CN104404007A - 一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法，该制备方法按照以下步骤实施：提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，利用电子克隆的方法得到香蕉PPO的编码区序列，构建含有PPO的重组质粒pQE 80L-PPO，将获得的重组质粒pQE 80L-PPO加入到大肠杆菌M15感受态细胞中得到香蕉PPO表达菌pQE 80L-PPO/M15；培养并纯化得到香蕉PPO重组蛋白；该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。

Description

一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种香蕉多酚氧化酶基因，本发明还涉及一种香蕉多酚氧化酶的重组蛋白，本发明还涉及一种香蕉多酚氧化酶的重组蛋白的制备方法。
背景技术
国内外对香蕉多酚氧化酶(PPO)基因的研究非常有限。美国专利公布了一种分离香蕉PPO的核酸及其片段和衍生物的方法(Robinson，1998)。威廉斯蕉四种不同的PPO cDNA片段BPOI(906bp),BPOII(901bp)，BPO34(925bp)和BPO35(960bp)被扩增出来，并且用特异性引物扩增得到BPOI2078bp的全长基因，该基因含有一个85bp的内含子，富含58％AT，但该PPO序列却未在NCBI等数据库中登陆。四种PPO cDNA在生长期和成熟期不同组织中的表达状况表明，香蕉PPO在果实生长早期合成，在成熟的过程中被释放。Grand Nain香蕉PPO基因部分序列被扩增得大，该基因编码141个氨基酸。Gros Michel香蕉在42℃15min处理后4℃储存延缓了香蕉果皮褐变，分析PPO基因的表达量发现，这与热处理后编码香蕉PPOmRNA的表达量减少，导致酶活性降低有关。AAA和AA基因型香蕉果肉和果皮PPO的褐变速率高于AAB和ABB基因型的。
传统克隆新基因的方法是采用克隆原位杂交筛选cDNA文库或是利用基因特异性引物进行cDNA末端快速扩增，其特点是花费高、耗时、成功率低。电子克隆(in silico cloning)是近几年来伴随着EST(Expressed sequence tags)计划发展起来的一种基于计算机分析的克隆基因的新方法。1994年美国Boguski开始利用电子克隆方法发现新基因，中国科学院生物物理研究陈润生课题组于1996年也开始了对电子克隆的研究(陈润生，1999)。
1975年建立的细胞融合技术使得真核生物基因在原核生物中进行表达成为可能，从而可以获得自然界无法大量获得的多肽和蛋白质。大肠杆菌是首个用于重组蛋白表达的宿主菌，它具有遗传背景清楚、生长繁殖快、培养操作简单、成本低廉和表达外源基因产物的水平高等特点。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
大肠杆菌表达系统主要由宿主菌、表达载体和外源基因构成。当前，应用的最广泛的原核表达载体主要是pET载体和PQE载体。pET系统是目前在E.coli中克隆表达重组蛋白最强大的系统，它是最初利用与启动子配套的能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶，构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，目的基因被克隆到pET质粒载体上，转入宿主菌，经过诱导表达可以生产大量的目的蛋白。人们运用基因工程技术已在PET系统中成功地表达了多酚氧化酶、漆酶、蔗糖磷酸化酶、酪氨酸酶、人胸腺素β4二串体蛋白、碳青霉烯酶、骨形态发生蛋白-2等蛋白。
多酚氧化酶是酶促合成茶黄素反应的关键酶。茶黄素具有极强的抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗菌杀菌和消除自由基等药理功能。其也是红茶滋味和汤色的主要品质成分，红茶汤色的“亮”和滋味的鲜爽度等都与茶黄素的含量有密切的关系。多酚氧化酶还可以应用于红茶香气和品质的改善，以及茶饮料稳定性的改善。多酚氧化酶催化蛋白质形成分子内或分子间交联，可改善蛋白质的热稳定性、乳化性、凝胶特性、保水性和流变学特性等功能特性。也可导致蛋白质过敏原性的降低,甚至完全消除。随着人们对多酚氧化酶新功能的不断挖掘，多酚氧化酶在食品领域必定有着广泛的应用。但是由于PPO在自然界含量较低，在分离纯化过程中易变性失活，且分离纯化步骤繁琐，得率低，因此制约了其在茶黄素酶法合成、蛋白交联等食品领域中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种香蕉多酚氧化酶，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是提供一种上述的香蕉多酚氧化酶的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一目的是提供一种香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，旨在利用大肠杆菌易培养、繁殖快、易诱导、在短时间内能廉价地大量生产所需酶类的特点，应用基因工程技术，克隆香蕉PPO基因，构建表达工程菌，获得工程蛋白酶，拓宽工业用多酚氧化酶的渠道。
本发明所采用的技术方案是，一种香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA；
步骤2、利用电子克隆的方法得到香蕉PPO的编码区序列，并进行PCR扩增验证，得到香蕉PPO的编码区序列；
步骤3、构建含有步骤2的PPO的编码区序列的重组质粒pQE80L-PPO；
步骤4、将步骤3获得的重组质粒pQE80L-PPO加入到大肠杆菌M15感受态细胞中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，37℃条件下培养过夜，得到香蕉PPO表达菌pQE80L-PPO/M15；
步骤5、培养香蕉PPO表达菌pQE80L-PPO/M15，使用IPTG诱导香蕉PPO，产生香蕉PPO重组蛋白，其中IPTG诱导条件为IPTG浓度0.6mM，诱导时间为6h；
步骤6、纯化香蕉PPO重组蛋白，得到香蕉PPO重组蛋白，所述香蕉PPO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，步骤1中香蕉果肉的总RNA的提取具体按照以下步骤实施：
提取缓冲液内含2％CTAB、pH9.0、100mM Tris-硼酸、1.4M NaCl、pH8.0、20mM EDTA和2％PVP-K30，用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，将其预热至60℃；果肉用液氮速冻后研磨成粉末，每0.2g果肉加入1mL提取缓冲液，涡旋混匀，于60℃放置30min，每隔5-10min颠倒混匀1次；向提取混合液中添加0.5M CaCl2使其摩尔浓度为100mM，25℃放置20min；冷至室温，用等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/min离心5min；取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/min离心5min；上清液加10M LiCl至终浓度为3M，-20℃中放置12h，4℃下12000r/min离心20min；小心倒掉上清，沉淀用0.5mL3M LiCl洗涤至少3次；沉淀用0.3mL DEPC水溶解,再用等体积的水饱和酚，氯仿顺序抽提；吸取上清液，加入1/15体积的pH5.2、3M NaAc和1/5体积无水乙醇，冰上放置0.5h，4℃下以12000r/min离心20min；上清液加1/10体积3M NaAc(pH5.2)和3倍体积无水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h，4℃下12000r/min离心20min，沉淀物用0.5mL75％乙醇洗涤2次，0.5mL无水乙醇洗涤一次，每次都经12000r/min离心1min，室温干燥后溶于RNase-free水中；取RNA样品通过超微量分光光度计检测其浓度和质量，剩余的RNA样品于-80℃保存备用。
进一步地，步骤2中电子克隆香蕉PPO具体按照以下步骤实施：
以步骤1中的反转录的cDNA为模板，利用上游引物FP1：5′-tcgatcctgttctcggcttc-3′；下游引物RP1：5′-cgatggtgcggcttttattttcc-3′；进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃10s，30个循环；72℃5min。
进一步地，步骤3中构建表达载体具体按照以下步骤实施：
根据步骤2得到的香蕉PPO基因序列，设计上游引物：含有内切酶KpnI的FPQE25’-CGGggtacc CCG atgactgca aat gccaagctcgac-3’；含有内切酶Hind III的下游引物：RPQE5’-CCCAagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3’；利用此对引物进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃10s，30个循环；72℃5min；
用凝胶回收试剂盒对所扩增的PCR产物进行切胶回收，将切胶回收后的PCR产物和pQE80L载体分别用Kpn I和Hind III进行双酶切，用T4连接酶将两个双酶切产物于16℃连接12h左右，再将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，于37℃培养过夜；挑取出单菌落，即为重组质粒pQE80L-PPO，在表达载体pQE80L多克隆位点的Kpn I和Hind III插入了不含终止密码子的猪FTO基因CDS区，使重组表达载体pQE80L-PPO的N端融合了6×His标签。
进一步地，步骤3中表达条件为：将步骤3获得的重组质粒pQE80L-PPO加入到冰预冷的大肠杆菌M15感受态细胞中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，36.8℃下以220rpm振荡培养过夜，得到香蕉PPO表达菌pQE80L-PPO/M15，工程菌培养于SOB培养基中，用0.6mM IPTG，0.25mM Cu2+，37℃诱导表达6h，得到香蕉香蕉多酚氧化酶重组蛋白。
本发明的有益效果是：本发明利用香蕉基因组信息进行电子克隆得到香蕉PPO基因，并利用RT-PCR技术从香蕉果肉中克隆了香蕉PPO基因的序列，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达产物香蕉PPO重组蛋白具有生物学活性。该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。
附图说明
图1是本发明提取缓冲液对RNA完整性的影响的电泳图片，其中，M:200bp Marker；1：RT-PCR产物；
图2是本发明香蕉PPO PCR产物胶回收电泳图，其中，M:200bp Marker；1：胶回收PCR产物；
图3是蓝白斑筛选；
图4是本发明菌液PCR鉴定结果，其中，M:200bp Marker；1-3：菌液PCR产物；
图5是本发明带有酶切位点香蕉PPO基因扩增结果，其中，M:200bpMarker；1-4:BXPPO2(Kpn I/HindIII)；
图6是本发明带有酶切位点香蕉PPO基因扩增产物胶回收结果，其中，M:200bp Marker；1：BXPPO2(Kpn I/HindIII)；
图7是本发明菌液PCR鉴定结果，其中，M:200bp Marker；7-8：BXPPO2(Kpn I/HindIII)；
图8是本发明双酶切PQE80L及PPO-pMD19-T产物胶回收结果，其中，M:1kb Marker；1:PQE80L；2:BXPPO2(Kpn I/HindIII)；3:BXPPO1(KpnI/HindIII)；
图9是本发明菌液PCR鉴定结果，其中，M:200bpMarker；1-2:BXPPO2(Kpn I/HindIII)；
图10是本发明BXPPO-PQE80L重组质粒双酶切验证结果，其中，M:1kbMarker；1:BXPPO2-PQE80L；2:BXPPO1-PQE80L；
图11是本发明pQE80L-PPO重组表达载体的构建图谱；
图12是本发明BXPPO2-pQE80l重组蛋白包涵体分析，M：ProteinMarker；1:菌体超声破碎后全液；2:菌体超声破碎后离心上清；3：菌体超声破碎后离心沉淀；
图13是本发明香蕉PPO包涵体纯化结果，其中，M：Protein Marker；1:菌体超声破碎后全液；2:变性I悬浮PPO包涵体后离心上清；3：变性II处理PPO包涵体的变性蛋白液；4-5：纯化的香蕉PPO；
图14是本发明香蕉PPO包涵体电泳图，其中，M：Protein Marker；1-4:5ul、10ul、15ul、20ul香蕉PPO包涵体；
图15是本发明重组蛋白的质谱分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1香蕉果肉总RNA的提取及扩增
1.1、香蕉果肉总RNA的提取
氯化锂沉淀法具体操作过程：提取缓冲液内含2％CTAB，100mM Tris-硼酸(pH9.0)，1.4MNaCl，20mMEDT(pH8.0)，2％PVP-K30，用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，将其预热至60℃；果肉用液氮研磨成粉末，每0.2g果肉加入1ml提取缓冲液，涡旋混匀，于60℃放置30min,每隔5-10min颠倒混匀1次；向提取混合液中添加0.5M CaCl2使其摩尔浓度分别为100mM，25℃放置20min；冷至室温，用等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000rpm离心5min；取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000rpm离心5min；上清液加10M LiCl至终浓度为3M，-20℃中放置12h，4℃下12000rpm离心20min；小心倒掉上清，沉淀用0.5ml3M LiCl洗涤至少3次；沉淀用0.3mlDEPC处理水溶解，再用等体积的水饱和酚，氯仿顺序抽提；吸取上清液，加入1/15体积的3MNaAc(pH5.2)和1/5体积无水乙醇，冰上放置0.5h，4℃下以12000rpm离心20min；上清液加1/10体积3MNaAc(pH5.2)和3倍体积无水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h，4℃下12000rpm离心20min，沉淀物用0.5ml75％乙醇洗涤2次，0.5ml无水乙醇洗涤一次，每次都12000rpm离心1min，室温干燥后溶于RNase-free水中，得到纯度高、得率高和完整性好的总RNA。
实施例2香蕉多酚氧化酶基因的电子克隆及RT-PCR验证
2.1、香蕉PPO基因的PCR扩增
以香蕉果肉总RNA为模板，合成cDNA第一链。然后以cDNA第一链为模板，用设计的特异性引物(上游引物FP1：5′-tcgatcc tgttctcggcttc-3′(SQE NO.4)；RP1：5′-cgatggtgcggcttttattttcc-3′(SQE NO.5))进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到了2100bp和1050bp的2个条带，且2100bp条带比1050条带片段更亮(图1)。2100bp的条带与预期片段大小一致。
2.2、香蕉PPO基因的PCR产物克隆与鉴定
将2100bp大小的片段切胶回收，采用TIANGEN普通型琼脂糖DNA回收试剂盒(DP209)纯化回收，得到单一的条带(图2)。胶回收PCR产物与pMD19-T Vector连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选，结果如图3所示。平板上有很多白色的菌落，说明克隆重组质粒成功的转化到E.coli DH5α感受态细胞中。随机挑选数个白色菌落，接种于LBA液体培养基中。挑取3管菌液做菌液PCR鉴定。图4显示，在2100bp处扩增出条带非常亮的产物，证明克隆子为阳性克隆。将3个克隆子送至上海英骏生物技术有限公司测序。
2.3、香蕉PPO基因的PCR产物测序结果分析
3个阳性克隆测序得到一致的cDNA序列，序列长2116bp。通过ORFFinder工具对所获得的cDNA序列进行开放阅读框架分析，发现其有两个完整的阅读框架。较长的阅读框架位于第350-2116位之间，推测编码588个aa。较短的阅读框架位于第470-2116位之间，推测编码533个aa。在cDNA5’端第350位和第470位存在起始密码子ATG，3’端的2116处存在终止密码子TGA。测序得到香蕉PPO的cDNA长短两个完整的阅读框架分别记为BXPPO1和BXPPO2。
从NCBI的核酸数据库检索得到Musa acuminataAAA Group Cavendishbanana polyphenol oxidase mRNA的部分序列EU880277.1。用此序列作为探针在NCNI数据库进行香蕉EST数据库的Blast检索，只有ES436966.1与基因探针有96％的匹配率。将ES436966.1序列在NCBI数据库中进行香蕉WGS数据库的Blast检索得到contig_1794(CAIC01022631.1)。序列分析表明contig_1794(CAIC01022631.1)长度为56431bp，与ES436966.1在24483bp-25362bp之间有99％的一致性，表明新香蕉PPO基因可能存在于contig_1794(CAIC01022631.1)之中。用FGENESH软件在线分析contig_1794(CAIC01022631.1)，得到可能的香蕉PPO基因CDS序列NBPPO2。序列通过Blasx检索后，能够检索到PPO同源蛋白，具有PPO1_DWL和PPO1_KFDV两个结构域，可以确定NBPPO2是香蕉PPO基因序列。NBPPO2通过Blast新颖性检测，NCBI数据库中未发现与NBPPO2完全一致的基因序列，可以判断NBPPO2是新的香蕉PPO基因。
实施例3原核表达载体pQE80L-PPO的构建
3.1、香蕉PPO基因扩增
根据实施例2得到的香蕉PPO基因序列，设计带酶切位点的引物，其中，上游引物：FPQE25’-CGGggtacc CCG atgactgca aat gccaagctcgac-3’(Kpn I)(SQE NO.6)；下游引物：RPQE5’-CCCAagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3’(Hind III)(SQE NO.7)。利用此对引物进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃10s，30个循环；72℃5min，通过PCR扩增得到1600bp大小的BXPPO2片段(带有Kpn I和Hind III限制性酶切位点)，如图5所示。
其中，25ul反应体系为：2×ES Master Mix12.5ul，上游引物(10uM)1ul，下游引物(10uM)1ul，质粒0.5ul，RNase-Free Water10ul。
3.2、构建重组质粒pQE80L-PPO
采用TIANGEN普通型琼脂糖DNA回收试剂盒(DP209)对所扩增的PCR产物进行纯化回收，将1600bp大小的片段切胶回收，得到单一的条带(如图6所示)，胶回收PCR产物与pMD19-T Vector连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选。随机挑选数个白色菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中。挑取2管菌液做菌液PCR鉴定。图7显示，都扩增出相应大小片段产物，证明克隆子为阳性克隆。
将切胶回收后的PPO-pMD19-T质粒和pQE80L载体分别用Kpn I和Hind III进行双酶切，其酶切体系采用Fermentas FastDigest enzymes进行双酶切，具体操作步骤如下：
表1质粒PPO-PQE80L双酶切体系
按表1反应体系，将各组分加入到PCR管中，37℃水浴保温酶切6h，80℃水浴加热10min灭酶，短暂离心，取5ul酶切产物进行1.0％琼脂糖电泳检测酶切结果，如图8所示，得到单一的条带。鉴定酶切完全，-20℃保存备用。
将胶回收的双酶切质粒按一定比例将目的片段与相应的表达载体采用NEB公司的T4连接酶(M0202V)进行连接，构建BXPPO2-PQE80L、表达载体，然后将表达载体转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含Amp的LB平板上进行抗性筛选。挑选平板上的白色单菌落，接种于LBA液体培养基中，于37℃培养过夜；挑取2管菌液做菌液PCR鉴定。图9显示，扩增出相应大小片段产物，证明目的基因与表达载体连接成功。
提取菌液PCR验证成功的阳性克隆子质粒，进行双酶切验证。图10显示，BXPPO2-PQE80L双酶切后，有一条4800bp的条带，以及1600bp的目的基因条带，表明BXPPO2-PQE80L表达载体构建成功。
将双酶切验证的BXPPO1-PQE80L、BXPPO2-PQE80L、BXPPO1-pET22b(+)和BXPPO2-pET22b(+)表达载体重组子送至上海英骏生物技术有限公司测序。将测序结果经Clustal软件与BXPPO1比对，无碱基突变和移码现象。结果表明，香蕉PPO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码完成的猪FTO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。重组的质粒pQE80L-PPO的构建图谱见图11。
实施例4香蕉PPO重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
挑取鉴定正确的阳性克隆单菌落于5mLSOB培养基(SOB液体培养基：称取0.5g酵母提取物，2g胰蛋白胨，0.05g氯化钠，0.02g氯化钾，0.2g硫酸镁，溶于100mL自来水中，调pH至7.0-7.2，121℃灭菌15min。)中(BXPPO2-PQE80L重组子接种于LBKA培养基中，在36.8℃下以220rpm振荡培养过夜，然后按1％(V/V)接种量转接(用相应的培养基),振荡培养至OD600值约0.5，加IPTG至终浓度为0.6mM，以及CuSO4至终浓度0.25mM，36.8℃下以220rpm诱导6h。
提取大肠杆菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果显示，如图6所示，与空的宿主菌及含有PQE80L的宿主菌相比，BXPPO2-PQE80L宿主菌能表达出分子量约为62KDa的蛋白。
实施例5
5.1、表达产物包涵体含量分析BXPPO2-PQE80L宿主菌在SOB培养基中，用0.6mM IPTG，0.25mM Cu2+，37℃诱导表达6h。菌体超声破碎后，12000rpm离心3min，分别取超声后全液、离心后上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析。发现目的蛋白主要在沉淀中，上清目的蛋白非常少(图12)。所以推测表达出目的蛋白主要为包涵体。
5.2、包涵体变性复性
包涵体为不溶的蛋白，没有酶活力。BXPPO2-PQE80L宿主菌在SOB培养基中，用0.6mM IPTG，0.25mM Cu2+，37℃诱导表达6h。菌体超声破碎后，12000rpm离心3min。将沉淀用含50mM Tris-Cl(pH7.5)，5mM DTT，2％Tritonx-100,5mM NaCl的溶液悬浮，经8M尿素变性后，透析去除尿素，得到复性蛋白。以邻苯二酚为底物，检测目的蛋白超声破碎后全液的酶活力为4.07U/mg，复性蛋白的酶活力为23.61U/mg。复性后蛋白的酶活力比未复性诱导蛋白全液酶活力提高5.8倍。
5.3、包涵体纯化
变性后的包涵体经琼脂糖亲和介质(Ni)纯化，取纯化的产物进行SDS-PAGE，电泳显示得到单一的目的条带，基本去除杂蛋白(图13)。
5.4、蛋白质测序验证
将目的蛋白包涵体上样进行SDS-PAGE，得到条带清晰的目的条带(图14)。将目的条带切下送去进行激光辅助解析/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)质谱测序(图15)。通过Mascot软件对对质谱所得数据进行检索鉴定，重组表达蛋白为香蕉PPO，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

Claims (7)

1.一种香蕉多酚氧化酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的香蕉多酚氧化酶的重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA；
步骤2、利用电子克隆的方法得到香蕉PPO的编码区序列，并进行PCR扩增验证，得到香蕉PPO的编码区序列；
步骤3、构建含有步骤2的PPO的编码区序列的重组质粒pQE80L-PPO；
步骤4、将步骤3获得的重组质粒pQE80L-PPO加入到大肠杆菌M15感受态细胞中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，37℃条件下培养过夜，得到香蕉PPO表达菌pQE80L-PPO/M15；
步骤5、培养香蕉PPO表达菌pQE80L-PPO/M15，使用IPTG诱导香蕉PPO，产生香蕉PPO重组蛋白，其中IPTG诱导条件为IPTG浓度0.6mM，诱导时间为6h；
步骤6、纯化香蕉PPO重组蛋白，得到香蕉PPO重组蛋白，所述香蕉PPO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤1中香蕉果肉的总RNA的提取具体按照以下步骤实施：
提取缓冲液内含2％CTAB、pH9.0、100mM Tris-硼酸、1.4MNaCl、pH8.0、20mM EDTA和2％PVP-K30，用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，将其预热至60℃；果肉用液氮速冻后研磨成粉末，每0.2g果肉加入1mL提取缓冲液，涡旋混匀，于60℃放置30min，每隔5-10min颠倒混匀1次；向提取混合液中添加0.5M CaCl2使其摩尔浓度为100mM，25℃放置20min；冷至室温，用等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/min离心5min；取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，混匀，静置分层，室温12000r/min离心5min；上清液加10MLiCl至终浓度为3M，-20℃中放置12h，4℃下12000r/min离心20min；小心倒掉上清，沉淀用0.5mL3MLiCl洗涤至少3次；沉淀用0.3mL DEPC水溶解,再用等体积的水饱和酚，氯仿顺序抽提；吸取上清液，加入1/15体积的pH5.2、3MNaAc和1/5体积无水乙醇，冰上放置0.5h，4℃下以12000r/min离心20min；上清液加1/10体积3MNaAc(pH5.2)和3倍体积无水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h，4℃下12000r/min离心20min，沉淀物用0.5mL75％乙醇洗涤2次，0.5mL无水乙醇洗涤一次，每次都经12000r/min离心1min，室温干燥后溶于RNase-free水中；取RNA样品通过超微量分光光度计检测其浓度和质量，剩余的RNA样品于-80℃保存备用。
5.根据权利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2中电子克隆香蕉PPO具体按照以下步骤实施：
以步骤1中的反转录的cDNA为模板，利用上游引物FP1：5′-tcgatcc tgttctcggcttc-3′；下游引物RP1：5′-cgatggtgcggcttttattttcc-3′；进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃10s，30个循环；72℃5min。
6.根据权利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3中构建表达载体具体按照以下步骤实施：
根据步骤2得到的香蕉PPO基因序列，设计上游引物：含有内切酶Kpn I的FPQE25’-CGGggtacc CCG atgactgca aatgccaagctcgac-3’；含有内切酶Hind III的下游引物：RPQE5’-CCCAagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3’；利用此对引物进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃10s，30个循环；72℃5min；
用凝胶回收试剂盒对所扩增的PCR产物进行切胶回收，将切胶回收后的PCR产物和pQE80L载体分别用Kpn I和Hind III进行双酶切，用T4连接酶将两个双酶切产物于16℃连接12h左右，再将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，于37℃培养过夜；挑取出单菌落，即为重组质粒pQE80L-PPO，在表达载体pQE80L多克隆位点的Kpn I和Hind III插入了不含终止密码子的猪FTO基因CDS区，使重组表达载体pQE80L-PPO的N端融合了6×His标签。
7.根据权利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3中表达条件为：将步骤3获得的重组质粒pQE80L-PPO加入到冰预冷的大肠杆菌M15感受态细胞中，于冰上放置30min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板，36.8℃下以220rpm振荡培养过夜，得到香蕉PPO表达菌pQE80L-PPO/M15，工程菌培养于SOB培养基中，用0.6mM IPTG，0.25mM Cu2+，37℃诱导表达6h，得到香蕉香蕉多酚氧化酶重组蛋白。
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