CN106032536B - 提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及应用。该基因片段的碱基组成如SEQ ID No.1所示，或基因片段为SEQ ID No.1的同义突变序列。本发明提供的针对大蕉的耐冷基因的完整开放阅读框片段，利用重组表达载体将其在香蕉中表达后，能够显著提高香蕉植株中的耐冷基因基因表达量，伴随着耐冷基因表达量的提高，香蕉植株对低温胁迫的耐受能力显著增强。因此本发明的针对大蕉的耐冷基因的完整开放阅读框片段可应用于香蕉的基因工程遗传育种，培育耐冷香蕉新品种，减轻低温对香蕉产业带来的危害，并可扩大香蕉种植区域。

Description

提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及应用

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，尤其是涉及一种提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及应用。

背景技术

香蕉和大蕉(Musa spp.)属于芭蕉科芭蕉属，是多年生大型草本单子叶植物。香蕉和大蕉是南美、中美、亚洲和撒哈拉沙漠以南的非洲等地区4亿多人的主食，也是全世界最受欢迎的水果之一。我国的香蕉种植主要分布于广东、台湾、海南、广西、福建等南亚热带地区。然而香蕉性不耐寒，在南亚热带北缘地区冬春季节频繁发生的寒潮使其极易遭受寒害威胁。近五六年中，仅广东省就遭受了2008、2011年两次特大冻害，大量蕉园被毁，产量急剧下降，造成经济损失估计超过200亿元，因此，香蕉的耐冷品种选育已成为目前香蕉产业发展中急需解决的问题。

不同种类品种的香蕉和大蕉，其耐冷性差异明显。在生产实践中发现：通常大蕉抗寒力较强，其次是粉蕉和龙牙蕉，最不耐冷的是目前商业化规模种植、风味佳的香蕉。大蕉能耐受0-4℃低温，但香蕉则不能承受如此温度。

对于香蕉耐冷性机理，前人从生理、生化等角度进行了大量的研究，如外施一些过氧化氢、钙离子、水杨酸、油菜素内酯或者甲基茉莉酸等化学试剂可提高冷敏感香蕉幼苗的抗寒性，并缓解冷胁迫造成的伤害，但未见其在农业生产中大规模应用。从分子生物学角度进行的研究报道较少，目前仅见比利时鲁汶大学热带作物改良实验室通过T-DNA tagging和实时检测技术，在香蕉中分离和鉴定出来了一个新的低温响应启动子。中山大学基因工程实验室通过抑制性缩减杂交方法，从大蕉中鉴定出来一个耐冷相关基因MpRCI，在烟草中超表达这个冷诱导的膜蛋白基因，能增强转基因烟草的耐冷性。

研究发现，大蕉在冷胁迫早期，细胞的细胞膜会发生相变，这种相变会导致肌动蛋白骨架的改变，进而启动Ca²⁺和磷酸化信号通路，比冷敏感香蕉更早地激活ICE1-CBF-COR耐冷代谢途径，在冷胁迫后期，大蕉ICE1和CBF的表达量下调，而MYBS3的表达量迅速恢复性上调，与多基因协调表达，进而调控如氧化还原过程、oxylipin生物合成过程、光合作用、光呼吸、糖酵解、三羧酸循环、碳水化合物代谢过程，脂肪酸生物合成和β-氧化等代谢过程，增强对冷胁迫的适应性。

发明内容

基于此，有必要提供一种提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及应用。

一种可提高香蕉耐冷性的基因片段，所述基因片段的碱基组成如SEQ ID No.1所示，或所述基因片段为SEQ ID No.1的同义突变序列。

一种重组表达载体，包括表达载体及插入在所述表达载体中的上述可提高香蕉耐冷性的基因片段。

在其中一个实施例中，所述表达载体为病毒载体或细菌质粒载体。

在其中一个实施例中，所述表达载体为pOX超表达载体，且在所述重组表达载体中，所述基因片段的启动子为玉米泛素启动子。

一种细胞，含有上述可提高香蕉耐冷性的基因片段。

在其中一个实施例中，所述细胞为细菌细胞或植物细胞。

在其中一个实施例中，所述植物细胞为香蕉植株细胞。

上述任一实施例所述的重组表达载体或上述任一实施例所述的细胞在培育耐冷香蕉品种中的应用。

一种重组表达载体的构建方法，包括将上述可提高香蕉耐冷性的基因片段插入空的表达载体上，得到所述重组表达载体。

一种提高香蕉耐冷性的方法，对香蕉植株进行转化处理，使所述香蕉品种含有上述可提高香蕉耐冷性的基因片段，并表达所述基因片段。

通过从耐冷大蕉中克隆出耐冷基因片段，该耐冷基因片段是耐冷大蕉应答低温胁迫的关键基因，通过对该耐冷基因片段进行研究，对于全面理解植物中冷响应信号转导途径具有重要的意义。香蕉是全球性重要的水果和粮食作物，低温是其最主要的非生物逆境胁迫之一，耐冷基因片段的克隆和生物学功能的验证，不但具有重要的理论意义，而且还有很强的生产实用价值，对于培育耐冷香蕉新品种具有重要的实际意义。

本发明针对耐冷大蕉克隆出耐冷基因片段，并利用重组表达载体将其在香蕉中表达后，能够显著提高香蕉植株中耐冷基因的表达量，伴随着耐冷基因表达量的提高，香蕉植株对低温胁迫的耐受能力显著增强。因此本发明的针对耐冷大蕉的耐冷基因片段可应用于香蕉的基因工程遗传育种，培育耐冷香蕉新品种，减轻低温对香蕉产业带来的危害，并可扩大香蕉种植区域。

附图说明

图1为一实施方式的重组表达载体的结构示意图；

图2为耐冷大蕉的叶片总RNA电泳图；

图3为耐冷基因开放阅读框的PCR扩增产物电泳图，其中，M为DL2000DNA分子量标准；

图4A为耐冷基因的染色体定位，图4B为耐冷基因表达的蛋白的结构域，图4C为耐冷基因表达的蛋白的三维结构图；

图5为各个物种ICE1氨基酸序列系统发育树同源性分析，其中，大蕉(MpICE1，KM379133)、小果野蕉(MaICE1，GSMUA_Achr10P12060)、葡萄(VaICE1，AGP04217；VaICE2，AGP04218；VaICE14，ADY17816)、V.vinifera(VvICE1，AFI49627；VvICE1b，AGQ03811)，V.riparia(VrICE1，AGG34704；VrICE2，AIA58705；VrICE3，AIA58706；VrICE4，AIA58707)，拟南芥(AtICE1，NP_189309；AtICE2，NP_172746)，油菜(BnICE1，AEL33687)，菜心(BrICE1，ACB70963)，荠菜(CbICE1，AAS79350)，茶树(CsICE，ACT90640)，赤桉(Ec ICE1，ADY68776)，蓝桉(EgICE1，AEF33833)，Eutrema salsugineum(EsICE，ACT68317)，大豆(GmICE1，ACJ39211)，大麦(HvICE2，ABA25896)，苹果(MdbHLH1，ABS50251)，西伯利亚白杨(PsICE1，ABF48720)，欧洲大叶杨(PtrICE1，ABN58427)，萝卜(RsICE1，ADY68771)，小麦(TaICE41，ACB69501；TaICE87，ACB69502)，玉米(ZmICE2，ACG46593)，分析用ClustalX 2.0比对；

图6为耐冷基因表达的蛋白与其他相关蛋白氨基酸全长序列的同源性分析，包括大蕉(Musa spp.Dajiao，ABB型)MpICE1、小果野蕉(Musa spp.DH-Pahang，AA型)MaICE1、葡萄V.amurensis(VaICE1，2)和拟南芥(AtICE1，2)的氨基酸序列比对；

图7为耐冷基因的重组表达载体的双酶切验证电泳图，其中，M为DL2000Plus DNA分子量标准；

图8为荧光实时PCR检测转基因香蕉中耐冷基因的相对表达量，其中，CK为亲本Grande Naine；DX-3、DX-5、DX-9和DX-12分别为转基因香蕉的不同株系；

图9为在人工气候室处理8天后亲本和转基因香蕉的表型图，其中，CK为亲本Grande Naine；DX为转基因香蕉株系；

图10为在广州2014年12月冬季低温处理2周后亲本和转基因香蕉的表型图，其中，CK为亲本Grande Naine；DX-3和DX-9分别为转基因香蕉的不同株系。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对本发明的提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及应用作进一步详细的说明。

本实施方式提供了一种可提高香蕉耐冷性的基因片段，其序列为序列表中SEQ IDNo.1所示的序列或其同义突变序列。同时，本发明还提供了一种提高香蕉耐冷性的方法，包括对香蕉植株进行转化处理，使香蕉植株含有上述基因片段，并能完整的表达该基因片段。该基因片段存在于耐冷大蕉基因组中，其编码的耐冷蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

本实施方式还提供了一种重组表达载体，其含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其同义突变序列。该重组表达载体可以为病毒载体或细菌质粒载体，如在一实施方式中，采用pOX超表达载体，将上述耐冷基因序列或其同义突变序列正向插入在pOX载体的SpeI与BamH I等酶切位点之间，并采用玉米泛素(ubiquitin)启动子作为耐冷基因序列或其同义突变序列的启动子，构成超表达载体。本实施方式的重组表达载体可广泛应用在培育耐冷香蕉品种的过程中，并可转化细胞，如细菌细胞或香蕉植株等植物细胞，构建含有该耐冷基因序列或其同义突变序列的细胞，

进一步，本实施方式还提供了一种重组表达载体的构建方法，其通过在空载体中插入如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其同义突变序列实现。如在一实施方式中，将扩增得到的可提高香蕉耐冷性的基因片段经SpeI和BamH I双酶切后插入到同样双酶切的pOX空载体上，得到含上述基因片段的重组表达载体，结构如图1所示，该基因片段的启动子为玉米泛素启动子，可以转化进相应的细胞中，在细胞中进行超表达，得到大量的耐冷蛋白。可理解，在其他实施方式中，载体也可以采用其他细菌质粒载体或病毒载体等，启动子也不限于玉米泛素启动子，也可以为其他超表达启动子。

在构建得到重组表达载体之后，本实施方式的构建方法还包括对构建的重组表达载体进行筛选验证的步骤，如可以将构建的pOX载体转化大肠杆菌TOP10，挑选单菌落提取质粒，采用SpeI和BamH I双酶切验证提取的质粒，筛选正确插入的质粒。

通过从耐冷大蕉中克隆出耐冷基因片段，该耐冷基因片段是耐冷大蕉应答低温胁迫的关键基因，通过对该耐冷基因片段进行研究，对于全面理解植物中冷响应信号转导途径具有重要的意义。香蕉是全球性重要的水果和粮食作物，低温是其最主要的非生物逆境胁迫之一，耐冷基因片段的克隆和生物学功能的验证，不但具有重要的理论意义，而且还有很强的生产实用价值，对于培育耐冷香蕉新品种具有重要的实际意义。

本发明针对耐冷大蕉克隆出耐冷基因片段，并利用重组表达载体将其在香蕉中表达后，能够显著提高香蕉植株中耐冷基因的表达量，伴随着耐冷基因表达量的提高，香蕉植株对低温胁迫的耐受能力显著增强。因此本发明的针对耐冷大蕉的耐冷基因片段可应用于香蕉的基因工程遗传育种，培育耐冷香蕉新品种，减轻低温对香蕉产业带来的危害，并可扩大香蕉种植区域。

以下为具体实施例部分：

实施例1 大蕉耐冷基因的克隆及其同源性分析

(1)以大蕉品种“广西灵川大蕉”(Musa spp.Dajiao,ABB型，“Guangxi LingchuanDajiao”)的叶片为试验材料，植物材料在广州国家香蕉种质资源圃正常条件下生长，冬季取样。

(2)RNA提取：用植物RNA OUT试剂盒(购自北京天恩泽基因科技有限公司)进行试验材料的总RNA提取，RNA变性胶电泳检测如图2所示。从图2可以看出，提取的RNA完整，并未降解，利用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，OD260/OD280＝1.98，符合实验要求。

(3)采用M-MLV反转录酶(购自Promega公司)逆转录总RNA中的mRNA成cDNA第一条链。以序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列为引物序列(F：5’-CGCACTAGTCCGTCTTCTGTCTTCTTCTG-3’，R：5’-GTGGGATCCAATTTCTGATTCTCCTCG-3’)，以合成的cDNA第一条链为模板链，特异性PCR扩增耐冷基因的开放阅读框，电泳结果如图3所示，PCR扩增产物大小与预期吻合。扩增过程中，采用KOD Plus Polymerase高保真酶(TOYOBO公司)进行PCR扩增，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性45s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共进行28个循环；68℃延伸5min。

(4)扩增获得的完整开放阅读框序列(即耐冷大蕉的耐冷基因片段)如SEQ IDNo.1所示，开放阅读框序列的长度为1680bp，编码一个由559个氨基酸组成的蛋白质，如SEQID No.2所示，推测分子量为59kD，pI＝5.09。如图4A所示，通过与小果野蕉(Musa spp.DH-Pahang,AA型)的基因组比对发现，耐冷基因序列定位在10号染色体，跨越3253bp。如图4B所示，结构特征分析表明，耐冷基因序列编码的蛋白含有一个保守的bHLH区域、一个ACT-like区域以及包含MYC类转录因子相似的bHLH结构域。图4C显示的是预测的耐冷基因表达的蛋白三维结构。如图5所示，氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现：耐冷基因序列与小果野蕉ICE1和葡萄VtICE1和VtICE4蛋白的同源性最高，另外，拟南芥ICE1含有一个SUMO修饰位点和与磷酸化相关的富丝氨酸结构域在耐冷基因表达的蛋白结构中也被发现。如图6所示，拟南芥ICE1中第403位的色氨酸，被丙氨酸取代后不能被泛素化，提高了抗寒性，在耐冷基因表达的蛋白中也存在此泛素化位点。

实施例2 大蕉耐冷基因的超表达载体的构建和遗传转化

实施例2的超表达载体骨架是pOX载体(由华南农业大学生命科学学院刘耀光研究员惠赠)，在此基础上构建大蕉耐冷基因的超表达载体pOX-Ubi-可提高香蕉耐冷性的基因片段，结构如图1所示。该超表达载体的构建步骤如下：将扩增得到的耐冷基因的PCR产物和pOX空载体经过Spe I和BamH I双酶切，连接到pOX载体上，再经转化大肠杆菌TOP10，挑单菌落提质粒，双酶切验证重组质粒，结果如图7所示，经测序鉴定正确后，形成如图1所示的超表达载体。该转基因超表达载体是将如SEQ ID NO.1所示的序列，正向插入表达载体pOX载体的酶切位点Spe I和BamH I之间，在宿主细胞中，该耐冷基因在玉米泛素启动子驱动下，组成性表达大蕉的耐冷基因。

实施例3 冻融法转化农杆菌EHA105

取2μl超表达载体加入至100μl的农杆菌EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min。于液氮中速冻1min，立即转入37℃水浴3～5min，待细胞融化后，加入1ml LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L及氯化钠10g/L)，28℃，180rpm摇2～4h。6000rpm离心5min，留下约100μl的上清重新悬浮细胞，并将其涂布于含有50mg/L Kan的LB平板上，28℃培养2～3天，挑单菌落进行PCR检测，将阳性菌液于-70℃保存备用。

在后续转化之前，将冻存的阳性菌液取出，解冻后，将其涂布于含有50mg/LLB平板上，于28℃恒温生化培养箱中培养直至长出单菌落。用接种环挑取单菌落于含有50mg/LKan的LB液体培养基中，28℃，180rpm摇菌过夜。6000rpm离心5min，用新鲜LB液体培养基(含有相同的抗生素浓度)重新悬浮，调节其OD600约为0.2，以相同的条件摇菌至对数生长期(OD600约为0.6～0.8)。6000rpm离心10min，收集菌体，用新鲜的M2液体培养基(MS基本培养基，2,4–D 1.0mg/L、生物素1.0mg/L、肌醇100mg/L、谷氨酰胺100mg/L、麦芽提取物100mg/L及45g/L蔗糖，pH 5.3)重新悬浮菌体，再调整OD600约为0.2，并加入乙酰丁香酮至终浓度100μmol/L，作为工程菌用于转化。

实施例4 超表达载体对香蕉品种的转化

侵染和共培养

取约100mg继代7d的Grande Naine(Musa spp.Cavendish,cv Grande Naine，AAA型)胚性悬浮细胞，转入10ml的工程菌中，在黑暗条件下，28℃，45rpm振荡侵染30min。然后，去除农杆菌，加入20ml M2液体培养基(MS基本培养基，2,4–D 1.0mg/L，生物素1.0mg/L，肌醇100mg/L，谷氨酰胺100mg/L，麦芽提取物100mg/L，45g/L蔗糖，pH 5.3；含100μmol/L乙酰丁香酮)继续在相同的条件下共培养24h。接着，将其转入28℃，110rpm，黑暗的条件下进行共培养3天，培养期间如果菌液浓度过大，则需要更换M2培养基以降低农杆菌浓度。

抗性胚的筛选

共培养之后，利用M2新鲜培养基冲洗侵染过的胚性悬浮细胞两次，然后在20ml含有400mg/L头孢菌素和5mg/L潮霉素的M2液体培养基中培养筛选1个月，每2周更换1次培养基。液体筛选之后，又将胚性悬浮细胞转至含有相同浓度的抗生素和筛选剂的M3固体培养基上(含大量元素和微量元素及铁盐SH培养基(Schenk and Hildebrandt,1972)，MS维生素(Murashige and Skoog,1962)，生物素1mg/L、谷氨酰胺100mg/L、脯氨酸230mg/L、麦芽提取物100mg/L、NAA 0.2mg/L、激动素0.1mg/L、肌醇1g/L、乳糖10g/L、蔗糖45g/L和植物凝胶2.1g/L，pH 5.8)进行胚的诱导，培养2个月至胚的成熟。

抗性胚萌发与植株再生

挑出成熟的抗性胚并转入M4胚萌发培养基中(MS基本培养基，6–BA1mg/L、NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶2.1g/L，pH 5.8)诱导胚的萌发，培养基中的抗生素和筛选剂浓度适当降低。1个月后，将健壮的萌发胚转入生根培养基RM中(MS基本培养基，NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶2.1g/L，pH 5.8)生根，获得完整的拟转基因植株，并于温室大棚内盆栽。

本实施例在转化过程中，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(胡春华等，农杆菌介导的香蕉高效遗传转化系统的建立.分子植物育种,2010,8(1):172-178)将上述超表达载体导入Grande Naine香蕉品种，通过抗潮霉素筛选标记基因HPT检测，由此确定获得转基因株系(扩增HPT基因片段所用引物：HPT-F：5’-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3'(如SEQ IDNo.5所示)；HPT-R：5’-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3'(如SEQ ID No.6所示))。

实时定量PCR鉴定转基因株系的耐冷基因表达量的程序如下：取经过HPT检测为阳性的水稻幼苗生长至四叶一心，取叶片进行总RNA的提取，采用的试剂为植物RNA OUT试剂盒(购自北京天恩泽基因科技有限公司)进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格按照试剂盒的RNA提取流程说明。并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为MMLV(Promega公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物RTICE1F和RTICE1R引物对检测耐冷基因的表达情况，采用香蕉持家基因25S ribosomal RNA基因的25SF和25SR引物对检测25S ribosomal RNA基因的表达作为内参。引物序列如下：

RTICE1F：5’-TGGGTTTGCCATGGATGTTT-3’(如SEQ ID No.7所示)

RTICE1R：5’-AGAACACCAGGGCCTTCCTT-3’(如SEQ ID No.8所示)

25SF：5’-ACATTGTCAGGTGGGGAGTT-3’(如SEQ ID No.9所示)

25SR：5’-CCTTTTGTTCCACACGAGATT-3’(如SEQ ID No.10所示)

如图8所示，1个亲本(CK)和4个超表达的转基因香蕉株系(DX-3、DX-5、DX-9和DX-12)进行耐冷基因的检测，25S ribosomal RNA基因的表达作为对照。结果表明，在持家基因25S ribosomal RNA基因在5个检测水稻株系的植株中表达一致的情况下，4个超表达的转基因香蕉株系的表达量明显提高。

实施例5 试验材料的低温处理

室内人工气候室评价：以转基因香蕉及其亲本作为试验材料。选取高约30cm、生长健壮、长势一致的Grande Naine(Musa spp.Cavendish,cv Grande Naine，AAA型)和转基因香蕉的盆栽苗进行试验。采用随机区组设计，设亲本和转基因香蕉2个处理，每3株为一试验单元。每处理设3次重复，在人工气候室中进行，人工降温程序见表1，配合降温的光照条件为：6:00-20:00时：200μmol/m²/s；20:00至次日6:00时：黑暗，相对湿度为75％。采样时间均为中午12:00点。

表1.人工气候室的降温程序

冬季室外评价：以转基因香蕉及其亲本作为试验材料。选取高约30cm、生长健壮、长势一致的Grande Naine(Musa spp.Cavendish,cv Grande Naine，AAA型)和转MpICE1的Grande Naine盆栽苗进行试验。采用随机区组设计，设亲本和转基因香蕉2个处理，每3株为一试验单元。每处理设3次重复，在广州冬季12月份进行，地点：广州国家香蕉种质资源圃，白天温度12-15℃，夜晚温度6-8℃，适度40-60％。

结果如图9和10所示，可以看出超表达耐冷基因的转基因香蕉株系无论是在人工气候室还是冬季室外，其耐冷性都要强于香蕉亲本植株。由此说明，耐冷基因是大蕉应答低温胁迫的关键基因，是一种耐冷蛋白基因。并且表明，本发明的针对大蕉耐冷蛋白基因MpICE1的超表达能够成功的提高冷敏感香蕉的耐冷性，调节香蕉对低温胁迫的适应性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种提高香蕉耐冷性的基因片段，其特征在于，所述基因片段的碱基组成如SEQ IDNo.1所示，或所述基因片段为SEQ ID No.1的同义突变序列。

2.一种重组表达载体，其特征在于，包括表达载体及插入在所述表达载体中的如权利要求1所述的提高香蕉耐冷性的基因片段。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为病毒载体或细菌质粒载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pOX超表达载体，且在所述重组表达载体中，所述基因片段的启动子为玉米泛素启动子。

5.一种细胞，其特征在于，含有如权利要求1所述的提高香蕉耐冷性的基因片段，所述细胞为细菌细胞。

6.如权利要求2～4中任一项所述的重组表达载体或如权利要求5所述的细胞在培育耐冷香蕉品种中的应用。

7.一种重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的提高香蕉耐冷性的基因片段插入空的表达载体上，得到所述重组表达载体。

8.一种提高香蕉耐冷性的方法，其特征在于，对香蕉植株进行转化处理，使所述香蕉品种含有如权利要求1所述的提高香蕉耐冷性的基因片段，并表达所述基因片段。