CN102643787B

CN102643787B - 紫贻贝c型溶菌酶及其制备方法

Info

Publication number: CN102643787B
Application number: CN 201210100101
Authority: CN
Inventors: 王春艳; 母昌考; 宋微微; 李荣华; 王春琳
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2012-04-09
Filing date: 2012-04-09
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-04-09
Also published as: CN102643787A

Abstract

本发明公开了一种紫贻贝C型溶菌酶及制备方法，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该紫贻贝C型溶菌酶的制备方法是通过对紫贻贝总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、基因克隆、重组质粒构建、表达质粒表达和蛋白纯化步骤得到该C型溶菌酶；该紫贻贝C型溶菌酶是一种新的C型溶菌酶，对多种革兰氏阳性和阴性微生物具有较强的抑制活性，具有开发为食品保鲜剂和饲料添加剂等方面的应用价值。

Description

紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及溶菌酶，具体涉及紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法。

背景技术

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）是无脊椎动物体内非常重要的固有免疫因子之一，它主要通过切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，使细胞胀裂从而引起细菌裂解。溶菌酶在机体免疫应答过程中不仅能直接杀死细菌，还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。溶菌酶按照其来源可分为六类：C（chicken）型、G（goose）型、I（invertebrate）型、植物型、细菌型和T4噬菌体型溶菌酶。G型溶菌酶主要存在于哺乳动物、鸟类和鱼类中，专利号为CN 2004100506518及2004100506522 从扇贝中获得了G型溶菌酶，而I型溶菌酶只存在于无脊椎动物中，C型溶菌酶大都来自于脊椎动物。由于C型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抑制和灭杀作用，在较低温度条件下活性较高且具有较强的热稳定性，因此在作为水产饲料添加剂和水产品保鲜剂方面具有很好的应用前景。目前，针对C 型溶菌酶已开展较多研究，发现其通常含有 130个左右的氨基酸残基，具有4 对二硫键，三维结构呈较紧密的椭球。研究发现，Glu³⁵、Asp⁵²及Trp⁶²残基是C型溶菌酶活性的必需氨基酸残基，Asp¹⁰¹、Arg^ll4、Trp¹⁰⁸等残基对“底物-酶复合物”的形成也发挥着重要作用 (Muraki M，et a1，1997)。近期研究发现，鲍鱼、三疣梭子蟹等无脊椎动物也存在C型溶菌酶，并且该类型的C型溶菌酶具有较强的抑制革兰氏阴性菌活性。迄今为止，尚未有关于紫贻贝C型溶菌酶及其抗菌活性的研究报道。

发明内容

本发明提供了紫贻贝C型溶菌酶及表达基因，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该紫贻贝C型溶菌酶对各种病原菌具有较好的抗菌作用。

本发明还提供了紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，该制备方法能得到纯度较高的紫贻贝C型溶菌酶。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为紫贻贝C型溶菌酶，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。表达该紫贻贝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，其步骤如下：

1）总RNA提取：用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；

2）mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；

3）cDNA模板制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒（购于Stratagene公司）将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I 接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒（购于QIAGEN公司）对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体（购于Invetrogen公司）连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒（购于Stratagene公司）对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜（DMSO），得到含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；测序该C型溶菌酶表达基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

4）基因克隆：以上述含C型溶菌酶基因的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增的引物如下：正向引物5`-TTACTTGTCT TGGTACTTGT G-3`，反向引物5`- TTTGTATGCT ATTTTATTTT G-3`；PCR产物经胶回收试剂盒纯化回收，连接入pMD18-T载体（购于大连宝生物工程有限公司）得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞（购于大连宝生物工程有限公司）中，挑选阳性克隆提取质粒，得到C型溶菌酶基因的克隆质粒；其中3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer 2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 1.0 μl、2.5 mM的dNTP 2.0 μl、10 μM 的上述正向引物溶液1 μl、10 μM 的通用引物T7溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA聚合酶0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl；反应在ABI Veriti^TM（购于ABI公司）中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60 ℃退火30秒, 72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR反应缓冲液2.5 μl、25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、10μM 的上述反向引物溶液1 μl、10μM的通用引物T3溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA 聚合酶0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl，反应在ABI Veriti^TM PCR仪中进行，反应条件为首先94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 45 秒, 60℃ 退火30 秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA 聚合酶均购自Promega公司，通用引物T7、通用引物T3购自上海生工科技有限公司；

5）表达质粒构建：对C型溶菌酶基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nco I酶切位点的下述核苷酸序列：5`- CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA -3`，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的下述核苷酸序:5`-CTCGAGTTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT-3`；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T载体中，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nco I和Xho I（均购于NEB公司）双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回收，并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET-21a (+)（购于Novagen公司），构建得到C型溶菌酶的表达质粒；

6）表达质粒表达：将上述表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)-plysS（北京全式金生物技术有限公司），筛选阳性克隆并测序确认；挑取阳性克隆接种于LB培养基中，220rpm，37℃培养至OD600=0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使终浓度达到0.6 mM，继续培养5小时，4℃，8000rpm离心10分钟，收集菌液；

7）蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的紫贻贝C型溶菌酶；经质谱测序鉴定，测得序列符合该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明的引物由上海生物工程有限公司合成。

与现有技术相比，本发明的优点在于一种紫贻贝C型溶菌酶，该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该紫贻贝C型溶菌酶的制备方法是通过对紫贻贝总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、基因克隆、重组质粒构建、表达质粒表达和蛋白纯化步骤得到该C型溶菌酶；该紫贻贝C型溶菌酶是一种新的C型溶菌酶，对多种革兰氏阳性和阴性微生物具有较强的抑制活性，具有开发为食品保鲜剂和饲料添加剂等方面的应用价值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

一、用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行：取紫贻贝仔血淋巴50 ml，2000 g离心10 分钟，弃上清，向沉淀细胞中加入20 ml 的TRIZOL（Invitrogen），用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡10秒；加入4 ml氯仿，剧烈震荡30秒；4℃ 10,000 g高速离心10分钟；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇（约15ml），置于-20℃静置1小时以上；4℃ 10,000 g高速离心10分钟；小心弃去上清液，用5 ml 70%的乙醇清洗沉淀；4℃ 10,000g 高速离心10分钟，小心弃去上清液；真空干燥5分钟，用约600 μl RNase-free water溶解RNA，待完全溶解后储存于-80℃备用。

二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA，具体纯化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行：包括在37℃水浴加热Oligotex Suspension，震荡混匀，室温放置；70℃水浴加热OEB Buffer；向500 μl总RNA溶液（RNA含量约为2mg）中加入：650 μl of OBB buffer，135 μl of Oligotex Suspension，650 μl of RNase-free water，70℃加热体系3分钟；取出反应体系后，室温下放置10分钟，15,000 g 离心2分钟，小心吸走上清液，用600 μl OW2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。然后将悬浊液移入放在1.5 ml离心管中的spin column内，15,000 g离心1分钟，将spin column 转移到一个新的1.5 ml离心管中，加入600 μl OW2，15,000 g离心1分钟，将spin column转移到新1.5 ml离心管中；向spin column中加入50 μl预热到70℃的OEB buffer，轻轻混匀，15,000 g离心1分钟；向spin column再加入50 μl OEB buffer，混匀后15,000 g离心1分钟；回收离心管中的mRNA溶液约100 μl。

三、用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA末端补平、EcoR I 接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为7%的DMSO溶液，得到含有核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃备用。具体逆转录方法包括一链cDNA合成：在RNase-free的200 μl离心管中依次加入试剂混匀，然后加入30 μl poly(A)引物+ RNA (5 μg)，混匀，室温下放置10分钟后，向体系中加入1.5 μl的一链合成酶StrataScript RT(50 U/μl)，终体积达到50 μl，轻轻混匀反应体系，离心数秒，42℃温育1小时。二链合成：在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入需用反应物反应，再向反应体系中加入2 μl RNase H(1.5 U/μl)，11 μl DNA polymerase I(9.0 U/μl)，轻轻混匀反应体系，离心数秒，16 ℃ 放置2.5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端：向二链合成体系中加入需用反应物，快速震荡反应体系离心后，于72℃反应30分钟；加入200 μl 酚－氯仿[1:1 (v/v)]，震荡混匀体系，室温下高速离心2分钟，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混匀，室温下高速离心2分钟，然后转移上清至新管中；加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系：20 μl 3M sodium acetate，400 μl 100% (v/v) ethanol，–20℃沉淀过夜；4℃高速离心60分钟，小心弃去上清，保留沉淀；加入500 μl 的70%乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心2分钟；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9 μl 含有 EcoR I adapters 的溶液溶解沉淀并于4℃放置至少30分钟。EcoR I 接头的连接：向体系中加入下列成分：1 μl 10× ligase buffer，1 μl 10mM rATP，1 μl T4 DNA ligase (4 U/μl)，离心后8℃放置过夜；70℃ 30分钟灭活连接酶。磷酸化EcoR I末端：离心反应物2秒，室温放置5分钟冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头：1 μl 10×ligase buffer，2 μl 10mM rATP，5 μl sterile water，2 μl T4 polynucleotide kinase (5 U/μl)，37℃温育30分钟，70℃ 30分钟灭活激酶，离心2秒后室温放置5分钟冷却。Xho I内切酶酶切：向体系中加入下列成分：28 μl Xho I buffer supplement，3 μl Xho I (40 U/μl)，37℃温育1.5小时，加入125 μl 的100% (v/v)乙醇，-20℃放置过夜，4℃离心60分钟，弃去上清，完全干燥沉淀，用50 μl ddH₂O溶解沉淀。cDNA与载体（Uni-ZAP XR vector，Invetrogen）连接：在干净的200 μl离心管中依次加入下列试剂：2.5 μl resuspended cDNA (>100 ng)，0.5 μl 10×ligase buffer，0.5 μl 10 mM rATP(pH7.5)，1.0 μl Uni-ZAP XR vector (1 μg)，0.5 μl T4 DNA ligase (4 U/μl)。12℃放置过夜。噬菌体文库的包装：从–80℃冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4 μl重组cDNA，用微量移液器吸头混匀体系（不要产生气泡），离心5秒，室温（22℃）温育2小时，加入500 μl 的 SM buffer和20 μl氯仿，轻轻混匀反应体系。快速离心数秒，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。包装反应的滴度测定：在含有氨苄青霉素的LB固体培养基（1升培养基含有氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g ，琼脂粉15 g，pH7.5）上将菌株XL1-Blue MRF’划线培养，37 ℃过夜培养；用LB液体培养基（1升培养基含有氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，pH7.5）培养单克隆菌落，30 ℃，200 rpm摇床培养过夜；4℃，1000 g下离心10分钟沉淀细菌。用25 ml 10 mM MgSO4 重悬细菌；用10 mM MgSO₄ 重悬XL1-Blue MRF’细胞，使浓度达到OD₆₀₀＝0.5；将包装产物按下列比例与宿主菌混合：（1）1 μl 包装产物 + 200 μl XL1-Blue MRF’ （OD₆₀₀＝0.5）；（2）0.1 μl 包装产物 + 200 μl XL1-Blue MRF’（OD₆₀₀＝0.5）；将混合体系置于37 ℃温育15分钟使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3 ml融化状态下约48 ℃的NYZ上层培养基（1升培养基含有氯化钠5 g，MgSO₄·7H₂O 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g ，琼脂糖7 g，pH7.5）；迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基（1升培养基含有氯化钠5 g，MgSO₄·7H₂O 2 g，NZ胺10 g，酵母提取物5 g ，琼脂粉15 g，pH7.5）上，静置10分钟后，倒置于37℃ 过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度（每毫升生长的噬菌斑数目，pfu/ml）。 30℃ 200 rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养XL1-Blue MRF’细胞50 ml；1000g离心宿主细胞10分钟；用25 ml 10 mM MgSO₄ 重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用10 mM MgSO₄ 将菌液稀释至浓度为OD₆₀₀＝0.5；将含有大约 5×10⁴ pfu 噬菌体颗粒的悬浊液与600 μl 浓度为OD₆₀₀＝0.5的XL1-Blue MRF’ 细胞混合，置于Falcon2059 聚丙烯管中，37℃温育混合液15分钟，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48℃ 的6.5 ml液态NZY上层培养基中，混匀后倒入新鲜的150 mm NZY琼脂糖培养基平板上，静置平板十分钟，倒转平板置于37℃ 约8小时（噬菌斑直径不超过2 mm）；在每块平板上倒入大约10 ml SM 缓冲液（1升缓冲液中含有5.8 g NaCl，2.0 g MgSO₄·7H2O，50.0 ml 1M Tris-HCl [pH 7.5]，5.0 ml 2%[w/v]白明胶），4℃放置过夜；将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用2 ml SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5% (v/v)的氯仿，室温下放置15分钟，混匀，500 g离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7% (v/v) DMSO，储存于– 80℃。测定扩增文库滴度（方法同前）。cDNA模板溶液中溶菌酶基因的确认：用Exassist Helper Phage和SOLR 菌株（均购于Stratagene公司）从Uni-ZAPXR Vector上体外切割， pBluescript 噬菌粒进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根据相似性分析结果寻找出如序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的溶菌酶基因片段。

四、对上述含溶菌酶基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的正向引物序列5`- TTACTTGTCTTGGTACTTGTG - 3`，反向引物的核苷酸序列为5`- TTTGTATGCTATTTTATTTTG - 3`，PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接获得克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，挑选阳性克隆提取质粒，得到溶菌酶基因的克隆质粒； 3`端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer 2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 1.0 μl、2.5 mM的dNTP 2.0 μl、10 μM的正向引物1 μl、10μM的通用引物T7 1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA polymerase 0.2 μl， cDNA 模板（文库）1 μl，用PCR水定容到25 μl；反应在ABI Veriti^TM PCR仪中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60℃退火30秒, 72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer溶液 2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 溶液1.0 μl、2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、10 μM的反向引物溶液1.0 μl、10 μM的通用引物T3溶液1 μl、浓度为1 U/μl的Taq DNA polymerase 0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl，反应在ABI Veriti^TMPCR仪中进行，反应条件为首先94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 45 秒, 60℃ 退火30 秒, 72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟；

五、对C型溶菌酶基因的克隆质粒进行PCR扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nco I酶切位点的核苷酸序列5`- CCATGGCTACAAAAACGAAGTGCCA -3`，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列5`- CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACATGTGCTGTAATCGT -3`；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nco I和Xho I（均购于NEB公司）双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回收，并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET-21a (+)（购于Novagen公司），构建C型溶菌酶基因的表达质粒；测序该C型溶菌酶的表达质粒确认；

六、将上述的表达质粒转入表达宿主菌 BL21 (DE3) plysS中，筛选阳性克隆并经测序确认，挑取阳性克隆接种于LB液体培养基中，220 rpm，37℃培养至OD₆₀₀=0.5-0.7，加入IPTG使终浓度达到0.6 mM，继续培养5 h，4℃，8000 rpm离心10 分钟，收集菌液；

七、对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化；最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的紫贻贝C型溶菌酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。具体方法为：在收集的菌体沉淀中，加入适量的菌体裂解液（0.5 M NaCl，10 mM Tris-HCl，0.5% Triton X-100 pH 8.5）重悬沉淀，超声波处理条件为：300 W，处理200次，每次5秒，间隔10秒；菌体裂解液在4℃下100,00 rpm离心20分钟收集包涵体；包涵体沉淀分别用洗液I（0.5 M NaCl，10 mM Tris-HCl，0.5% Triton X-100，2 M 尿素 pH 8.5 ）和洗液II （0.5 M NaCl，10 mM Tris-HCl，0.5% Triton X-100，2%脱氧胆酸钠 pH 8.5）洗涤一次，用8 M尿素溶液（20 mM PBS，0.5 M NaCl，8 M 尿素， 20 mM 咪唑 pH 7.4）溶解；经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白采用逐渐降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下：100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，1 mM EDTA，2 mM 还原型谷胱甘肽，0.02 mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，1%甘氨酸，尿素（6 M，4 M，3 M，2 M，0 M），pH 9.0。透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4℃透析12小时，最后在TBS缓冲液（50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 9.0）中透析两次。重组蛋白浓度测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物公司）。具体操作依试剂盒说明书进行：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；完全溶解蛋白标准品，取10 μl用PBS稀释至100 μl，使终浓度为0.5 mg/ml；将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20 μl加到96孔板的标准品孔中，用PBS溶液补足到20 μl；加适当体积样品到96孔板的样品孔中并用PBS补足到20 μl；各孔加入200 μl BCA工作液，37℃放置30分钟；测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

应用例：

将紫贻贝C型溶菌酶加入试管中制成浓度为0.42 mg/mL作用液，分别接种产气肠杆菌、奇异变形杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌以及鳗弧菌各5 μl，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml，培养24小时后，利用酶标仪测定600 nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表1所示的结果。

表1：紫贻贝C型溶菌酶的抗菌谱

供试菌株	MIC值（μM）
		金黄色葡萄球菌	6.95-13.89
藤黄微球菌	1.74-3.47
		鳗弧菌	3.47-6.95
恶臭假单胞菌	1.74-3.47
		奇异变形杆菌	3.47-6.95
产气肠杆菌	3.47-6.95

从表1中可以看出，紫贻贝C型溶菌酶对上述革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制活性，说明本发明的紫贻贝C型溶菌酶具有广谱抗菌活性，且效果较好。其中产气肠杆菌、奇异变形杆菌、藤黄微球菌以及金黄色葡萄球菌37℃培养；恶臭假单胞菌以及鳗弧菌28℃培养；具体步骤：调节各菌至OD₆₀₀为1后，稀释1000倍备用；在96孔板中每孔中加入100 μl LB 液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100 μl C型溶菌酶，混匀后从第一个孔中吸出100 μl 加到第二个孔中，混匀后吸出100 μl加到第三个孔中，依此类推，第10个孔中吸出的100 μl 不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5 μl，第12孔为只含培养基的对照。培养24h 以上，测定吸光值并计算相应的MIC。结果发现，紫贻贝C型溶菌酶对各供试菌株均表现出一定的抑制作用，其中对藤黄微球菌和恶臭假单胞菌的抑制效果最为显著，最小抑菌浓度均为1.74-3.47 μmoL/L。

<110> 宁波大学

<120> 紫贻贝C型溶菌酶及其制备方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> 紫贻贝C型溶菌酶

<400> 2

Met Pro Ser Cys Gly Gly Ile Leu Phe Val Ser Ile Leu Leu Val

5 10 15

Leu Val Leu Val Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala Thr Lys Thr Lys Cys

20 25 30

Gln Val Val Gln Ala Leu Arg Asn Gln Gly Val Pro Asp Ser Asp

35 40 45

Leu Arg Asp Trp Leu Cys Leu Val Lys His Glu Ser Asn Phe His

50 55 60

Tyr Asp Ala Ile Gly Thr Asn Ser Gly Ser Lys Asp Tyr Gly Ile

65 70 75

Phe Gln Ile Asn Ser Lys Phe Asn Cys Gly Arg Pro Ser Gly Thr

80 85 90

Ser Thr Ser Ile Cys Trp Arg Val Asn Thr Tyr Gly Cys Ala Asp

95 100 105

Ser Cys Thr Ser Leu Thr Asn Ser Asp Ile Ser Asn Asp Ala Tyr

110 115 120

Cys Ala Val Arg Ile Lys Lys Cys Gly Gly Phe Ser Lys Trp Asn

125 130 135

Gly Trp Lys Asp Tyr Cys Ser Asn Val Gln Gly Ser Glu Tyr Asp

140 145 150

Tyr Ser Thr Cys

154

<210> 2

<211> 529

<212> cDNA

<213> 紫贻贝C型溶菌酶基因

<400> 1

atgccgtcat gtggtggaat tctgttcgtt tccatcttac ttgtcttggt acttgtgggg 60

tattcctatg gagctacaaa aacgaagtgc caagttgtac aagcactacg caatcagggc 120

gtaccagata gtgatcttag agactggttg tgtttggtta aacacgaaag taacttccat 180

tatgacgcaa taggtacaaa ttctggatcg aaagattatg gtatattcca gattaacagt 240

aaattcaatt gcggaaggcc aagcggcact agtacctcca tatgttggag agttaatacc 300

tacggatgtg ccgactcttg cacctcattg actaactcgg acatatcaaa cgatgcatat 360

tgtgccgtaa ggattaaaaa atgtgggggg tttagcaaat ggaatggttg gaaagattac 420

tgttccaatg tccagggttc agaatacgat tacagcacat gttaaatagt tttgacgttt 480

caaaataaaa tagcatacaa aagatgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 529

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TTACTTGTCT TGGTACTTGT G 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

TTTGTATGCT ATTTTATTTT G 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA 25

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

CTCGAGTTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT 44

Claims

1.紫贻贝C型溶菌酶，其特征在于该紫贻贝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的紫贻贝C型溶菌酶，其特征在于表达所述的紫贻贝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的紫贻贝C型溶菌酶的制备方法，其特征在于其步骤如下：

1）紫贻贝总RNA的提取：用Trizol试剂从鳗弧菌感染的紫贻贝血淋巴中提取总RNA，存于-80 ℃备用；

2）紫贻贝mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；

3）紫贻贝cDNA模板制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100 bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7% 的二甲基亚砜，得到含核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；

4）基因克隆：对上述含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增，PCR扩增的引物如下：正向引物序列TTACTTGTCT TGGTACTTGT G，反向引物序列TTTGTATGCT ATTTTATTTT G，3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer 2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 溶液1.0 μl、2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、10 μM 的上述正向引物溶液1 μl、10 μM 的通用引物T7溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA聚合酶0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl，反应条件为94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60 ℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR反应缓冲液2.5 μl、25 mM的MgCl₂ 溶液1.0 μl、2.5 mM的dNTP溶液2.0 μl、10μM 的上述反向引物溶液1 μl、10μM的通用引物T3溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA 聚合酶0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl，反应条件为94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 45 秒，60 ℃ 退火30 秒，72℃延伸60秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经胶回收试剂盒纯化，与pMD18-T载体连接得到克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，挑选阳性克隆提取质粒，得到C型溶菌酶基因的克隆质粒；

5）表达质粒构建：以上述C型溶菌酶基因的克隆质粒为模板进行PCR扩增反应，扩增反应的正向引物为含有Nco I酶切位点的核苷酸序列： CCATGGCTAC AAAAACGAAG TGCCA，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列：CTCGAGTTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGACA TGTGCTGTAA TCGT；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nco I和Xho I双酶切亚克隆质粒；用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，并将该片段导入经同样双酶切的表达载体pET-21a (+)中，构建得到C型溶菌酶的表达质粒；

6）表达质粒表达：将上述表达质粒转入表达宿主菌BL21 (DE3) plysS，筛选阳性克隆并经测序确认，将阳性克隆接种于LB培养基中，220rpm，37℃培养至OD₆₀₀=0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其终浓度达到0.6 mM，继续培养5 h，然后8000rpm离心10分钟收集菌体；

7）蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤和溶解，然后采用镍柱亲和层析纯化，最后对纯化产物进行透析、复性得到氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的紫贻贝C型溶菌酶。