CN117887734B - 一种Pt9G41650基因及其蛋白在判定油松种子休眠程度中的应用 - Google Patents
一种Pt9G41650基因及其蛋白在判定油松种子休眠程度中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种Pt9G41650基因及其蛋白在判定油松种子休眠程度中的应用。本发明提供了Pt9G41650基因及其蛋白，Pt9G41650基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因及其蛋白均能用于判定油松种子的休眠程度。此外，本发明还提供了特异性扩增上述基因的引物对，使用该引物对能特异性扩增Pt9G41650基因，并通过比较待测样本和参考样本中Pt9G41650基因的表达量，能够实现对待测样本休眠程度的准确判定。实验证明，本发明提供的技术方案可准确反映出油松种子的休眠程度，且精度更高，科学性更强，可重复性好。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种Pt9G41650基因及其蛋白在判定油松种子休眠程度中的应用。
背景技术
油松（Pinus tabulaeformis Carr.），松科松属针叶常绿乔木，为中国特有树种，产于东北、中原、西北和西南等省区。其具有强大的水土保持、涵养水源及改良土壤的作用，是荒山造林及城市绿化的重要树种，不仅可以为桥梁建设、铁路建设等提供优质的木材，且油松的各个部位均可以入药，经济价值极高。
然而，油松种子存在不同程度的休眠，进而导致了油松植物生长不均匀，苗木参差不齐、缺苗断垅空杯的现象，以此造成严重的损失和浪费。因而，在油松育种过程中通常以油松种子的萌发率来判定种子的休眠程度，但该方式不仅费工费时，且操作不便，不利于现代化营林事业的发展需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Pt9G41650基因及其蛋白在标记油松种子休眠程度中的应用，以此能够实现高效、准确地判定油松种子的休眠程度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了Pt9G41650基因，所述Pt9G41650基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了上述技术方案所述Pt9G41650基因编码的Pt9G41650蛋白，所述Pt9G41650蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
扩增上述技术方案所述Pt9G41650基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述技术方案所述的引物对和PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括SYBR Green DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和内参基因引物。
本发明提供了上述技术方案所述的Pt9G41650基因、所述的Pt9G41650蛋白、所述的引物对或所述的检测试剂盒在判定油松种子休眠程度中的应用。
本发明提供了一种判定油松种子休眠程度的方法，包括如下步骤：
以待测样本的cDNA和参考样本的cDNA为模板，分别利用上述技术方案所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，并分别统计待测样本和参考样本中Pt9G41650基因的表达量；
当待测样本中Pt9G41650基因的表达量与参考样本中Pt9G41650基因的表达量无显著差异时，则判定待测样本的休眠程度与参考样本的休眠程度相同；
当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著低于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度高于参考样本的休眠程度；
当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著高于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度低于参考样本的休眠程度。
优选的，所述显著差异包括P<0.05时的显著差异。
优选的，所述荧光定量PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10μL的2× SuperRealPreMix Plus （SYBR Green）、cDNA模板1μL、100μM的上游引物0.8μL、100μM的下游引物0.8μL，无RNA酶水补充至20μL。
优选的，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，94℃变性5s，60℃退火30s，运行39个循环。
有益效果：
本发明提供了Pt9G41650基因，所述Pt9G41650基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在此基础上，本发明还进一步提供了该基因编码的Pt9G41650蛋白。Pt9G41650基因和Pt9G41650蛋白均能用于判定油松种子的休眠程度。
基于上述技术优势，本发明提供了一种判定油松种子休眠程度的方法。通过使用本发明提供的引物对对待测样本的cDNA和参考样本的cDNA进行荧光定量PCR扩增，并比较待测样本和参考样本中Pt9G41650基因的表达量，能够实现对待测样本休眠程度的准确判定。实验证明，与传统的依赖观察种子萌发率及生理指标的分辨方法相比，本发明提供的技术方案可准确反映出油松种子的休眠程度，且精度更高，科学性更强，可重复性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明展示的萌发露白的种子；
图2为实施例2中不同处理后油松种子中Pt9G41650基因的表达量。
具体实施方式
本发明提供了Pt9G41650基因，所述Pt9G41650基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5'- ATGATGGCAGCACCATTGTTCTACAAGGGCTACTATCATCTGTTCTACCAATATAATCCCAAGTCGGCTGTGTGGGGACTGATCGTGTGGGGGCATGCAGTTTCAACAGATCTCATAAATTGGAGACATATGACGGGTGCAGCTATATACCCTGATGAATGGTACGATGCCAATGGTGCCTGGTCTGGATCTGCCACTTTCCTACACAAAGGGGGCCCTCCTGTAATCTTATATACAGGATCCAACAATGCCTCGGAACAAGTTCAAGTCATGGCTGTTCCCAAGAACCCATCGGATCCTTTGCTACGGGAGTGGAAGAAGATCGCGCAGAATCCCATCATGGTGCCTATTGGCATCAACGTCAGTTCTTTCAGAGATCCAACAACGGCATGGTTGGGATCAGACCAAAGATGGCGAGTCCTGGTGGGCAGCAAAAGCGATGAGAATAAGGTGGGAATGGCATTGATGTTCAGAAGCAAAGATTTCGTTAAATGGGTGAAAGCCAAACATCCGCTGCACTCGGCCAGGCATACTGGAATGTGGGAGTGCCCGGACTTCTACCCTGTGTCCCTCTATGGCAGCCATGGCGTTGATACCTCGACCACGGGTCCTTCTGTGAAGCACGTTCTCAAGAACAGTTTGGACGATAACAAAGTGGACTACTATACAGTGGGCCATTACTCGCCCGAGTTGGACAGGTATGTCCCCGACGATGGATCTGTGGAGGGCCACAATGGTCTGAGGTATGACTACGGTAAATTTTATGCGTCCAAGACCTTTTTTGACGATAACAAGTCCCGTAGGATTCTGTGGGGTTGGATCAACGAATCTGACAGCGTGGTGGATGATCTCAACAAAGGATGGGCTTCCCTTCAGGCGATTCCTAGGGTTGTGCAGCTTGATCCTCTTACCAGGAGAAGCCTCGTTCAGTGGCCAGTGCCAGAGCTTGAATCTTTGCGCGAGCATAATATAAGGAAGGACCACGTGGTTTTGGAAAGAGAATCGGTAATGAAGGTGGAGGGATTCAACTCCGGAGCTGCGCAGGTGGACGTGGAGGTAGAGTTTGAGTTGGAAAGCGATTATGAAACGGAGGAGGAGTTGGAGGCAATGACAGCAACAGCTCAAAGCTTGTGCAGTCGCGGGGGGAACAACAATACGAGGGGATTCGGGTTGATGGTGTTGGCATCTGATGATCTCAAAGAGAGGAGTGCTGTCTTCTTCAAGATTTTCAAGGGCAGAGTTAATGGCAATGTCCACAGAAAGGTGGCCTTGTGCGTGGATCAGAGCAGGTCCACACTGCAAGTGAATGTGGATAAGACGAGCTATGGAGGATTTGTGAGCGTGAAGCCTGACCAACGGTCGCTGTCGCTCAGAGTATTGGTTGATCACTCAATCGTGGAGAGTTTTGCAGAAGGAGGGAGAACATGCATAACGTCGAGGAGTTATCCGACGGTAGCGGTTAATGAGAATGCTCGTCTCTTCGTATTTAATTATAACAAATTGCCCCTCGTCCTTCGTCGCCTCTCTGCATGGCATATGAACAGTACCATCCAAATATACGAATCTAACTGA-3'，该基因能够用于判定油松种子的休眠程度。
在本发明中，如无特殊说明，所用到的试剂、材料均为常规购买。
本发明还提供了上述技术方案所述Pt9G41650基因编码的Pt9G41650蛋白，所述Pt9G41650蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：MMAAPLFYKGYYHLFYQYNPKSAVWGLIVWGHAVSTDLINWRHMTGAAIYPDEWYDANGAWSGSATFLHKGGPPVILYTGSNNASEQVQVMAVPKNPSDPLLREWKKIAQNPIMVPIGINVSSFRDPTTAWLGSDQRWRVLVGSKSDENKVGMALMFRSKDFVKWVKAKHPLHSARHTGMWECPDFYPVSLYGSHGVDTSTTGPSVKHVLKNSLDDNKVDYYTVGHYSPELDRYVPDDGSVEGHNGLRYDYGKFYASKTFFDDNKSRRILWGWINESDSVVDDLNKGWASLQAIPRVVQLDPLTRRSLVQWPVPELESLREHNIRKDHVVLERESVMKVEGFNSGAAQVDVEVEFELESDYETEEELEAMTATAQSLCSRGGNNNTRGFGLMVLASDDLKERSAVFFKIFKGRVNGNVHRKVALCVDQSRSTLQVNVDKTSYGGFVSVKPDQRSLSLRVLVDHSIVESFAEGGRTCITSRSYPTVAVNENARLFVFNYNKLPLVLRRLSAWHMNSTIQIYESN*，该蛋白也能够用于判定油松种子的休眠程度。
本发明提供了扩增上述技术方案所述Pt9G41650基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5'-CGACGATGGATCTGTGGAGG-3'；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：5'-ACCACGCTGTCAGATTCGTT-3'。该引物对能特异性的扩增Pt9G41650基因。
本发明提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述技术方案所述的引物对和PCR扩增试剂。在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括SYBR Green DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液和内参基因引物；所述SYBR Green DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液和内参基因引物的来源、用量没有特殊限定，采用本领域熟知的技术即可。
本发明提供了上述技术方案所述的Pt9G41650基因、所述的Pt9G41650蛋白、所述的引物对或所述的检测试剂盒在判定油松种子休眠程度中的应用。以此能够准确、快速的对油松种子的休眠程度进行断定。
本发明提供了一种判定油松种子休眠程度的方法，包括如下步骤：以待测样本的cDNA和参考样本的cDNA为模板，分别利用上述技术方案所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，并分别统计待测样本和参考样本中Pt9G41650基因的表达量；当待测样本中Pt9G41650基因的表达量与参考样本中Pt9G41650基因的表达量无显著差异时，则判定待测样本的休眠程度与参考样本的休眠程度相同；当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著低于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度高于参考样本的休眠程度；当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著高于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度低于参考样本的休眠程度。
本发明优选分别制备得到待测样本的cDNA和参考样本的cDNA。在本发明中，所述待测样本与参考样本的品种优选相同；所述参考样本优选包括经37℃热胁迫处理15d后的油松种子；经过37℃热胁迫处理15d后的油松种子，其萌发率为30%~40%，处于休眠时期，而当油松种子萌发率＜30%时部分种子失去活力，不能用以表示休眠时期的种子；所述热胁迫处理的方式没有特殊的要求，采用本领域熟知的技术即可。本发明所述制备cDNA的方式和试剂没有特殊的要求，采用本领域熟知的技术即可。
得到所述待测样本的cDNA和参考样本的cDNA后，本发明以待测样本的cDNA和参考样本的cDNA为模板，分别利用上述技术方案所述的引物对进行荧光定量PCR扩增。在本发明中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括：10μL的2× SuperReal PreMixPlus （SYBR Green）、cDNA模板1μL、100μM的上游引物0.8μL、100μM的下游引物0.8μL，无RNA酶水补充至20μL；所述荧光定量PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性2min，94℃变性5s，60℃退火30s，运行39个循环。以此能够分别实现待测样本的cDNA和参考样本的cDNA的特异性扩增。
所述荧光定量PCR扩增后，本发明分别统计待测样本和参考样本中Pt9G41650基因的表达量，并做出判定。当待测样本中Pt9G41650基因的表达量与参考样本中Pt9G41650基因的表达量无显著差异时，则判定待测样本的休眠程度与参考样本的休眠程度相同；当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著低于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度高于参考样本的休眠程度；当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著高于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度低于参考样本的休眠程度；所述显著差异优选包括P<0.05时的显著差异。本发明对所述荧光定量PCR扩增的设备、基因表达量的分析方式没有特殊的要求，采用本领域熟知的技术即可。在本发明的具体实施例中，用于荧光定量PCR扩增的设备型号为：CFX ConnectTM Optics Module，该设备具体编号为：788BR04747；用于基因表达量数据分析的软件为：Bio-Rad CFX Manager。
实验证明，与传统的依赖观察种子萌发率及生理指标的分辨方法相比，本发明提供的技术方案可准确反映出油松种子的休眠程度，且精度更高，科学性更强，可重复性好。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种Pt9G41650基因及其蛋白在判定油松种子休眠程度中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验前准备：
油松种子：购买自山西省运城市垣曲县中条山国营林场；垣曲中条山林场属断陷盆地，年均气温22℃，最高气温达40℃，最低气温-11℃；商家从生长良好的壮年油松母株上采集成熟的油松球果，室温下晾干后收集种子，并混合均匀；
将上述购买的油松种子运回北京林业大学实验室，在蒸馏水中进行萌发测试，具体过程如下：在培养皿中铺置6层灭菌纱布，并用无菌水将其浸湿，使纱布处于湿润状态。将种子用水清洗过后，用质量分数为0.5%的次氯酸钠对种子消毒20分钟，随后用灭菌水充分清洗；在培养皿中放置25粒种子，将种子均匀放置在培养皿中，使每粒种子都接触到湿润纱布。一个培养皿为一个处理，每个处理设置4平行重复。
将装有种子的培养皿放入温度为22℃，光照条件为8h光照、16h黑暗的培养箱中进行培养，每天记录萌发种子的数量，并且根据需要向培养皿中添加灭菌蒸馏水。萌发的判断标准为胚根突出种皮。未萌发的种子用镊子夹破，检测种子是否有活力（活力判断标准：若种子的胚为白色且坚实，则判定为种子有活力；若胚发霉或者用镊子一碰就碎，则判定为种子没有活力，通过种子活力判定将死亡的种子排除，更有利于萌发率的精准表示），结果见表1。
表1 油松种子的萌发验证实验
| 时间 | 实验天数 | 萌发率（%） |
| 2月10日 | 1d | 0 |
| 2月11日 | 2d | 0 |
| 2月12日 | 3d | 0 |
| 2月13日 | 4d | 0 |
| 2月14日 | 5d | 0 |
| 2月15日 | 6d | 0 |
| 2月16日 | 7d | 7 |
| 2月17日 | 8d | 20 |
| 2月18日 | 9d | 35 |
| 2月19日 | 10d | 49 |
| 2月20日 | 11d | 61 |
| 2月21日 | 12d | 65 |
| 2月22日 | 13d | 65 |
| 2月23日 | 14d | 65 |
| 2月24日 | 15d | 65 |
由表1可以看出，油松种子从第7天开始萌发，第12天结束萌发，萌发率为65%，因此能够判断上述购买的种子处于何种状态，能够用于制备露白种子、非休眠种子和诱导种子的休眠。
将购买的种子采用下述方法进行处理，以制备得到不同处理后的种子：
露白种子（GW）：胚根突破种皮视为萌发即露白的种子，具体如图1所示（图1中的三个种子均表示露白的种子），将胚根伸出种皮＜3mm的种子从培养皿中取出，放在液氮中迅速冷冻，贮存在-80℃冰箱。
非休眠种子（C7d）：将油松种子均匀放置在垫有6层纱布（纱布经过灭菌处理）的培养皿中，将培养皿中加入灭菌蒸馏水，使纱布处于饱和湿润状态。培养皿用锡箔纸包裹，再装在黑色袋子中。将装有种子的培养皿放在4℃的冰箱内，进行冷层积处理。冷层积处理4、7、10天之后，分别在蒸馏水中进行萌发测试（萌发测试的具体过程如上所述），记录萌发的种子数量，并检测未萌发的种子活力（活力判断标准如上），结果见表2。萌发测试的过程中，一个培养皿为一个处理，每个处理4次平行重复，每个培养皿内25粒种子。
表2 不同处理种子的萌发率
由表2可以看出，冷层积处理4、7、10天之后的萌发率分别为71%、86%、87%。即油松种子吸胀7天后，已达到吸胀饱和状态，因而能够作为非休眠种子进行后续实验，将冷层积7天的种子放在液氮中迅速冷冻，贮存在-80℃冰箱。
诱导种子的休眠（H15d）：将冷层积处理获得的非休眠种子放在垫有6层湿润纱布的培养皿中，培养皿用锡箔纸包裹，置于37℃的完全黑暗培养箱中（即热胁迫处理）。培养的过程中每5天，用小喷壶湿润种子，并分别于热胁迫10天、15天和20天后取出一批种子在蒸馏水中进行萌发测试（萌发测试具体过程如上所述）并统计萌发率，结果见表3。每个培养皿为一个处理，每个处理4次平行重复，每个培养皿内25粒种子，记录萌发的种子数量，并检测未萌发的种子活力。
表3 不同处理种子的萌发率
由表3可以看出，37℃热胁迫10天、15天、20天之后的油松种子的萌发率分别为41%、32%和10%。当种子萌发率＜30%时，部分种子会出现种子失活的现象，因此取萌发率30%~40%的种子，而热胁迫15天后的种子萌发率为32%处于30%~40%之间，因此选择37℃热胁迫15天的油松种子为休眠时期的种子，并将休眠时期的种子在液氮中迅速冷冻，贮存在-80℃冰箱。
实施例1
休眠标记基因Pt9G41650的筛选：
1）不同休眠程度油松种子的取样
取实验前准备的热胁迫15天后的种子、冷层积7天后的种子和露白的种子作为样本，每组样本3个生物学重复，每个重复25粒种子，上述材料在取样后均立即用液氮速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存，以此有利于保护样本中的生物分子（如DNA、RNA和蛋白质）不被降解，从而保持样本的完整性和质量。
2）RNA提取、文库构建、转录组测序
通过Trizol法分别提取参考样本（热胁迫15天后的种子、冷层积7天后的种子和露白的种子）的总RNA，经过质检后使用NEB#7530试剂盒（#E7530购买自New EnglandBiolabs）进行转录组文库构建，在文库质检合格后，送至上海云序生物科技有限公司，在Illumina nova-6000平台上进行高通量测序。
3）数据质控及参考基因组比对
对原始数据（raw reads）进行数据质控，依次过滤碱基N的比例大于10%的reads，过滤质量值Q≤20的碱基数占整个read的50％以上的reads，截去adaPtor及其后的部分，过滤截去adaPtor后短于50bp的reads，得到高质量的质控数据（High quality cleanreads）；
以油松的高质量基因组Chinese pine genome（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA784915）作为参考基因组，将质控数据与之进行比对，获得后续用于转录本组装和表达量分析的匹配数据（mapped reads）。
4）基因表达量分析
将各样本的clean reads映射到油松参考基因组上，以获得mRNA的表达水平，利用RNA-Seq数据量化软件Kallisto计算每个uigene的表达丰度，选择以TPM（TranscriPt permillion）的归一方法表征基因的表达量。
5）加权基因共表达网络分析
将基因在所有样本中表达量即TPM< 1的基因过滤去除，将过滤后的基因集以软阈值“power=15”并构建基因网络，网络构建及模块合并参数为“deepSplit =2；minModuleSize=100；mergeCutHeight = 0.20”。对所得模块进行模块与模块间相关性、样本与模块间相关性分析，前者通过模块基因表达量聚类，后者通过Pearson相关分析，对模块特征值与样本表达矩阵进行的相关性计算。最后对模块中基因表达量进行PCA分析，用PC1代表模块的指标即模块特征向量（MEs），并由MEs值的变化趋势进行模块筛选。保留2个模块前1%的基因进行hub基因网络构建，使用Cytoscape软件对网络进行可视化和hub基因筛选，通过MCODE插件提取子网络，继而用CytoHubba插件结合MMC等12种算法的交集得到休眠标记基因Pt9G41650，Pt9G41650基因的CDs序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例2
休眠标记基因的验证
1）引物设计
根据休眠标记基因Pt9G41650的CDs序列，利用NCBI的在线引物设计网站Primer-BLAST进行引物设计，Pt9G41650基因的引物序列为：
上游引物：5'-CGACGATGGATCTGTGGAGG-3'（SEQ ID NO.3）；
下游引物：5'-ACCACGCTGTCAGATTCGTT-3'（SEQ ID NO.4）。
2）不同休眠程度油松种子的取样
选择37℃热胁迫15天的油松种子（命名为H15d）、4℃冷层积7天的油松种子（命名为C7d）和萌发露白时期的油松种子（命名为GW），上述材料在采集后均立即用液氮速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存。
3）样本总RNA的提取
应用天根生化科技（北京）有限公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）分别提取步骤2）所采集的三个样本的总RNA。RNA浓度和完整性分别用Nano微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳测定。
4）样本总RNA的反转录
在RNase free PCR管中，完成步骤3）中三个样本总RNA的反转录反应，并去除基因组DNA。按照下表4配制反转录体系：
表4 反转录体系
将上述体系分别轻轻混匀，于PCR仪中42℃孵育15min，之后85℃加热5s使RT/RIEnzyme和gDNA Remover彻底失活，将三种不同的产物cDNA分别保存在-20℃。
5）Pt9G41650基因的实时荧光定量PCR验证
将步骤4）中反转录生成的cDNA稀释5倍后作为模板（以确保内参基因的Ct值确定在18~22之间），按照下表5中qRT-PCR反应体系和反应条件进行qRT-PCR：
表5 qRT-PCR反应体系
| 组成成分 | 使用量/µL |
| 2 x SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | 10µL |
| 上游引物(100 μM) | 0.8µL |
| 下游引物 (100 μM) | 0.8µL |
| 模板 cDNA (cDNA) | 1µL |
| 无RNase水 | 7.4µL |
| 总量 | 20µL |
注：用于荧光定量PCR验证的设备型号为：CFX ConnectTM Optics Module，设备具体编号为：788BR04747；用于基因表达量数据分析的软件为：Bio-Rad CFX Manager。
采用SYBR Green嵌合荧光法进行反应，预变性反应程序设置为：95℃预变性2min，PCR反应程序设置为：94℃变性5s、60℃退火30s，39个循环；熔解曲线分析反应程序设置为65~95℃每5s增加0.5℃；
每个待检测的样品进行3次技术重复和3次生物学重复，且每板样品加入独立的内参基因Actin。内参基因Actin的引物序列如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.6所示：
上游引物：5'-GGCATACCGGCAGCTCTTC-3'（SEQ ID NO.5）；
下游引物：5'-AAGTTGTTGGCGGCGTCTT-3'（SEQ ID NO.6）。
分别在表达量仪器中统计37℃热胁迫15天（H15d）、4℃冷层积7天（C7d）、萌发露白（GW）油松种子中Pt9G41650基因的表达量，结果见图2（在图2中，H15d表示37℃热胁迫15天后油松种子内Pt9G41650基因的表达量，C7d表示4℃冷层积7天后油松种子内Pt9G41650基因的表达量，GW表示萌发露白后油松种子内Pt9G41650基因的表达量）和表6。
表6 不同处理的种子中Pt9G41650基因的表达量
| 样本 | Pt9G41650基因的表达量 | 标准误差 |
| H15d | 1 | 0.21564 |
| C7d | 2.44499 | 0.23889 |
| GW | 7.74743 | 0.94573 |
由表6和图2可以看出，随着种子休眠的解除以及萌发，Pt9G41650基因的表达量在升高；油松种子中Pt9G41650基因的表达量与休眠程度呈负相关，随着油松种子休眠的打破至种子萌发而逐渐上升。
综上可知，本发明提供的技术方案能够实现对待测样本休眠程度的准确判定。与传统的依赖观察种子萌发率及生理指标的分辨方法相比，本发明提供的技术方案可准确反映出油松种子的休眠程度，且精度更高，科学性更强，可重复性好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.Pt9G41650基因，其特征在于，所述Pt9G41650基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述Pt9G41650基因编码的Pt9G41650蛋白，其特征在于，所述Pt9G41650蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.扩增权利要求1所述Pt9G41650基因的引物对，其特征在于，所述引物对由上游引物和下游引物组成；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求3所述的引物对和PCR扩增试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括SYBR GreenDNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液和内参基因引物。
6.权利要求1所述的Pt9G41650基因、权利要求2所述的Pt9G41650蛋白、权利要求3所述的引物对或权利要求4或5所述的检测试剂盒在判定油松种子休眠程度中的应用。
7.一种判定油松种子休眠程度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样本的cDNA和参考样本的cDNA为模板，分别利用权利要求3所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，并分别统计待测样本和参考样本中Pt9G41650基因的表达量；
当待测样本中Pt9G41650基因的表达量与参考样本中Pt9G41650基因的表达量无显著差异时，则判定待测样本的休眠程度与参考样本的休眠程度相同；
当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著低于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度高于参考样本的休眠程度；
当待测样本中Pt9G41650基因的表达量显著高于参考样本中Pt9G41650基因的表达量时，则判定待测样本的休眠程度低于参考样本的休眠程度；
所述Pt9G41650基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述显著差异包括P<0.05时的显著差异。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10μL的2× SuperReal PreMix Plus 、cDNA模板1μL、100μM的上游引物0.8μL、100μM的下游引物0.8μL，无RNA酶水补充至20μL。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min，94℃变性5s，60℃退火30s，运行39个循环。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4132270A1 (de) * | 1991-09-27 | 1993-07-29 | Forschungsanstalt Fuer Forst U | Verfahren zur vorbehandlung von saatgut, insbesondere solches von forstgehoelzen |
| CN105087759A (zh) * | 2014-05-06 | 2015-11-25 | 中国种子集团有限公司 | 鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法 |
| CN105420250A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-03-23 | 华南农业大学 | 荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用 |
| CN115927721A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-04-07 | 北京林业大学 | 一种湿加松年龄标记基因PtTIFY20及其筛选方法与应用 |
| CN115927377A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-04-07 | 北京林业大学 | 一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用 |
| CN116397008A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-07-07 | 北京林业大学 | 一种油松年龄标记基因PtMADS26的筛选鉴定方法与应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7162371B1 (en) * | 2000-10-11 | 2007-01-09 | Georgia Tech Research Corporation | Differentially-expressed conifer cDNAs, and their use in improving somatic embryogenesis |
-
2024
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4132270A1 (de) * | 1991-09-27 | 1993-07-29 | Forschungsanstalt Fuer Forst U | Verfahren zur vorbehandlung von saatgut, insbesondere solches von forstgehoelzen |
| CN105087759A (zh) * | 2014-05-06 | 2015-11-25 | 中国种子集团有限公司 | 鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法 |
| CN105420250A (zh) * | 2015-10-10 | 2016-03-23 | 华南农业大学 | 荔枝细胞壁酸性转化酶基因及其应用 |
| CN115927721A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-04-07 | 北京林业大学 | 一种湿加松年龄标记基因PtTIFY20及其筛选方法与应用 |
| CN115927377A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-04-07 | 北京林业大学 | 一种湿加松年龄标记基因PtAP2L3及其筛选方法与应用 |
| CN116397008A (zh) * | 2022-11-02 | 2023-07-07 | 北京林业大学 | 一种油松年龄标记基因PtMADS26的筛选鉴定方法与应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BT116904.1;MacKay J;《Genbank》;20091203;第1-1885位 * |
| Genome-wide identification of the COBRA-Like gene family in Pinus tabuliformis and the role of PtCOBL12 in the regulation of cellulose biosynthesis;Yilan E等;《Industrial Crops & Products》;20230731;第203卷;第1-11页 * |
| GLJ21970.1;Fujino T等;《Genbank》;20230404;第1-580位 * |
| Phytohormone profiles and related gene expressions after endodormancy release in developing Pinus tabuliformis male strobili;Zhang JX等;《Plant Sci》;20211227;第316卷;第1-11页 * |
| XP_057818276.2.《Genbank》.2023,第1-563位. * |
| 油松DELLA蛋白结合GID1关键位点的鉴定和验证;杜冉等;《西北植物学报》;20170115;第37卷(第01期);第32-39页 * |
| 油松FT/TFL1-like基因表达模式与调控分析;刘洋等;《北京林业大学学报》;20181015;第40卷(第10期);第60-66页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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