CN103146719A

CN103146719A - 华南美丽葡萄花青素还原酶基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN103146719A
Application number: CN2013100613364A
Authority: CN
Inventors: 彭清忠; 杜次; 朱越; 李菁
Original assignee: Jishou University
Current assignee: Jishou University
Priority date: 2013-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明公开了一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因及其编码的蛋白与用途，该基因为首次从华南美丽葡萄的cDNA中获得，填补了我国葡萄资源中分子克隆出花青素还原酶基因的空白。本发明所提供的花青素还原酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明提供的花青素还原酶基因可以通过生物技术提高葡萄中原花青素类活性成分的含量，同时可以进行牧草品种改良、农产品脱涩、茶多酚的分子育种、作物抗病虫害的提高等，具有很好的应用前景。

Description

华南美丽葡萄花青素还原酶基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及通过合成华南美丽葡萄cDNA、PCR和重组表达技术获得花青素还原酶基因及其编码产物，属于分子生物学和植物基因工程领域。

背景技术

植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，经济作物次生代谢合成相关功能基因的研究成为热点领域之一，这些基因的克隆将为解析经济作物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释作物品质的形成提供理论依据，同时为利用生物技术进行作物品质改良、分子遗传育种和作物抗逆性等带来广阔的应用前景。

原花青素(Proanthocyanidins，PA)又称缩合单宁，是高等植物特有并广泛存在的聚多酚类化合物。具有抗紫外线、抗病、抗虫、清除自由基、调节种子休眠和萌发等生理功能；从食物中摄取寡聚原花青素可以抗衰老，预防心血管疾病、癌症、阿兹海默氏病等疾病，享有多方面的保健和药用价值。花青素还原酶(anthocyanidin reductase，ANR)是原花青素类化合物合成下游途径中的关键酶，也是原花青素单体合成的直接酶类，在原花青素生物合成途径中具有重要的调节作用。

葡萄除作为重要的经济作为外，其葡萄籽和皮中原花青素含量丰富，是提取原花青素的主要原材料。目前，我国葡萄种植主要为欧洲品种，本土丰富的野生资源未有得到开发利用。因此从野生葡萄资源中获得花青素还原酶基因，将为通过代谢工程手段改良葡萄或其他作物品质和分子遗传育种等提供重要基础。在本次发明公布之前，仅有欧洲酿酒葡萄(Vitis vinifera)有关花青素还原酶基因的报道，尚未有公开或报道过野生葡萄--华南美丽葡萄(Vitisbellula)花青素还原酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因(ANR)及其编码的蛋白与应用。

本发明实施例是这样实现的，一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因，核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO.1的DNA序列；或

(2)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

本发明的另一目的在于提供一种具有上述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的华南美丽葡萄花青素还原酶。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的宿主细胞。

本发明的另一目的在于提供上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因通过转基因技术和代谢工程手段在葡萄或牧草品质改良、农产品脱涩、茶多酚分子育种、作物抗病虫害中的应用。

本发明所提供的花青素还原酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明提供的花青素还原酶基因可以通过生物技术提高葡萄中原花青素类活性成分的含量，同时可以进行牧草品种改良、农产品脱涩、茶多酚的分子育种、作物抗病虫害的提高等，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：华南美丽葡萄总RNA和ANR基因的PCR扩增电泳图；

图2：大肠杆菌表达载体pET-32a(+)/ANR构建图；

图3：重组花青素还原酶表达和纯化SDS-PAGE图；M，蛋白质标准；1，重组菌破壁后上清液；2，重组菌全菌；3，重组菌破壁后沉淀部分；4，空载体重组菌；Trx-VbANR，纯化的重组花青素还原酶；

图4：重组花青素还原酶活性HPLC检测图；a，花青素标准品HPLC图；b，Trx-VbANR酶促反应产物HPLC图(EC，表儿茶素)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的目的在于提供一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因(ANR)。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。

本发明所提供的华南美丽葡萄花青素还原酶(ANR)，为以下核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO.1的DNA序列；

(2)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

本发明所提供的华南美丽葡萄花青素还原酶(ANR)，其特征在于，是一下氨基酸序列之一：

具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

含有本发明的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围；

含有本发明的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围；

所述宿主细胞为有价值的活性材料。

本发明的华南美丽葡萄花青素还原酶基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下：

“华南美丽葡萄花青素还原酶”基因(ANR)指：编码具有华南美丽葡萄花青素还原酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-1017位核苷酸序列。

“华南美丽葡萄花青素还原酶蛋白或多肽(ANR)”指：具有华南美丽葡萄花青素还原酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括华南美丽葡萄花青素还原酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。

本发明还包括花青素还原酶或多肽的类似物。这些类似物与天然华南美丽葡萄花青素还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化修饰的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。

在生产本发明中的华南美丽葡萄花青素还原酶多肽时，可以将华南美丽葡萄花青素还原酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成华南美丽葡萄花青素还原酶表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其他植物细胞。

发明还可用Northern印迹法技术分析华南美丽葡萄花青素还原酶基因产物的表达，即分析华南美丽葡萄花青素还原酶的RNA转录物在细胞中的存在和数量。

此外，本发明可用作探针的核酸分子通常具有华南美丽葡萄花青素还原酶基因核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码华南美丽葡萄花青素还原酶的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在华南美丽葡萄花青素还原酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于华南美丽葡萄花青素还原酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

实施例1、华南美丽葡萄cDNA的合成

1、华南美丽葡萄总RNA的提取与检测

取华南美丽葡萄(Vitis bellula)嫩叶2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中[CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L，EDTA25mmol/L，NaCl2.0mol/L，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％]，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提2次，7500g离心15min。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混合后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20min，沉淀用500μL SSTE[SDS0.5％，NaCl1mol/L，Tris-HCl(pH8.0)10mmol/L，EDTA1mmol/L]，在65℃溶解5min。用等体积氯仿抽提，13000g离心5min，上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h，4℃13000g离心20min，沉淀室温干燥10min后溶于100μLDEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

2、反转录合成cDNA

采用mRNA纯化试剂盒(PolyATract mRNA isolation system III，Promega公司)分离mRNA后，采用TaKaRa公司提供的PrimeScript反转录试剂盒，合成蛇足石杉mRNA第一互补链DNA。

实施例2、花青素还原酶基因的克隆

从NCBI中搜索花青素还原酶基因相关的核苷酸序列和EST序列，通过比对分析，利用vector NTI软件设计一对扩增引物ANR-F(ATGGCCACCCAGCAC CCCAT)和ANR-R(TCAATTCTGCAATAGCCCCTTGGC)。以华南美丽葡萄的cDNA为模板，按照以下体系[10×Ex PCR buffer 5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物LDC-F和LDC-R(10pmol)各1.0μL，Ex Taq聚合酶0.25μL，cDNA4.0μL，补加ddH₂O至终体积50.0μL]扩增LDC基因；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。扩增结果于1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0纯化PCR产物，然后克隆到

19-T载体中，提取阳性克隆子送TaKaRa公司测序，获得华南美丽葡萄花青素还原酶相关基因序列。利用Vector NTI软件分析，发现该序列具有完整开放阅读框，长度为1017 bp，可编码338个氨基酸，将该基因分别命名为ANR。

实施例3、花青素还原酶基因的原核表达

1、原核表达载体的构建

以T载体中的ANR为模板，利用引物P1(CATGCCATGGCCACCCAG CACCCCAT)和P2(CCGCTCGAGTCAATTCTGCAATAGCCCCTTG)进行PCR反应，扩增产物经电泳检测和纯化后，用限制性内切酶Nco I和Xho I在37℃酶切2h，采用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物；同时利用Nco I和Xho I在37℃酶切pET-32a(+)载体2h，利用试剂盒回收大片段。

将回收的两个片段混合，在DNA连接酶作用下于16℃反应12h，连接产物利用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)，在氨苄和氯霉素抗性平板上进行抗性筛选，并对克隆子进行全菌PCR检测，将阳性克隆子接入LB液体培养基中培养，提取重组质粒，进行Nco I和Xho I双酶切分析，琼脂糖凝胶电泳鉴定完全酶切后存在两个片段，表明表达载体构建成功。命名为：pET-32a(+)/ANR(图2)。

2、花青素还原酶基因的可溶性表达

将筛选获得的阳性克隆子接种到含有氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)和氯霉素(终浓度170μg/mL)的LB液体培养基中，37℃150r/min培养3-4h后使用分光光度计检测菌体密度，OD₆₀₀约为1.0时添加IPTG(终浓度260μg/mL)诱导表达，继续培养4h，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心收集菌体，用1mL的PBS(50mM pH7.0)洗涤和重悬菌体，重悬菌液分2份，其中一份加入2μL溶菌酶(100mg/mL)，室温静置10min后在液氮中反复冻融3次，12000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀。分别在上清、沉淀、全菌中加入等体积的2×loading buffer，沸水浴3min，短暂离心后使用10％的SDS-PAGE电泳检测分析(图3)。

实施例4、重组花青素还原酶的纯化和活性鉴定

1、重组花青素还原酶的纯化

大量培养重组菌株，经IPTG诱导表达，收集菌体，PBS反复洗涤3次，使用Ni-NTA SefinoseTM Resin蛋白纯化试剂盒(上海生工)中的binding buffer重悬菌体，溶菌酶酶解，冰浴超声破碎细胞，12000rpm离心30min收集上清；根据融合蛋白上的His-Tag采用Ni-NTA纯化柱纯化重组花青素还原酶，分管收集纯化液，10％的SDS-PAGE电泳检测纯化效果(图3)。

2、重组花青素还原酶活性鉴定

在柠檬酸缓冲液(100mM，pH4.0)中配制酶反应体系(1mL)，使各试剂终浓度分别为：花青素(cyanidin)100μM、NADPH1.0mM、500μg重组酶(Trx-VbANR)。将反应体系于40℃水浴45min，然后加入2mL乙酸乙酯萃取酶反应产物，离心收集萃取液，浓缩至干，用50μL甲醇溶解。

高效液相色谱(HPLC)检测：采用LC-20A高效液相色谱仪(岛津，日本)，色谱条件：色谱柱Diamonsil C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)、流动相甲醇-0.08M醋酸铵(25∶75)、流速1mL/min、检测波长280nm、柱温25℃、进样量20μL。分别吸取花青素标准品(底物)和酶促反应产物进行分析(图4)

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因，其特征在于，核苷酸序列为：

(1)SEQ ID NO.1的DNA序列；或

(2)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

2.一种具有权利要求1所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的华南美丽葡萄花青素还原酶。

3.一种含有权利要求1所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的重组载体。

4.一种含有权利要求1所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的宿主细胞。

5.如权利要求1所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因通过转基因技术和代谢工程手段在葡萄或牧草品质改良、农产品脱涩、茶多酚分子育种、作物抗病虫害中的应用。