CN116970638A - 敲除番茄SlZF3基因在提高番茄产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种敲除番茄SlZF3基因的表达在提高番茄产量中的应用，所述SlZF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以番茄为研究对象，构建了基于CRISPR/Cas9技术的番茄SlZF3基因敲除载体，通过对两个突变株系的表型鉴定，发现该基因的敲除会导致番茄果实的数量以及单株产量提高；该发明为番茄高产分子育种提供基因资源。

Description

敲除番茄SlZF3基因在提高番茄产量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及SlZF3基因在调控番茄产量方面的应用，更具体涉及敲除番茄SlZF3基因在提高番茄产量中的应用。
背景技术
目前粮食安全问题越来越紧迫，培育高产作物品种是解决粮食安全问题的根本措施。提高单产可以有效提高土地利用率、减少土地使用、满足人们不断增长的需求。
番茄(Solanum Lycopersicum)是世界范围内栽培最广、消费量最大的蔬菜作物，原产于南美洲，由于其良好的口感、富含多种维生素且可以生食、炒食、生产番茄酱等多方面的食用方式而被人们喜爱，在中国南北方广泛种植。番茄生长周期通常为3至5个月，全体生粘质腺毛，有强烈气味，茎易倒伏，叶羽状复叶或羽状深裂，常3-7朵花，花萼辐状，花冠辐状，浆果扁球状或近球状，肉质而多汁液，种子呈黄色。番茄在全球蔬菜生产与消费中占有重要地位，提高番茄产量能够带来较高的经济价值。为了提高产量，菜农通常需要浪费过多的土地以及施加更多的肥料，这对土地资源及生态环境带来了极大的不利因素。因此，如何更加高效提高番茄的产量成为了亟待解决的问题。
研究发现，在植物众多类型的转录因子和调控蛋白中，锌指蛋白是植物中家族成员最多且多样性丰富的转录因子家族之一(占15％左右)。锌指蛋白参与转录调控、RNA结合、细胞凋亡调控以及蛋白间互作等，在植物生长和逆境响应中发挥着重要作用。按锌指结构中结合锌离子的半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)残基的数目，可将锌指蛋白分为C2H2、C2C2、C2HC、C2C2C2C2、C2HCC2C2等类型。其中，C2H2型锌指蛋白是植物中最大的转录调节因子家族之一，在拟南芥中有176个成员，水稻中有189个，玉米中有211个，而在番前中至少有37个。植物梓指结构域中含有保守的QALGGH序列，为植物所特有的。近年来，研究表明C2H2型锌指蛋白转录因子主要在植物发育过程中及抵御和响应逆境中发挥着重要作用。
更有研究显示，从耐盐芯片数据中候选出一个盐诱导锌指蛋白基因SlZF3。它编码类似ZAT12的C2H2型锌指蛋白，该蛋白含有两个核定位信号肽(NLS)和一个EAR敲除结构域。拟南芥原生质体瞬时表达实验表明S1ZF3蛋白定位在细胞核中，超表达S1ZF3的转基因番茄幼苗下胚轴明显短于非转基因对照，植株全生育期表现为矮化、叶片变小并增厚。但是还没有关于其和产量有关的报道。
由于番茄重要的经济作物，因此研究番茄坐果与果实体积大小的调控机理将为提高园艺作物产量提供技术指导。此外，创建番茄增产新材料，培育高产新品种，对保障番茄产业可持续发展具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供SlZF3基因在调控番茄产量方面的应用，通过敲除SlZF3基因来提高番茄的产量。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：
本发明的SlZF3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SlZF3基因编码框核苷酸序列长度为1465bp，由465个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高番茄产量方面的功能也落入本发明的保护范围之内。
本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述SlZF3基因，还包括与SlZF3基因具有较高同源性(如同源性高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因在调控番茄产量方面的功能。
本发明根据SlZF3的CDS基因序列构建了CRISPR-Cas9基因敲除载体，通过农杆菌侵染获得了SlZF3基因敲除株系，分析了野生型和SlZF3基因敲除转基因系在调控产量方面的生物学功能，从而为作物高产分子育种提供基因资源。
本发明公开的SlZF3基因在调控产量方面的生物学功能，具体表现在：敲除SlZF3基因在提高产量方面，产量提高表现为：基因敲除株系的果实重量、果实的大小均高于野生型，其中，果实大小从果实的纵径和横径两方面衡量。
根据其功能，可以通过转基因的方式来获得产量提高的植株，具体地，可以通过将SlZF3基因在目的植物中进行敲除或敲低，得到转基因植物，该植株产量高于目的植物。
作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到CRISRP载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达SlZF3蛋白到植物细胞中，使所述的植物细胞中S1ZF3蛋白缺失。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得SlZF3基因缺失的突变体植物。并利用农杆菌转化法将重组质粒转入植物中。
为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，通过敲除目的植物中SlZF3基因的表达，获得产量于目的植物的植株；
“敲除目的植物中SlZF3基因”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：
(1)将SlZF3基因在目的植物中进行敲除或敲低；
(2)引入沉默子；
(3)本领域内的其它常见方法。
其中，本发明所述目的植物是番茄。
目的基因，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。
本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：番茄，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
本发明的优点：
(1)本发明通过以番茄“Ailsa Craig”品种为研究对象，构建了基于CRISPR/Cas9技术的番茄SlZF3基因敲除载体，通过对两个突变株系的表型鉴定，果实的大小以及重量提高；该基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，该发明可以为促进番茄生长发育、提高果实产量提供巨大帮助，为番茄高产分子育种提供基因资源。
(2)可以通过转基因的方式来获得高产的植株，具体地，可以通过将目的植物的SlZF3基因敲除，得到转基因植物，该植株产量高于目的植物，为植物高产育种提供一种新的途径。
附图说明
图1A为T2代植株的检测结果比对；
图1B为对照组AC，实验组CR1、CR2的果实表型对比图；
图1C为对照组AC，实验组CR1、CR2的果实重量指标的数据分析图。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。
另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：
“突变体”，是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。
“表达载体”，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。
实施例1SlZF3基因敲除载体的构建
一、SlZF3基因的sgRNA靶点序列的获得
通过NCBI在线服务工具针对番茄SlZF3基因的CDS区进行gRNA(guide RNA)的设计。选取位于起始密码子下游500bp以内、On-Target分值高且脱靶率低的gRNA，合成其正反链的单链DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)。最终选定了外显子区域两个的sgRNA靶点：靶点1∶5’-TAGAGAAGACAAGGGTGAAG-3’；靶点2∶5’-ATTACGACGATCTCGATCTA-3’。二、CRISPR/Cas9载体的构建
将番茄SlZF3基因序列于基因组网站中进行最优的sgRNA选择，选择的两条sgRNA序列。并将该sgRNA插入到CRIPSR/CAS9基因编辑系统中，获得番茄SlZF3基因编辑的敲除载体。具体是以质粒CP043为模板，以CR-SlZF3-F和CR-SlZF3-R为引物(CR-S1ZF3-F：AACAGTGTAGTTTGGGTTTGTAGAGAAGACAAGGGTGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；CR-S1ZF3-R：TCTAGCTCTAAAACCGAAACATTACGACGATCTCGATCTACCAAACTACACTGTTAGATT)进行PCR扩增)，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段，然后将上述片段与载体CP098-sgRNA-Cas9混合，使用BsaI限制性内切酶和T4 DNA连接酶进行循环酶切连接反应，得到S1ZF3-CP098重组载体。
将重组产物加入DH5α感受态中，冰置30min后，在金属浴上42℃热激45s，转至冰上静止3min。向离心管中添加600μL不含抗生素的LB培养；37℃摇床复壮45min，用无菌涂布棒将100-200μL菌液均匀涂布于LB固体培养基上(LB+100mg/L Spec)，在37℃培养箱进行培养12-18h，即可观察到白色的独立单菌落。
挑取单菌落于500ul LB液体培养基中(LB+100mg/L Spec)培养8h后，进行PCR阳性检测。将阳性单克隆菌液送上海生工公司测序。序列比对结果正确，载体构建成功，将载体命名为SlZF3-CP098，菌液保存备用。
将重组载体转入DH5α大肠杆菌中并测序确定敲除载体构建是否成功，并将构建成功的基因敲除载体S1ZF3-cp098重组载体转入农杆菌GV3101中。使用北京庄盟生物公司感受态进行农杆菌的转化具体步骤是：
取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。每100ul感受态加1ug(体积不大于10u1)构建好的重组质粒SIZF3-cp098，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；后加入700ul无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时；6000rpm离心一分钟收菌，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
待平板上长出单菌落后进行PCR鉴定筛选阳性菌，用以侵染番茄子叶。借助组织培养的方法，获得了番茄SlZF3基因编辑的转基因植株。取待测植株的叶片基因组DNA，并在目标序列附近设计引物并PCR目标片段，鉴定引物序列如表1的SlZF3基因的鉴定引物序列。通过测序的手段检测目标片段有无编辑。
表1 PCR鉴定所用的引物
实施例2SlZF3基因突变番茄植株的构建
2.1.番茄无菌苗培养
精选饱满、大小一致的番茄种子(防止有干瘪种，可适量多加些种)，播种前先用蒸馏水在三角瓶中将其浸泡10-20min(30min)，然后用75％的乙醇(10ml无菌水+30ml无水乙醇)消毒1min(不断震荡)，再用50％的次氯酸钠溶液(25ml无菌水+25ml生活用84消毒液)表面杀菌15min，最后用灭菌的ddH2O清洗3-4次，播种于1/2MS培养基，一般每瓶播约50粒种子，置于光周期为光照16h/黑暗8h的组培间培养7-8d。
2.2.农杆菌活化与培养
农杆菌活化(划板)：目标载体的农杆菌GV3101划含有相应抗生素的LB培养基上。挑取含目标载体的农杆菌GV3101单菌落，接种到20mL含50mg/L卡那霉素和35mg/L利福平的LB液体培养基中，200r/min、28℃、暗培养14-20h，一般菌液OD600＝1。取1.5ml此菌液全已灭菌的1.5m离心管中，10000r/min离心30s，然后用0.2MS液体培养基将菌体悬浮并稀释至OD600＝0.1～0.3备用。
2.3转基因植株外植体再生
(1)预培养：无菌苗培养7-8d，选取两片子叶完全展开的幼苗，从叶柄处将子叶切掉，并用刀片把叶片切割成2-3段，再把切好的子叶平展放在铺有灭菌的KCMS培养基上，用封口膜将培养皿密封以防细菌和真菌侵入，培养皿置于组培间暗培养1d(尤其夏季注意放在凉爽的地厅，如空调迁风口处)。
(2)侵染：将高温灭菌后的0.2MS悬浮液倒入培养皿中，然后把喑培养一天的子叶悬浮在0.2MS液体培养基中。最后加入100-300uL(一般250uL)左右各好的OD600＝0.1～0.3的农杆菌悬浮液(浓度高容易使染过重，冬季温度低，可活当提高浓度，夏季温度高注意用低浓度侵染)》盖上培养皿兼并用手轻轻转动培养皿，侵染时间为3-4min。侵染结束后，倒出菌液，用无菌滤纸吸干子叶上的菌液，把侵染后的子叶摆放回原KCMS培养基上(可将原来的滤纸换掉，置组培间暗培养2d(培养期问注意勤观察，若有农杆菌落班出现，及时转2Z)。
(3)2Z再生：将侵染过过后的子叶转移到相应的2Z培养基上再生，子叶正面朝上，叶面充分接触培养基，并注意子叶之间保持合适的距离，密度适中，置组培间培养2周左右。
(4)0.2Z再生：当侵染后的番茄子叶在2Z培养基上生长10～14天左右时，开始产生大量愈伤组织并形成芽点。14-20天左右时愈伤组织产生大量的芽点，为降低芽点畸形率，将产生芽点的愈伤组织转移到含相应的0.2Z培养基上继续培养。
(5)转基因植株的获得及移栽：芽点在0.2Z培养基上生长大概2周左右时形成了约1cm长的幼芽，此时选取具有完整生长点的幼芽自茎基部切断，在R培养基上进行生根培养。培养一周左右，转基因植株开始生根。经过2周生根培养后，再生苗的根生长到5-6cm时逐渐揭开封只膜开始炼苗。在组培间炼苗2d后，将再生苗转移到绿化间炼苗1d，然后用镊子把幼苗从三角瓶内轻轻夹出，小心洗去其根部的培养基，移栽入装有营养土的方钵中，覆盖保湿3-4d后逐步揭开，练苗结束后进行正常的栽培管理。
实施例3番茄SiZF3基因在在培育高产番茄中的应用
本实施例番茄SlZF3基因在在培育高产番茄中的应用，通过基因敲除系番茄来鉴定其功能，具体过程说明如下：
3.1阳性苗继续培养
将长出3至4片叶子的外植体转移至含有生茎培养基的培养瓶中，当长出较为明显的茎时，应当使用无菌剪刀将发育出明显叶片和茎杆的番茄苗切出，并转移到生根培养基中，诱导其生根，当番茄植株长出2至3条根后，将其转移到营养土中培养繁代。对于突变体植株，当番茄植株壮硕后，再次提取DNA对突变体类型进行检测，保证获得植株为阳性突变体。
3.2敲除植株表型观测
将筛选后的纯合株系按照上诉萌发方式进行无菌苗的萌发，在萌发后放入种植盆中进行培养，并定期观察、记录植株的表型，并与野生型番茄植株进行对比。
(1)纯合基因编辑株系获得
以番茄植株嫩叶DNA为模板，扩增SlZF3基因目的片段，获得T0代转基因阳性植株。鉴定出2个阳性植株株系命名为CR1和CR2，通过测序结果比对发现2个株系在2个靶位点均有编辑。
继续对于T1代转基因阳性植株中的CR1、CR2株系进一步在播种定植管理，鉴定出T2代纯合编辑植株，对基因编辑株系中SlZF3基因的表达情况进行检测(如图1A所示)，测序结果比对发现材料均出现被编辑的纯合体系，其中CR1材料在靶位点1有3个碱基缺失，在第二个靶位点有6个碱基缺失，CR2材料在靶位点1有1个碱基缺失，在第2个靶位点有2个碱基缺失。
(2)植株产量测定
摘取成熟期不同株系整株的果实，两个基因敲除株系CR1和CR2的果实数量和果实大小显著多于野生型WT(图1B)，对不同株系测产统计发现，两个基因敲除株系的产量显著高于WT(图1C)。综上结果发现敲除SlZF3基因能显著提高番茄果实数量、单果的重量，提高番茄单株产量，可以用于制备高产番茄材料。
由此，利用本发明提供的含gRNA序列的CRISPR-Cas9系统定点编辑SlZF3基因可以调控番茄植株生长发育，而且通过敲除SlZF3基因获得突变体植株，可以提高番茄单株产量，进而培育高产番茄品系，丰富番茄高产种质资源，为番茄提质增产育种提供新思路。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (6)

1.敲除番茄SlZF3基因在提高番茄产量中的应用，其特征在于，所述SlZF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SlZF3基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，敲除番茄SlZF3基因是通过构建SlZF3基因敲除载体，获得产量提高的转基因番茄植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，产量提高表现为：基因敲除株系的果实单株数量、单果重量均高于野生型。
5.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为通过敲除目的植物中SlZF3基因，获得产量高于目的植物的植株；所述SlZF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物为番茄。
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