CN105695462B - 大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应用。本发明提供了MicroRNA172或其编码核酸分子或含有其编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物和/或提高植物生物量中的应用；本发明的实验证明，本发明过表达pre‑miR172得到转基因大豆，其高于转空载体大豆或野生型大豆，具体体现在盐胁迫下生物量高于转空载体或野生型大豆。本发明对培育耐盐且生物量增加的植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

Description

大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆MicroRNA172在培育耐逆植物中的应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化,例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类蛋白激酶、转录因子等与植物耐逆性相关，但是，有关MicroRNA与耐逆性的相关性报道较少。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300-1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70-90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24nt的成熟miRNA。

在植物中，miRNA在RISC的作用下与靶基因的mRNA结合后，通过降解mRNA或抑制翻译的方式对基因的进行调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。植物中已知miRNA通过调控与植物开花及花器官发育相关基因的表达,参与植物生殖发育及花器官分化。一些miRNA调控植株的发育和耐逆性，例如玉米中铅胁迫响应miRNA与植株的耐铅胁迫相关；海南大学薄维平等分析了木薯低温下miRNA的差异。

发明内容

本发明的一个目的是提供MicroRNA172(简称为miR172)或其编码核酸分子或含有其编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的新用途。

本发明提供了MicroRNA172或其编码核酸分子或含有其编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物和/或提高植物生物量中的应用；

所述MicroRNA172的核苷酸序列为序列表中序列2或序列3。

上述序列表中序列2所示的RNA为pre-miRNA172，序列3所示的RNA为MicroRNA172，pre-miRNA172为MicroRNA172的前体。

上述应用中，所述MicroRNA172编码核酸分子的核苷酸序列为序列表中序列1，编码pre-miRNA172。

上述应用中，所述含有MicroRNA172编码核酸分子的重组载体为将所述MicroRNA172编码核酸分子插入表达载体得到表达MicroRNA172的重组载体，在本发明的实施例中，表达载体为pBin438，重组载体为将序列表的序列1所示pre-MicroRNA172的编码核酸分子插入pBin438载体BamHI和KpnI酶切位点之间得到的载体，且插入的位置在CaMV35S启动子之后，将该重组载体命名为pBin438-pre-MicroRNA172。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性；

所述提高生物量体现在提高根长、提高株高和/或提高地上部分鲜重。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，在本发明的实施例中，采用的双子叶植物为大豆。

本发明另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将MicroRNA172编码核酸分子导入目的植物，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下1)和/或2)特征：

1)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

2)所述转基因植物的生物量大于所述目的植物；

所述MicroRNA172的核苷酸序列为序列表中序列2或序列3。

上述方法中，所述MicroRNA172编码核酸分子通过重组载体导入所述目的植物；

所述重组载体为将所述MicroRNA172编码核酸分子插入表达载体得到表达MicroRNA172的重组载体；

所述MicroRNA172编码核酸分子的核苷酸序列为序列表中序列1。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；

所述生物量体现在提高根长、提高株高和/或提高地上部分鲜重。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为大豆。

上述耐盐体现在盐胁迫下提高根长、提高株高、提高地上部分鲜重和/或降低电导率。

使用Pre-miR172构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以干旱或高盐处理筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的大豆Pre-miR172导入植物细胞，可获得对高盐逆境胁迫耐受力增强、且生物量增加的转基因植株。携带有Pre-miR172的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的实验证明，本发明过表达pre-miR172得到转基因大豆，其高于转空载体大豆或野生型大豆，具体体现在盐胁迫下生物量高于转空载体或野生型大豆。本发明对培育耐盐且生物量增加的植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为miR172在各器官中的表达

图2为miR172受高盐/干旱处理诱导

图3为植物表达载体pBin438-miR172的图谱

图4为转pre-miR172大豆分子鉴定

图5为正常条件下转pre-miR172大豆的表型分析

图6为80mM NaCl处理时转pre-miR172大豆表性分析

图7为80mM NaCl处理后转pre-miR172大豆叶片和根表型

图8为转pre-miR172大豆生理指标统计

图9为转pre-miR172大豆叶和根的电导率测定

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用引物均由三博生物公司合成。

大豆科丰1号(Glycine max L.Merr.Kefeng1)记载在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTL mapping of ten agronomictraits on the soybean(Glycine max L.Merr.)genetic map and their associationwith EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；

植物双元表达载体pBin438：公众可以从中国科学院微生物研究所方荣祥院士实验室获得；参考文献：李太元,田颖川,秦晓峰,等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(辑),1994,24(3):276-282。

发根农杆菌K599记载在Attila Kereszt,et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology,Nature Protocols,2007,2(4),549-552)中，公众可从Peter M Gressnon教授，The University ofQueensland,St Lucia,Queensland4072,Australia,获得，或经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、大豆miR172的克隆及其对非生物胁迫的应答

1、大豆miR172的克隆

通过RNA-Seq测序分析获得了大豆中的部分miRNA序列及其靶基因，建立了大豆miRNA库。通过Realtime-PCR检测数个miRNA在大豆科丰1号的根、茎、叶、花、果实等不同器官的表达模式及在不同胁迫处理下的受诱导情况。Realtime-PCR实验结果表明其中miR172在根、茎、叶、花和果实中均有表达，其中在根部和茎部表达量较高(图1)。miR172在150mMNaCl和空气干燥处理下均受到诱导(图2)。因此对miR172作进一步功能鉴定。

根据大豆miRNA数据库，获得pre-miR172序列，设计引物，在大豆科丰1号的基因组DNA中扩增得到miRNA的前体pre-miR172，具体如下：

提取科丰1幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA作为模板，用如下扩增引物进行PCR扩增：

Pre-miR172-up：5’-CGCGGATCCTTAACAGTCGTTATTTGCGGATGTA(序列3)；

Pre-miR172-dp：5’-CGGGGTACCGTGAAGTCGTTTATGGCTGATGCA(序列4)

得到约159bpPCR产物。经过测序，该PCR产物为159bp，具有序列表中序列1所示的核苷酸，该核苷酸所示为pre-miR172的编码核酸分子，编码pre-miR172，该RNA的核苷酸序列为序列表中序列2，pre-miR172经过剪切得到的miR172，其核苷酸序列为序列3。

2、逆境胁迫处理下大豆miR172的表达特征

将大豆科丰1种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗分别进行盐和渗透胁迫处理。盐胁迫处理为在蛭石中加入150mM NaCl，干旱处理为将豆苗根部小心的吸去水分，置于滤纸上暴露于室温空气中。两种处理均分别在0、3、6、12小时分别收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀得到总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA。引物为：5’-5'AGAATCTTGATGATGCTGCAT和5’-GCGAGCACAGAATTAAT ACGAC，进行Real Time-PCR鉴定。大豆Tublin基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT，和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。

结果如图2所示，与未处理对照比较，在盐胁迫和脱水处理3小时时，miR172含量上升，盐胁迫下6小时至峰值，而脱水处理6小时时下降，至12小时时两种处理大豆苗中miR172量两均下降。结果说明miR172受高盐和干旱处理诱导。

实施例2、大豆miR172的耐逆性研究

一、转pre-miR172大豆植株的获得

1、植物表达载体构建

将上述实施例1的1得到的159bp含有BamHI和KpnI接头序列的PCR产物pre-miR172用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切，回收酶切产物。用限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切植物双元表达载体pBin438，回收载体骨架。两个酶切产物连接，得到的重组载体。重组载体测序，结果表明，重组载体为将序列表的序列1所示pre-miR172的编码核酸分子插入pBin438载体BamHI和KpnI酶切位点之间得到的载体，且插入的位置在CaMV35S启动子之后，将该重组载体命名为pBin438-pre-miR172，其部分结构示意图如图3所示，该载体表达pre-miR172，最终可以剪切为miR172。

2、重组农杆菌的获得

将上述得到重组载体pBin438-pre-miR172，用电击法导入发根农杆菌K599，得到重组农杆菌K599/pBin438-pre-miR172，测序，表明重组菌构建正确,该质粒为pBin438-pre-miR172。挑取重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为K599/pre-miR172。

3、转pre-miR172大豆植株的获得及鉴定

用注射器将重组农杆菌K599/pBin438-pre-miR172接种,生长6天含两片真叶的大豆科丰1号(以下也称为野生型大豆)幼苗，保湿生长：光照16小时，温度25℃，湿度50％。2周后，长出毛状根即为转化的毛状根。分别获得70个转pBin438-pre-miR172毛状根,标记为miR172-OE,继续培养，得到70个T0代转pre-miR172大豆植株；可进一步作转基因鉴定和耐逆性检测。

以相同的方法将空载体pBin438转入大豆科丰1号幼苗，得到70个T0代转pBin438大豆植株，以作为实验对照。

4.转K599/pre-miR172大豆植株分子鉴定

分别提取在水培和80mM NaCl处理3天时T0代转pre-miR172大豆植株的根(毛状根)、叶片和T0代转pBin438大豆植株根、叶片的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用miR172-F和miR172-R作为引物分析pre-miR172表达量。Real-Time PCR反应使用TOYOBO公司的RealTime PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。所用引物:

miR172-F:5'AGAATCTTGATGATGCTGCAT3'

miR172-R:5'GCGAGCACAGAATTAATACGAC3'

大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。

Primer-TF：5’-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3’

Primer-TR：5’-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’

实验重复三次，结果取平均值±标准差。

结果如图4所示，显示了Real Time PCR检测在水培和80mM NaCl处理3天时，转pre-miR172大豆植株根和叶(记作miR172-OE)和转pBin438大豆植株根和叶(记作WT)中pre-miR172的表达。从图中看出，以大豆GmTubulin基因为内标，水培(/water)时，miR172-OE根和叶中pre-miR172的相对表达量分别约为34％和18％；WT根和叶中pre-miR172的相对表达量是大豆原有的pre-miR172的表达，约为4％和3％。在80mM NaCl处理3天(/salt)时，miR172-OE中pre-miR172的相对表达量明显上升，根和叶中分别约为61％和28％，而对照WT中也略有上升，分别为5％和4％。图中所示为每个样本15株的统计数据。

从上述结果可以看出，无论是水培还是高盐胁迫下，转pre-miR172大豆植株根和叶中，pre-miR172的表达量远高于转pBin438大豆植株根和叶中pre-miR172的表达量。

转pBin438大豆与野生型大豆无显著差异。

二、转pre-miR172大豆植株的耐盐性检测

实验样本为T0代转pBin438大豆植株、野生型大豆(WT，对照)和T0代转pre-miR172大豆植株(miR172-OE)，处理前WT株高约为27.3厘米，根长约为6.1厘米；miR172-OE株高约为26.7厘米，根长约为5.9厘米。

每个株系各取10株浸入80mM NaCl水溶液中，25℃处理3天。以在水中25oC生长3天为对照。实验重复三次，结果取平均值±标准差。

1、表型观察统计

拍照观察，结果如图5所示，在正常生长情况下，WT和miR172-OE植株的生物量有明显差异，miR172-OE植株根和地上部分的生长势均显著优于对照。

图6和图7显示，在80mM NaCl处理3天后，miR172-OE植株基本保持正常生长态势，仅老叶出现萎蔫，而对照整株表现萎蔫。

WT和miR172-OE的生理指标统计列于图8，具体如下：

水培中，WT和miR172-OE根(主)的增长量分别约为2.3厘米和3.0厘米，而盐处理后，分别约为1.0厘米和1.5厘米。

水培时，对照和miR172-OE株高增长量分别约为3.5和3.8厘米，而盐处理后，约为2.1和2.95厘米。

水培时，对照和miR172-OE地上部分鲜重分别约为1.40和1.45克，而盐处理后约为0.60和1.04克。

T0代转pBin438大豆植株和野生型大豆结果无显著差异。

上述实验表明,在盐胁迫下,转基因植株根和株高增长量及植株鲜重均高于对照。

2、电导率检测

相对电导渗透率是检测植物在受到逆境胁迫的时候释放出的相对离子量，表示所鉴定部位的细胞膜受损伤的程度。一般来说，如果逆境对细胞膜的损伤大时，细胞中的离子渗漏也大，则测定出的相对电导率较大，而如果植物具有一定耐逆性，则会较大限度的保存自身的离子，因而释放出的离子较少，离子渗漏少，则相对电导率较小。因此相对电导渗透率与植物的耐盐性呈现一定的相关性。

每种各15个实验样本，包括为转基因和转化pre-miR172的植株和转化空载体的植株。在水或80mM NaCl水溶液中培养3天后分别测定相对电导率。

相对电导率测定方法：将材料用清水清洗4-6次，充分洗净材料表面的离子，将材料置于15ml玻璃管中，加入12ml去离子水，0.1Mpa抽真空20-30分钟，室温放置2-3h，测定此时溶液中的电导率G1；将玻璃管置于沸水中煮20-30分钟，待叶片完全变黄，取出，温度降到室温后再次测定电导率G2。相对电导渗透率＝G2/G1。

结果如图9所示，在正常水培(/water)下，对照和miR172-OE单叶相对电导率分别约为4.5％和4％，盐胁迫(/salt)下约为53％和35％；复叶的相对电导率水培时分别约为3.5％和3％，盐胁迫时分别约为27.5％和18％；根中的相对电导率水培时分别约为9.5％和10.5％，盐胁迫下分别约为41％和30.5％。盐胁迫下转基因植株单叶、复叶和根中的相对电导率均明显小于对照，表明转基因植株细胞膜所受的损伤小于对照。

T0代转pBin438大豆植株和野生型大豆结果无显著差异。

因此，过表达pre-miR172提高了植株的耐盐性。

Claims (5)

1.MicroRNA172或其编码核酸分子或含有其编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐盐性植物和/或提高植物生物量中的应用；

所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为大豆；

所述MicroRNA172的核苷酸序列为序列表中序列2或序列3；

所述提高生物量体现在提高根长、提高株高和/或提高地上部分鲜重。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述MicroRNA172编码核酸分子的核苷酸序列为序列表中序列1。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述含有MicroRNA172编码核酸分子的重组载体为将所述MicroRNA172编码核酸分子插入表达载体得到表达MicroRNA172的重组载体。

4.一种培育转基因植物的方法，为将MicroRNA172编码核酸分子导入目的植物，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下1）或2）特征：

1）所述转基因植物的耐盐性高于所述目的植物；

2）所述转基因植物的生物量大于所述目的植物；

所述MicroRNA172的核苷酸序列为序列表中序列2或序列3；

所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物为大豆；

所述生物量体现在提高根长、提高株高和/或提高地上部分鲜重。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述MicroRNA172编码核酸分子通过重组载体导入所述目的植物；

所述重组载体为将所述MicroRNA172编码核酸分子插入表达载体得到表达MicroRNA172的重组载体；

所述MicroRNA172编码核酸分子的核苷酸序列为序列表中序列1。