CN102719440B - 杂色鲍血蓝蛋白ⅰ和ⅱ型亚基基因及克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基基因及克隆方法。本发明提供的杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因和Ⅱ型亚基基因有利于针对血蓝蛋白等杂色鲍体内重要免疫分子开展基因功能及其相关应用研究，对于鲍等经济贝类病害的防治具有重要意义，且可将杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因和Ⅱ型亚基基因资源进一步应用于免疫医学领域，并降低医疗成本。

Description

杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基基因及克隆方法

技术领域

本发明涉及一种杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ亚基基因及Ⅱ型亚基基因，本发明还涉及杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ亚基基因及Ⅱ型亚基基因克隆方法。

背景技术

血蓝蛋白（Hemocyanin）是动物界的三大呼吸蛋白之一，主要存在于低等动物如节肢、软体动物的血液中，其活性中心结合有两个Cu⁺离子，能够可逆地结合氧气。与氧结合时，无色的Cu⁺变为蓝色的Cu²⁺，从而使血液呈现淡淡的蓝色。血蓝蛋白是一种多功能蛋白，除最主要的氧气运输功能外，还在金属离子转运、蛋白质储存、渗透压调节、蜕皮激素载体、表皮固化等方面发挥作用，尤其重要的是，近年越来越多的证据表明它还在免疫反应中发挥重要的功能，其中研究最为深入的是酚氧化酶活性。酚氧化酶是先天免疫反应中的重要免疫分子，其催化的反应及反应中产生的活性物质可以通过多种方式参与到宿主防御反应中。

杂色鲍（Haliotis diversicolor）属软体动物，腹足纲，是我国南方重要的养殖鲍品种，其肉质鲜美、营养丰富，是中华民族的传统美食。由于近年来急速膨胀的鲍养殖业及日益恶化的养殖环境，鲍病害呈现出爆发性的增长态势，对水产养殖业造成了极大损害。杂色鲍等低等动物缺少特异性免疫系统，血蓝蛋白作为其中重要的先天性免疫分子，在鲍血液中的含量非常丰富，因此血蓝蛋白在免疫防御反应中扮演着非常重要的角色。此外，由于贝类血蓝蛋白在哺乳动物体内具有很好的免疫原性，广泛用作医学免疫佐剂，但贝类血蓝蛋白基因较大，很难通过基因工程表达的方法大量生产，只能从甲壳类、贝类等活体中纯化，成本很高，因而目前在NCBI数据库中没有杂色鲍血蓝蛋白的两个亚基的核苷酸全基因序列和蛋白全序列的记载。

发明内容

本发明的第一个目的是提供杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因（HdHc1，Haliotis diversicolor Hemocyanin type Ⅰ gene）。

本发明的第二个目的是提供杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型亚基基因（HdHc2，Haliotis diversicolor Hemocyanin type II gene）。

本发明的第三个目的是提供杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因和Ⅱ型亚基基因的核苷酸全序列的克隆方法。该方法简单易操作，成本低。

完整的杂色鲍血蓝蛋白由两种亚基组成，分别由两个基因编码，命名为HdHc1和HdHc2。而血蓝蛋白具有复杂的高级结构，其酚氧化酶活性需由两种亚基组成的完整蛋白分子才能发挥出来，单独的HdHc1或者HdHc2蛋白不能发挥功能。但是，目前尚无法通过体外表达的方法生产有天然活性的血蓝蛋白，因此，本发明先从杂色鲍的血淋巴中提取分离得到一种蓝色蛋白，经质谱鉴定以及与NCBI中已知的同源鲍类的血蓝蛋白的肽段序列比对，确定所获得的蓝色蛋白具有HdHc1和HdHc2两种血蓝蛋白亚基的部分肽段序列，同时具有酚氧化酶活性，进而确定所得蛋白为完整的杂色鲍血蓝蛋白。然后，根据所得HdHc1和HdHc2部分肽段序列，及NCBI中同源性90%的欧洲瘤鲍（Haliotis tuberculata）血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基基因序列（AJ252741和AJ297475），分别设计特异性引物，进而组建杂色鲍基因组文库并从中筛选到了完整的HdHc1和HdHc2基因序列，而血蓝蛋白基因均为单拷贝，且杂色鲍基因组中没有同源基因，因此根据所获得的HdHc1和HdHc2基因序列与所得的质谱鉴定的蛋白肽段序列进行比对，从而确定所得HdHc1和HdHc2基因是杂色鲍血蓝蛋白的两个亚基基因的核苷酸全序列。

本发明提供的HdHc1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因序列全长19339 bp，其对应外显子（exon）及长度如表1所示：

表1：HdHc1核苷酸序列外显子（exon）及长度

外显子	翻译起止位置	长度
			exon1	1 – 255	255
exon2	602 – 820	219
			exon3	1577 – 1828	252
exon4	1947 – 2351	405
			exon5	3210 – 4451	1242
exon6	5119 – 6357	1239
			exon7	6741 – 7973	1233
exon8	8310 – 9566	1257
			exon9	9824 – 9937	114
exon10	9999 – 10985	987
			exon11	12636 – 13694	1059
exon12	14009 – 14224	216
			exon13	14743 – 14904	162
exon14	15371 – 16195	825
			exon15	17807 – 19339	1533

本发明提供的HdHc2核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因序列全长18226 bp，其对应PolA信号、外显子（exon）及长度如下：

表2：HdHc2核苷酸序列外显子（exon）及长度

外显子	翻译起止位置	长度
			exon1	1 – 258	258
exon2	1376 – 1594	219
			exon3	2459 – 2710	252
exon4	3095 – 3499	405
			exon5	3977 – 5206	1230
exon6	5914 – 7155	1242
			exon7	7653 – 8891	1239
exon8	9104 – 10414	1311
			exon9	10665 – 10853	189
exon10	11866 – 12921	1056
			exon11	13850 – 14065	216
exon12	14531 – 14692	162
			exon13	15028 – 15852	825
exon14	16313 – 17743	1431
			PolA	18221

本发明还提供了由上述HdHc1基因编码的杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了由上述HdHc2基因编码的杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型亚基蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的是通过以下技术措施来实现的：以杂色鲍肌肉为材料提取基因组DNA，对得到的基因组DNA进行片段化处理，然后对DNA断裂末端进行补齐和磷酸化修复，然后进行电泳分离片段化DNA，回收38kb-48kb的DNA片段，所回收的DNA片段与pCC1FOS载体连接，再经噬菌体包装并转染大肠杆菌，经过酶切与测序鉴定后制备了杂色鲍基因组文库，然后制备杂色鲍基因组文库甘油菌，用HdHc1和HdHc2的上、下游引物通过PCR方法筛选阳性克隆，经测序，最终筛选到杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型(HdHc1)和Ⅱ型(HdHc2)亚基基因的核苷酸全序列。

所述HdHc1和HdHc2的上、下游引物分别为：

HdHc1的上游引物：GAGCAGGTATGGTTCTTTCAGTATTCTTTC；

HdHc1的下游引物：AGTATCTTCTACGCACTTTTACAATAACGGA；

HdHc2的上游引物：ATCATGACTACGATGTTCTT；

HdHc2的下游引物：TACCACACAGTTGAAGAG。

本发明与现有技术相比具有的优点：

(1) 本发明提供了杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ亚基基因，利于促进针对血蓝蛋白等杂色鲍体内重要免疫分子的基因功能研究，对于鲍等经济贝类病害的防治具有重要意义。

(2) 本发明所获得杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ亚基基因序列，为该基因资源能够进一步应用于免疫医学领域，并降低医疗成本打下了良好基础。

附图说明

图1是SDS-PAGE检测纯化的杂色鲍血蓝蛋白；

胶浓度为12.5%；1：中等分子量蛋白Marker；2：纯化的血蓝蛋白，上样量4μg。

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。

以下实施例中涉及的试剂和电泳条件：

PBS缓冲液：1L PBS缓冲液中含8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用HCl调节pH为7.6。

LB培养液：1% Tryptone，0.5% Yeast Extract和1% NaCl，百分比表示W/V。

普通电泳条件：电压6V/cm，1小时。

脉冲电泳条件：泵80，温度12℃，电压4V/cm，角度120°，脉冲时间3~30s，运行3小时。

实施例一：血蓝蛋白（Hc）的提取及鉴定

1．粗血蓝蛋白的制备

取杂色鲍的血淋巴加入1.5mL Eppendorf管中，8000rpm，4℃，离心30min，弃沉淀，上清液再10000rpm，4℃离心30min，弃沉淀，然后30000rpm，4℃离心1.5h，弃上清，可见管底有蓝色沉淀，得到粗血蓝蛋白。向蓝色沉淀中加入1mL PBS缓冲液重悬沉淀，-20℃保存。

2．密度梯度离心纯化血蓝蛋白

用PBS缓冲液配置4个浓度的CsCl的溶液置于梯度管中，从管底到管顶分别为45%、35%、25%、15%（V/W）。将步骤1中提取的血蓝蛋白加入梯度管的顶层，然后35000rpm，4℃，离心16h。在45%与35%交界面附近出现1条蓝色带，将其吸出，加入PBS缓冲液稀释后，35000rpm，4℃，离心2h，去上清，得到的沉淀用100μL PBS缓冲液（pH 7.6）重悬得到样品溶液，每管分装50μL，4℃保存备用。

3．SDS-PAGE检测血蓝蛋白纯度与质谱鉴定

取步骤2中所得的样品溶液3μL，与2×上样缓冲液（TaKaRa，Cat：D622）混合，SDS-PAGE采用7.5%的分离胶、5%的浓缩胶按照常规方法电泳、染色和脱色，如图1所示，凝胶中只可见单一血蓝蛋白条带，说明蛋白纯化效果良好。

割取凝胶上血蓝蛋白条带，送由暨南大学测试中心进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，并与NCBI数据库中杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基的部分肽段序列（gi|194410718和gi|255046234）进行比较，结果参见表3，鉴定结果与杂色鲍两种血蓝蛋白亚基的部分肽段序列完全一致，说明所纯化到的蛋白确为完整的杂色鲍血蓝蛋白。其中，肽段IFAIWQR、EMPWAYER、LWAIWQELQR、LYTVQFQDALR、LWAIWQALQIR和LYTVQFQDALRR来源于HdHc2。

表3：

实施例二：血蓝蛋白（Hc）酚氧化酶活性的测定

1．血蓝蛋白酚氧化酶活性的测定

紫外可见分光光度计检测实施例一的步骤2中所得纯化的血蓝蛋白（Hc）在不同波长下的吸光值，用考马斯亮蓝法检测Hc的浓度。酚氧化酶活性测定分为对照组和实验组，对照组用PBS代替杂色鲍血蓝蛋白，其他与实验组相同。实验组取100μL 3mg/mL的血蓝蛋白加入2.8mL PBS缓冲液中，放入25℃的水浴锅，静置15min；加入100μL 18mmol/L的邻苯二酚，混匀，记录每分钟其在400nm的吸光值。重复3次。计算反应初速度：

Vi=（TODe-TODc）/3×摩尔吸光系数，

其中TODe为反应前3min实验组的吸光值变化，TODc为反应前3min对照组的吸光值变化，邻苯二酚氧化产物邻-苯醌的摩尔吸光系数为1417/（mol·CM）。

2．血蓝蛋白酚氧化酶的激活

分别以10μL 30mmol/L的SDS（十二烷基磺酸钠）和10μL 10mg/mL的胰蛋白酶与100μL 3mg/mL的血蓝蛋白混合，置于37℃的水浴锅中静置15min，其他操作同实施例二的步骤1，测定SDS和胰蛋白酶对血蓝蛋白酚氧化酶的影响。

酶活性测定及活性激活实验结果表明，天然的杂色鲍血蓝蛋白以6mmol/L邻苯二酚为底物时表现出微弱的酚氧化酶活性，反应初速度为（1.603±0.064）nmol/（min·mg）。在一定浓度的胰蛋白酶和SDS激活后，杂色鲍血蓝蛋白的酚氧化酶活性得到了不同程度的加强，其中SDS激活后反应初速度为（6.176±0.113）nmol/（min·mg），胰蛋白酶激活后的反应初速度为（4.253±0.125）nmol/（min·mg），表明SDS的激活作用要比胰蛋白酶更强。

实施例三：HdHc1和HdHc2基因提取

1．HdHc1和HdHc2基因文库筛选引物的设计

根据实施例一中质谱鉴定所得HdHc1和HdHc2肽段序列，及NCBI中同源性90%的欧洲瘤鲍（Haliotis tuberculata）血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基基因序列（AJ252741和AJ297475），分别设计特异性引物，进而从杂色鲍基因组文库中筛选完整的HdHc1和HdHc2基因序列。

HdHc1的上游引物：GAGCAGGTATGGTTCTTTCAGTATTCTTTC；

HdHc1的下游引物：AGTATCTTCTACGCACTTTTACAATAACGGA；

HdHc2的上游引物：ATCATGACTACGATGTTCTT；

HdHc2的下游引物：TACCACACAGTTGAAGAG。

2．杂色鲍Fosmid基因组文库的制备

2.1 基因组DNA提取与片段化处理

取5g的新鲜成熟杂色鲍肌肉组织，液氮研磨后，按照动物基因组提取试剂盒（Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit，Cat：A1120）操作说明书进行，提取后的DNA溶液用200μL的吸头采用反复吹打的方法，对基因组DNA进行片段化处理，进行普通电泳和脉冲电泳检验片段化效果。

2.2 末端修复

根据TaKaRa BKL Kit（TaKaRa，Cat：D6127）操作说明书配制混合体系，主要成分包括DNA片段、末端修复酶混合物、10×Buffer、dNTPs和ATP等，室温放置1小时，对DNA断裂末端进行补齐和磷酸化修复，70℃放置10min，使酶失活。

2.3 插入片段制备

配置1%的低熔点琼脂糖胶进行脉冲电泳，分离片段化的DNA，切胶回收38 kb-48 kb之间的DNA片段，注意紫外灯下操作要迅速，切割片段不能小于25 kb，防止嵌合克隆的产生。割下的胶块放于70℃水浴中至胶溶解，然后快速将其转移到45℃的水浴中，加入1/10的β-Agarase I Reaction Buffer (10X)（NEB，Cat：M0392S），温浴过夜降解琼脂糖，最后70℃放置10min使酶失活。将混合物按每支离心管500μL的量进行分装，冰浴冷却5min，10000rpm离心20min，转移上清液至新的离心管，加入上清液的1/10体积的3M醋酸钠（pH 7.0）和上清液的2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀10min，10000rpm离心20min，弃上清，用70%乙醇洗涤DNA，重复两次，沉淀的DNA在室温条件下自然风干5-10min，溶解于水中，进行普通电泳和检测回收的DNA片段。

2.4 载体连接

将回收后的DNA片段与pCC1FOS载体（Epicentre，Cat：CCFOS110）按照如下反应体系进行连接：

1 μL 10×Fast-Link Ligation Buffer

1μL ATP（10 mM）

1μL pCC1FOS Vector (0.5μg/μL)

0.25μg DNA片段

1μL Fast-Link DNA Ligase，

加水补齐至10μL，放置于室温2h，后70℃ 10min灭活连接酶。

2.5 噬菌体包装

取一支包装蛋白（MaxPlax Lambda Packaging Extracts，Epicentre，Cat：CCFOS110）置于冰上，将连接产物加入到25μL包装蛋白中，混匀并避免气泡产生，低速离心2s后将混合物置于30℃反应90min，再加入25μL包装蛋白30℃继续反应90min，结束后加入噬菌体稀释液（Phage Dilution Buffer，Epicentre，Cat：CCFOS110）至终体积达到1mL，加入25μL氯仿混匀后置于4℃冰箱保存备用。

2.6 滴度确认、转染与涂板

将包装产物用PDB（Phage Dilution Buffer）按照102~105梯度稀释，取10μL 加入100μL的EPI300-T1大肠杆菌细胞中，37℃放置20min，涂布于含12.5 μg/mL氯霉素的LB平板上37℃培养过夜，筛选阳性克隆并计算滴度，结果以105稀释后的平板上的阳性克隆在100 cfu左右。

2.7 酶切与测序鉴定

从平板中随机选取50个白色单菌落，培养后用质粒大提试剂盒（东盛生物，Cat：N1031）提取Fosmid DNA，Not I（TaKaRa，Cat：D1166A）酶切4小时，使用脉冲电泳鉴定插入片段长度。从上述50个克隆中随机选取8个克隆送宝生物工程（大连）有限公司进行末端测序，在NCBI上比对测序结果：在其中16个测序结果中，8个序列确定为鲍鱼来源的DNA序列，另有8条序列无比对结果。上述结果说明，本研究所建文库确为杂色鲍基因组文库，其中未见人源或细菌DNA的污染。

2.8 Fosmid文库甘油菌的制作

以每孔约100个克隆的量进行96孔板菌体培养，37℃过夜培养后甘油超低温冰箱中保存，同时分别在两个LB固体平板中涂布同样的菌量以确认96 孔板中每孔起始培养克隆数。

3．PCR方法从杂色鲍基因组文库中筛选阳性克隆

于96孔PCR板上制备PCR反应体系，每孔反应体系为15μL：7.5μL HS Mix（东盛生物，P2081），上、下游引物（5μM）各1.5μL，不足部分用水补齐，用排枪沾取文库板中菌液在96孔PCR板的对应孔中混匀。PCR反应程序为：95℃预变性4分钟，循环30~35个：95℃变性40~60秒，55~68℃退火40~60秒，72℃延伸20~70秒；最后72℃充分延伸7分钟。扩增反应结束后进行普通电泳检测扩增结果，确定阳性克隆孔。进一步从阳性克隆孔中吸取1μL菌液加入到1mL的LB培养液中，混匀后取100-300μL菌液涂平板，37℃培养过夜，第二天以同样的PCR体系和程序，用牙签挑取96个单克隆菌落进行菌落PCR检测，进而筛选到阳性单克隆菌。

4.克隆测序与分析

用LB液体培养基扩大培养筛选到的两个阳性单克隆菌，送由宝生物工程（大连）有限公司进行测序，分别得到杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型（HdHc1）和Ⅱ型（HdHc2）亚基基因的核苷酸序列。其中，HdHc1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因序列全长19339 bp，其对应外显子（exon）及长度如表1所示。

上述HdHc1基因编码的杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

HdHc2核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因序列全长18226 bp，其对应PolA信号、外显子（exon）及长度如表2所示。

上述HdHc2基因编码的杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型亚基蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

将上述翻译后的杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ和Ⅱ型亚基蛋白序列与实施例一中质谱鉴定的肽段序列（表3）进行比较发现：其中，HdHc1来源的肽段序列IFAGFVLSGLR、FNYEYDNLR、TNSYPNIVFDHYR、GQDIQDLEVVLNELR、IFAGFVLSGLRISATVK、IRGQDIQDLEVVLNELR、APLHPFNYENVNEDEFTR、IEFTPIDSSVDRPMVELGSFTALAK、EMPWAFDR、YDPNPFFR、VFAGFLLSGIK、LLALQAENALR、LHTIQMERALK、LFVTQVEDALVR、EHAIPFDVFNYR、LFVTQVEDALVRR、IFAIWQRLQELR、GKPYNTANCAIASMR、YRGKPYNTANCAIASMR和FACCMHGMASFPHWHR分别与所得蛋白序列SEQ ID NO.2中的3478-3488、3448-3456、3435-3447、3459-3473、3478-3494、3457-3473、3417-3434、3604-3628、736-743、1336-1343、1110-1120、875-885、3253-3263、461-472、1066-1077、461-473、184-195、1032-1046、1030-1046和445-460位置的序列100%吻合；HdHc2来源的肽段序列IFAIWQR、LWAIWQALQIR、LWAIWQELQR、LYTVQFQDALRR和EMPWAYER分别与所得蛋白序列SEQ ID NO.4中的185-191、607-617、1427-1436、1723-1734和3197-3204位置的序列100%吻合。又因血蓝蛋白基因均为单拷贝，杂色鲍基因组中没有同源基因，综合上述结果表明，本发明的HdHc1和HdHc2基因编码的蛋白序列与杂色鲍血蓝蛋白质谱鉴定结果一致，进一步结合其酚氧化酶活性的证据，可以确定所得基因HdHc1和HdHc2为杂色鲍血蓝蛋白基因序列。

Claims (2)

1.杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.杂色鲍血蓝蛋白Ⅰ型亚基蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型亚基基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4. 杂色鲍血蓝蛋白Ⅱ型亚基蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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