CN117384915A - 纹瓣兰CaHY5基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子育种技术领域，具体公开了一种纹瓣兰CaHY5基因及其应用。本发明提供的CaHY5基因是bZIP家族的基因，将其转入本氏烟草，过表达CaHY5转基因植物的株高、侧枝数、花朵数和果荚数均显著增加，愈伤组织芽再生率显著提高，表明CaHY5基因能改善植株生长发育，促进分枝，增加花朵数和果荚数，提高芽分化率，可用于相关育种目标性状的遗传改良。

Description

纹瓣兰CaHY5基因及其应用

技术领域

本发明属于植物分子育种技术领域。更具体地，涉及纹瓣兰CaHY5基因及其应用。

背景技术

国兰株形优美、花色雅致、香气宜人，在我国有悠久的栽培历史和丰富的文化内涵，素有“花中君子”之称。但其组培快繁效率低，导致国兰迄今依然主要靠分株繁殖生产种苗，严重威胁国兰产业可持续发展。因此改良国兰组培快繁特性，培育易工厂化繁殖国兰新品种就成为推动国兰产业化和大众化发展，传播和推广兰文化的关键。

易工厂化繁殖国兰新品种可以采用杂交结合回交，最终将大花蕙兰中易组培快繁基因导入国兰中进行，但该方法所需时间长(曾瑞珍等，2014；2016)。我们的研究表明，通过杂交和回交培育易工厂化繁殖墨兰新品种需要20年以上时间。因此建立快速培育易工厂化繁殖国兰新品种对推动国兰产业化发展具有重要意义。转基因是一种快速培育兰花新品中的方法，具有育种周期短、效率高、资源利用范围广和定向精准改良植物性状的特点，而开展转基因育种的首要条件是获得关键育种目标性状基因。因此，克隆获得更多新的兰花优良性状基因用于国兰新品种的育种具有重要意义。

HY5是一个强大的基因，在植物光形态建成、植物激素信号传递和花青素代谢调控、营养积累和高温低温胁迫等方面起着极其重要的作用(Xiao et al.,2022)。各种植物中的HY5直系同源物已被证明可以介导多种光调节的发育和反应，如本氏烟草、大豆、豌豆、苹果、苔藓、番茄、水稻和玉米中的HY5调节下胚轴或茎的生长，以及植物对遮荫、内部激素信号和外部信号(光、低温和高温)的反应(Oyama et al.,1997；Yamawaki et al.,2011；Anet al.,2017；Burman et al.,2018；Wang et al.,2018；Huai et al.,2020)。HY5在植物的生长发育过程中发挥极其重要的作用，是整合光信号与其他生理生化过程的关键光响应因子，但迄今为止在兰花上未见报道，其具体作用机制尚不明确。目前在兰花中关于HY5基因的研究仍然较少，更缺少其在兰花生长发育方面的研究。因此，克隆兰花HY5基因对推动兰花分子育种和产业发展，进一步开展兰花进化研究具有十分重要的意义。

发明内容

本发明提供纹瓣兰CaHY5基因及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种纹瓣兰CaHY5基因。

本发明的第二个目的是提供纹瓣兰CaHY5基因的编码蛋白。

本发明的第三个目的是提供纹瓣兰CaHY5基因的应用。

本发明的第四个目的是提供一种重组载体以及包含重组载体的重组菌。

本发明的第五个目的是提供一种促进植物生长、分枝或果期改良的制剂。

本发明的第六个目的是提供一种促进植物分枝发育和/或果期改良的转基因材料的构建方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首次在纹瓣兰中克隆并鉴定得到一个cDNA全长为633bp的基因，该基因属于bZIP家族，为CaHY5基因，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中5’UTR为73bp，3’UTR为98bp；CDS为462bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；CaHY5基因的编码蛋白的氨基酸序列全长为153aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明通过PCR扩增方法从纹瓣兰中克隆了一个基因CaHY5，通过构建表达载体，转化到本氏烟草中，发现转基因本氏烟草叶外植体诱导出的愈伤组织芽分化率显著提高，能够用于改善组织培养过程中外植体芽分化少的情况；同时，CaHY5基因过表达的转基因植株的侧枝数增加，生长速度快；花朵数、果荚数和株高增加，显示过表达CaHY5基因会改变分枝发育，促进植株侧枝生长，能够用于植物改善植物组培快繁的芽分化，并解决植物芽分化难的问题；能促进植株生殖生长，促进果实成熟，对于提高植物芽分化率，分枝发育和果期提早具有重要意义，为CaHY5基因在分子育种中的应用奠定了基础。

因此，本发明提供纹瓣兰CaHY5基因或其表达促进剂、或其编码蛋白在促进植物生长或在制备植物促生剂、在促进植物组培快繁中的芽再生、在促进植物分枝、花朵开放和/或果荚成熟、在制备促进植物分枝或果期改良制剂、在构建促进分枝和果实发育的转基因材料中的应用。

进一步地，所述促进植物生长为促进植物生殖生长，具体为促进分枝生长、花朵开放、果荚成熟。

进一步地，所述促进植物果实发育为促进植株果实成熟。

优选地，所述植物为纹瓣兰、烟草。

更近一步地，表达促进剂包括但不限于：表达激活剂、酶激活剂、化合物促进剂、质粒等。

本发明提供一种重组载体，包含纹瓣兰CaHY5基因。

本发明提供一种重组菌，包含上述重组载体。

本发明还提供一种促进植物生长、分枝或果期改良的制剂，包含过表达纹瓣兰CaHY5的试剂。

本发明还提供一种构建促进分枝和果实发育的转基因材料的方法，将纹瓣兰CaHY5基因通过植物表达载体转化到植物中，从而获得含有纹瓣兰CaHY5基因的转基因材料；或在植物中过表达纹瓣兰CaHY5基因。

优选地，先构建super1300-CaHY5-cGFP植物表达载体，然后将super1300-CaHY5-cGFP植物表达载体转化至农杆菌中，再以农杆菌叶盘法转化植物。

更优选地，所述植物表达载体由super1300-cGFP载体和CaHY5基因连接而成，植物表达载体的构建方法为：先合成CaHY5基因的cDNA序列，然后扩增编码区序列，得目标序列；最后将目标序列与载体连接，得到植物表达载体。

作为上述技术方案的优选实施例，扩增编码区序列所用引物为：

CaHY5-F：5’-AAAATCTTCTCCTTCTACTTGC-3’；

CaHY5-R：5’-AAAGATAATAAGCGAAACACGA-3’。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过PCR扩增方法从纹瓣兰克隆了一个基因CaHY5，通过构建表达载体，转化到本氏烟草中，发现转基因本氏烟草叶外植体诱导出的愈伤组织芽分化率显著提高，能够用于改善组织培养过程中间繁殖体的芽分化；表明纹瓣兰CaHY5基因可以在组织培养的芽分化阶段促进外植体的分化，这在改变植物组织培养中的分化特性和改变植株生长趋势上具有广泛的应用前景。

其次，CaHY5基因过表达的转基因植株的侧枝数增加，生长速度快，显示过表达CaHY5基因会改变分枝发育，促进植株侧枝生长，能够用于植物改善并解决植物分枝数量少的问题，对于提高植物芽分化率和分枝发育具有重要意义，为CaHY5基因在分子育种中的应用奠定了基础。

再者，CaHY5基因过表达的转基因植株的花朵数和果荚数增加，发育速度比野生型快，显示过表达CaHY5基因会改变植株果期，促进植株多花多果，能够用于植物改善并解决植物花少果少的问题，对于促进果实发育和果期改良具有重要意义，为CaHY5基因在作物育种中的应用奠定了基础。

附图说明

图1为本发明包含CaHY5基因cDNA片段的1％琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明包含super1300-cGFP载体酶切位点和同源臂的CaHY5目的基因扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。

图3为目的基因启动子为35SN的过表达载体super1300-CaHY5-cGFP载体图。

图4为本发明转CaHY5基因本氏烟草PCR阳性验证图(注：M.DL2000Marker；23.对照植株CK；24.阳性对照质粒；14、18和22为未转化植株，其余为转化植株)。

图5为本发明转CaHY5基因阳性和野生型本氏烟草叶片外植体于光下培养40d时愈伤增殖芽分化情况对比图(注：A1.WT见光0d；A2.WT见光20d；A3.WT见光30d；A4.WT见光40d；B1.OE-1见光0d；B2.OE-1见光20d；B3.OE-1见光30d；B4.OE-1见光40d；C1.OE-2见光0d；C2.OE-2见光20d；C3.OE-2见光30d；C4.OE-2见光40d；D1.OE-3见光0d；D2.OE-3见光20d；D3.OE-3见光30d；D4.OE-3见光40d)。

图6为本发明转CaHY5基因本氏烟草和野生型植株生长情况对比图。

图7为本发明转CaHY5基因本氏烟草和野生型植株性状比较图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中采用的RNA提取试剂盒为TakaRa Mini BEST Plant RNAExtraction Kit(TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(诺唯赞公司)；反转录试剂盒为HiScript III1st Strand cDNA Synthesis Kit(诺唯赞公司)。

实施例1CaHY5基因的挖掘与克隆

1、序列挖掘与比对

对纹瓣兰(Cymbidium aloifolium)和‘企剑白墨’墨兰(Cym.sinense‘Qijianbaimo’)茎尖培养获得的根状茎进行芽分化培养，选取在光照下易分化纹瓣兰和难分化‘企剑白墨’墨兰芽分化阶段的根状茎，采用试剂盒提取样本RNA并构建cDNA文库的转录组测序数据，通过生物信息学方法分析，找到了在两个材料芽分化时期差异表达的一段unigene序列，将这段unigene序列在NCBI数据库中进行Blast比对，发现unigene序列与其他物种的HY5基因相似度较高，推测可能为纹瓣兰的HY5基因，并将其命名为CaHY5基因，并进一步进行其功能验证。

2、纹瓣兰芽分化阶段的根状茎总RNA提取

取新鲜的纹瓣兰芽分化阶段的根状茎约1g，于液氮中迅速研磨成粉，采用用试剂盒，按照说明书提取纹瓣兰总RNA，溶解于灭菌的超纯水，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，-80℃超低温冰箱中保存待使用。

3、CaHY5基因cDNA全长克隆

CaHY5基因cDNA全长的扩增包括基因核心序列的扩增、3’端序列的扩增和5’端序列的扩增。其中，我们根据unigene序列进行基因核心引物设计，设计得到的基因核心序列扩增引物为：

CaHY5-F：5’-AAAATCTTCTCCTTCTACTTGC-3’；

CaHY5-R：5’-AAAGATAATAAGCGAAACACGA-3’；

扩增完成后，将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖电泳，并用凝胶回收试剂盒进行产物回收。回收之后的产物利用pMD^TM18-T Vector进行TA克隆，转化大肠杆菌感受态DH5α、挑取阳性单克隆并送至上海生工生物公司进行Sanger双端测序。

PCR产物进行琼脂糖电泳检测结果如图1所示，最终获得CaHY5基因的cDNA全长633bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示，其中5’UTR为73bp，3’UTR为98bp；其编码区CDS为462bp，具体序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列全长为153aa，具体序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2CaHY5基因植物表达载体的构建

1、第一链cDNA的合成

取纹瓣兰芽分化阶段根状茎提取总RNA，提取方法同实施例1，并采用反转录试剂盒合成纹瓣兰第一链cDNA，具体反应步骤为(1)基因组DNA去除：Total RNA 1μg；2μL 5×gDNA wiper Mix；RNase-Free ddH₂O up to 10μL，用移液枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2min；(2)配制第一链cDNA合成反应液：取10μL上一步的混合液，2μL 10×RT Mix，2μL HiScriptIII Enz yme Mix，1μL Oligo(dT)20VN和5μL RNase-free ddH₂O，用移液枪轻轻吹打混匀；37℃孵育15min，85℃孵育5s，完成cDNA的合成，存于-20℃备用。

2、super1300-CaHY5-cGFP表达载体构建

(1)根据CaHY5的CDS序列信息和Super1300-cGFP载体序列信息设计同源臂引物：super1300-CaHY5-F：5’-CCAAATCGACTCTAGTCTAGAATGCAGC GAGAGCAAGCAA-3’；super1300-CaHY5-R：5’-TATTTAAATGTCGACCCCGG GTCACGAAAGGCTTTCTCCCA-3’；并采用同源臂引物克隆目的片段。

super1300-cGFP载体酶切位点和同源臂的CaHY5目的基因扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，显示super1300-CaHY5-cGFP载体构建成功。

(2)用限制性内切酶XbaI和SmaI对Super1300-cGFP载体进行双酶切，配制酶切反应体系：取37.5μL ddH₂O，加入5μL 10×FastDigest Buffer，2.5μL限制性内切酶XbaI，2.5μL限制性内切酶SmaI和2.5μL载体质粒，混匀后置于37℃恒温箱中酶切过夜后，80℃水浴灭活25min，得到线性Super1300-cGFP载体片段。

(3)将PCR产物和酶切产物分别进行切胶回收(采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。

(4)将双酶切的目的基因和双元载体进行连接，37℃连接30min，反体系如下：双酶切载体产物4μL，目的基因回收产物5μL，Exnase II 1μL。

(5)大肠杆菌转化：将上述重组产物用热激法转入大肠杆菌感受态DH5α，具体步骤如下：取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，冰上静置20min。42℃水浴热激80sec后，立即置于冰上冷却2min；加入500μL LB液体培养基，200rpm，37℃摇菌1h；5,000rpm离心5min收集菌体，弃掉450μL上清。用150μL重悬菌体在含有Kan抗性的平板上轻轻涂匀；37℃培养箱中倒置过夜培养。

(6)重组质粒阳性鉴定：挑取5个平板上长出的单菌落，置于3-5mL含相应抗生素的液体培养基中，37℃、220rpm摇菌12h；提取大肠杆菌质粒的DNA，并以其为模板用包含外源DNA插入片段的引物进行PCR扩增，检测引物序列为：

super1300-F：5’-GCCATTTCGCCTTTTCAG-3’；

super1300-CaHY5-R：5’-TCACGAAAGGCTTTCTCCCA-3’；

再通过凝胶电泳检测片段大小，将检测正确的质粒载体送公司测序；测序结果用Bioedit软件进行比对，查看目的基因是否插入正确，正确条带为588bp，将成功构建的super1300-CaHY5-cGFP表达载体，如图3所示，取500μL菌液并加入500μL灭菌甘油(浓度为50％)进行混合，并置于-80℃保存。

实施例3纹瓣兰CaHY5基因农杆菌介导转化本氏烟草及鉴定

1、农杆菌EHA105感受态的转化

取2.5μL super1300-CaHY5-cGFP重组质粒载体加入到100μL农杆菌感受态细胞中，置于冰上30min，液氮速冻5min，37℃水浴5min；加入300μL液体LB培养基，220rpm，28℃摇菌4h；取150μL菌液均匀涂布于含有Kan抗性的平板上，28℃倒置培养2d；挑取单菌落检测正确后，于含有Kan抗性的液体培养基中，28℃，220rpm，培养14h，并取500μL菌液与50％的无菌甘油等体积混合于无菌离心管中，保存于-80℃。进行检测验证，检测引物同实施例2，结果表明Super1300-CaHY5-cGFP载体质粒成功导入农杆菌。

2、本氏烟草无菌播种

对由华南农业大学林学与风景园林学院陈曙博士惠赠的野生型本氏烟草种子(Nicotiana benthamiana)，用无菌水冲洗3次，2.5％ NaClO浸泡5min，无菌水冲洗3次，用无菌镊子夹取种子放入培养基种，间隔一瓶播种2-3粒。在4000lx，16h/d光照培养箱中培养4周左右。播种培养基：30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+MS培养基。

3、本氏烟草叶盘法遗传转化

(1)农杆菌的活化和侵染液的制备：

挑取携带Super1300-CaHY5-cGFP载体质粒的农杆菌单菌落，接种在500μL含50mg/L Kan的LB培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。取100μL活化过夜的农杆菌菌液接种到100mL LB含50mg/L Kan液体培养基中，28℃，200rpm继续培养至OD₆₀₀＝0.5；5000r/min离心10min，收集菌体，用MS液体培养基悬浮至OD₆₀₀＝0.2-0.4，准备浸染用。

(2)外植体的预培养：

取已经完全展开的第3-4片烟草叶片，将其切成0.5cm×0.5cm大小四周有伤口的方块，正面朝上接种在愈伤诱导培养基中(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉，pH＝6.0)，22℃、16h/d光照条件下培养2d。

(3)烟草的遗传转化：

将经过预培养的外植体放入悬浮好的农杆菌侵染液中，不断轻轻摇动5-8min。用无菌滤纸吸去叶片表面菌液，转移至共培养培养基(MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+100μmol/L AS+滤纸，pH＝6.0)，避光培养，22℃共培养2d。转移至愈伤化培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+400mg/L Cef+400mg/L Tit+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉，pH＝6.0)，22℃，16h/d光照培养。

15d后转入分化培养基中(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+

200mg/L Cef+200mg/L Tit+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉，pH＝6.0)，22℃，16h/d光照培养。

(4)转基因植株的获得：

当烟草分化出的不定芽长至1-2cm左右时，将其切下插入到生根培养基(MS+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉，pH＝6.0)中进行生根培养。待生根成苗后炼苗2-3d，将小苗转至花盆中进行常规栽培。

(5)转基因植株的鉴定：

经过培养得到228株本氏烟草再生植株，利用DNA快速提取法提取再生植株叶片DNA，进行PCR目的基因检测，结果如图4所示，显示共有172株阳性植株，遗传转化效率达75.4％。

实施例4纹瓣兰CaHY5基因的转基因本氏烟草表型观察

1、转基因材料

取实施例3中的本氏烟草转基因阳性植株材料，具体为阳性转CaHY5本氏烟草OE-1的植株、阳性转CaHY5本氏烟草OE-2的植株、阳性CaHY5本氏烟草OE-3的植株。

2、组织培养中芽分化能力调查

挑选3个高表达的阳性株系，将阳性植株和对照植株纯化3代后，选取部位一致的叶片，取0.5cm×0.5cm大小且四周带有伤口的方块叶片，置于培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L Cef+200mg/L Tit+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉，pH＝6.0)中，10d转接一次，观察阳性植株与对照植株的不定芽分化情况，比较0d、20d、30d、40d出愈率和出芽率。出愈率和出芽率计算公式如下(参考赵宇飞，2020)：

出愈率＝(出愈伤的外植体数/接种的总外植体数)×100％

出芽率＝(分化出不定芽的数量/出愈的外植体数)×100％

转基因本氏烟草与野生型本氏烟草愈伤组织芽分化情况如图5所示，显示本氏烟草根外植体诱导出愈伤组织后，与野生型本氏烟草相比，转基因本氏烟草芽分化情况是明显改善的。

转基因本氏烟草与野生型本氏烟草的愈伤组织芽分化率统计结果如表1所示，显示转基因本氏烟草叶外植体诱导出的愈伤组织在光照下芽分化率显著提高，能够用于改善组织培养过程中外植体的芽分化；表明纹瓣兰CaHY5基因可以在组织培养的芽分化阶段促进外植体的分化，这在改变植物组织培养中的分化特性和改变植株生长趋势上具有广泛的应用前景。

表1为本氏烟草阳性和对照植株的出愈率和芽分化率

3、生长情况调查

将野生型本氏烟草及3个CaHY5基因过表达株系的种子，消毒除菌后均匀点播到MS培养基平板上，每个平板分为两个区域，分别播种野生型和转基因本氏烟草种子各70粒，每个株系播种3个重复，每个重复播种5个培养皿，置于在22℃、16h光照/8h黑暗条件下培养，生长12-15d后，将上述在培养基上生长的转基因本氏烟草与野生型本氏烟草移栽到基质与蛭石的混合营养土中正常培养，观察转基因本氏烟草与野生型本氏烟草植株生长情况的区别。

结果如图6和图7所示，与野生型本氏烟草相比，转基因本氏烟草植株的侧枝数增加，生长速度明显加快；同时CaHY5基因过表达的转基因植株的花朵数和果荚数显著增加，发育速度比野生型快，能促进植株多花多果，还能提高植株的株高，有效促进植株生长。

综上，表明过表达CaHY5基因会改变植株的分枝发育，促进植株侧枝生长，能够用于植物改善并解决植物分枝数量少的问题，对于提高植物芽分化率和分枝发育具有重要意义；还能促进株高，能够用于促进植株生长；同时，能够用于植物改善并解决植物花少果少的问题，对于促进果实发育和果期改良具有重要意义，为CaHY5基因在作物育种中的应用奠定了基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纹瓣兰CaHY5基因，其特征在于，所述基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，基因编码序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因的编码蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因或其表达促进剂、或权利要求2所述编码蛋白在促进植物生长或在制备植物促生剂中的应用。

4.权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因或其表达促进剂、或权利要求2所述编码蛋白在促进植物组培快繁中芽再生中的应用。

5.权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因或其表达促进剂、或权利要求2所述编码蛋白在促进植物分枝、花朵开放和/或果荚成熟，或在制备促进植物分枝或果期改良制剂中的应用。

6.权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因或其表达促进剂、或权利要求2所述编码蛋白在构建促进分枝和/或果实发育的转基因材料中的应用。

7.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因。

8.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求7所述重组载体。

9.一种促进植物生长、分枝或果期改良的制剂，其特征在于，包含过表达纹瓣兰CaHY5的试剂。

10.一种促进植物分枝发育和/或果期改良的转基因材料的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因通过植物表达载体转化到植物中，从而获得含有纹瓣兰CaHY5基因的转基因材料；或在植物中过表达权利要求1所述纹瓣兰CaHY5基因。