CN117604019A - 本氏烟草NbSRM2基因工程载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种本氏烟草NbSRM2基因工程载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术技术领域。本氏烟草NbSRM2基因在调控叶绿素降解及促进种子萌发中的应用，其中所述本氏烟草Nb SRM2基因为其过表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明通过基因编辑技术，创制Nb SRM2基因表达异常材料，发现其可显著促进烟草叶片落黄，降低种子萌发效率。因此，Nb SRM2基因能够作为控制烟草叶片落黄进程的关键基因并应用于相关基因工程，具有重要应用潜力，同时该基因可作为调控种子萌发的基因资源加以利用。

Description

本氏烟草NbSRM2基因工程载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术技术领域，尤其涉及到一种本氏烟草NbSRM2基因工程载体及其构建方法和应用。
背景技术
叶片是植物利用光能合成有机化合物的重要场所，衰老是叶片发育的最后一个阶段。种子萌发对植物完成正常的生命周期至关重要，发芽率是衡量种子质量的一个重要指标，发芽率高的种子能够有效地提高作物的出苗率、增加生长发育速度，使作物在生长期间更加强壮健康，从而提高作物产量。另外，发芽率高的种子能够减少生产成本，降低播种量，减少浪费，节省种子使用量，降低生产成本。
烟草作为我国重要的经济作物之一。烟叶衰老直接影响烟草叶片落黄进度，进而影响烟草产品产量、品质及经济收益。因此利用现代基因工程手段改造烟草基因，获得烟草叶片落黄可控的植物材料是提高烟叶品质的重要手段。另外，烟草叶片落黄直接影响叶片后期烘烤工艺，对烟叶香气物质的形成具有重要影响。本氏烟草作为栽培烟草的近缘物种，其基因对于栽培烟草同样有效。另外，在烟草生物反应器应用中，叶绿体转化是一种高效表达外源蛋白的方法，本氏烟草的叶绿体转化技术体系最为成熟，而其中关键影响因素就是烟草本身所含有的叶绿体的稳定性，不易降解。因此，研究本氏烟草叶绿体降解、叶片衰老对叶绿体工程应用极为关键。在现代作物品种选育过程中，育种家追求种子萌发的更快速、更整齐，种子萌发异常会导致穗发芽，影响粮食生产和食品安全。因此，种子萌发对保障作物的增产稳产和食品安全具有重大意义。
发明内容
本发明提供了一种本氏烟草NbSRM2基因工程载体及其构建方法和应用，该方法通过过表达或基因编辑技术，创制Nb SRM2基因表达异常材料，发现其可显著促进烟草叶片落黄，降低种子萌发效率，该基因可作为控制烟草叶片落黄进程的关键基因作为调控种子萌发的基因资源加以利用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种本氏烟草NbSRM2基因在调控叶绿素降解及促进种子萌发中的应用，所述本氏烟草Nb SRM2基因为其过表达载体，核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供了一种制备可调控叶片叶绿素降解及促进种子萌发的转基因烟草植物的方法，通过对本氏烟草Nb SRM2基因进行过表达，利用叶盘法转化本氏烟草叶片，获得再生苗后对其初步抗性筛选，获得阳性转基因材料，从而获得可调控叶片叶绿素降解及种子萌发的转基因烟草植物，所述本氏烟草Nb SRM2基因为其过表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明提供了一种本氏烟草Nb SRM2基因过表达载体的构建方法，包括以下步骤：
设计可用于gateway连接系统的Nb SRM2基因特异性引物Nb SRM2-gF和Nb SRM2-gR；
提取本氏烟草总RNA，利用试剂盒将其反转录为cDNA，其序列如SEQ ID NO：2所示，然后利用上述特异性引物Nb SRM2-gF和Nb SRM2-gR进行退火梯度降落PCR扩增；
合成gateway扩增引物，以上述退火梯度降落PCR扩增产物稀释50倍为模板，进行普通PCR扩增；
将PCR产物回收纯化，通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero上，连接后，将连接产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a，测序，选择测序正确的克隆提取质粒，命名为Nb SRM2-pzero载体；
然后通过LR反应将Nb SRM2-pzero载体连入最终过表达载体pEarlyGate202中，连接后，鉴定提取过表达载体的阳性质粒，得到本氏烟草Nb SRM2基因过表达载体，其序列如SEQ ID NO：1所示。
作为优选，所述特异性引物Nb SRM2-gF的序列如SEQ ID NO：5所示；Nb SRM2-gR的序列如SEQ ID NO：6所示。
作为优选，所述退火梯度降落扩增程序为：
step 1：95℃3min；
step 2：95℃30S，72℃15S，72℃30S；2个循环；
setp3：95℃30S，68℃15S，72℃30S；2个循环；
step 4：95℃30S，66℃15S，72℃30S；4个循环；
step 5：95℃30S，64℃15S，72℃30S；4个循环；
sept6：95℃30S，60℃15S，72℃30S；3个循环；
step 7：95℃30S，56℃15S，72℃30S；24个循环；
step 8：72 5min。
作为优选，所述普通PCR扩增程序为：
step 1：98℃2min；
step 2：98℃15S，56℃15S，72℃30min；35个循环；
setp 3：72℃5min。
作为优选，在通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero步骤中，连接体系为：pzero载体1μL，纯化后的PCR片段3μL，BP酶1μL，于25℃过夜连接。
作为优选，在通过LR反应将Nb SRM2-pzero载体连入最终过表达载体pEarlyGate202步骤中，反应体系为：Nb SRM2-pzero载体2μL，pEarlyGate202载体2μL，LR酶1μL，于25℃过夜连接。
本发明还提供了一种本氏烟草Nb SRM2基因的基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：
选取针对Nb SRM2基因的目标序列合成Nb SRM2基因编辑合成序列，其序列如SEQID NO：4所示；
设计含有接头的引物Nb SRM2-CRI-F和Nb SRM2-CRI-R，并以上述合成序列为模板，对SEQ ID NO：4所示的基因编辑片段进行扩增，获得PCR片段，命名为Nb SRM2-CRI；
将上述所得PCR片段通过infusion技术连接到基因编辑载体1300-CRI上，连接后，讲连接产物转化到大肠杆菌DH5a，鉴定提取编辑载体的阳性质粒，得到本氏烟草Nb SRM2基因的基因编辑载体，其序列如SEQ ID NO：3所示。
作为优选，所述方法中所用序列如下：
Nb SRM2基因的目标序列：CTCTTCATGGCGAAGGTCGTTGG，其中TGG为PAM序列：
Nb SRM2-CRI-F：
GATCGGAAGCTTAGGTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAG；
Nb SRM2-CRI-R：
GGCAACGCGTTCTAGGCACCGACTCGGTGCCACT。
作为优选，所述infusion技术的反应体系为：Nb SRM2-CRI片段2μL，基因编辑载体1300-CRI 2μL，infusion酶mix：1μL；反应条件为：50℃，反应15分钟。
作为优选，所述普通PCR扩增程序为：
step 1：98℃2min；
step 2：98℃15S，56℃15S，72℃30min；35个循环；
setp 3：72℃5min。
本发明还提供了一种本氏烟草Nb SRM2基因的工程载体，为通过权利要求上述任一项技术方案所述的构建方法构建得到的过表达载体，或为通过上述任一项技术方案所述的构建方法构建得到的基因编辑载体。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供了一种本氏烟草Nb SRM2基因过表达载体及其构建方法和应用，通过过表达或基因编辑技术，创制Nb SRM2基因表达异常材料，发现其可显著促进烟草叶片落黄，降低种子萌发效率。因此，Nb SRM2基因能够作为控制烟草叶片落黄进程的关键基因并应用于相关基因工程，具有重要应用潜力，同时该基因可作为调控种子萌发的基因资源加以利用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的Nb SRM2基因克隆；
图2为本发明实施例提供的Nb SRM2过表达载体菌液阳性鉴定；
图3为本发明实施例提供的Nb SRM-CRISPR-CAS9载体菌液阳性鉴定；
图4为本发明实施例提供的Nb SRM2过表达转基因烟草的鉴定；
图5为本发明实施例提供的Nb SRM2-CRI-CAS9基因组水平及序列信息鉴定；
图6为本发明实施例提供的Nb SRM2-CRISPR-CAS9植株抑制本氏烟草叶绿素降解；
图7为本发明实施例提供的Nb SRM2过表达促进本氏烟草叶绿素降解；
图8为本发明实施例提供的Nb SRM2调控本氏烟草种子发芽率；
图9为本发明实施例提供的利用叶盘法转化本氏烟草叶片所获得的再生苗后的初步抗性筛选示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1Nb SRM2基因的克隆及过表达载体构建
(1)设计可以用于gateway连接系统的Nb SRM2基因特异引物：
Nb SRM2-gF(如SEQ ID NO：5所示)：
TACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATATTCAACATGTTAAT；
Nb SRM2-gR(如SEQ ID NO：6所示)：
GTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGACATCATTGTTGAGTTGTTGC；该引物加有部分gateway接头(粗体标出)，可以特异扩增Nb SRM2基因序列；
(2)提取本氏烟草总RNA，利用公司试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司，RT MasterMix for qPCR II(gDNA digester plus))反转录为cDNA(其序列如SEQ ID NO：2所示)，利用上述Nb SRM2-gF/Nb SRM2-gR进行退火梯度降落PCR扩增，扩增程序为：
step 1：95℃3min；
step 2：95℃30S，72℃15S，72℃30S；2个循环；
setp3：95℃30S，68℃15S，72℃30S；2个循环；
step 4：95℃30S，66℃15S，72℃30S；4个循环；
step 5：95℃30S，64℃15S，72℃30S；4个循环；
sept6：95℃30S，60℃15S，72℃30S；3个循环；
step 7：95℃30S，56℃15S，72℃30S；24个循环；
step 8：72 5min。
可以理解的是，优化后的降落PCR较普通PCR更容易富集目标片段，通过退火温度的从高到低的设计，可使PCR产物不容易产生非特异条带。
(6)合成gateway扩增引物
attBF：GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC；
attBR：GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC；
以上述PCR扩增获得的产物稀释50倍为模板，进行普通PCR扩增；扩增程序为：
step 1：98℃2min；
step 2：98℃15S，56℃15S，72℃30min；35个循环；
setp 3：72℃5min。
将PCR产物回收纯化(图1)，通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero上，连接体系为：pzero载体1μL，纯化后的PCR片段3μL，BP酶1μL。连接方法为：25℃过夜连接；反应后，将连接产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a；测序，选择测序正确的克隆提取质粒，命名为Nb SRM2-pzero；
(4)通过LR反应将Nb SRM2基因连入最终过表达载体pEarlyGate202中，反应体系为：Nb SRM2-pzero载体2μL，pEarlyGate202载体2μL，LR酶1μL。反应方法为：25℃过夜连接；反应后，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，鉴定提取过表达载体的阳性质粒(如图2所示)，命名为Nb SRM2-OE，其序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2Nt SRM2基因编辑载体的构建
我们利用CRISPR-CAS9技术构建了针对Nb SRM2基因的基因编辑载体，构建方法如下：
(1)选取针对Nb SRM2基因的20bp目标序列，如下：
CTCTTCATGGCGAAGGTCGTTGG，其中TGG为PAM序列，合成Nb SRM2基因编辑合成序列(其序列如SEQ ID NO：4所示)，序列如下：
(2)设计含有接头的引物，如下：
Nb SRM2-CRI-F：
GATCGGAAGCTTAGGTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAG；
Nb SRM2-CRI-R：
GGCAACGCGTTCTAGGCACCGACTCGGTGCCACT；
以上述的合成序列为模板，将基因编辑片段(SEQ ID NO：4)进行扩增，获得片段命名为Nb SRM2-CRI，扩增程序为：
step 1：98℃1min；
step 2：98℃15S，56℃15S，72℃30S；35个循环；
setp3：72℃5min；
将获得的片段通过1％的琼脂糖凝胶验证，并切胶回收；
(3)将上述步骤获得的PCR片段通过infusion技术连接到基因编辑载体1300-CRI上，将1300-CRI通过stuI和xbaI双酶切，切胶回收线性化片段。
infusion反应程序为：Nb SRM2-CRI片段2μL，基因编辑载体1300-CRI 2μL，infusion酶mix：1μL；infusion反应为：50℃，反应15分钟，连接产物转化到大肠杆菌DH5a，鉴定提取编辑载体的阳性克隆质粒(如图3所示)，命名为Nb SRM2-CRI-CAS9，其序列如SEQID NO：3所示。
实施例3转基因烟草获得
将上述所得Nb SRM2基因的过表达载体Nb SRM2-OE及基因编辑载体Nb SRM2-CRI-CAS9分别转入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化本氏烟草叶片，获得再生苗后进行初步抗性筛选(如图9所示)，最终获得阳性转基因材料，并进行表型分析(如图6A、7A所示)和相关生理参数测定。
其中，生理参数测定包括叶绿素及电导率测定，结果表明，如图6B、7B、图8上所示，取生长60天的过表达、基因编辑材料较野生型第5叶位测量叶绿素及电导率，结果表明过表达材料的叶绿素含量升高40％，电导率下降30％，而基因编辑材料叶绿素含量下降45％，电导率则升高25％；另外，对野生型及过表达材料、基因编辑持续10天观察种子萌发情况，结果表明在第4天到第7天，过表达材料种子萌发率可提高40％；而基因编辑材料在第6天到第8天，种子萌发率降低了30％左右。
上述测定方法具体为：
叶绿素测定方法：种子萌发后生长80d的转基因和野生型植株，剪取中部叶片，进行叶绿素含量的测定，实验操作步骤如下：每组叶片放入一个15mL离心管中，称量叶片鲜重；每管中加入10mL无水乙醇，使乙醇完全浸过叶片；避光放置过夜，使叶片完全脱色；用分光光度计分别测量脱色液在665nm和649nm处的吸光值(以无水乙醇作为参比)，分别记为A665和A649；按照如下公式计算每组叶片的叶绿素含量：Ca＝13.95A665–6.88A649，Cb＝24.96A649–7.32A665
总叶绿素含量(mg/g)＝(Ca+Cb)×V/W
注：V为提取液体积，10mL；W为叶片鲜重。
电导率测定方法：取大小相当的烟草叶片，用纯净水清洗3次，然后用滤纸吸干表面水分，分别置于10ml去离子水中，1h后，用电导仪测量浸提液电导(R1),然后沸水加热15min,冷却至室温，再次测量电导值(R2)，相对电导率计算公式：R1/R2x100％)。
叶盘法本氏烟草转化一般步骤：
1、无菌苗的培养：
取烟草种子，利用75％酒精灭菌1m30s；50％次氯酸钠+1滴Tween20灭菌2次，每次15min，无菌水清洗3次以上。消毒后播种到发苗培养基上，等苗子长到0.5cm左右移到移苗培养基上，配方同发苗培养基。待叶片长至5-8片叶的时候，选取绿色叶片，进行农杆菌侵染。
2、农杆菌的培养
农杆菌培养用YEB配方(PH7.0)
Tryptone(进口)5g/L
Yeast Extract(进口)1g/L
硫酸镁0.5g/L
牛肉膏5g/L
蔗糖5g/L
筛选所用抗生素
利用保存的原菌液(-80度)，取100ul-500ul加入到YEB液体中(一般使用三角瓶，200ml/瓶)，28度，250转，黑暗条件下培养18h左右至OD＝0.6-0.8。
3、农杆菌侵染：
将上述的菌液离心收集，利用MS0(见下表)稀释到OD600＝0.8，然后加入20mg/L的AS(乙酰丁香酮)，侵染无菌叶片8min，叶片大小适中。
4、共培养
侵染后的叶片以叶脉朝上，平铺到共培养培养基(G)上，22度或者23度黑暗培养3天。
5、S1继代培养
将共培养的叶片接种到S1培养基上(将叶脉朝下)，放到人工气候室，25度左右，黑暗培养(用黑色的塑料袋遮住白炽灯的灯光)2-3周，见叶片边缘长出丛芽，芽长在0.1-0.5cm，可依据经验自行调整。
6、S2继代培养
将S1上的丛芽转接到S2培养基上，丛芽可以掰下来的将丛芽直接接种，不能掰取的和叶片一同接种，去除没有长出丛芽的叶片部分。光下培养1-2周，丛芽长成幼小的小苗。
7、S3继代培养
将S2上的幼小小苗掰取到S3培养基上，光下培养1-2周，小苗逐渐健壮。
8、生根培养
将S3上健壮的苗子，去除底部膨大的部分和下部发黄的叶片，接种到生根培养基上(R)，光下培养1-2周时间，待根3-10根，根长2-3cm左右，移栽到营养钵中。
实施例4Nb SRM2基因过表达载体及基因编辑转阳性材料的鉴定
为明确转基因材料中Nb SRM2基因表达情况，我们利用qRT-PCR技术对获得的过表达载体进行了分析，另外通过测序及基因组鉴定对基因编辑转基因植株进行了分析。方法如下：
(1)设计针对Nb SRM2基因的qRT-PCR引物，如下：
Nt Nb SRM2-qF：GACCTTAAAAGAGGTTCATG；
NtTS3-qR：CGAAGATAATTAAGCCATCTC；
分别提取野生型本氏烟(Nicotiana benthamiana)、Nb SRM2基因过表达叶片RNA，反转录为cDNA，利用上述引物及cDNA模板进行qRT-PCR分析。
具体方法为：2–△△Ct法：
△Ct(实验组)＝Ct(实验组目的基因)-Ct(实验组内参基因)
△Ct(对照组)＝Ct(对照组目的基因)-Ct(对照组内参基因)
△△Ct＝△Ct(实验组)-△Ct(对照组)；
最后表达水平的差异倍数Fold Change＝2-△△Ct。
鉴定结果如图4所示，Nb SRM2基因在过表达材料中表达量升高了4倍以上，表明NbSRM2基因达到了过量表达的效果。
(2)提取野生型本氏烟及Nb SRM2-CRI-CAS9基因编辑材料的DNA，设计cas9特异引物，如下：
CAS9F：GATCGGCACAGCATCAAGAAG；
CAS9R：GAGCGATCAAGTTCTCAAGCCG；
进行基因组水平验证，如图5所示，cas9基因已经在转基因材料的基因组中。同时，利用如下引物：
Nb SRM2-CRI-CAS9F：CAACATGTTAATAAAGATAATATGG；
Nb SRM2-CRI-CAS9R：TTATCAACCACATGAATACAGAC；
克隆含有基因编辑区域的片段，连接T-载体，反应条件:pEASY-T1Cloning Vector(全式金生物科技有限公司)1μL，PCR片段4μL，室温反应15min通过测序鉴定植物材料的编辑情况。
Nb SRM2-WT：其序列如SEQ ID NO：7所示；
Nb SRM2-CRI-CAS9-1：其序列如SEQ ID NO：8所示，Nb SRM2-CRI-CAS9-1材料中NbSRM2基因CDS+97位序列由野生型的C变为G，氨基酸相应的由H变为D；
Nb SRM2-CRI-CAS9-2：其序列如SEQ ID NO：9所示，Nb SRM2-CRI-CAS9-2材料中NbSRM2基因CDS+100位序列由野生型的G变为A，氨基酸相应的由G变为S。
实施例5Nb SRM2过表达及Nb SRM2-CRI-CAS9基因编辑材料的表型分析
将Nb SRM2过表达及Nb SRM2-CRI-CAS9基因编辑的阳性材料与野生型本氏烟在同样条件下生长60天左右开始进行表型观察，并对叶片的叶绿素及光合效率进行测定。同时，将野生型、过表达及基因编辑的阳性材料的种子点播到0.5×MS培养基(具体配方包括：分别称取2.2g MS粉末，10g蔗糖放入1L纯净水中，调节PH值到5.8，加入琼脂8g，混匀后灭菌，121℃25min)上，通过连续10天观察种子萌发，统计不同材料的种子萌发效率。
如图6-8所示，取生长60天的过表达、基因编辑材料较野生型第5叶位测量叶绿素及电导率，结果表明过表达材料的叶绿素含量升高40％，电导率下降30％，而基因编辑材料叶绿素含量下降45％，电导率则升高25％；另外，对野生型及过表达材料、基因编辑持续10天观察种子萌发情况，结果表明在第4天到第7天，过表达材料种子种子萌发率可提高40％；而基因编辑材料在第6天到第8天，种子萌发率降低了30％左右。

Claims (10)

1.本氏烟草NbSRM2基因在调控叶绿素降解及促进种子萌发中的应用，其特征在于，所述本氏烟草Nb SRM2基因为其过表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种制备可调控叶片叶绿素降解及促进种子萌发的转基因烟草植物的方法，其特征在于，通过对本氏烟草Nb SRM2基因进行过表达，利用叶盘法转化本氏烟草叶片，获得再生苗后对其初步抗性筛选，获得阳性转基因材料，从而获得可调控叶片叶绿素降解及种子萌发的转基因烟草植物，所述本氏烟草Nb SRM2基因为其过表达载体，核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，或为其基因编辑载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.本氏烟草Nb SRM2基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
设计可用于gateway连接系统的Nb SRM2基因特异性引物Nb SRM2-gF和Nb SRM2-gR；
提取本氏烟草总RNA，利用试剂盒将其反转录为cDNA，其序列如SEQ ID NO：2所示，然后利用上述特异性引物Nb SRM2-gF和Nb SRM2-gR进行退火梯度降落PCR扩增；
合成gateway扩增引物，以上述退火梯度降落PCR扩增产物稀释50倍为模板，进行普通PCR扩增；
将PCR产物回收纯化，通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero上，连接后，将连接产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a，测序，选择测序正确的克隆提取质粒，命名为NbSRM2-pzero载体；
然后通过LR反应将Nb SRM2-pzero载体连入最终过表达载体pEarlyGate202中，连接后，鉴定提取过表达载体的阳性质粒，得到本氏烟草Nb SRM2基因过表达载体，其序列如SEQID NO：1所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述特异性引物Nb SRM2-gF的序列如SEQ ID NO：5所示；Nb SRM2-gR的序列如SEQ ID NO：6所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述退火梯度降落扩增程序为：
step 1：95℃3min；
step 2：95℃30S，72℃15S，72℃30S；2个循环；
setp3：95℃30S，68℃15S，72℃30S；2个循环；
step 4：95℃30S，66℃15S，72℃30S；4个循环；
step 5：95℃30S，64℃15S，72℃30S；4个循环；
sept6：95℃30S，60℃15S，72℃30S；3个循环；
step 7：95℃30S，56℃15S，72℃30S；24个循环；
step 8：72 5min。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在通过gateway试剂盒连接到中间载体pzero步骤中，连接体系为：pzero载体1μL，纯化后的PCR片段3μL，BP酶1μL，于25℃过夜连接；
在通过LR反应将Nb SRM2-pzero载体连入最终过表达载体pEarlyGate202步骤中，反应体系为：Nb SRM2-pzero载体2μL，pEarlyGate202载体2μL，LR酶1μL，于25℃过夜连接。
7.本氏烟草Nb SRM2基因的基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
选取针对Nb SRM2基因的目标序列合成Nb SRM2基因编辑合成序列，其序列如SEQ IDNO：4所示；
设计含有接头的引物Nb SRM2-CRI-F和Nb SRM2-CRI-R，并以上述合成序列为模板，对SEQ ID NO：4所示的基因编辑片段进行扩增，获得PCR片段，命名为Nb SRM2-CRI；
将上述所得PCR片段通过infusion技术连接到基因编辑载体1300-CRI上，连接后，讲连接产物转化到大肠杆菌DH5a，鉴定提取编辑载体的阳性质粒，得到本氏烟草Nb SRM2基因的基因编辑载体，其序列如SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述方法中所用序列如下：
Nb SRM2基因的目标序列：CTCTTCATGGCGAAGGTCGTTGG，其中TGG为PAM序列：
Nb SRM2-CRI-F：
GATCGGAAGCTTAGGTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAG；
Nb SRM2-CRI-R：
GGCAACGCGTTCTAGGCACCGACTCGGTGCCACT。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述infusion技术的反应体系为：NbSRM2-CRI片段2μL，基因编辑载体1300-CRI 2μL，infusion酶mix：1μL；反应条件为：50℃，反应15分钟。
10.本氏烟草Nb SRM2基因的工程载体，其特征在于，为通过权利要求3-6任一项所述的构建方法构建得到的过表达载体，或为通过权利要求7-9任一项所述的构建方法构建得到的基因编辑载体。
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