应的标准曲线，根据标准曲线回归方程，将OD值代入公式可以算出转化成的蔗糖含量，从而反应酶活性的高低。当OD值为负值时，不能用于计算相应酶的活性。
有益效果：
本发明针对现有技术测定梨果实中转化酶活性是因处理方法不当造成转化酶活性的测定不准确或低效的问题，提供了一种有效的梨果实中蔗糖转化酶提取方法，在初提取酶液中逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，能够有效地将酶蛋白充分的盐析出来，减少初提取液中所含的糖分对测定结果的影响；再对初酶液进行充分地透析，能够有效地将酶液中的离子等小分子物质过滤掉，从而较少对酶活性的影响，有利于酶活性测定结果的准确性。以此梨果实中蔗糖转化酶为基础，能够更加准确、有效地测定转化酶的活性，对深入糖风味形成的生理机制，改善果实品质有着重要的意义。
具体实施方式
实施例1
（一）实验方法
1、供试材料为鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd‘yali’）。
2、样品采集：采取鸭梨花后105天时的果实，采样时按照树冠的上，东，南，西，北的5个方向随机选取无病害的果实5个，置于冰盒中，带回实验室处理。
3、样品的处理：将采集的果实清洗干净，去皮去核，将果肉混匀后四分法取样，在液氮中速冻后，置于-70℃冰箱中，用于蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶活性的测定。
4、蔗糖合酶和蔗糖合成酶酶的提取：
酶液的提取均在0～4℃的条件下进行。准确称取梨果肉1g，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入5mL提取缓冲液（200mmol·L-1Hepes-NaOH,5mmol·L-1MgCl2,0.1%β-巯基乙醇，0.05%Triton-X 100,0.05%BSA，2%PVPP,1mmol·L-1EDTA,1mmol·L-1EGTA,10mmol·L-1抗坏血酸钠,10mM半胱氨酸-盐酸，2%甘油，pH 7.5），充分匀浆，4℃条件下20000g离心30min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80%的饱和度，静置30min后，4℃条件下20000g离心20min，去除上清液，加入3mL脱盐缓冲液（20mmol·L-1Hepes-NaOH，0.25mmol·L-1MgCl2，1mmol·L-1EDTA,1mmol·L-1EGTA，0.01%β-巯基乙醇，0.05%BSA，0.2%甘油，pH 7.5）重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋脱盐，透析液为稀释10倍的提取液（不含PVPP），脱盐后的酶液用于酶活性分析。
5、转化酶的测定：
a)蔗糖合酶（分解方向）活性的测定：在490μL的反应液（80mmol·L-1Mes缓冲液，5mmol·L-1NaF，100mmol·L-1蔗糖，5mmol·L-1UDP,pH 5.5）中加入490μL的脱盐后的酶液，30℃反应30min后，加入490μL的DNS,准确沸水浴5min，冷却后测定OD540值，对照为不含底物的反应液。
b）蔗糖合酶（合成方向）活性的测定：在50μL的反应液（0.1mmol·L-1磷酸缓冲液4mmol·L-1UDP-葡萄糖，0.06mmol·L-1果糖，15mmol·L-1MgCl2,pH 8.0）中加入50μL的脱盐后的酶液，34℃反应1h后加入0.2mL的30%KOH，准确沸水浴10min终止反应，冷却，冷却至室温，加入3mL蒽酮（0.15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中），40℃温浴20min，冷却至室温后测定OD620值。对照为不含底物的反应液。
c）蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性的测定：在50μL的反应液（0.1mol·L-1硼酸缓冲液，10mmol·L-1UDP-葡萄糖，5mmol·L-1果糖-6-磷酸，15mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸，15mmol·L-1MgCl2,1mmol·L-1EDTA）中加入50μL脱盐后的酶液，34℃反应1h后加入0.2mL的30%KOH，准确沸水浴10min终止反应，冷却至室温，加入3mL蒽酮（0.15g的蒽酮溶于100mL81%硫酸中），40℃温浴30min，冷却至室温后测定OD620值。对照为不含底物的反应液。
（二）结果分析
表1中经过盐析和透析方法提取的SS(分解方向)、SS(合成方向)和SPS酶液测定的OD值，分别0.023、0.274和0.155，说明在经过盐析和透析的情况下，酶液得到纯化，酶活性比较高，测定结果较好。表1中不经过盐析的酶液SS(分解方向)、SS(合成方向)和SPS酶活性的OD值，分别是-0.008、0.008和-0.114，由于测定样品为花后105天的果实，SPS和SS（合成方向）的活性是比较高的，能够形成较多的蔗糖，测定结果不应该出现负值或者是OD较低，这说明在粗提取的酶液没有经过盐析时，果实中本身所含有的糖在测定时与蒽酮发生了反应，导致结果OD值较低和负值。表1中不经过透析的酶液SS(分解方向)、SS(合成方向)和SPS酶活性的OD值，分别为0.014，-0.024，-0.009，SPS和SS（合成方向）酶活性的OD值是负值，说明在没有经过透析的情况下，果实中所含有的一些小分子物质，离子等对OD值的测定也有很大的影响，而SS（分解方向）酶活性的OD值只有0.014，对照和实验组之间的颜色差异几乎相同，这可能是由于分光光度计在比色时所形成的误差。
表1 SS和SPS粗酶液经过不同处理后测定的OD值
实施例2
1、蔗糖合酶（分解方向）标准曲线的制定：
1）将分析纯的果糖在80℃下烘至恒重，精确称取果糖1g，加水溶解，定容到100mL，形成果糖的标准液。
2）取7支具有25mL刻度的试管，编号，按照表2所示的量精确加入溶液。
表2制作标准曲线的试剂量
3）将各试管摇匀，在沸水浴中加热5min，冷却至室温，在540nm的波长下测定OD540值。以吸光度为纵坐标，果糖毫克数为横坐标，求得回归方程(y=2.3013x-0.1841)。
酶活性的计算：
酶活性（μmol·h-1·g-1FW）=[根据标准曲线算出果糖含量（mg）/180.17(摩尔质量)×脱盐缓冲液的体积（mL）×酶提取液的总体积(mL)]/[样品鲜重（g）×反应时所加的酶液体积(mL)×第一次离心所取上清液的体积(mL)×反应时间（hr）]×1000
根据以上公式计算出相应的酶活性。
以实施例1中测定SS（分解方向）酶的OD540为0.023，其相应的酶活性计算如下：SS(分解方向)酶活性=(0.023+0.1841)÷2.3013÷180.17×3×5/[1×0.49×3.5×0.5]×1000=8.737（μmol·h-1·g-1FW）；
2、蔗糖合酶（合成方向）和蔗糖磷酸合成酶的标准曲线的制定：
1）将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取蔗糖1g，加水溶解，定容到100mL，形成蔗糖的标准液。
2）取10支具有25mL刻度的试管，编号，按照表3所示的量精确加入溶液。
表3制作标准曲线的试剂量
3）加入试剂后充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，准确煮沸1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在620nm波长下测定其吸光度。以含糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准曲线方程（y=0.9212x-0.0012）。
酶活性（μmol·h-1·g-1FW）=[根据标准曲线算出蔗糖含量（mg）/342.3(摩尔质量)×脱盐缓冲液的体积（mL）×酶提取液的总体积(mL)]/[样品鲜重（g）×反应时所加的酶液体积(mL)×第一次离心所取上清液的体积(mL)×反应时间（hr）]×1000
根据以上公式计算出相应的酶活性：
以实施例1中测定SS（合成方向）酶的OD620为0.274，其相应的酶活性计算如下：
SS(合成方向)酶活性=（0.274+0.0012）÷0.9212÷342.3×3×5/[1×0.05×3.5×1]×1000=74.807（μmol·h-1·g-1FW）；
SPS酶活性=（0.155+0.0012）÷0.9212÷342.3×3×5/[1×0.05×3.5×1]×1000=42.459（μmol·h-1·g-1FW）。
Claims (8)
1.一种提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于称取梨果肉，放入预冷的研钵中，冰浴下研磨，加入提取缓冲液，充分匀浆后，0～4℃条件下180000～20000g离心30～40min，取上清液，逐渐加入硫酸铵至80％的饱和度，静置20～30min后，0～4℃条件下180000～20000g离心20～30min，去除上清液，加入脱盐缓冲液重新溶解沉淀，再用D27mm透析袋透析脱盐得蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，所述的提取缓冲液配方为200mmol·L-1Hepes-NaOH,5mmol·L-1MgCl2，0.1％β-巯基乙醇，0.05％Triton-X 100,0.05％BSA，2％PVPP，1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1EGTA，10mmol·L-1抗坏血酸钠，10mM半胱氨酸-盐酸，2％甘油，pH 7.5；提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是3～10ml：1g；所述的脱盐缓冲液的配方为20mmol·L-1Hepes-NaOH，0.25mmol·L-1MgCl2，1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1EGTA，0.01％β-巯基乙醇，0.05％BSA，0.2％甘油，pH 7.5；脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是1～5ml：1g；所述的透析使用的透析液为稀释10倍的不含PVPP的提取缓冲液。
2.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的整个提取过程在0～4℃的条件下进行。
3.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的提取缓冲液与梨果肉的体积质量比是5ml：1g。
4.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的脱盐缓冲液与梨果肉的体积质量比是3ml：1g。
5.根据权利要求1所述的提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶的方法，其特征在于所述的透析时间为6～10小时，优选8小时。
6.一种测定梨果实中分解方向的蔗糖合酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）按照权利要求1所述的方法提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；
（2）分解方向蔗糖合酶活性的测定：在490μL的反应液中加入490μL权利要求1提取的脱盐后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，30℃反应30min后，加入490μL的DNS，沸水浴5min，冷却后测定OD540值，对照为不含底物的反应液；通过制定果糖标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为80mmol·L-1Mes缓冲液，5mmol·L-1NaF，100mmol·L-1蔗糖，5mmol·L-1UDP，pH 5.5。
7.一种测定梨果实中合成方向蔗糖合酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）按照权利要求1所述的方法提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；
（2）合成方向蔗糖合酶活性的测定：在50μL的反应液中加入50μL权利要求1提取的脱盐 后的蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶混合酶液，34℃反应1h后加入0.2mL的30％KOH，沸水浴10min终止反应，冷却至室温，加入3mL蒽酮溶液，40℃温浴20min，冷却至室温后测定OD620值。对照为不含底物的反应液；再通过制定蔗糖标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为0.1mmol·L-1磷酸缓冲液4mmol·L-1UDP-葡萄糖，0.06mmol·L-1果糖，15mmol·L-1MgCl2,pH 8.0；所述的蒽酮溶液为0.15g的蒽酮溶于100mL81％硫酸中制得。
8.一种测定梨果实中蔗糖磷酸合成酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）按照权利要求1所述的方法提取梨果实中蔗糖合酶和蔗糖磷酸合成酶；
（2）蔗糖磷酸合成酶活性测定：在50μL的反应液中加入50μL脱盐后的酶液，34℃反应1h后加入0.2mL的30％KOH，准确沸水浴10min终止反应，冷却至室温，加入3mL蒽酮溶液，40℃温浴30min，冷却至室温后测定OD620值。对照为不含底物的反应液；再通过制定蔗糖标准曲线即可计算相应酶的活性；所述的反应液配方为0.1mol·L-1硼酸缓冲液，10mmol·L-1UDP-葡萄糖，5mmol·L-1果糖-6-磷酸，15mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸，15mmol·L-1MgCl2,1mMEDTA；所述的蒽酮溶液为0.15g的蒽酮溶于100mL81％硫酸中制得。
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2012
- 2012-06-19 CN CN2012102045879A patent/CN102747055A/zh active Pending
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