CN102206646B - 紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQ ID NO.1所示的Hydramacin-1基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQ ID NO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该紫贻贝克隆基因和重组蛋白的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、抗菌肽基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组的紫贻贝抗菌肽。

Description

紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法

技术领域

本发明涉及克隆基因和抗菌肽，具体涉及紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法。

背景技术

抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为三大类：(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等。此外，近年来发现某些抗菌肽可由前体大分子酶解产生，如淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。软体动物抗菌肽的研究始于1996年，Charlet等从贻贝(Mytilusedulis)中分离到了富含半胱氨酸的贻贝素(mytilin，具有8个保守的半胱氨酸残基)和贻贝霉素(mytimicin，具有12个半胱氨酸)，序列比对表明与昆虫抗菌肽有较高的相似性。Hubert从贻贝(Mytilus galloprovincialis)中纯化到含4对二硫键的MGD1(含有38个氨基酸残基，含有2个半胱氨酸)，其具有广谱的抗G⁺和G^-活性。

发明内容

本发明从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQ ID NO.1所示的Hydramacin-1基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQ ID NO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等具有抗菌效果。

本发明还提供了紫贻贝Hydramacin-1基因和重组蛋白的制备方法，该制备方法能得到纯度较高的紫贻贝抗菌肽，紫贻贝抗菌肽具有开发抗菌药物应用的前景。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种紫贻贝Hydramacin-1基因，为克隆基因，该Hydramacin-1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；该克隆基因表达的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，该重组蛋白即为紫贻贝抗菌肽，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等具有抗菌效果。

紫贻贝抗菌肽的制备方法，包括下述步骤：

1)总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；

2)mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；

3)cDNA模板溶液制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒(购于Stratagene公司)将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX IIAgarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒(购于QIAGEN公司)对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XRvector载体(购于Invetrogen公司)连接，得到是cDNA质粒，用ZAP-

III Gold Cloning Kit试剂盒(购于Stratagene公司)对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7％的二甲基亚砜(DMSO)，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；

4)抗菌肽基因筛选：

紫贻贝cDNA文库EST序列的大规模测定：从已构建文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据。

紫贻贝EST序列的同源性分析及Hydramacin-1基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLAST分析，根据相似性分析结果寻找出与Hydramacin-1基因同源的EST序列。

5)基因克隆：

紫贻贝Hydramacin-1基因cDNA全长序列的获得：采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)，根据已经获得的目的基因的部分片段设计基因特异性引物P1(5′GTGGGATTCT ATTGGGTTTG 3′)和P2(5′GAAGCGAATG TGATTGGTGA 3′)，以接头通用引物Adapter dT在M-MLV反转录酶的作用下引导反转录合成cDNA。用接头通用引物Universal primer分别和基因特异性引物进行Nested-PCR，扩增基因3′末端。PCR产物用胶回收试剂盒(购于上海中科开瑞生物芯片公司)进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体(购于大连宝生生物工程有限公司)连接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞(购于北京全氏金生物技术有限公司)中，阳性转化子经PCR筛选后测序，序列拼接得到全长cDNA序列的克隆质粒，即为抗菌肽基因的克隆质粒；

3’RACE所用反应体系及条件：

一扩体系：

10×PCR Buffer   2.5μL

MgCl₂(25mM)      1.2μL

dNTP(2.5mM)      2.0μL

Universal primer 0.5μL

水               17.05μL

cDNA(模板)       1μL

Taq              0.25μL

P1(引物)         0.5μL

条件：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60℃至56℃每循环降低0.5℃，退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行10个循环，再进入下列循环：94℃变性45秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行20个循环，最后72℃延伸10分钟

二扩体系：

10×Buffer    2.5μL

MgCl₂(25mM)   1.2μL

dNTP(2.5mM)   2.0μL

Universal primer   0.5μL

水                 17.05μL

Taq                0.25μL

P2                 0.5μL

稀释后的一扩产物   1μL

条件：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。)

上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均购自Promega公司，通用引物购自上海生工科技有限公司。

6)重组质粒构建：对抗菌肽基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列(5’-CATATGAATG TGATTGGTGA TTGCTG-3’，其中划线上的序列表示Nde I酶切位点)，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的5’-CTCGAGTTAAAA ACCGCACCAC CATG-3’，其中下划线为Xho I酶切位点，方框为His纯化标签)核苷酸序；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T simple(购于大连宝生生物工程有限公司)载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10感受态细胞(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I(均购于NEB公司)双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，该抗菌肽重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a(购于Novagen公司)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法：扩增反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟；

7)抗菌肽重组基因表达：将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)-plysS(购于北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth(SOB，购于上海生工科技有限公司)培养基中，接种浓度为220rpm，37℃培养至OD600＝0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使终浓度达到1mmol/ml，继续培养3h，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌液；

8)重组蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的紫贻贝抗菌肽，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，具体纯化方法依蛋白纯化试剂盒的说明书操作。

本发明的引物由上海生工科技有限公司合成。

与现有技术相比，本发明的优点在于从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQ ID NO.1所示的Hydramacin-1基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQ ID NO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该紫贻贝克隆基因和重组蛋白的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、抗菌肽基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组的紫贻贝抗菌肽。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

紫贻贝抗菌肽的制备：

一、用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到总RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行：取紫贻贝血细胞50ml，2000g离心10min，弃上清，向沉淀细胞中加入20ml的

(Invitrogen)中，用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡10秒；加入4ml氯仿，剧烈震荡30秒；4℃10,000g高速离心10min；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇(约15ml)，置于-20℃静置1小时以上；4℃10,000g高速离心10分钟；小心弃去上清液；用5ml 70％的乙醇清洗沉淀；4℃10,000g高速离心10分钟，小心弃去上清液；真空干燥5分钟，用约600μlRNase-free water溶解RNA，待完全溶解后储存于-80℃备用。

二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA，具体纯化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行：包括在37℃水浴加热OligotexSuspension，震荡混匀，室温放置；70℃水浴加热OEB Buffe；向500μl总RNA溶液(RNA含量约为2mg)中加入：650μl of OBB buffer，135μl of Oligotex Suspension，650μl ofRNase-free water，70℃加热体系3分钟；取出反应体系后，室温下放置10分钟，15,000g离心2分钟，小心吸走上清液，用600μl OW2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。然后将悬浊液移入放在1.5ml离心管中的spin column内，15,000g离心1分钟，将spin column转移到一个新的1.5ml离心管中，加入600μl OW2，15,000g离心1分钟，将进入离心管的液体丢弃，将spin column转移到另一新的1.5ml离心管中；向spin column中加入50μl已经加热到70℃的OEB buffer，轻轻混匀，15,000g离心1分钟；向spin column再加入50μl OEBbuffer，混匀后15,000g离心1分钟；回收离心管中的mRNA溶液约100μl。

三、用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-

III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为7％的DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于-80℃备用。

第一链cDNA合成：在RNase-free的200μl离心管中依次需用试剂混匀，然后加入30μl poly(A)引物+RNA(5μg)，混匀，室温下放置10分钟后，向体系中加入1.5μl的一链合成酶StrataScript RT(50U/μl)，终体积达到50μl，轻轻混匀反应体系，离心数秒，42℃温育1小时。二链合成：在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入需用反应物反应，再向反应体系中加入2μl RNase H(1.5U/μl)，11μl DNA polymerase I(9.0U/μl)，轻轻混匀反应体系，离心数秒，16℃放置2.5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端：向二链合成体系中加入需用反应物，快速震荡反应体系离心后，于72℃反应30分钟；加入200μl酚-氯仿[1∶1(v/v)]，震荡混匀体系，室温下高速离心2分钟，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混匀，室温下高速离心2分钟，然后转移上清至新管中；加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系：20μl 3M sodium acetate，400μl 100％(v/v)ethanol，-20℃沉淀过夜；4℃高速离心60分钟，小心弃去上清，保留沉淀；加入500μl的70％乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心2分钟；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9μl含有EcoR I adapters的溶液溶解沉淀并于4℃放置至少30分钟。EcoR I接头的连接：向体系中加入下列成分：1μl 10×ligase buffer，1μl 10mM rATP，1μl T4DNA ligase(4U/μl)，离心后8℃放置过夜；70℃30分钟灭活连接酶。磷酸化EcoRI末端：离心反应物2秒，室温放置5分钟冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头：1μl10×ligase buffer，2μl 10mM rATP，5μl sterile water，2μl T4polynucleotide kinase(5U/μl)，37℃温育30分钟，70℃30分钟灭活激酶，离心2秒后室温放置5分钟冷却。Xho I内切酶酶切：向体系中加入下列成分：28μl Xho I buffer supplement，3μl Xho I(40U/μl)，37℃温育1.5小时，加入125μl的100％(v/v)乙醇，-20℃放置过夜，4℃离心60分钟，弃去上清，完全干燥沉淀，用50μl ddH₂O溶解沉淀。

cDNA片段回收方法：从浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上将DNA带切下，将大约250mg的胶块放入1.5ml离心管中，加入相当于3倍胶块体积的Buffer QX1，将QIAEX II剧烈震荡30秒，充分混匀，向含有胶块的Buffer QX1中加入60μl QIAEX II，50℃加热10分钟，溶解胶块；每2分钟震荡一次，保持溶液始终为黄色；13,000rpm离心30秒，小心吸去上清液；用500μl Buffer QX1清洗沉淀，重悬沉淀，13,000rpm离心30秒并小心吸去上清液；用500μl PE Buffer清洗沉淀2次，重悬沉淀，13,000rpm离心30秒，弃上清液，真空干燥15分钟至沉淀变白，加入20μl pH8.5的10mM Tris-Cl溶液室温下溶解5分钟。

cDNA与载体(Uni-ZAP XR vector，Invetrogen)连接：在另一干净的200μl离心管中依次加入下列试剂：2.5μl resuspended cDNA(＞100ng)，0.5μl 10×ligase buffer，0.5μl 10mM rATP(pH7.5)，1.0μl Uni-ZAP XR vector(1μg)，0.5μl T4DNA ligase(4U/μl)。12℃放置过夜。

噬菌体文库的包装：从-80℃冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4μl重组cDNA，用微量移液器吸头混匀体系(不要产生气泡)，离心5秒，室温(22℃)温育2小时，加入500μl的SM buffer和20μl氯仿，轻轻混匀反应体系。快速离心数秒，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。

包装反应的滴度测定：在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7.5)上将菌株XL1-Blue MRF’划线培养，37℃过夜培养；用LB液体培养基(1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7.5)培养单克隆菌落，30℃，200rpm摇床培养过夜；4℃，1000g下离心10分钟沉淀细菌。用25ml 10mM MgSO₄重悬细菌；用10mM MgSO₄重悬XL1-BlueMRF’细胞，使浓度达到OD600＝0.5；将包装产物按下列比例与宿主菌混合：(1)1μl包装产物+200μl XL1-Blue MRF’(OD₆₀₀＝0.5)；(2)0.1μl包装产物+200μlXL1-Blue MRF’(OD₆₀₀＝0.5)；将混合体系置于37℃温育15分钟使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3ml融化状态下约48℃的NYZ上层培养基(1升培养基含有氯化钠5g，MgSO₄·7H₂O 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，琼脂糖7g，pH7.5)；迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基(1升培养基含有氯化钠5g，MgSO₄·7H₂O 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7.5)上，静置10分钟后，倒置于37℃过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度(每毫升生长的噬菌斑数目，pfu/ml)。

30℃200rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养XL1-Blue MRF’细胞50ml；1000g离心宿主细胞10分钟；用25ml 10mM MgSO₄重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用10mM MgSO4将菌液稀释至浓度为OD600＝0.5；将含有大约5×10⁴pfu噬菌体颗粒的悬浊液与600μl浓度为OD600＝0.5的XL1-Blue MRF’细胞混合，置于

2059聚丙烯管中，37℃温育混合液15分钟，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48℃的6.5ml液态NZY上层培养基中，混匀后倒入新鲜的150mmNZY琼脂糖培养基平板上，静置平板10分钟，倒转平板置于37℃约8小时(噬菌斑直径不超过2mm)；在每块平板上倒入大约10ml SM缓冲液(1升缓冲液中含有5.8g NaCl，2.0gMgSO4·7H2O，50.0ml 1M Tris-HCl[pH 7.5]，5.0ml 2％[w/v]白明胶)，4℃放置过夜；将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用2ml SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5％(v/v)的氯仿，室温下放置15分钟，混匀，500g离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7％(v/v)DMSO，储存于-80℃。测定扩增文库滴度(方法同前)。

四、cDNA模板溶液中抗菌肽基因的确认：用Exassist Helper Phage和SOLR菌株均购于Stratagene公司)从Uni-

XR Vector上体外切割pBluescript噬菌粒(进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根据相似性分析结果寻找出抗菌肽基因片段。

五、对上述含抗菌肽基因的cDNA模板溶液进行巢式PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的特异性引物P1的核苷酸序列为：5’-GTGGGATTCT ATTGGGTTTG-3’，特异性引物P2的核苷酸序列为：5’-GAAGCGAATG TGATTGGTGA-3’，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，挑选阳性转化子经PCR筛选后测序，序列拼接得到抗菌肽Hydramacin-1基因的全长cDNA序列；

阳性克隆质粒提取，得到Hydramacin-1基因的克隆质粒；3’端PCR扩增一扩的反应体系和反应条件为：10×PCRbuffer溶液2.5μl、摩尔浓度为25mM的MgCl₂溶液1.2μl、摩尔浓度为2.5mM的dNTP溶液2.0μl、摩尔浓度为10pmol/μl的特异性引物P1溶液0.5μl、摩尔浓度为10pmol/μl的通用引物溶液0.5μl、浓度为5U/μl的TaqDNA polymerase 0.25μl，cDNA模板(文库)溶液1μl，用PCR水定容到25μl；反应在ABI Veriti^TM PCR仪中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60℃至56℃每循环降低0.5℃，退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行10个循环，再进入下列循环：94℃变性45秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行20个循环，最后72℃延伸10分钟；3’端PCR扩增二扩反应体系和反应条件为：10×PCR buffer溶液2.5μl、摩尔浓度为25mM的MgCl₂溶液1.2μl、摩尔浓度为2.5mM的dNTP溶液2.0μl、摩尔浓度为10pmol/μl的特异性引物P2溶液0.5μl、摩尔浓度为10pmol/μl的通用引物溶液0.5μl、浓度为5U/μl的Taq DNA polymerase 0.25μl，模板溶液1μl，用PCR水定容到25μl，反应在ABIVeriti^TMPCR仪中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

六、对抗菌肽基因的克隆质粒再进行扩增反应，(扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列：5’-CATATGAATGTGATTGGTGA TTGCTG-3’，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列：5’-CTCGAGTTA

AAA ACCGCACCAC CATG-3’)；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10F、感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，该抗菌肽重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法：扩增反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

七、将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21-plysS中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth培养基中，接种浓度为220rpm，37℃培养至OD₆₀₀＝0.5-0.7，加入IPTG，使终浓度达到1mmol/ml，继续培养3h，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌液。

八、对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的紫贻贝抗菌肽，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；在收集的菌体沉淀，加入适量的菌体裂解液(0.5M NaCl，5mM咪唑，10mM Tris-HCl pH 8.0，1mg/ml溶菌酶)重悬沉淀，向体系中加入1mg/ml的溶菌酶，室温放置半小时；超声波处理，条件为：20W，处理60次，每次2秒，间隔14秒；用15％的SDS-PAGE分离胶电泳分析(Laemmli，1970)上清和沉淀，Coomassie brilliant blueR-250后用凝胶成像系统照相。

应用例

将紫贻贝抗菌肽加入试管中制成浓度为2.2mg/ml抗菌肽液共9管，分别接种产气肠杆菌，奇异变形杆菌，枯草芽孢杆菌，滕黄微球菌，海洋真菌链孢粘帚菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌，恶臭假单胞菌以及鳗弧菌各5μl，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml，培养24小时后，利用酶标仪测定600nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表1所示的结果，从表1中可以看出，紫贻贝抗菌肽对上述3种革兰氏阳性菌和上述6种革兰氏阴性菌都有效，说明本发明的紫贻贝抗菌肽是一种广谱抗菌肽，且疗效较好。

其中产气肠杆菌，奇异变形杆菌，枯草芽孢杆菌，滕黄微球菌，海洋真菌链孢粘帚菌以及金黄色葡萄球菌37℃培养；副溶血弧菌，恶臭假单胞菌以及鳗弧菌28℃培养；

具体步骤：调节各菌至OD₆₀₀为1后，稀释1000倍备用。在96孔板中每孔中加入100μl LB液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100μl抗菌肽，混匀后从第一个孔中吸出100μl加到第二个空中，混匀后吸出100μl加到第三个孔中，依此类推，第10个孔中吸出的100μl不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5μl，第12孔为只含培养基的对照。

培养24h以上，测定吸光值，并计算相应MIC。最终测得如表1所示的紫贻贝抗菌肽对各菌的MIC值表：紫贻贝抗菌肽对以上各种菌都有一定的抑制作用，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌、副溶血弧菌的作用最为显著，最小抑菌浓度分别为：1.1mg/mL、0.28mg/mL、1.1mg/mL、0.55mg/ml。

表1：紫贻贝抗菌肽对各菌的MIC值表

受试菌	MIC值
		金黄色葡萄球菌	＞1.1mg/ml
藤黄微球菌	1.1mg/ml
		枯草芽孢杆菌	0.28mg/ml
鳗弧菌	＞1.1mg/ml
		海洋真菌链孢粘帚菌	＞1.1mg/ml
恶臭假单胞菌	＞1.1mg/ml
		奇异变形杆菌	＞1.1mg/ml
产气肠杆菌	1.1mg/ml
		副溶血弧菌	0.55mg/ml

<110>  宁波大学

<120> 紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  691

<212>  DNA

<213>  紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (277)..(579)

 

<400>  1

aatgctggca taaaaaataa cccaaaggaa cttacaactt tgattatttc agtaccaaac    60

aataaaacaa gtcaaatatg gaatagtatc ttttttaatt ttgtaatatt cgtgttaatg       120

aatttaacat ttgctgcttc tgggcagtga aattttaata ttctttcatc aaacgaaggt      180

gttgtaataa agtagacatt ttatggtcat tttgctgtta cagcattatc agaacacttt      240

ggtactgctg atttcatcta atcaacataa gctgca atg gga tat ctc ggt cta       294

                               Met Gly Tyr Leu Gly Leu          

                                1             5                

tgt ggg att cta ttg ggt ttg tca ttg ctg acc ctc ctg cat att ccc        342

Cys Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Leu Leu Thr Leu Leu His Ile Pro          

          10                15               20                   

 

aca tct gaa gcg aat gtg att ggt gat tgc tgg gat gac tgg agc aga        390

Thr Ser Glu Ala Asn Val Ile Gly Asp Cys Trp Asp Asp Trp Ser Arg          

       25              30                35                       

tgc aca cga caa acg gat tgg ttt aca aat ata ttt tgg caa agt tgt        438

Cys Thr Arg Gln Thr Asp Trp Phe Thr Asn Ile Phe Trp Gln Ser Cys          

    40               45               50                           

cag aat aga tgc aag tgc aaa gga caa cct ggt ggt aat tgc atc gaa      486

Gln Asn Arg Cys Lys Cys Lys Gly Gln Pro Gly Gly Asn Cys Ile Glu          

55                60               65                70           

gtt cct tcc aaa tgc ttt ctc tgg aag gac aaa aga tgg atg tgc gat       534

Val Pro Ser Lys Cys Phe Leu Trp Lys Asp Lys Arg Trp Met Cys Asp          

              75               80               85                

tgc tat gga cca aca tct ggg tca aaa cca tgg tgg tgc ggt ttt         579

Cys Tyr Gly Pro Thr Ser Gly Ser Lys Pro Trp Trp Cys Gly Phe              

          90               95               100                  

taaatttcgt ttgaaaatga caattatgcg atcaacatac tatataaatg taataggttg   639

atatacaaca ttaaagaaaa taccataagt gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa      691

 

<210>  2

<211>  101

<212>  PRT

<213>  紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）

 

<400>  2

Met Gly Tyr Leu Gly Leu Cys Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Leu Leu

1              5                10                15     

Thr Leu Leu His Ile Pro Thr Ser Glu Ala Asn Val Ile Gly Asp Cys

           20              25              30         

Trp Asp Asp Trp Ser Arg Cys Thr Arg Gln Thr Asp Trp Phe Thr Asn

       35               40               45             

Ile Phe Trp Gln Ser Cys Gln Asn Arg Cys Lys Cys Lys Gly Gln Pro

   50               55                60                 

Gly Gly Asn Cys Ile Glu Val Pro Ser Lys Cys Phe Leu Trp Lys Asp

65               70               75               80 

Lys Arg Trp Met Cys Asp Cys Tyr Gly Pro Thr Ser Gly Ser Lys Pro

              85               90               95     

Trp Trp Cys Gly Phe

          100    

<210> 3

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  3

GTGGGATTCT  ATTGGGTTTG     20

 

<210> 4

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  4

GAAGCGAATG  TGATTGGTGA    20

 

<210> 5

<211>  26

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  5

CATATGAATG TGATTGGTGA TTGCTG  26

 

<210> 6

<211>  44

<212>  DNA

<213> 人工序列

 

<400>  6

CTCGAGTTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGAAA ACCGCACCAC CATG  44

 

Claims (3)

1.紫贻贝Hydramacin-1基因，为克隆基因，其特征在于该Hydramacin-1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的紫贻贝Hydramacin-1基因表达的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.制备权利要求2所述的紫贻贝Hydramacin-1基因表达的重组蛋白的方法，其特征在于包括下述步骤：

1)总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到总RNA，存于-80℃备用；

2)mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；

3)cDNA模板溶液制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到是cDNA质粒，用

III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7％的二甲基亚砜，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；

4)基因筛选：从上述已构建文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件数据经Phred程序处理转化为序列文件和质量文件，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13且长度大于100bp的序列作为EST数据；将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLAST分析，根据相似性分析结果寻找出与Hydramacin-1基因同源的EST序列；

5)基因克隆：采用cDNA末端快速扩增技术，根据已经获得的目的基因的部分片段设计基因特异性引物P1：如序列表SEQ ID NO.3所示，P2：如序列表SEQ ID NO.4所示，以接头通用引物Adapter dT在M-MLV反转录酶的作用下引导反转录合成cDNA；用接头通用引物Universal primer分别和基因特异性引物进行Nested-PCR，扩增基因3′末端，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞中，阳性转化子经PCR筛选后测序，序列拼接得到全长cDNA序列的克隆质粒；

扩增反应体系及条件，一扩体系：10×PCR Buffer：2.5μL，25mM的MgCl₂：1.2μL，2.5mM的dNTP：2.0μL，Universal primer：0.5μL，PCR水：17.05μL，cDNA模板：1μL，Taq：0.25μL，P1引物：0.5μL；条件：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性45秒，60℃至56℃每循环降低0.5℃，退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行10个循环，再进入下列循环：94℃变性45秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行20个循环，最后72℃延伸10分钟；二扩体系：10×Buffer：2.5μL，25mM的MgCl₂：1.2μL，2.5mM的dNTP：2.0μL，Universal primer：0.5μL，PCR水：17.05μL，Taq：0.25μL，P2引物：0.5μL，稀释后的一扩产物：1μL；条件：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟；

6)重组质粒构建：对上述克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的如序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的如序列表SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T simple载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的重组基因：紫贻贝Hydramacin-1基因，测序该重组基因，该重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a，得到重组质粒；

7)重组基因表达：将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)-plysS，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super OptimalBroth培养基中，接种浓度为220rpm，37℃培养至OD600＝0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使终浓度达到1mmol/ml，继续培养3h，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌液；

8)重组蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，该重组蛋白为紫贻贝抗菌肽，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。