CN117721127A - 三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2及其编码蛋白、引物对和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于三叶木通种植领域，公开了一种三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2及其编码蛋白、引物对和应用，并公开了相应的核苷酸序列和氨基酸序列。通过在三叶木通中过表达AtrBGAL2可加速三叶木通果实开裂和果皮中果胶的降解，而抑制表达AtrBGAL2可减缓三叶木通果实开裂和果皮中果胶的降解。还公开包含AtrBGAL2基因的过表达载体和沉默载体，并提供所述基因AtrBGAL2在培育延迟果实成熟与开裂新品种中的应用，该基因AtrBGAL2能显著减缓三叶木通果皮中果胶的降解，为培育延迟果实成熟与开裂三叶木通新品种提供了基因和载体资源。

Description

三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2及其编码蛋白、引物对 和应用

技术领域

本发明属于三叶木通种植技术领域，尤其涉及一种三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2及其编码蛋白、引物对和应用。

背景技术

三叶木通(Akebia trifoliate(Thunb.)Koidz.)隶属木通科木通属，作为一种野生藤本果树，广泛分布于中国20多个省市，药、食、油和赏兼用，营养丰富，适种区域广，增产潜力大，经济效益高。三叶木通腹缝线处的果皮会随着果实成熟而逐渐开裂，也被称为“八月札”，此时果肉开始变软，可食用，是品尝果实的最佳时期，也是采摘的最佳时期。

不同树种或品种的裂纹位置和形状也不同。果树在规模化栽培和推广过程中，裂果会导致外观不良，易因细菌感染而引起果实腐烂，降低适销性和抗病性，影响果实品质，降低商品价值，缩短果实贮藏期。保鲜期品质降低，加速果实老化，影响果实利用率和生产成本，造成重大的商业价值和产量损失。

自20世纪30年代以来，研究人员已经进行了许多果树开裂相关的理论和实践研究。裂果是内因和外因共同作用的结果，内因主要是果实本身的特性(果实的大小、形状、硬度、角质、蜡质沉积、果皮强度、果皮细胞的排列、果皮细胞的数量、果实中气孔的数量和状况、可溶性糖等渗透调节剂的积累、果实生长阶段等，而外部因素主要是环境因素(水分、光照、温度、风等)和栽培管理措施(灌溉、矿质营养等)。近年来研究发现裂果与遗传的相关性显著大于与环境的相关性，揭示裂果性状表现出稳定的遗传性，可能受到特定基因的调控。

由于环境对裂果的影响难以控制、成本高、效果弱，因此很难彻底解决这一问题。选育抗裂品种是更有效的解决方案，但裂果遗传分析是培育抗裂品种的初步要求。但目前有关于三叶木通果皮开裂调控研究有限，因此挖掘三叶木通果皮开裂调控的候选基因，可为三叶木通或其它木通属的品质改良与分子育种提供理论与技术支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2及其编码蛋白和应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种用于克隆所述基因AtrBGAL2的引物对，其碱基序列如下：

AtrBGAL2-cDNA-F：5’-TTTGAGAAGGCATTGGGAGA-3’；

AtrBGAL2-cDNA-R：5’-GTATACTACGAAGAAATCTGACAAGC-3’。

一种过表达载体，包括载体PBI121-eGFP，在所述载体PBI121-eGFP中包含所述基因AtrBGAL2。

一种用于构建所述过表达载体的引物对，其碱基序列如下：

AtrBGAL2-XbaI-F：5’-aaggttaccgaattctctagaGCTATAGTGGTTAATGGATACCGAAG-3’；

AtrBGAL2-BamH-R：5’-cgtgagctcggtaccggatccGTTGCAAGTATTTATAATCGGGTCG-3’。

一种病毒诱导的基因沉默载体，包括载体pTRV2，在所述载体pTRV2中包含所述基因AtrBGAL2。

一种用于构建所述基因沉默载体的引物对，其碱基序列如下：

AtrBGAL2-cDNA-F(pTRV2)：5’-TTATTATTACGGACCAGTG-3’；

AtrBGAL2-cDNA-R(pTRV2)：5’-GCGGTTAAGAGATTTGAA-3’；

AtrBGAL2-BamH-F(pTRV2)：5’-agaaggcctccatggggatccGCTATAGTGGTTAATGGATACCGAAG-3’；

AtrBGAL2-BamH-R(pTRV2)：5’-cgtgagctcggtaccggatccGTTGCAAGTATTTATAATCGGGTCG-3’。

一种基因AtrBGAL2的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种基因AtrBGAL2在培育延迟/加速果实成熟与果皮开裂新品种中的应用。

上述的应用，优选的，通过在植物中过表达AtrBGAL2以加速植物的果实成熟与果皮开裂，通过在植物中抑制表达AtrBGAL2以延迟植物果实成熟与果皮开裂。

更优选的，所述植物新品种为三叶木通或番茄的新品种。

三叶木通品种选育中的应用，通过过表达AtrBGAL2以加速三叶木通果皮中果胶的降解，进而加速三叶木通果皮开裂；通过抑制表达AtrBGAL2以减缓三叶木通果皮中果胶的降解，进而延迟果实成熟与果皮开裂。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种基因AtrBGAL2在番茄品种选育中的应用，通过过表达AtrBGAL2以加速番茄果实成熟；通过抑制表达AtrBGAL2以延缓番茄果实成熟。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明首次发现三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2，并公开了其核苷酸序列及其编码蛋白的序列，通过在三叶木通中过表达AtrBGAL2可加速三叶木通果实开裂和果皮中果胶的降解，进而加速三叶木通果皮开裂；而抑制表达AtrBGAL2可减缓三叶木通果实开裂和果皮中果胶的降解，进而延迟果实成熟与果皮开裂。

2、本发明还公开包含AtrBGAL2基因的过表达载体和沉默载体，并提供所述基因AtrBGAL2在培育延迟果实成熟与开裂新品种中的应用，该基因AtrBGAL2能显著减缓三叶木通果皮中果胶的降解，为培育延迟果实成熟与开裂三叶木通新品种提供了基因和载体资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是三叶木通AtrBGAL2基因PCR扩增产物，(a)BGAL2 cDNA片段长度(b)农杆菌菌液PCR片段长度；

图2是三叶木通AtrBGAL2保守结构域分析；

图3是三叶木通AtrBGAL2氨基酸序列同源性比对；

图4是AtrBGAL2蛋白三维结构模拟图；

图5是AtrBGAL2在三叶木通不同发育时期和不同种质中的表达模式分析；

图6是AtrBGAL2基因亚细胞定位分析；

图7是三叶木通果皮瞬时侵染过表达和抑制表达AtrBGAL2基因表型观察和PCR检测，(a)表型观察；(b)PCR检测；

图8是瞬时侵染过表达和抑制表达AtrBGAL2基因三叶木通果皮中细胞壁物质含量测定；

图9是三叶木通果皮瞬时表达AtrBGAL2基因表达量分析；

图10是部分转基因阳性植株表型观察及PCR检测；

图11是部分转基因阳性植株PCR检测及测序结果比对；

图12是AtrBGAL2基因编辑突变体番茄果实表达量分析。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明采用的三叶木通果实采自湖南省沅江市中国农业科学院麻类研究所三叶木通资源圃，在未成熟时对三叶木通果实进行瞬时转化，取样后用于后续分析。

实施例：

本发明首先对三叶木通BGAL家族成员进行生物信息学分析，从三叶木通果皮中分离得到BGAL2全长cDNA序列，对该基因的结构特征、表达模式及烟草转化进行了研究。确定BGAL2基因的定位信息；通过瞬时转化获得过表达和抑制表达三叶木通果实；通过对番茄进行遗传转化，获得了超表达和基因编辑的转基因果实，为阐明BGAL基因对三叶木通果实成熟和开裂的影响以及调控果实开裂的分子机制提供依据。具体试验如下：

1试验方法

1.1三叶木通果皮总RNA提取及反转录

使用植物通用性RNA提取试剂盒(艾科瑞生物科技有限公司，中国长沙)，从三叶木通果皮样品中分离用于克隆目的基因的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA样品的纯度。使用Thermo Scientific反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA，体系和程序见表1。

表1反转录反应体系

1.2三叶木通果皮开裂关键基因AtrBGAL2的克隆

根据三叶木通基因组中AtrBGAL2基因(Atr04G009500)CDS序列(2550bp)，AtrBGAL2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

ATGAGTTCCTCCAGACTTGTAATGTGGAACGTGTGGAGAACCCACACGTTTCTGCTGATGATCATATTTTCTTGTTTTTGGTCTGTTAAAGCCTCTGTGTCTTACGACCATAAGGCTATAGTCGTTAATGGATACCGAAGAATCCTTATTTCGGGTTCCATCCACTACCCACGAAGCACTCCTGAGATGTGGCCGGATCTTATTCAAAAGGCAAAAGATGGAGGTTTGGATGTAATCGAAACCTATGTGTTCTGGAATGGGCACGAGCCTTCTCCAGGCAAATATTATTTTGAGGGGAGATATGATCTGGTTCGGTTTGTTAAGCTAGTGAAGCAAGCTGGCCTTTATGTTCATCTCAGGATTGGTCCCTATGTTTGTGCTGAATGGAACTTTGGAGGGTTTCCTGTTTGGCTGAAATATGTTCGTGGTATCAGTTTCAGAACAGACAATGAACCTTTCAAGGTTGCAATGAGAGGATTTACAAAAAAGATTGTTGACATAATGAAGGCAGAAGGATTGTTTGAAACTCAAGGAGGTCCGATAATTCTTTCGCAGATAGAGAATGAATATGGACCTGTGGAGTGGGAAATCGGTGCTCCTGGTCGTGCTTATACTAAATGGGCAGCAGATATGGCCGTGGGTCTCGACACTGGAGTCCCGTGGGTCATGTGTAAGCAAGATGATGCTCCCGACCCGATTATAAATACTTGCAACGGTTTCTACTGCGATTGGTTCTCTCCTAACAAGGCTTATAAGCCCAAGATGTGGACTGAAAACTGGACTGGCTGGTTCACAGGGTTTGGGGGTCCGGTTCCTCACCGGCCTGCTGAAGATATAGCATTTTCAGTTGCCAAATTTATACAAAAAGGTGGATCGTTCATTAACTACTACATGTACCACGGAGGGACAAATTTCGGTCGGACAGCGGGTGGTCCTTTTATAGCCACTAGTTATGACTATGATGCTCCAATCGATGAATATGGACTACTAAGGGAACCTAAATGGGGTCATTTGAGAGATCTTCATAGAGCCATCAAGCTATGTGAGCCAGCTTTAGTTTATTCAGAACCGACTGTGATGTCCCTTGGGAATAATCAAGAGGCTCATGTCTTCACGTATAAGGCTGGAGGTTGTGCTGCGTTCCTCGCAAACTATGACTCAAAATCTTTTGCAACAGTAGCCTTTCGAAACATGCACTATAACCTCCCTCCTTGGTCTATCAGCATCCTTCCTGATTGCAAGAACACCGTTTACAACACTGCAAGGGTTGGGTCACAAAGCTCACAGATGAAAATGACACCAGTGCGCAATGGATTCTCTTGGCAGTCATACAATGACGAGACTGCCTCCTATGATGACAATTCAATCACGACAGTTGGGTTGATGGAGCAAATAAATACCACTAGAGATGTTTCAGACTATTTGTGGTACTCAACAGCCGTTAAGATAGACCCAGACGAACAATTCTTGAAGAATGGCCAATACCCTGAGCTTACGGTGTTATCGGCAGGCCATGCTTTGCATGTTTTCATCAATGGCCAGCTATCAGGAACTGCGTACGGGAATATAGATCACCCGAAACTAACATTCAATGGCAATGTAAGACTGCGAGCTGGAATGAACATGATTTCTCTATTAAGCATCGCTGTTGGCCTCCCGAATGTCGGTCCACATTTCGAGACATGGAATGCTGGGGTTCTTGGTCCAGTCACGCTGACAGGTCTCAATGAGGGGAAAAGAGATTTAACATGGCAGAAATGGTCATACAAGATTGGGTTGAAGGGAGAATCTTTGAGTCTTCATACACTCAGTGGAAGTAATTCTGTTGAGTGGGTTGAAGGGTCTTTACTCGCTCAAAAGCAGCCCCTGACATGGTATAAGACCATCTTTAATGCACCAGCTGGCAACGATCCCTTGGCTTTAGATATGGGTAGCATGGGTAAAGGTCAGGTATGGATAAATGGGGAGAGCATTGGACGCTATTGGCCTGCATACAAAGCATCTGGTTCCTGTGGCGGCTGTAATTATGCCGGAACATATACCGAGAAAAAATGTCAAAGTAATTGCGGAGAGGCCTCGCAAAGATGGTACCACATTCCTCGTTCATGGCTGGACCCAACTGGGAACCTATTGGTTGTTTTTGAAGAATGGGGTGGTGAACCAAGTGGGATTACTTTGGTTACAAGAACAGTACAAAGTGTTTGTGCTAATATTTTCGAATGGCAGCCAACACTTATGAATTACCAAATGCAAGCCTCGGGCAGAGTCGACAGACCCTTAAGGCCCAAAGCCCATCTATGGTGTGCCCCGGGGCAGAAAATCTCATCGATAAAGTTTGCAAGCTTTGGAACTCCACAAGGAGTTTGTGGAAGCTTTAGGGAGGGAAGCTGTCATGCCCACAAGTCGTACGATGCTTTCGAGAGGGAGGGTCTATTGCAGAATTGTGTTGGGAGGCAAGCGTGCGCAGTAAGTGTGGCTCCTGAGGTTTTCGGAGGAGATCCTTGTCCAAGTGTCATGAAGAAGCTCTCAGTTGAGGCCATCTGCAGCTGA。

通过Primer Premier 5软件设计用于克隆基因AtrBGAL2的引物并交由公司合成，其引物序列为：

AtrBGAL2-cDNA-F：5’-TTTGAGAAGGCATTGGGAGA-3’(如SEQ ID NO：3)；

AtrBGAL2-cDNA-R：5’-GTATACTACGAAGAAATCTGACAAGC-3’(如SEQ ID NO：4)。

以正常生长的对照果实cDNA为模板，使用KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO，日本)扩增目的基因，PCR反应体系及反应程序见表2。

表2 PCR反应体系及程序

首先，通过1.0％(W/V)琼脂糖凝胶电泳分离目的基因的PCR产物，并在凝胶成像系统上观察目的条带大小。随后，使用凝胶回收试剂盒(Omega D2400-01，Omega，美国)回收纯化目的条带。

1.3目的基因AtrBGAL2过表达和VIGS载体构建

使用pEASY-Blunt克隆载体试剂盒(北京全世金生物技术有限公司)通过平端连接将回收的目的基因产物连接到克隆载体中，克隆载体连接体系及程序见表3。连接产物用热休克法转化大肠杆菌感受态DH5α(北京青科生物技术有限公司，北京)，回收后均匀涂于含有抗生素氨苄青霉素的LB培养基上，置于37℃培养箱中培养过夜。选择单菌落收集于10μL灭菌超纯水中，使用pEASY载体中的通用引物，Taq DNA聚合酶(北京全世金生物技术有限公司)对单克隆进行PCR检测，反应体系及方法见表4。阳性克隆在含氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增培养后测序。使用NCBI BlastN和DNAMAN 9将测序结果与目标基因的CDS序列进行比较。

表3克隆载体连接体系及程序

表4 PCR反应体系及程序

使用二元表达载体PBI121-eGFP构建含有AtrBGAL2基因(Atr04G009500)ORF序列的表达载体。以PBI121-eGFP序列作为载体序列，以目的基因序列作为连接序列。选择QuickCutTMXbaI和Quick CutTM BamHI作为限制性内切酶，设计带有限制性位点的PCR引物，其引物序列为：

AtrBGAL2-XbaI-F：5’-aaggttaccgaattctctagaGCTATAGTGGTTAATGGATACCGAAG-3’(如SEQ ID NO：5)；

AtrBGAL2-BamH-R：5’-cgtgagctcggtaccggatccGTTGCAAGTATTTATAATCGGGTCG-3’(如SEQ ID NO：6)。

以含有AtrBGAL2基因ORF序列的克隆载体的重组质粒作为模板进行PCR扩增(PCR扩增体系如表2)，通过琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收得到AtrBGAL2基因片段。用QuickCut^TMXbaI和QuickCut^TMBamHI限制性内切酶酶切PBI121-eGFP质粒DNA，反应体系见表5，对酶切后的产物进行电泳、回收，获得线性化载体片段。

将得到的AtrBGAL2基因片段与线性化的PBI121-eGFP载体通过ClonExpressR II一步克隆法试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国)进行连接，连接体系如表6所示。转化DH5a感受态(北京擎科生物科技有限公司，中国)后，涂布于含有卡那霉素(Kan⁺)的LB固体培养基中，37℃培养过夜。利用35S-F端引物(PBI121-eGFP载体)和AtrBGAL2基因的R端引物对获得的阳性克隆进行PCR检测、测序。选择正确测序的单克隆菌液进行质粒提取，转化农杆菌感受态细胞GV3101(北京擎科生物科技有限公司，中国)，涂布到含有Kan⁺和利福平的固体LB培养基上，28℃培养2天。收集单克隆进行PCR确认阳性克隆，按照1:1(50％甘油：菌液)放于-80℃冰箱保存。

将从三叶木通果皮中克隆得到的AtrBGAL2基因的CDS序列为靶基因序列，以PYL156(pTRV2)序列用作载体序列，选择Quick CutTM BamHI作为限制性内切酶，设计带有限制性位点的PCR引物，通过酶切，连接，测序、提取质粒、转化农杆菌等步骤(参照过表达载体构建)，获得pTRV2-AtrBGAL2重组载体。其引物序列为：

AtrBGAL2-cDNA-F(pTRV2)：5’-TTATTATTACGGACCAGTG-3’(如SEQ ID NO：7)；

AtrBGAL2-cDNA-R(pTRV2)：5’-GCGGTTAAGAGATTTGAA-3’(如SEQ ID NO：8)；

AtrBGAL2-BamH-F(pTRV2)：5’-agaaggcctccatggggatccGCTATAGTGGTTAATGGATACCGAAG-3’(如SEQ ID NO：9)；

AtrBGAL2-BamH-R(pTRV2)：5’-cgtgagctcggtaccggatccGTTGCAAGTATTTATAATCGGGT CG-3’(如SEQ ID NO：10)。

表5酶切反应体系及反应程序

表6酶切反应体系及反应程序

表7连接体系

1.4瞬时侵染三叶木通果实

瞬时过表达侵染液的配置：将PBI121-AtrBGAL2-eGFP过表达重组载体农杆菌菌液，在LB固体培养基中划线，并在28℃恒温培养箱中培养过夜。挑选单克隆接种到1mL液体LB培养基中(含卡那霉素和利福平)，28℃、200r/min下培养过夜，待菌液浑浊后取100μL菌液转移至50mL液体LB培养基(含卡那霉素和利福平)中，28℃、200r/min下培养过夜。最后将菌液5000rpm下离心15min，弃上清，将沉淀重悬于MES缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES，200μM乙酰丁香酮，pH＝5.6)中，测定OD₆₀₀值，调整到0.8-1.0，侵染前添加0.1％的吐温静置2-3个小时。

三叶木通果皮病毒介导的基因沉默侵染液的配置：方法同上，取构建好的含AtrBGAL2基因的pTRV2沉默载体、空载pTRV2沉默载体、pTRV1农杆菌菌液进行活化，重悬于MES中，将pTRV2-AtrBGAL2沉默载体、空载pTRV2载体重悬液与pTRV1重悬液按1:1的体积比混合，加入0.1％的吐温，配制成侵染液。

三叶木通果实侵染：选择成熟度相同、无机械损伤、无病虫害的果实作为接种材料，注射含有目的基因片段的PBI121-AtrBGAL2-eGFP过表达载体农杆菌液的果实作为试验组，注射PBI121-eGFP作为对照，将重悬的菌液用5mL无菌注射器通过挤压法注射到成熟前20天左右的果皮中，每个部位至少注入菌液2mL，每组至少侵染20个果实。一周后从树上摘下果实，在注射部位附近采集相应的果皮组织，液氮冷冻，保存在-80℃超低温冰箱中。

同样选择成熟度相同、无机械损伤、无病虫害的果实作为接种材料，注射含有目的基因片段的pTRV2-AtrBGAL2基因沉默表达载体农杆菌液的果实作为试验组，注射pTRV2+pTRV1作为对照，将重悬的菌液用5mL无菌注射器通过挤压法注射到成熟前20天左右的果皮中，每个部位至少注入菌液2mL，每组至少侵染20个果实。一周后从树上摘下果实，在注射部位附近采集相应的果皮组织，液氮冷冻，保存在-80℃超低温冰箱中。

1.5目的基因AtrBGAL2基因编辑载体构建

载体一：pP1C.5重组载体的构建

通过在线设计软件CRISPR-P v2.0，根据三叶木通AtrBGAL2序列，设计获得可编辑AtrBGAL2的靶位点序列GATTCTCTGTGTCTTACGACCATA(核苷酸序列如SEQ ID NO：11)和GATTGACCGAAATTTGTCCCTCCG(核苷酸序列如SEQ ID NO：12)，GC含量值为45％和55％，靶位点GC含量符合在40％-70％之间。AtrBGAL2-1的靶点位置为384-403bp区域(共20bp)，PAM序列为AGG；同时AtrBGAL2-2的靶点位置为3152-3133bp区域(共19bp)，PAM序列为TGG。sgRNA的表达由拟南芥AtU6-26启动子驱动。通过用BsaⅠ酶切消化将pP1C.5载体线性化，将退火后的靶位点引物连接至线性化的载体上，从而将靶位点序列克隆至sgRNA的上游位置。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆。将阳性克隆菌落放于含有Kan⁺的液体LB培养基中，37℃生长16h。然后提取重组质粒并测序，测序正确的重组质粒-20℃保存备用。

载体二：pP1C.L重组载体的构建

pP1C.L基因编辑载体的Cas9蛋白两侧有核定位信号，其表达由35S启动子驱动。将pP1C.5重组载体用EcoRI酶切回收小片段。同时使用EcoRI对pP1CL进行线性化以回收大片段。将线性化载体与凝胶回收产物相连接。涂布在含有Kan⁺的固体LB培养基上，37℃生长16h。使用U6-F和gRNA-R作为PCR检测的引物。保存正确测序的菌株并提取质粒以备后用。最后将得到的阳性质粒克隆和空载体质粒进行农杆菌转化，用于后续实验。

1.6番茄遗传转化及转基因植株的检测

将饱满的番茄种子在无菌条件下用75％酒精消毒30秒，用无菌水清洗3次。加20％次氯酸钠消毒20分钟，用无菌水清洗5-10次。在MS培养基上播种，25℃下培养7-15天。剪下子叶，置于预培养基(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/LZT)上，弱光培养24-36小时。将上述过表达重组载体的农杆菌菌液接种到50mL LB液体培养基中，28℃过夜培养。以6,000rpm离心10分钟，并将细胞重悬于液体MSO培养基(MS+100mMAS)中。然后将预培养的外植体浸泡在MSO中10-15min，灭菌水洗3-5次，播种于MS培养基上，25℃培养。共培养2天后，转移至选择培养基(MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L ZT+100mg/L Kan⁺+100mMAS)，然后每3周更换一次培养基，直至愈伤组织形成。将生长良好的愈伤组织放入分化培养基(MS+0.1mg/L IAA+1.75mg/L ZT+100mg/L Kan⁺+300mg/L Timentin)中，诱导出芽成苗。将幼苗移至生根培养基(MS+0.3mg/LIAA+100mg/L Kan⁺+150mg/L Timentin)中用于生根培养。

通过农杆菌浸染法将过表达载体达转入番茄植株，获得转基因AtrBGAL2过表达和沉默表达的番茄植株，提取叶片基因组RNA、PCR检测和测序，鉴定转基因阳性植株。通过RT-qPCR分析阳性植株中基因表达量变化。

2结果与分析

2.1AtrBGAL2基因克隆和序列特征

以全裂时期三叶木通果皮cDNA为模板扩增BGAL2基因全长ORF序列。扩增产物经电泳、回收、连接、转化、测序等操作，得到BGAL2全长ORF 2550bp，编码849个氨基酸(图1)。利用在线预测工具ExPASy ProtParam，BGAL2基因编码的氨基酸相对分子量为94.71kD，PI为7.94，分子式为C₄₂₈₅H₆₄₄₉N₁₁₃₅O₁₂₁₉S₄₂。通过TMHMM Server v.2.0和SignalP 5.0Server进行在线预测，发现BGAL2蛋白具有跨膜结构域和信号肽。pLoc-mPlant在线预测BGAL2蛋白定位于细胞壁。通过NetPhos 2.0Server在线分析预测BGAL2蛋白中有11个磷酸化位点(>0.9)(7个Ser,2个Thr,2个Tyr)。BGAL2蛋白含有保守的β-半乳糖苷酶结构域(图2)。通过比较BGAL2基因不同转录本编码的氨基酸序列发现BGAL2与Atr04G009500.2和Atr04G009500.4蛋白序列同源性较高，与Atr04G009500.3同源性较低(图3)。BGAL2具有保守的GH35和Gal_Lectin家族结构域。利用SOPM在线软件分析BGAL2蛋白的二级结构，发现该蛋白主要由α-螺旋(22.65％)，延伸链(25.17％)和不规则卷曲(44.7％)组成。利用SWISS-MODEL在线预测BGAL2蛋白的三维结构如图4。

AtrBGAL2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

MSSSRLVMWNVWRTHTFLLMIIFSCFWSVKASVSYDHKAIVVNGYRRILISGSIHYPRSTPEMWPDLIQKAKDGGLDVIETYVFWNGHEPSPGKYYFEGRYDLVRFVKLVKQAGLYVHLRIGPYVCAEWNFGGFPVWLKYVRGISFRTDNEPFKVAMRGFTKKIVDIMKAEGLFETQGGPIILSQIENEYGPVEWEIGAPGRAYTKWAADMAVGLDTGVPWVMCKQDDAPDPIINTCNGFYCDWFSPNKAYKPKMWTENWTGWFTGFGGPVPHRPAEDIAFSVAKFIQKGGSFINYYMYHGGTNFGRTAGGPFIATSYDYDAPIDEYGLLREPKWGHLRDLHRAIKLCEPALVYSEPTVMSLGNNQEAHVFTYKAGGCAAFLANYDSKSFATVAFRNMHYNLPPWSISILPDCKNTVYNTARVGSQSSQMKMTPVRNGFSWQSYNDETASYDDNSITTVGLMEQINTTRDVSDYLWYSTAVKIDPDEQFLKNGQYPELTVLSAGHALHVFINGQLSGTAYGNIDHPKLTFNGNVRLRAGMNMISLLSIAVGLPNVGPHFETWNAGVLGPVTLTGLNEGKRDLTWQKWSYKIGLKGESLSLHTLSGSNSVEWVEGSLLAQKQPLTWYKTIFNAPAGNDPLALDMGSMGKGQVWINGESIGRYWPAYKASGSCGGCNYAGTYTEKKCQSNCGEASQRWYHIPRSWLDPTGNLLVVFEEWGGEPSGITLVTRTVQSVCANIFEWQPTLMNYQMQASGRVDRPLRPKAHLWCAPGQKISSIKFASFGTPQGVCGSFREGSCHAHKSYDAFEREGLLQNCVGRQACAVSVAPEVFGGDPCPSVMKKLSVEAICS。

2.2AtrBGAL2基因表达模式分析

为了了解AtrBGAL2基因表达的特异性，我们分析了该基因在不同组织、不同发育阶段、不同种质中表达量的变化。首先选取不同发育时期的腹缝线(V)和背部(B)果皮组织，91d(08-V，08-B)，122d(09-V，09-B)，132d(PS-V，PS-B)、142d(PM-V，PM-B)和152d(PL-V，PL-B)进行RT-qPCR分析。结果表明AtrBGAL2基因在果实未开裂时期，如91d，122d和132d果皮样品中表达量较低，而在142d(PM)和152d(PL)中表达量逐渐升高。其次，AtrBGAL2在不同组织中也具有明显的差异表达，腹缝线和背部果皮中表达量相似，BGAL2在背部组织中的表达量同样呈现出随果实成熟开裂而逐渐升高的趋势(图5)。另外，我们对不同种质中AtrBGAL2基因的表达模式进行分析，发现在不同种质中，AtrBGAL2基因同样表现出随果实成熟开裂而逐渐升高的趋势，在全裂时期表达量达到最高，与前期转录组测序和RT-qPCR验证结果的表达量相一致。结合AtrBGAL2基因在不同时期、不同组织、不同种质中的表达量变化，结果表明果实中AtrBGAL2基因表达水平随着果实的成熟和开裂而逐渐升高，且在全裂时期表达量最高，推测BGAL2基因可能参与了三叶木通果实的成熟与开裂。

2.3AtrBGAL2基因亚细胞定位分析

通过在线网站预测，推测AtrBGAL2蛋白定位在细胞壁上。为了确定AtrBGAL2蛋白是否定位于细胞壁，我们构建了过表达载体PBI121-AtrBGAL2-GFP，并利用农杆菌侵染法将PBI121-AtrBGAL2-GFP与PBI121-GFP转化烟草叶片，然后在激光共聚焦显微镜下观察。结果显示PBI121-GFP荧光信号在细胞不同部位中均有表达，而PBI121-AtrBGAL2-GFP发出的绿色荧光主要分布在细胞壁，从定位结果中可以看出，PBI121-AtrBGAL2-GFP定位在细胞壁中(图6)。

2.4AtrBGAL2过表达促进果胶裂解和果实开裂

在前期研究中，AtrBGAL2作为果皮开裂的关键下游基因之一，其表达量在开裂果皮中显著上调。因此，我们选择对AtrBGAL2基因进行进一步的功能验证。以农杆菌重悬液PBI121-AtrBGAL2、PBI121-GFP、pTRV2-AtrBGAL2、TRV2+TRV1为材料，在成熟前20天左右对三叶木通果皮进行瞬时侵染。通过PCR检测，获得AtrBGAL2基因在PBI21和pTRV2重组载体中对应的片段大小。说明通过瞬时侵染，获得了过表达和抑制表达AtrBGAL2基因的三叶木通果实。

与对照相比，侵染PBI121-AtrBGAL2一周后的腹缝线更加清晰可见，果皮开始出现裂口。而在注射pTRV2-AtrBGAL2后一周，与对照相比，注射部位的色素沉着减少，未发现可见的腹缝线(图7)。分别提取过表达、对照、抑制表达果皮的细胞壁成分，包括水溶性果胶(WSP)、酸溶性果胶(ASP)、纤维素和半纤维素。与对照果实相比，OE-AtrBGAL2果实表现出较高的WSP含量以及较低的ASP含量，纤维素和半纤维素含量，而在抑制表达照果实中观察到相反的情况(图8)。

2.5AtrBGAL2基因表达量分析

对瞬时转化的PBI121-AtrBGAL2、PBI121-GFP、pTRV2-AtrBGAL2、pTRV2+pTRV1果实进一步进行RT-qPCR分析，发现与对照相比，过表达果实(OE-AtrBGAL2)中，AtrBGAL2基因表达量远高于对照PBI21-GFP果实，高达20-25倍；在仅注射pTRV2+pTRV1的对照果实中，AtrBGAL2基因表达水平是抑制表达果实(pTRV2-AtrBGAL2)的2-2.5倍(图9)。我们分析了在瞬时过表达和抑制表达果实中细胞壁降解相关基因的表达量变化。发现细胞壁降解相关基因的表达量同样存在过表达中表达量较高，而在抑制表达果实中较低。结合细胞壁物质含量变化，说明AtrBGAL2基因过表达促进果胶降解，基因沉默则延缓细胞壁物质降解，特别是果胶降解，促进/延缓三叶木通果实的成熟与开裂。

2.6AtrBGAL2转基因番茄的鉴定与基因表达量分析

通过番茄的遗传转化，共获得5个转AtrBGAL2基因独立株系，以转基因植株叶片cDNA为模板，AtrBGAL2基因克隆35S-F/AtrBGAL2-R为引物，检测外源基因是否整合到番茄基因组中。部分转基因植株PCR检测结果如图10，测序结果表明2个转PBI121-AtrBGAL2-GFP独立株系均为转基因阳性植株。

为了探索AtrBGAL2的表达模式，通过RT-qPCR检测AtrBGAL2在不同发育阶段的转录水平。AtrBGAL2的表达水平在番茄果实发育过程中急剧增加，在对照和转基因果实的红熟期达到最高，但OE果实中AtrBGAL2的表达量比对照果实增加约100倍。与对照相比，OE-AtrBGAL2果实中细胞壁降解相关基因的转录本随着果实成熟逐渐增加，同样在红熟期表达量达到最高(图12)。

2.7AtrBGAL2基因编辑番茄的鉴定与基因表达量分析

为了进一步分析AtrBGAL2基因的功能，我们利用CRISPR/Cas9技术将AtrBGAL2基因编辑载体转化到番茄叶片中。通过PCR扩增了AtrBGAL2基因的基因编辑位点所在区域的片段。PCR产物连接至T载体上，挑取单克隆进行Sanger测序，结果表明本研究构建的基因编辑载体能够对AtrBGAL2基因进行编辑，共产生3种突变类型(图11)。其次，对AtrBGAL2基因在突变体和对照植株中的表达量进行分析，表明与对照果实相比，突变体果实中AtrBGAL2基因表达量显著下调。其次，AtrBGAL2基因突变体果实中，细胞壁降解基因表达量同样呈现出显著下调的趋势(图12)。前期对三叶木通瞬时过表达和抑制表达的细胞壁成分分析也表明，过表达AtrBGAL2可加速果胶的降解，而抑制表达AtrBGAL2可减缓果胶的降解。结合表型数据，说明虽然AtrBGAL2在三叶木通果实成熟与开裂中发挥重要作用。

在本发明中，通过前期的转录组分析，发现果胶相关基因AtrBGAL2可能在果皮开裂中发挥重要作用，选择该基因作为下游靶基因进一步分析其对果实成熟和开裂的影响。通过AtrBGAL2瞬时过表达和抑制表达三叶木通果实，发现在OE-AtrBGAL2转基因果实中，WSP增加，ASP、纤维素和半纤维素含量下降，表明三叶木通果实中SSP到WSP的变化是导致其裂果的主要原因。此外，OE转基因果实显示出果胶相关基因的表达量的增加。AtrBGAL2转基因番茄果实中表现相同的表达模式。然而，来自VIGS和基因编辑AtrBGAL2突变体果实中，WSP含量低于对照果实，且AtrBGAL2基因的表达量也低于对照果实，表明VIGS和基因编辑方法成功地用于三叶木通中。此外，番茄TBGAL6反义抑制被证明可以增加果实的开裂。然而，通过抑制三叶木通的AtrBGAL2表达可延迟果实成熟与开裂，这表明物种之间的基因组和基因功能差异很大。

Claims (10)

1.一种三叶木通果皮开裂调控基因AtrBGAL2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种用于克隆如权利要求1所述基因AtrBGAL2的引物对，其特征在于，其碱基序列如下：

AtrBGAL2-cDNA-F：5’-TTTGAGAAGGCATTGGGAGA-3’；

AtrBGAL2-cDNA-R：5’-GTATACTACGAAGAAATCTGACAAGC-3’。

3.一种过表达载体，其特征在于，包括载体PBI121-eGFP，在所述载体PBI121-eGFP中包含如权利要求1所述基因AtrBGAL2。

4.一种用于构建如权利要求3所述过表达载体的引物对，其特征在于，其碱基序列如下：

AtrBGAL2-XbaI-F：5’-aaggttaccgaattctctagaGCTATAGTGGTTAATGGATACCGAAG-3’；

AtrBGAL2-BamH-R：5’-cgtgagctcggtaccggatccGTTGCAAGTATTTATAATCGGGTCG-3’。

5.一种病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于，包括载体pTRV2，在所述载体pTRV2中包含如权利要求1所述基因AtrBGAL2。

6.一种用于构建如权利要求5所述基因沉默载体的引物对，其特征在于，其碱基序列如下：

AtrBGAL2-cDNA-F：5’-TTATTATTACGGACCAGTG-3’；

AtrBGAL2-cDNA-R：5’-GCGGTTAAGAGATTTGAA-3’；

AtrBGAL2-BamH-F：5’-agaaggcctccatggggatccGCTATAGTGGTTAATGGATACCGAAG-3’；

AtrBGAL2-BamH-R：5’-cgtgagctcggtaccggatccGTTGCAAGTATTTATAATCGGGTCG-3’。

7.一种如权利要求1所述的基因AtrBGAL2的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种如权利要求1所述的基因AtrBGAL2在培育延迟/加速果实成熟与果皮开裂植物新品种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达AtrBGAL2以加速植物的果实成熟与果皮开裂，通过在植物中抑制表达AtrBGAL2以延迟植物果实成熟与果皮开裂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物新品种为三叶木通或番茄的新品种。