CN105420250A - 荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术领域，首次克隆了5个荔枝细胞壁酸性转化酶（<i>CWAI</i>）基因全长，分别命名为<i>LcCWAI</i><i>？1</i>、<i>LcCWAI</i><i>？2</i>、<i>LcCWAI</i><i>？3</i>、<i>LcCWAI</i><i>？4</i>、<i>LcCWAI</i><i>？5</i>，长度分别为1713bp、1722bp、1734（1758）bp、1677bp和1740bp，编码的氨基酸数目分别为570、573、577（585）、558、579个；通过基因沉默技术证明，沉默所述酸性转化酶基因能够缩小荔枝的种子大小，提高荔枝焦核率，在生产上有着广泛的应用前景。

Description

荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，更具体地，涉及荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用。

背景技术

荔枝(LitchichinensisSonn.)是我国重要的南方热带亚热带果树，种植资源十分丰富，具有很高的食用价值和营养价值，可食部分为假种皮，可食率因为品种的不同而有着很大的差别。果实中核(即种子)大是影响荔枝果实品质的突出问题之一，荔枝的种胚败育即“焦核”是荔枝果实发育过程中常见的一种遗传现象，焦核果可食率高，口感也比大核果好，焦核率是评估荔枝品质的一个非常重要的指标。

目前栽培的优质荔枝品种如广东的糯米糍、桂味，福建的兰竹、绿荷包，广西的灵山香荔等，均以焦核为特征。然而，迄今为止学界对荔枝种胚败育的机制研究尚停留在组织结构观察和生理生化变化的层面上，种胚败育的内在分子机制还没有完全清楚。

胚胎发育的任一方面，如花粉、胚囊、胚和胚乳等发育过程受阻都可能引起种子败育。在荔枝种子的发育过程中，糖分不能在胚乳中正常代谢和积累与其败育有着重要的联系，现有研究中细胞壁酸性转化酶活性与玉米、蚕豆、大麦、大米以及番茄等植物种类种子发育呈正相关，缺少细胞壁酸性转化酶的表达降低了玉米和大米种子的贮藏物质储存过程，番茄细胞壁酸性转化酶抑制物基因沉默后(即增加CWAI活性)，番茄种子的尺寸变大。Wang和Ruan通过对棉花GhCWIN1在种子发育早期的时空表达模式研究，发现GhCWIN1基因在胚乳的早期发育阶段(游离核时期)起重要作用。这些研究都说明了细胞壁酸性转化酶在种子发育过程中有着的重要的作用。申请人通过前期研究发现荔枝的种胚发育与荔枝中的酸性转化酶相关，但现有技术中还没有克隆出荔枝相关酸性转化酶基因，荔枝种胚研究机制无法在分子机制层面展开。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供荔枝细胞壁酸性转化酶基因。

本发明的第二个目的是提供上述酸性转化酶基因的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～5所示。

所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：6～10所示。

本发明还提供用于扩增所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的引物，其引物序列如SEQIDNO：11～20所示。

本发明还提供含有权利要求1所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的表达载体。

申请人通过基因沉默表达的方法，对荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的功能进行了验证，发现沉默表达荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5能够引起荔枝种胚败育，从而提高荔枝焦核率。

因此，本发明还保护所述基因或所述表达载体在提高荔枝焦核率方面的应用。

本发明还保护所述基因或所述表达载体在制备提高荔枝焦核率的制剂方面的应用。

优选地，所述应用是构建LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4或LcCWAI5的沉默表达载体，转化农杆菌获得农杆菌工程菌，以所述农杆菌工程菌作为浸染液浸染荔枝植株。

更优选地，所述农杆菌工程菌的OD₆₀₀为0.7～1.4。

更优选地，所述荔枝植株为盛花期的植株或花后3周前内结有幼果的植株。

优选地，所述荔枝品种为黑叶、白荔、早红、马贵荔等大核品种。

优选地，所述浸染荔枝植株的方式为喷洒、浸没、注射。

更优选地，对于不同的荔枝品种，所述浸染液的浸染方式有所不同，例如，可以在荔枝盛花期浸染花穗，也可以通过注射的方式将浸染液注射入荔枝果柄或种柄。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次克隆出5荔枝细胞壁酸性转化酶基因，分别命名为LcCWAI1、LcCWAI2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5，长度分别为1713bp、1722bp、1734(1758)bp、1677bp和1740bp，编码的氨基酸数目分别为570、573、577(585)、558、579个；通过基因沉默技术证明，沉默所述酸性转化酶基因能够提高荔枝焦核率，在生产上有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为部分荔枝组织RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1～4为荔枝叶片样品，泳道5～8为荔枝种皮样品，泳道9～12为荔枝种柄样品，泳道13～14为荔枝花的样品，泳道15～16为荔枝种仁样品。

图2荔枝和其他植株种类CWAI基因进化树分析。

图3为荔枝LcCWAIs扩增结果；其中，S代表扩增序列(sequence)，M代表DNA长度标记(Marker)。

图4为荔枝LcCWAIs在不同品种间的单核苷酸突变，其中，HY：黑叶；NMC：糯米糍；FZX：妃子笑。

图5为LcCWAIs氨基酸序列与其他物种的同源性比较。

图6为LcCWAIs蛋白的3D结构模型(A)和功能位点预测(B)；图6A和图6B按顺序从左到右依次是LcCWAI1、LcCWAI2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5编码的蛋白。

图7为LcCWAIs不同组织的表达；数据点上的线段为标准误(n＝3)。

图8为TRV1(a)和TRV2(b)结构示意图；其中，RdRP为RNA依赖的RNA聚合酶；16K为富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp为运动蛋白；Cp为衣壳蛋白；MCS为多克隆位点。

图9为不同浓度菌液种柄和果柄注射对“黑叶”和“白荔”种胚发育的影响，其中，OD00.7是OD₆₀₀＝0.7，其它类似。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

实施例1酸性转化酶基因筛选和克隆

一、荔枝样品RNA的提取以及质量检测

采用华越洋超快型RNA提取试剂盒(具体方法参照说明书)对“妃子笑”、“黑叶”和“糯米糍”荔枝的叶片、花、果皮、果蒂、种皮、种仁等组织的RNA进行提取，RNA的浓度用紫外核酸蛋白检测仪，取1μl测定260nm与280nm的比值，若介于1.80～2.00之间则可以进行下一步实验。如果RNA浓度较高，可以稀释一定倍数后检测。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，可以看出RNA呈现出清晰的28S和18S两条带，并且28S的亮度是18S的两倍左右，没有拖尾现象，无DNA污染。表明提取的RNA质量比较高，无明显降解，满足后续实验的需要。

二、细胞壁酸性转化酶基因的筛选和聚类分析

根据荔枝基因组测序结果，调出注释为Cellwallinvertase的相关基因(一共14个)，经NCBI比对(与其他物种中相关酸性转化酶基因比对)和生物信息学分析软件分析，利用MEGA5进行聚类分析后删除同源性较差的个别成员，用生物信息学在线分析网站Smart工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)删除掉一些不具备完整功能或者基因组注释错误的成员，最后筛选出5个结构完整，与细胞壁酸性转化酶的氨基酸保守功能域一致的基因LcCWAIs(表1，转化酶基因Genbank分类号见表2)，分别为LcCWAI1、LcCWAI2、LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5，对荔枝和5个其他品种已报道的CWAI、SAI和细胞质中性/碱性转化酶(NI)基因用MEGA5进行聚类分析(图2)，可以看出基因LcCWAIs大致聚成三类，NI基因聚成一类，液泡酸性转化酶聚成一类，CWAI的5个基因和其他物种已报道的细胞壁酸性转化酶基因聚在一起，表明筛选出的基因确实是CWAI基因。荔枝的CWAI又被归成三小类。其中LcCWAI1聚成一类，LcCWAI2聚成一类，LcCWAI3、LcCWAI4、LcCWAI5比较相近聚成一类。

表1荔枝细胞壁转化酶基因LcCWAIs的基本信息

表2用于进化树构建的转化酶类基因GeneBank分类号

物种拉丁名	基因名	NCBI分类号
			Arabidopsis thaliana	AtVIN	X95537
	AtCWIN1	NP_001189881.1
				AtCWIN4	NP_565837
	AtCINV1	NP_174791
				AtCINV2	NP_176049
Daucus carota	DcINV1	M58362
				DcINV2	X78424
	DcSI1	X75353
				DcSI2	X67163
Escherichia coli	E.coli	X81461
			Gossypium arboreum	GaCWIN1-like	KHG30589.1
Lycopersicon esculentum	LeVIN1	Z12025
				LIN5	NP_001234793.1
	Lin7	NP_001234701
			Manihot esculenta	MeCWIN	AFH77950.1
Morus notabilis	MnCWINV1	XP_010097052.1
			Nicotiana tabacum	NtCWIN1	X81834

Oryza sativa	OsCWI1	AB073749
				OsCWI2	AY578159
	OsINV2	AF276703
				OsINV3	AF276704
	Osβfruct2	AY037870
			Populus trichocarpa	PtINV	XP_002309496
Saccharomyces cerevisiae	Suc2	Z46921
			Solanum tuberosum	StINV1	Z22645
	StINV2	L29099
			Theobroma cacao	TcCWIN2	XP_007027801.1
	TcCIN2	XP_007020016.1
			Zea mays	ZmCWIN1	AF050631
	ZmCWIN2	U17695
				ZmIvr1	U16123

三、细胞壁酸性转化酶基因LcCWAIs的克隆和信号肽分析

(一)LcCWAIs克隆

分别提取“黑叶”、“妃子笑”和“糯米糍”叶片的RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，之后利用M-MLVFirstcDNASynthesisKit(invitrogen公司)以cDNA为模板，根据荔枝基因组测序结果中LcCWAIs的全长序列，用PrimerPremier5.0软件分别于其起始子和终止子处设计引物(引物序列如表3，委托生工生物工程(上海)有限公司合成)，扩增目的基因的全长；使用东洋纺生物科技有限公司的KOD-Plus-NeoTaq聚合酶，具体反应体系参照说明书。扩增条件为94℃，2min；98℃，10s，55℃(其中LcCWAI1退火温度为57℃)，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min。反应结束后取2μl跑胶检测扩增产物是否正确。

表3荔枝LcCWAIs基因的全长扩增引物

基因名称	上游引物	下游引物
			LcCWAI I	ATGGCCTTCGTCATTAGAAACAG	CTATATCTTAAAACCTTCCTCTCCC
LcCWAI 2	ATGGAGATATCAAAATATCTATCAG	CTAGTTCATCTCGACGGGC

LcCWAI 3	ATGGCCAACCGCTCTACTTTC	TCAAAAAATATGGGCTTTCTTCATG
			LcCWAI 4	ATGACCAACTTCTCCGTTACTC	TCAGTTAATTTGAGCTTTCTTC
LcCWAI 5	ATGGCTAACACTTCAATTTCTC	TCAATTGATTTGAGCTTTGTTC

(二)PCR产物加A和目的基因的回收

由于KOD为平末端聚合酶，为进行TA克隆需在PCR产物的3’端加一个A，因此对PCR产物进行加A孵育，反应体系为0.1μlExTaq，3μl10×ExTaqBuffer(TaKaRa)，在72℃孵育半小时。

根据目的片段的特异性来决定是进行产物纯化还是切胶回收，若目的片段特异，采用PCR产物纯化试剂盒(生工生物)，具体方法参见试剂盒说明书。若目的片段不特异，将产物全部进行普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下进行切胶，然后用DNA凝胶回收试剂盒(生生生物)进行回收，具体方法参加试剂盒说明书。回收完成后，取2μl跑胶检测。

(三)载体连接与转化

取适量检测正确的PCR产物与克隆载体pMD19-T(TaKaRa)进行连接，目的片段与克隆载体的摩尔比控制在3～5：1之间。连接体系包括1μl19-Tvector、适量纯化后的PCR产物、5μlLigationsolutionI(TaKaRa)，加双蒸水补至10μl，混匀后在16℃条件下恒温连接过夜。

将感受态细胞DH5α(Vazyme)从-80℃取出并置于冰上融化，将2μl连接产物加入到30μl感受态细胞中，轻轻敲打，冰浴30min，然后于42℃水浴热击90s，取出置冰上稳定3min左右后加入不加抗生素的SOC培养基500μl，37℃震荡培养1h。4000rpm离心3min，留下约100μl上清，用枪头将菌体重悬浮后涂于含有100μgml^-1Amp⁺的LB平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

用灭菌的牙签从平板上挑取单菌落接种于含有100μgml^-1Amp⁺的LB液体培养基中，在37℃恒温震荡摇床震荡培养6～8h后，跑菌液PCR检测阳性克隆。菌液PCR方法为：在PCR管中加入8μl水，1μl菌液混匀后在100℃条件下加热5min，待恢复室温后，往PCR管里加入2μl10×Buffer，0.8μl2.5mMdNTPs，0.2μlrTaq酶，扩增条件为95℃30s，55℃30s，72℃2min。扩增结束取2μl产物跑胶检测，挑取扩增产物条带大小正确的送去测序(测序委托艾基生物技术有限公司完成)，最终克隆获得LcCWAIs。

(四)信号肽预测

扩增到LcCWAIs的全长序列，对它们在ExPASytranslatetool(http://web.expasy.org/translate/)进行翻译分析和在SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析，发现LcCWAI1不能正确翻译成蛋白，具有信号肽。

四、LcCWAIs序列分析及氨基酸序列理化性质的预测

对LcCWAI1DNA序列(如SEQIDNO：1所示)进行分析，最终扩增到1731bp的序列，对其在ExPASyProtParamTool(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)对氨基酸序列进行预测分析，得到其编码570个氨基酸，蛋白质分子量为64.5kD，等电点为5.65。

LcCWAI2的全长序列(如SEQIDNO：2所示)为1722bp，对其氨基酸序列进行预测分析得到其编码573个氨基酸，蛋白质分子质量为64.6kD，等电点为9.11。

不同品种间LcCWAI3有一定的差异，“黑叶”中LcCWAI3全长序列(如SEQIDNO：3所示)1758bp，其余两个品种LcCWAI3的序列为1734bp，对氨基酸序列进行预测分析得到，“黑叶”的LcCWAI3编码585个氨基酸，蛋白质分子质量为66.1kD，等电点为8.58。其余两个品种中LcCWAI3编码577个氨基酸，蛋白质分子质量为65.2kD，等电点为8.79。

LcCWAI4cDNA全长(如SEQIDNO：4所示)为1677bp，对其氨基酸序列进行预测分析，得到其编码558个氨基酸，蛋白质分子质量为62.7kD，等电点为6.84。

LcCWAI5cDNA全长(如SEQIDNO：5所示)为1740bp，对其氨基酸序列进行预测分析，得到其编码579个氨基酸，蛋白质分子质量65.6kD，等电点为8.95。

表4LcCWAIs理化特性分析

五、目的基因的比对以及生物信息学分析

把克隆出的5个LcCWAIs基因的氨基酸序列进行预测(图4)，这些基因均编码约570～590个氨基酸，在N端均含有一个长度约为19～28的信号肽。与拟南芥、烟草、玉米等物种的已知的细胞壁酸性转化酶和液泡酸性转化酶氨基酸序列比对发现，酸性转化酶都包含有NDPNG、WECXD这两个酸性转化酶类保持的功能位点，还包含有一个RDP保守的糖基化位点。荔枝的细胞壁酸性转化酶和拟南芥的细胞壁酸性转化酶有68％的同源性，而与液泡酸性转化酶的同源性只有45％(图5)。

六、LcCWAIs氨基酸序列的生物信息学分析

CWAI是一种定位在细胞壁上的蛋白质，属于外泌蛋白，在其氨基酸序列的N端有一段信号肽序列引导成熟的氨基酸序列定位到胞外。用ExPASytools(TargetP,SignalP和THMMM)来预测细胞壁酸性转化酶的亚细胞定位，从预测结果得到，5个CWAI蛋白均有信号肽，定位于分泌通路，置信度为1(最强)，即结果可信。信号肽剪切位置分别位于第28位，19位，26位，19位，27位氨基酸上，从跨膜区预测结果可知，CWAI蛋白均位于膜外。

通过3级结构预测工具(Phyrehttp://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre/)对CWAI蛋白的3级结构进行预测，所用模板为拟南芥细胞壁酸性转化酶晶体结构，PDB号为C2AC1A_，同源度达58～70％，预测可信度达100％，说明预测的3D结构可信。结果如图6A，从预测结果来看，5个CWAI蛋白3D结构类似。图6B为蛋白的功能位点，红色表示与模板相同，绿色表示为新的功能位点，由于LcCWAI1的一个功能位点发生了缺失突变(NDPNG变为NNG)，产生了一个新的功能位点。

实施例2荔枝LcCWAIs基因的表达分析

通过实时荧光定量PCR对所获得的5个LcCWAIs基因进行组织特异性分析，可以发现5个细胞壁酸性转化酶基因存在着明显组织特异性(图7)。其中LcCWAI1在各个组织中都有表达，其中在“妃子笑”大部分组织表达比其余两个品种高，除了雄花外，“糯米糍”的表达明显比其余两个品种低但在源器官(叶子)中的表达量相对最高；LcCWAI2主要在种皮和种胚中的表达量最高，在成熟叶和雄花中“糯米糍”中的表达量低于其它两个品种，其它组织无规律性的差异；LcCWAI3主要在成熟叶和花器官中表达；除种柄和种仁外，其余组织的LcCWAI4均高表达；LcCWAI5主要在雄花和雌花中有显著表达，表达量很高，约是其他组织的400～1000倍。

荔枝中LcCWAI2主要在种子和假种皮糖分卸载的关键部位种柄和种皮表达，而LcCWAI5主要在花器官中特异表达，这两者可能是影响荔枝种子发育的关键CWAI基因成员。

实施例3荔枝LcCWAIs基因功能验证

以逆转录出的“糯米糍”果皮和“黑叶”叶片的cDNA为模板，以荔枝LcCWAIs同源性比较高的500bp左右片段设计引物(表5)，并在引物前加上与pTRV2的BamHI和SmaI酶切位点同源的15bp的载体序列接头，引物序列见下表5，PCR扩增条件为94℃，2min；98℃，10s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，10min。取2μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化回收。

表5VIGS载体构建的片段克隆引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		CWAI-TRV2-F	GCCTCCATGGGGATCCGATAAGGTGTGGAGAGTGTTGGTTG
CWAI-TRV2-R	CTTCGGGACATGCCCGGGAAACCCTCCTCTGCTTCTCACTATC

选取pTRV2(pYL156)上的BamHI和SmaI两个酶切位点对载体进行双酶切，限制性内切酶选用NEB(NewEnglandBiolabs)公司的BamHIHF和SmaI内切酶。反应体系为：pTRV2质粒1μg，BamHIHF和SmaI内切酶各1μl，10×CutsmartBuffer5μl，用水补足至50μl。于37℃酶切15分钟，65℃酶失活20分钟。酶切产物经酚氯仿抽提后，经2倍的无水乙醇和1/10体积的NaAc沉淀，用75％的乙醇洗两次后，将乙醇吹干。把酶切后的线性化质粒溶于20μl的双蒸水中备用。

利用GibsonMasterMix(NewEnglandBiolabs)对纯化后的PCR扩增产物和得到的线性化的载体进行连接，具体反应体系为：1μl纯化回收的PCR扩增产物，1μl线性化载体，4μl2×GibsonAssemblyMasterMix，用水补足至8μl；50℃反应半小时后取2μl转入50μl大肠杆菌DH5α感受态，转化以及鉴定方法为生物技术领域常规技术，测序鉴定结果正确的即为pTRV2-LcCWAI重组质粒，扩摇提取质粒。

取出100μlGV3101农杆菌感受态细胞于冰上解冻，立即加入5μl重组质粒DNA；轻弹，冰上放置30min，液氮中冷冻5min，37℃水浴中温浴5min，冰上2min，加入无抗生素的500μl的YEP(AgrobacteriumGrowthMedium)液体培养基，28℃摇3～4h。3000r，离心3min，去培养基500μl，剩下的100μl全部均匀涂布于YEP固体培养基上(100μl100mgl^-1Kan,50μl50mgl^-1Rif)。28℃静止2～3d。摇菌于含抗生素的(100μl100mgl^-1Kan,50μl50mgl^-1Rif)YEP培养基中，28℃，250rpm振荡过夜；菌液PCR验证。

挑取阳性克隆于500μl含有100μgml^-1Amp的LB(Lysogenybroth，LB)液体培养基中过夜培养。转接100μl菌液至10mlLB液体培养基37℃过夜培养，15,000g离心1min收集菌体，按照每毫升菌体加：

SolutionI100μl(冰浴5min剧烈振荡)

SolutionII200μl(冰浴5min轻轻混匀)

SolutionIII150μl(冰浴5min轻轻混匀)

SolutionI～III配方参见分子克隆实验指南(莎姆布鲁克，美，2005)。

之后15,000g离心5min，上清加入RNAse(10mgml^-1)37℃1h后加入等体积酚：氯仿(1：1)，剧烈振荡后15,000g5min离心，取上清，加入等体积氯仿异戊醇，15,000g条件下离心5min；上清加1/10体积2.5MNaAc和2体积无水乙醇，-20℃沉淀10min后，用75％乙醇洗涤，晾干后加入适量双蒸水溶解。

每100mlYEP培养基中加入100μl100mgl^-1Kan，50μl50mgl^-1Rif，挑取单菌落至2ml离心管含有500μlYEP培养基，后转入50ml离心管摇菌15ml，28℃，200r.m，摇菌过夜，每个基因包括pTRV1和pTRV2-LcCWAI两种菌。

将第一天摇好的菌液，按1：50或1：25稀释到新鲜的YEP培养基中，每100mlYEP培养基加入1ml1MMES(农杆菌转化时用，终浓度10mM)，10μl乙酰丁香酮母液(终浓度20mM)，100μl100mgl^-1Kan，50μl50mgl^-1Rif；500ml三角瓶摇菌100～200ml，28℃，200rpm摇菌过夜。

3000g离心15min，倒掉培养基，用枪吹吸菌体使之均匀悬浮在侵染液中，吸打混匀直至无块状。用分光光度计测重悬菌液浓度，使OD₆₀₀在1.0～3.0之间，将pTRV1和pTRV2-LcCWAI菌液按体积1：1混合制成浸染液，暗处静置4～6h。

在花后35天，用侵染液浓度约为OD₆₀₀＝1.4和OD₆₀₀＝0.7，对“黑叶”和“白荔”进行处理，其中“黑叶”采用种柄注射和果柄注射两种方式，以只扎伤不注射空白为对照，结果发现：“黑叶”种柄刺伤后，种子发育明显受到抑制，而荔枝对果柄的注射处理对果实的伤害小，果实发育正常(表6)。在处理后14天，对侵染处理和对照处理的“黑叶”种子进行采样，带回实验室进行解剖观察并拍照，如图9和表6，对种柄用浓度为OD₆₀₀＝0.7和OD₆₀₀＝1.4的侵染液处理后，黑叶‘种子’大小与仅种柄刺伤的对照物显著差异，而用OD₆₀₀＝1.4侵染液进行果柄注射的果实种子显著小于对照。

处理后14天，对“白荔”处理的果穗进行采收回实验室解剖观察，结果如表7和图9。“白荔”对种柄刺伤较不敏感，刺伤后种子基本发育正常，而两个不同浓度菌液侵染处理的种子均出现不同程度的败育，有些种子种胚发育迟缓而有些种子胚未发育，处理果实的种子重量显著小于对照，且随着侵染液浓度的提高，种子败育程度加剧。

表6pTRV2-LcCWAI种柄和果柄注射对“黑叶”果重和种子重影响

处理	果重(g)	种子重(g)
			种柄注射OD600＝0.7	2.67±0.19c	0.73±0.08c
种柄注射OD600＝1.4	2.27±0.26c	0.50±0.09c
			种柄注射对照	2.52±0.52c	0.65±0.21c
果柄注射OD600＝1.4	2.55±0.17c	0.62±0.07c
			果柄注射对照	4.40±0.19b	1.12±0.09b
空白	5.06±0.21a	1.50±0.09a

表7pTRV2-LcCWAI种柄注射对“白荔”果重和种子重影响

处理	果重(g)	种子重(g)
			OD600＝0.7	1.68±0.11b	0.50±0.04b
OD600＝1.4	1.67±0.15b	0.37±0.09c
			对照	2.60±0.09a	0.86±0.04a
空白	2.79±0.20a	0.81±0.11a

SEQUENCELISTING

<110>华南农业大学

<120>荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用

<130>

<160>22

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1713

<212>DNA

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IleAspLysAsnAlaHisLeuTyrAlaPheAsnTyrGlyThrGluLys

545550555560

ValLysIleLeuAsnLeuAsnAlaTrpSerMetLysLysAlaHisIle

565570575

PheGluSerValIleGluAspLeuLys

580585

<210>9

<211>558

<212>PRT

<213>LcCWAI4编码的蛋白

<400>9

MetThrAsnPheSerValThrLeuIleLeuLeuPheSerLeuLeuLeu

151015

SerHisGlyIleIleGluLeuGluAlaSerThrAsnGlnProTyrArg

202530

ThrGlyPheHisPheGlnProAlaLysAsnTrpMetAsnAspProAsn

354045

GlyProMetIleTyrArgGlyIleTyrHisLeuPheTyrGlnTyrAsn

505560

ProTyrAlaAlaValTrpGlyAsnIleThrTrpAlaHisSerThrSer

65707580

ThrAspLeuIleAsnTrpThrProHisAspIleAlaLeuAlaProSer

859095

AlaProPheAspSerHisGlyCysTyrSerGlySerAlaThrIleArg

100105110

ProGlyGlyArgProAlaIlePheTyrThrGlySerIleAspSerPhe

115120125

ThrAsnGlnValGlnAsnLeuAlaValProLysAsnTyrSerAspPro

130135140

TyrLeuArgGluTrpLeuLysTyrThrTyrAsnProLeuIleSerAla

145150155160

ThrArgProIleAspAlaThrSerPheArgAspProSerThrAlaTrp

165170175

LeuGlyProAspLysArgTrpArgMetLeuIleGlySerValIleAsp

180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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275280285

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305310315320

SerSerSerGluGluAspAsnLysLysLysGlyTrpAlaGlyLeuGln

325330335

AlaIleProArgSerLeuTrpLeuGluLysSerGlyLysGlnLeuVal

340345350

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355360365

LeuGlnAsnArgPheLeuGlnGlyGlySerValLeuGluValSerGly

370375380

IleThrAlaAlaGlnAlaAspValGluIleLeuPheAspValIleGlu

385390395400

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420425430

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ArgSerLeuIleAspHisSerIleValGluSerPheGlyGlyGlyGly

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AspAlaHisLeuTyrAlaPheAsnTyrGlyIleGluGlyValSerIle

530535540

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<210>10

<211>579

<212>PRT

<213>LcCWAI5编码的蛋白

<400>10

MetAlaAsnThrSerIleSerLeuSerPheLeuPheValSerAlaLeu

151015

PheLeuGlyHisGlnValLeuGluLeuGluAlaSerHisHisIlePhe

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

SerAlaThrIleLeuProGlyGlyLysProValIleLeuTyrThrGly

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LeuSerAspProHisLeuThrGluTrpIleLysTyrProLysAsnPro

165170175

LeuMetLysAlaThrProThrAsnLysIleAsnGlySerAlaPheArg

180185190

AspProThrThrAlaTrpGlnGlyProAspAsnValTrpArgValLeu

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325330335

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SerLysValLysIleSerTyrLeuAsnAlaTrpSerMetAsnLysAla

565570575

GlnIleAsn

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>LcCWAI1上游引物

<400>11

atggccttcgtcattagaaacag23

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>LcCWAI1下游引物

<400>12

ctatatcttaaaaccttcctctccc25

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>LcCWAI2上游引物

<400>13

atggagatatcaaaatatctatcag25

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>LcCWAI2下游引物

<400>14

ctagttcatctcgacgggc19

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>LcCWAI3上游引物

<400>15

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<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>LcCWAI3下游引物

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tcaaaaaatatgggctttcttcatg25

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<211>22

<212>DNA

<213>LcCWAI4上游引物

<400>17

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<211>22

<212>DNA

<213>LcCWAI4下游引物

<400>18

tcagttaatttgagctttcttc22

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>LcCWAI5上游引物

<400>19

atggctaacacttcaatttctc22

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>LcCWAI5下游引物

<400>20

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<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>CWAI-TRV2-F

<400>21

gcctccatggggatccgataaggtgtggagagtgttggttg41

<210>22

<211>43

<212>DNA

<213>CWAI-TRV2-R

<400>22

cttcgggacatgcccgggaaaccctcctctgcttctcactatc43

Claims (7)

1.荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～5所示。

2.权利要求1所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：6～10所示。

3.用于扩增权利要求1所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的引物，其特征在于，其引物序列如SEQIDNO：11～20所示。

4.含有权利要求1所述荔枝细胞壁酸性转化酶基因LcCWAI1，LcCWAI2，LcCWAI3，LcCWAI4，LcCWAI5的表达载体。

5.权利要求1所述基因或权利要求4所述表达载体在提高荔枝焦核率方面的应用。

6.权利要求1所述基因或权利要求4所述表达载体在制备提高荔枝焦核率的制剂方面的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述荔枝品种为黑叶、白荔、早红、马贵荔。