CN116179574A - CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实品质中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实品质中的应用，所述CmEAF7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述提高甜瓜果实品质表现为甜瓜果实中蔗糖与果糖含量提高。本发明通过沉默CmEAF7基因，对沉默植株与阴性对照进行冷处理，通过对比冷处理前后沉默植株与阴性对照之间的耐冷性表型差异以及离子渗透量的变化，明确CmEAF7基因能够正调控甜瓜苗期的耐冷性；另外，过表达CmEAF7基因能够提高甜瓜果实中果糖和蔗糖含量，相反沉默CmEAF7基因能够降低甜瓜果实中果糖和蔗糖含量，可见CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实中果糖和蔗糖含量中起着重要的作用，在甜瓜耐低温与高品质协同改良中具有潜在的应用价值。

Description

CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实品质中的应用
技术领域
本发明属于生物技术育种领域，具体涉及CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实品质中的应用。
背景技术
低温冷害是危害农业生产的重要非生物胁迫之一，不仅影响作物的正常生长发育，对产量和品质也能造成不可逆的伤害。甜瓜(Cucumis melo L.)起源于非洲和亚洲的印度和巴基斯坦地区，属于典型的喜温作物，最适生长温度在25-35℃之间，尤其是苗期对低温极其敏感。低温冷害是限制我国甜瓜生产的主要非生物胁迫之一，“倒春寒”易造成甜瓜在苗期育种和定植初期遭遇冷害胁迫，严重影响幼苗的正常生长，同时容易引发育苗期延长、定植期推后、坐果期延长、品质和产量下降等一系列问题，降低甜瓜产业的生产效益。
甜瓜作为一种重要的经济型园艺作物，营养丰富，口感香甜，深受消费者喜爱，在全世界范围内广泛种植。与大田作物不同，甜瓜的果实品质对甜瓜的产业影响重大，品质由可溶性糖、有机酸、氨基酸、香气、类胡萝卜素、抗坏血酸等综合作用决定。其中，可溶性糖和有机酸的种类和含量直接决定了瓜果的口感和风味。
抗逆性和高品质一直是农业育种的两个重要目标。植物生育期中容易遭受各种各样的危害，包括生物和非生物胁迫。面对生存和生长发育之间的权衡，植物通过复杂的调节机制来适应和响应胁迫，但这往往会对植物的生长、发育、产品器官的质量和产量造成不利影响。因此，探索平衡品质与胁迫的基因对于培育优质抗胁迫新品种具有重要的应用价值。“传统的”权衡基因在增强植物的生物和非生物抗性的同时，经常对植物的生长、发育、品质或产量造成不利影响。因此，生产中大多认为“品质优的品种抗性弱，抗性强的品种品质差”。近年来，越来越多的研究发现了一些“理想的”权衡基因，可以在不影响生长发育和产量的情况下提高抗逆性，这些可能是未来育种中的“理想型”基因。
本发明涉及到的CmEAF7为组蛋白H4乙酰转移酶的亚基，该基因同源基因的功能研究在植物中也鲜有报道。本发明首次发现CmEAF7基因在提高甜瓜苗期耐冷性与果实品质中具有重要应用价值，可能成为甜瓜耐低温与高品质育种中的“理想型”基因之一，具有十分广阔的应用前景。对于从分子层面研究基因对甜瓜的耐冷性和果实品质的影响具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实品质中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：
本发明采用的CmEAF7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且具有同等功能的衍生基因。
上述CmEAF7基因编码的蛋白选自，
(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或
(3)与(1)限定的蛋白序列有80％(较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白。
也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述CmEAF7基因，还包括与SEQID NO.1具有较高同源性(如高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因在提高植物耐冷性和/或果实品质方面的功能。
其中，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的381bp，为CDS序列。其基因编码126个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在此方面的功能也落入本发明的保护范围之内。
本发明公开的CmEAF7基因在提高植物耐冷性和/或果实品质中的生物学功能，所述耐低温表现为：低温处理(4℃)后，CmEAF7基因沉默株系的幼苗耐冷性低于野生型；所述果实品质表现为：CmEAF7基因沉默株系果实的蔗糖和果糖含量低于对照；而CmEAF7过表达果实的蔗糖和果糖含量高于对照。
根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐冷和高品质的植株，具体地，可以通过将CmEAF7基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐冷性和品质高于目的植物。
具体地，CmEAF7基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，所述方法为以下(1)或(2)：
(1)通过增加目的植物中CmEAF7蛋白的活性，获得耐低温和/或果实品质强于目的植物的植株；
(2)通过促进目的植物中CmEAF7基因的表达，获得耐低温和/或果实品质强于目的植物的植株；
“促进目的植物中CmEAF7基因的表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：
(1)将CmEAF7基因导入目的植物；
(2)引入强启动子和/或增强子；
(3)本领域内的其它常见方法。
其中，目的植物，本发明所述目的植物是甜瓜。
目的基因，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。
为了研究基因的功能，有时通过“抑制目的植物中的CmEAF7基因的表达”的方法来进行，“抑制目的植物中的CmEAF7基因的表达”的方法为敲除、沉默或定向突变CmEAF7基因。
所述敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述CmEAF7基因敲除，获得转基因植物株系。本发明就是通过沉默CmEAF7基因获得沉默株系来验证了沉默株系的幼苗耐冷性低于野生型，CmEAF7基因沉默株系果实的蔗糖和果糖含量低于对照，来说明CmEAF7基因能够正调控甜瓜幼苗的耐冷性和果实的蔗糖和果糖含量。
本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：甜瓜，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
本发明的优点：
本发明采用VIGS技术在三种甜瓜材料中分别沉默CmEAF7基因，获得阳性沉默植株。首先，对阳性植株通过提取叶片总RNA，反转录获得cDNA，进一步通过荧光定量PCR证明沉默植株中CmEAF7基因表达量显著下降。其次，对沉默植株与阴性对照进一步冷处理，通过对比冷处理前后沉默植株与阴性对照之间的耐冷性表型差异以及离子渗透量的变化，明确CmEAF7能够正调控甜瓜苗期的耐冷性。三种甜瓜材料中的结果高度一致，表明CmEAF7基因在甜瓜耐低温分子育种中具有重要的应用价值。
本发明还通过在甜瓜果实糖分积累的关键时期，利用瞬时转化技术，对两种甜瓜材料的果实进行了瞬时过表达和沉默。通过荧光定量PCR证明瞬时过表达后CmEAF7基因的表达量显著性增加，同时瞬时沉默样本中CmEAF7基因的表达量显著性下降。进一步通过植物蔗糖和果糖含量检测试剂盒检测了过表达和沉默不同时间点的蔗糖和果糖含量变化，证实了过表达CmEAF7能够提高甜瓜果实中果糖和蔗糖含量，相反沉默CmEAF7能够降低甜瓜果实中果糖和蔗糖含量。
本发明提供了CmEAF7基因在提高甜瓜苗期耐冷性与果实品质中的应用，过表达CmEAF7基因能够同时提高甜瓜苗期耐冷性和增加甜瓜果实中的蔗糖和果糖含量。在甜瓜耐低温与高品质协同改良中具有潜在的应用价值。
可以通过转基因的方式来获得耐低温和/或高品质的植株，具体地，可以通过将CmEAF7基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株耐冷性和品质(蔗糖和果糖含量高)高于目的植物，为植物耐低温和/或高品质育种提供一种新的途径。
附图说明
图1是VIGS沉默植株叶片中CmEAF7基因表达量；
图2是HH09、HH14和H581 CmEAFVIGS沉默植株与阴性对照的耐冷性鉴定；
图3是HH09、HH14和H581 CmEAF7基因沉默植株和阴性对照冷处理前后的离子渗透量比较；
图4是HH14和H581果实中瞬时过表达与沉默后部分样本中CmEAF7基因表达量；
图5是HH14和H581果实中瞬时过表达与沉默后样本中蔗糖与果糖含量的测定。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括eDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。
实施例1CmEAF7基因的克隆
以甜瓜材料HH09的cDNA为模板，通过引物CmEAF7-F1(ACGGGGGACTCTTGACCATGGTAATGGAAAGCGGCGGC包含载体接头)和CmEAF7-R1(AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTTTAAGACTCTTCTTTGACGAAGAAG包含载体接头)扩增CDS全长(381bp)，序列如SEQ ID NO.1所示。pCAMBIA1302载体采用Nco I和Spe I限制性内切酶进行双酶切，37℃酶切1h后进行产物纯化。利用同源重组的方法将CmEAF7的381bp CDS全长与线性化的pCAMBIA1302载体片段进行同源重组。重组产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有卡那抗性的LB平板上生长12h后，挑取若干单克隆进行扩繁培养，使用CaMV35s通用引物进行阳性检测。阳性克隆经一代测序，显示HH09中CmEAF7的CDS序列与参考基因组(DHL92)完全一致，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2CmEAF7基因正调控甜瓜苗期耐冷性功能验证
(一)CmEAF7基因VIGS表达载体的构建
以甜瓜材料HH09的cDNA为模板，通过引物CmEAF7-F2(TGTTTTAAATGCCTTTACGTAAGAACAAGACGGCATTTCTG包含载体接头)和CmEAF7-R2(AACACACAAAACACCTACGTAGCTTCAGCATCTCCAGGTTA包含载体接头)扩增获得特应性片段(269bp)，序列如SEQ ID NO.3所示。TRSV2载体采用SnaB I限制性内切酶进行单酶切，37℃酶切2h后进行产物纯化。利用同源重组的方法将CmEAF7的269bp特异性片段与线性化的TRSV2载体片段进行同源重组。重组产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有卡那抗性的LB平板上生长12h后，挑取若干单克隆进行扩繁培养，使用TRSV2载体通用引物TRSV2-F(TGCGTCGCACTGAGGCA)和TRSV2-R(GCAGCTGACAGACAGACA)进行阳性检测。阳性克隆测序无误后提取质粒，进一步转入农杆菌感受态细胞GV3101，在含有卡那和利福平抗性的LB平板上生长48h后，再次使用TRSV2-F和TRSV2-R引物进行阳性鉴定。TRSV2-CmEAF7重组菌液保存于15％的甘油，-80℃保存备用。
(二)CmEAF7基因沉默植株
分别对HH09、HH14和H581的种子进行温汤浸种(55℃，30min)，剥去种皮，消毒后播种于1/2MS培养基上，待根长1-2cm后用于侵染。播种的同时准备侵染用的菌液，提前将TRSV1、TRSV2和TRSV2-CmEAF7农杆菌菌液在含有卡那(100mg/L)和利福平(50mg/L)抗性的LB平板上进行划线，挑取单克隆用含有卡那(100mg/L)和利福平(50mg/L)抗性的LB进行小摇，取适量菌液用含有卡那(50mg/L)和AS(15μM)的LB进行大摇，待OD600为0.8-1.0时于超净工作台内收集菌液，5000rpm离心5min后弃上清。用含有4.43g/L MS、30g/L蔗糖、100μM AS(乙酰丁香酮)和1.25mM MES的重悬液(无菌，pH 5.8)重悬，并调整OD600为1.0左右。将TRSV1重悬菌液分别与TRSV2和TRSV2-CmEAF7重悬菌液等比例混合，25℃培养箱中黑暗静置培养2-3h后用于后续侵染。
于超净台内将根长1-2cm的种子在子叶远轴端切一刀(方便农杆菌进一步从伤口处进行侵染)，分别放入TRSV1+TRSV2和TRSV1+TRSV2-CmEAF7的重悬菌液中，-0.9MPa抽真空5min，使菌液从根和子叶伤口渗入进行侵染。于无菌滤纸上吸干菌液后置于共培养培养基(4.43g/LMS、30g/L蔗糖、100μMAS、1.25mMMES和8g/L琼脂，pH 5.8)上，25℃黑暗共培养4d。移栽至营养钵中，置于25℃16h光照/8h黑暗的人工气候箱中进行培养。
(三)沉默植株CmEAF7基因表达量的鉴定
沉默植株于三叶一心时期进行CmEAF7基因表达量的鉴定。取第三片真叶样品，用全式金RNA提取试剂盒(Code#ET101-01)提取样本总RNA，全式金反转录和荧光定量试剂盒(Code#AUQ-01)分别进行反转录和实时荧光定量PCR，具体实验操作参考试剂盒说明书进行。VIGS沉默植株的表达量如图1所示。
(四)鉴定CmEAF7基因功能
(1)低温处理后耐冷性鉴定
对三叶一心的CmEAF7 VIGS沉默植株(TRSV2-CmEAF7)和阴性对照(TRSV2)进行4℃冷处理实验。冷处理16h时取样用于生理指标的测定。同时根据HH09、HH14和H581甜瓜幼苗的耐冷性强度的差异，进行不同程度的冷处理。其中HH14材料的CmEAF7沉默植株和阴性对照在4℃冷处理60h后进行25℃恢复培养96h；HH09和H581材料的CmEAF7沉默植株和阴性对照在4℃冷处理60h后进行25℃恢复6h，再继续0℃处理48h后25℃恢复培养96h。结果显示，沉默CmEAF7后，HH09、HH14和H581幼苗的冷害程度较相应的阴性对照明显升高，即耐冷性均降低(图2)。
(2)离子渗透量的测定
分别测定常温生长材料与4℃冷处理16h的CmEAF7沉默植株和阴性对照的离子渗透量(测定结果见图3)。在15ml离心管中加入8ml去离子水，将第一片真叶上打取的6个叶盘放入其中，于室温下摇床中200r/min震荡15min，测定电导率S1。将15ml离心管置于水浴锅中100℃煮沸20min，再放于摇床中200r/min震荡20min，待液体冷却至室温后测定电导率S2。只含有去离子水的空白对照电导率记为S0，根据下列公式计算离子渗透量：
离子渗透量(％)＝(S1-S0)/(S2-S0)*100。
综上，我们发现沉默CmEAF7基因后，HH09、HH14和H581幼苗的耐冷性均降低。进一步比较冷处理前后沉默植株(TRSV2-CmEAF7)和阴性对照(TRSV2)之间离子渗透量的变化，冷处理后沉默植株(TRSV2-CmEAF7)的离子渗透量均显著高于阴性对照(TRSV2)，即植株耐冷性降低，说明CmEAF7基因能够正调控甜瓜幼苗的耐冷性(图2和3)。
实施例3CmEAF7基因正调控甜瓜蔗糖和果糖含量的功能验证
(1)CmEAF7基因瞬时过表达载体的构建
以甜瓜材料HH09的cDNA为模板，通过引物CmEAF7-F3(TCTGAGCTCTCTAGAATGGAAAGCGGCGGCAAAG包含载体接头)和CmEAF7-R3(TTTGGCGTCTTCCATAGACTCTTCTTTGACGAAGAAG包含载体接头)扩增获得CmEAF7CDS全长序列(378bp，不包含终止密码子)，序列如SEQ ID NO.4所示。pCAMBIA3301-LUC载体采用Spe I和HindIII限制性内切酶进行双酶切，37℃酶切1h后进行产物纯化。利用同源重组的方法将CmEAF7全长CDS与线性化的pCAMBIA3301-LUC载体片段进行同源重组。重组产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α。阳性克隆测序无误后提取质粒，进一步转入农杆菌感受态细胞EHA105，在含有卡那和利福平抗性的LB平板上生长48h后，进行阳性鉴定。pCAMBIA3301-CmEAF7-LUC(简写为OE-CmEAF7)重组菌液保存于15％的甘油，-80℃保存备用。
(2)CmEAF7基因瞬时沉默载体的构建
以甜瓜材料HH09的eDNA为模板，通过引物CmEAF7-F4(GCCCTTGCTCACCATGAATTCATGGAAAGCGGCGGCAAAG包含载体接头)和CmEAF7-R4(TCTTCACTGTTGATACATATGAGACTCTTCTTTGACGAAGAAG包含载体接头)扩增获得CmEAF7 CDS全长序列(378bp，不包含终止密码子)，序列如SEQ ID NO.4所示。pRI101-EGFP载体采用EcoR I和Nde I限制性内切酶进行双酶切，37℃酶切1h后进行产物纯化。利用同源重组的方法将CmEAF7 CDS反向链接至pRI101-EGFP载体，构建反义融合表达载体pRI101AS-CmEAF7-EGFP(简写为AS-CmEAF7)。重组产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α。阳性克隆测序无误后提取质粒，进一步转入农杆菌感受态细胞EHA105，在含有卡那和利福平抗性的LB平板上生长48h后，进行阳性鉴定。pRI101AS-CmEAF7-EGFP重组菌液保存于15％的甘油，-80℃保存备用。
(3)注射法瞬时过表达和沉默甜瓜果实中CmEAF7基因
1、侵染菌液的制备
分别吸取少量过表达载体(OE-CmEAF7)及其空载(OE-LUC)和反义沉默载体(AS-CmEAF7)及其空载(AS-GFP)的甘油菌，按照1∶100的比例加入含有卡那和利福平的LB液体培养基中28℃进行小摇。随后将以上菌液进行扩大培养，按1∶100的比例加入到含有25u g/ml利福平、50u g/ml卡那、10mM MES和20μM AS的LB液体培养基中，28℃200r/min振荡培养18-24h至菌液OD600值为1.0-1.5。
5000rpm室温离心5min收集菌体，用含有10mM MES、10mM MgCl2、200μM AS、0.005％Tween 20(v/v)和100mg/L 2，4-D的悬浮液进行重悬。调整重悬菌液OD600为1.0-1.2，28℃黑暗静置培养2-3h，备用。
2、注射法侵染甜瓜果实
分别选取H581和HH14授粉后20-25d，大小一致的甜瓜果实用于瞬时转化。选择注射部位为甜瓜果实赤道和靠近瓜蒂部位进行注射，注射深度为果肉厚度1/2左右，每孔注射菌液0.5ml，每个瓜注射6-9个点。分别于注射后1.5、3.5、5.5和7.5d进行取样。用1cm直径的打孔器取注射针孔附近的果肉样品，弃去果皮和种子部位，在活体荧光成像仪中检测LUC与GFP表达情况，根据荧光表达情况进行取样，液氮速冻，-80℃保存备用。
(4)CmEAF7基因表达量的鉴定
瞬时转化果肉样品经液氮研磨，用华越洋多糖多酚RNA提取试剂盒(Cat：0416-50gk)提取样本总RNA，全式金反转录和荧光定量试剂盒(Code#AUQ-01)分别进行反转录和实时荧光定量PCR，具体实验操作参考试剂盒说明书进行。部分样品的表达量如图4所示。
(5)甜瓜果实中蔗糖与果糖含量的测定
瞬时转化果肉样品经液氮研磨，分别准确称取0.05g样本，用北京盒子生工科技有限公司的植物蔗糖含量检测试剂盒(Cat.AKPL006M)和植物果糖含量检测试剂盒(Cat.AKPL007M)分别检测瞬时过表达和沉默样品中的蔗糖与果糖含量。结果见图5，瞬时表达5.5d时，H581和HH14中过表达(OE-CmEAF7)果实的蔗糖和果糖含量均较阴性对照(OE-LUC)果实显著增加。相反，沉默(AS-CmEAF7)果实的蔗糖和果糖含量较阴性对照(AS-GFP)果实显著降低。
综上，过表达CmEAF7能够提高甜瓜果实中蔗糖和果糖含量，沉默CmEAF7则降低其含量。因此，CmEAF7基因能够正调控甜瓜果实中蔗糖与果糖含量，有助于提高甜瓜品质。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (7)

1.CmEAF7基因在提高甜瓜耐冷性和/或果实品质中的应用，其特征在于，所述CmEAF7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述提高甜瓜果实品质表现为甜瓜果实中蔗糖与果糖含量提高。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过构建CmEAF7过表达载体，获得耐低温和/或高品质的转基因植株。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为甜瓜。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述耐低温表现为：低温处理后，CmEAF7基因沉默株系的幼苗耐冷性低于野生型；所述果实品质表现为：CmEAF7基因沉默株系果实的蔗糖和果糖含量低于野生型；而CmEAF7过表达株系的果实的蔗糖和果糖含量高于野生型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述低温处理的温度为4℃。
6.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下(1)或(2)或(3)：
(1)通过增加目的植物中CmEAF7蛋白的活性，获得耐低温和/或果实品质强于目的植物的植株；
(2)通过促进目的植物中CmEAF7基因的表达，获得耐低温和/或果实品质强于目的植物的植株；
所述CmEAF7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CmEAF7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述果实品质通过甜瓜果实中蔗糖与果糖含量来体现。
7.根据权利要求6所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物为甜瓜。
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