CN109306001A - 芳香烃受体核转位蛋白arnt——一种新型海洋生物污染检测标志物 - Google Patents

芳香烃受体核转位蛋白arnt——一种新型海洋生物污染检测标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明还公开了厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物，及其检测海洋生物污染的方法。有益效果为：首次通过基因克隆技术克隆获得厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其在厚壳贻贝的消化腺和腮中的相对表达量最高，可用于检测海洋污染，标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

Description

芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测 标志物
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物。
背景技术
厚壳贻贝(Mytilus coruscus)(贻贝科)是生长最快的海洋双壳贝类之一，广泛分布于黄海，朝鲜半岛和日本北海道海域。由于其营养丰富，味道鲜美，广泛受到海洋贝类生产量最大的中国大规模养殖市场和知名度的欢迎。近年来，中国海域海洋环境污染呈现加剧趋势。此外，作为较低的物种，厚壳贻贝缺乏适应性免疫系统，这会引起外部刺激的脆弱性。这种贻贝种类受到病毒，细菌甚至重度精神和有机污染物所产生的疾病打击，导致显着的经济损失。阐明厚壳贻贝免受环境刺激的免疫防御机制，有助于制定新的疾病防治管理策略和文化产业的长期可持续性。
近年来，随着工农业的迅猛发展，近海遭到不同程度的污染，特别是石油工业和海上交通运输业的发展，使得石油成为近海中最主要的污染物，石油污染不仅能使鱼、虾、贝类海产品变味，严重时能产生毒性效应，给海洋生态环境和渔业资源带了严重危害；同时，由于重金属易在底质中蓄积，不易降解，往往被生物富集，对人体健康具有潜在的威胁，重金属污染也是当今世界普遍关注的环境问题之一，重金属铜污染主要是由采矿排放出的废水和废气、城市工业和生活污水(包括一些钢铁、电子产品等)无节制的排放等致使水质中或土壤中重金属含量增加，导致重金属污染达到无法承受的地步，并造成生态环境的严重恶化，铜污染一直是重金属污染中的一个重要方面，铜污染越来越受到人们的重视。有研究表明，生物组织中标志物活性(含量)与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。
芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)是一个转录因子，它属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子超家族中新发现的PAS(periodicity[Per]/aryl hydrocarbon receptor nucleartranslocator[ARNT]/single-minded[Sim])亚家族，该家族的成员均以一个高度保守的毗邻于螺旋-环-螺旋二聚化区域的碱性DNA结合序列为特征，是一类生物传感器。它与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)、低氧诱导因子(hypoxia inducible factor1a，HIF1a)、哺乳动物生理节律调节蛋白CLOCK、21三体综合征临界因子、HIF like因子/上皮细胞特异因子(HLF/EPAS)，以及各种转录调节辅助因子，如SRC-1、TIF-2、核受体共活化物ACTR同属于PAS亚家族。ARNT作为一个反式作用因子，通过与基因启动子中的顺式作用元件特异结合并发生相互作用，从而激活或抑制特定基因的转录和翻译。这些转运蛋白在各种组织，包括鳃，外套膜，性腺，消化腺，肌肉，血细胞，肝胰腺等组织中表达出来，在各种各样的化合物的上升、分布和排泄中发挥了至关重要的作用，这些蛋白质作为细胞的第一道防线，在细胞的解毒过程中发挥着重要作用。目前还未有报道将厚壳贻贝ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术获得的厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其在消化腺和腮中的相对表达量最高，克隆用引物合适、能增大PCR反应的成功性。
本发明的目的之二在于提供一种利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记，标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
本发明的目的之三在于提供一种基于厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的新型海洋生物污染检测标记在在海洋污染检测中的应用。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1：ATGGCCTCTTCAACAATATCTCCAGGACCATCAGGATCTGGAGATGGAGGCAAGGGAGGCAACAGAAAAAGGAAAGGTGTTAATCATAAAGATTCTGATGATGAAGATAGCCAGCAAAGCACACCATATAACCAGGAACAAATTGACAAAGAAAAGTTTGCTAGGGAGAGCCATTGTGAGATTGAGAGAAGAAGAAGAAACAAGATGACCTCCTACATTAATGAACTCTGTGATATGGTACCAACATGCAGTACCTTAGCTAGGAAACCAGACAAACTAACCATTCTTAGAATGGCTGTTTCTCACATGAAAACACTCCGGGGTACTGGCAATACAGGAACTGATGGGTCGTATAAACCTTCTTTCCTCACAGACCAGGAGTTAAAACATCTCATTCTAGAGGCAGCAGATGGATTCCTGTTTGTTGTACAATGTGATACGGGGAGAATAATATATGTGTCTGACTCAGTGACACCAGTTCTTCACCAGTCTATGAATGAATGGTTTGGAAACTGCGTCTATGAACTGATCCACCCAGATGATATAGACAAAGTAAGAGAACAGCTTTCCACGACAGAATCTCAAAACACAGGAAGAATTCTAGATTTGAAAACTGGAACAGTTAAAAAAGACAGTCATCAAACCTCTATTAGACTATGTATGGGGTCCAGGAGAGGTTTTATATGTAGAATGAAGATGGGTAATGTCCAGGTTGATCCAATGACAGCCAATCATTCCTTACGTGTCCGTCAGCGTAACACCATTGGTCCGTCTAATGATGGGAATCATTATACGGTTGTACATGTCACTGGGTATATAAAGAACTGGCCACCTTCAGGTGTACAGATTGATAGAGATCCTGATGAGAATTCTGGTCCCGGCAGCCATTGTTGTTTGGTTGCCATTGGTAGACTGCAGGTGACTAGTGCACCTAACTGTAATGATTTAATGGGAGCTAACAATGCCACAGAGTTCGTTTCCAGACACAGTATAGAGGGCAAATTTACTTTTGTCGACCAGAGGGTAACAGCTTTACTTGGTTATCAACCACAGGAATTGCTAGGAAAATCAGCTTTTGATTTTTATCACCCTGAAGATAAAACACACATGAAGGATACTTTTGAACAAGTGTTAAAGTTGAAAGGTCAAGTGATGTCTATAATGTACAGATTTAGAGCAGCTAATAATGACTGGGTATGGTTGAGAACCAGTAGCTTTAGTTTCCAGAATCCTTATACTGATGAAGTAGAGTACATTGTTTGTACTAATACATCAGCAAAAACAGCTCAACAAGGTGCAGCAGGCCAGCAGTCTGGAATACCTAATCCAGCTGATCAGGCACAAGATCCACAGATAAATACATTTAGTAATCCACCTCGCCCATTACCTACAGACAATCTGGGCATGACATCCTCATCAAAGGCTGACTACACTAATCAGTATAGTCATCCAGAGGCTGCAGGGGGATATCCATCAGTTCTCACAAGTACAAGACAGGTAGGGCAGGACATGTATGGGTTTAACTCGTCTGCACAGATGAAGTACCCCTCTCCCAATGTGTCTGCCTCCATGTCAATGCCACAATCTGCCTCAGGGAGAGGAGGAGGTATGTCACATCTCAGGAGAAGTCCAAACCCAGAGAGTAGATGGCAAAATCAGGCAGGATTCTCACAAAATCAGGCAGCAGATTATACCAGCAATTCACAGTCAGGATTTTCTCAGATAAGTCCCAACAGTTCATCTCCAGCAGGTGCCCCTACTTATACACAGCTAGGAAGTAATCAAACAGCACCAAATTCACAACCTAATTCATTCTCTCATTCCTCCGCTGGTGGTTCTGGACCAGTTATATGGCCGAATGCTTCTCATTGGCAGGGAGGTGGAGCAGATGTGTCACAGCAGCAGACACAACCTCAACAGCAGACGACACCACAACAGCAGCAGCAGCAGACAGAAGAATTCAGTGACATGTTACAAATGTTACAACAGCCTGGAGGACCAGAATTTAGTGATTTTACAATGTTTAATCCTCTAGGTGATTAA。
芳香烃受体核转位蛋白ARNT蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.2：MASSTISPGPSGSGDGGKGGNRKRKGVNHKDSDDEDSQQSTPYNQEQIDKEKFARESHCEIERRRRNKMTSYINELCDMVPTCSTLARKPDKLTILRMAVSHMKTLRGTGNTGTDGSYKPSFLTDQELKHLILEAADGFLFVVQCDTGRIIYVSDSVTPVLHQSMNEWFGNCVYELIHPDDIDKVREQLSTTESQNTGRILDLKTGTVKKDSHQTSIRLCMGSRRGFICRMKMGNVQVDPMTANHSLRVRQRNTIGPSNDGNHYTVVHVTGYIKNWPPSGVQIDRDPDENSGPGSHCCLVAIGRLQVTSAPNCNDLMGANNATEFVSRHSIEGKFTFVDQRVTALLGYQPQELLGKSAFDFYHPEDKTHMKDTFEQVLKLKGQVMSIMYRFRAANNDWVWLRTSSFSFQNPYTDEVEYIVCTNTSAKTAQQGAAGQQSGIPNPADQAQDPQINTFSNPPRPLPTDNLGMTSSSKADYTNQYSHPEAAGGYPSVLTSTRQVGQDMYGFNSSAQMKYPSPNVSASMSMPQSASGRGGGMSHLRRSPNPESRWQNQAGFSQNQAADYTSNSQSGFSQISPNSSSPAGAPTYTQLGSNQTAPNSQPNSFSHSSAGGSGPVIWPNASHWQGGGADVSQQQTQPQQQTTPQQQQQQTEEFSDMLQMLQQPGGPEFSDFTMFNPLGD*。
核苷酸序列为SEQ ID NO.1、氨基酸序列为SEQ ID NO.2的芳香烃受体核转位蛋白ARNT来自于厚壳贻贝。
厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，包括：准备样品、提取总RNA、合成cDNA第一链、克隆核心序列、克隆全长序列、PCR产物的克隆及序列分析、生物信息学分析，具体包括：
(一)准备样品：
厚壳贻贝的个体平均重量为60.15g，壳在健康条件下宽度平均分别是4.5cm，壳高度平均9.1cm，来自东极岛水产养殖基地(中国浙江省舟山市)，饲养期间过滤海水保持持续充氧，在温度24～25℃、pH值8.0条件下培养。
(二)提取总RNA：
以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA，总RNA的提取与纯化按Promega公司的SVTotal RNA Isolation System试剂盒推荐方法进行。
(三)合成cDNA第一链：
cDNA第一链的合成使用TaKaRa RAN LA PCRTM Kit(AMV)Ver1.1试剂盒，以获得的总RNA样品作为模板，oligo(dT)20为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法进行。
(四)克隆核心序列：
根据已知贻贝科动物ARNT氨基酸序列的保守区域设计合成简并引物ARNT 01F和ARNT 02R，如表1所示，核心片段PCR扩增的引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。以上述cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。
表1引物列表
引物名称 引物序列 序列表位置
ARNT 01F 5′-TGTACCGGGCCCATCAAAGCTTGGCC-3′ SEQ ID NO.3
ARNT 02F 5′-CACGTCTGACTAAGGAGGCTGAAA-3′ SEQ ID NO.4
Actin-real-F CGATCTGTCCTTATACCTCCG SEQ ID NO.5
Actin-real-R CCGGCAAGAGGAAACCTCAT SEQ ID NO.6
优选的，PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。
优选的，PCR反应的程序为：94℃预变性3min，94℃1min，40℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。
将PCR产物以1％琼脂糖电泳检测后割胶回收纯化，经克隆后将PCR产物直接与pMD18-T载体(TaKaRa)进行连接，并转化入DH5α感受态细菌中。培养、筛选后测序。
(五)克隆全长序列：利用目的基因已知序列设计用于芳香烃受体核转位蛋白ARNT基因3′端和5′端RACE扩增的特异性引物，以厚壳贻贝组织总RNA为模板，获得扩增3′RACE和5′RACE片段所需的模板cDNA，利用巢式PCR来扩增3′RACE和5′RACE未知片段，将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送检测序。使用Lasergene软件对芳香烃受体核转位蛋白ARNT的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT基因的cDNA全长序列。
(六)PCR产物的克隆及序列分析：
PCR产物经2％琼脂糖电泳纯化，H.Q.&.Q.Gel Extraction Kit Ⅱ(U-gene)回收后克隆至pMD18-T载体(TaKaRa)，转化感受态E.coil DH5α，利用M13正反向引物，通过PCR反应监测得到阳性克隆，送检测序，测序结果应用BLAST软件及DNA分析软件Vector NTIsuite 8.0进行序列测定，获得芳香烃受体核转位蛋白ARNT序列，由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对PCR片段进行克隆扩增。
(七)生物信息学分析：
以厚壳贻贝cDNA为模板，用简并引物ARNT 01F和ARNT 02R获得预期PCR产物片段大小约为2050bp，将产物电泳纯化、回收后克隆至pMD18-T Vector，用M13正反向引物进行测序，得到片段大小为2043bp，芳香烃受体核转位蛋白ARNT共编码681个氨基酸。上述该克隆方法能够有效得到芳香烃受体核转位蛋白ARNT序列和其编码蛋白质的氨基酸序列，同时能发现在厚壳贻贝的消化腺和腮中ARNT的相对表达量最高，而基因在消化腺和腮中过量表达可以提高厚壳贻贝中芳香烃受体核转位蛋白的表达量，从而可以提高厚壳贻贝对抗生存的水体环境中污染的能力，提高繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。
本发明还提供一种基于上述厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物。本发明利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因ARNT具有灵敏性，易于检测分析，也可以用于厚壳贻贝的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，预防赤潮发生，减少经济损失。
一种利用上述新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测ARNT在消化腺和腮中的相对表达量，即可。厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中相对表达量最高，同时在铜离子和LPS刺激后，芳香烃受体核转位蛋白ARNT在氧化过程中发生显著作用，其含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
优选的，荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的ARNT基因cDNA全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，如表2所示，使用β-actin基因作为内参基因，配制25.0μlreal-time PCR反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：95℃10min，95℃10s持续40个循环，60℃45s。收集荧光信号，然后进行数据处理，测量相对表达水平使用2-ΔΔCt方法，即可得到芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相对表达量。厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况，利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
本发明的有益效果为：
1)本发明首次通过基因克隆技术克隆获得厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其在厚壳贻贝的消化腺和腮中的相对表达量最高，可用于检测海洋污染；
2)本发明厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT核心片段PCR扩用引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性；
3)本发明利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
本发明采用了上述技术方案提供芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为本发明的厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在各组织中相对表达量示意图；
图2为在LPS挑战下本发明的厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在腮中的相对表达量示意图；
图3为在Cu2+挑战下本发明的厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在腮中的相对表达示意图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nucleartranslocator ARNT)，其片段大小为2043bp，共编码681个氨基酸。
厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，包括：准备样品、提取总RNA、合成cDNA第一链、克隆核心序列、克隆全长序列、PCR产物的克隆及序列分析和生物信息学分析，克隆核心序列PCR扩增简并引物为：
ARNT 01F：5′-TGTACCGGGCCCATCAAAGCTTGGCC-3′和
ARNT 02R：5′-CACGTCTGACTAAGGAGGCTGAAA-3′，核心片段PCR扩增的引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。
克隆方法具体包括：
(一)准备样品：
厚壳贻贝的个体平均重量为60.15g，壳在健康条件下宽度平均分别是4.5cm，壳高度平均9.1cm，来自东极岛水产养殖基地(中国浙江省舟山市)，饲养期间过滤海水保持持续充氧，在温度24～25℃、pH值8.0条件下培养。
(二)提取总RNA：
以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA，提取RNA过程中所使用的的镊子、剪刀、枪头、离心管等都需要经过Rnase Free处理。
①取2mLEP管，向离心管中加入500μlRNAiso Plus，取100mg的各组织，用电动匀浆器研磨直到组织完全溶解，用RNAiso Plus定容至1mL，室温静置5min；
②加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，12000×g，离心15min；
③取上清液约500μl至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃过夜；
④4℃，12000×g，离心10min，除去上清液，得到白色沉淀；
⑤加入1ml的预冷的75％的乙醇，吹吸混匀，静置5min；
⑥4℃，7500×g，离心5min，除去上清液，将⑥⑦重复一次；
⑦干燥10min，加入50μl DEPC处理水，-80℃保存备用；
⑧电泳检测RNA质量，核酸蛋白仪检测RNA浓度。
(三)合成cDNA第一链：
经检测合格的RNA用于后续实验。取1μg总RNA，以Oligo dT20为引物用PrimeScriptTM II Reverse Transcriptase试剂进行反转录，在0.2ml PCR离心管中加入反应物，具体步骤如下：
10μM Oligo dT20 2.0μl
10mM dNTP 1.0μl
总RNA 1.0μg
以DEPC处理水补至10μl；65℃孵育5min；迅速置于冰上1min；
在上述反应物中加入如下试剂：
5×PrimeScript II buffer 4.0μl
Ribonuclease Inhibitor(40U/μl) 0.5μl
PrimeScript II(200U/μl) 1.0μl
以DEPC处理水补至20μl，将离心管在涡旋震荡仪上将上述反应物轻轻混匀，并短暂离心，置于PCR仪内，42℃孵育1h，70℃孵育15min，反应结束取出后-20℃保存备用。
(四)克隆核心序列：
根据已知贻贝科动物ARNT氨基酸序列的保守区域设计合成简并引物ARNT 01F和ARNT 02R，核心片段PCR扩增的引物的长度、上下游引物长度的差对PCR反应的扩增较为合适，且上下游引物的Tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大PCR反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。以上述cDNA为模板，用TaqDNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。
PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mMMgCl2 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、cDNA1.0μl、rTaq酶0.5μl。
PCR反应的程序为：94℃预变性3min，94℃1min，40℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。
将PCR产物以1％琼脂糖电泳检测后割胶回收纯化，经克隆后将PCR产物直接与pMD18-T载体(TaKaRa)进行连接，并转化入DH5α感受态细菌中。培养、筛选后测序。
(五)克隆全长序列：
1)获取3′端cDNA序列：
利用目的基因已知序列设计用于芳香烃受体核转位蛋白ARNT基因3′端RACE扩增的特异性引物，配合Clontech公司生产的SMARTTM RACE cDNAAmplification kit试剂盒中自带的3′端RACE引物，以厚壳贻贝组织总RNA为模板，获得扩增3′RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3′RACE未知片段，操作根据试剂盒提供说明书进行。将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送检测序。
2)获取5′端cDNA序列：
利用目的基因已知序列设计用于芳香烃受体核转位蛋白ARNT基因5′端RACE扩增的特异性引物，配合Clontech公司生产的SMARTTM RACE cDNA Amplification kit试剂盒中自带的5′端RACE引物，以厚壳贻贝组织总RNA为模板，获得扩增5′RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增5′RACE未知片段，操作根据试剂盒提供说明书进行。将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送检测序。
3)使用Lasergene软件对芳香烃受体核转位蛋白ARNT的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT基因的cDNA全长序列。
(五)PCR产物的克隆及序列分析：
PCR产物经2％琼脂糖电泳纯化，H.Q.&.Q.Gel Extraction KitⅡ(U-gene)回收后克隆至pMD18-T载体(TaKaRa)，转化感受态E.coil DH5α，利用M13正反向引物，通过PCR反应监测得到阳性克隆，送检测序，测序结果应用BLAST软件及DNA分析软件Vector NTI suite8.0进行序列测定，获得芳香烃受体核转位蛋白ARNT序列，由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对PCR片段进行克隆扩增。
(六)生物信息学分析：
以厚壳贻贝cDNA为模板，用简并引物ARNT 01F和ARNT 02R，预期PCR产物片段大小约为2050bp，将产物电泳纯化、回收后克隆至pMD18-T Vector，用M13正反向引物进行测序，得到片段大小为2043bp，芳香烃受体核转位蛋白ARNT共编码681个氨基酸。上述该克隆方法能够有效得到芳香烃受体核转位蛋白ARNT序列和其编码蛋白质的氨基酸序列，同时能发现在厚壳贻贝的消化腺和腮中ARNT的相对表达量最高，而基因在消化腺和腮中过量表达可以提高厚壳贻贝中芳香烃受体核转位蛋白的表达量，从而可以提高厚壳贻贝对抗生存的水体环境中污染的能力，提高繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。
基于上述厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物。本发明利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因ARNT具有灵敏性，易于检测分析，也可以用于厚壳贻贝的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，预防赤潮发生，减少经济损失。
利用上述新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测ARNT在消化腺和腮中的相对表达量，即可。厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中相对表达量最高，同时在铜离子和LPS刺激后，芳香烃受体核转位蛋白ARNT在氧化过程中发生显著作用，其含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的ARNT基因cDNA全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因：Actin-real-F：CGATCTGTCCTTATACCTCCG和Actin-real-R：CCGGCAAGAGGAAACCTCAT，配制25.0μl real-timePCR反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：95℃10min，95℃10s持续40个循环，60℃45s。收集荧光信号，然后进行数据处理，测量相对表达水平使用2-ΔΔCt方法，即可得到芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相对表达量。厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况，利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
实施例2：
作为对实施例1的进一步优化，厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，具体包括下列步骤：
(一)准备样品：
厚壳贻贝的个体平均重量为60.15g，壳在健康条件下宽度平均分别是4.5cm，壳高度平均9.1cm，来自东极岛水产养殖基地(中国浙江省舟山市)，饲养期间过滤海水保持持续充氧，在温度24～25℃，pH值8.0下培养。
(二)LPS和Cu2+挑战：
1)LPS挑战：对于LPS挑战，将80只成年厚壳贻贝随机分成两组，一组40只个体(对照组)注射内收肌用PBS(pH7.4)和另一组的40只个体(挑战组)进行LPS挑战。受到挑战的贻贝被注射在无菌PBS(pH7.4)中加入500μL LPS(1mg/mL)。注射后，分别在0h、3h、6h、12h、24h和36h随机选择每组3只厚壳贻贝行组织采集；立即进行所有组织样本在液氮中冷冻并储存在-80℃直至RNA萃取。
2)Cu2+挑战：与LPS挑战类似，将80只成年厚壳贻贝分为两组，一组40只个体(对照组)海水中没有添加任何物质和另一组的40只个体(挑战组)用于Cu2+挑战。在挑战组中，将Cu2+(CuSO4·5H2O)加入到海水中至终浓度为20μg/L。在暴露后0d、2d、5d、10d、16d、23d和30d处死3只个体进行组织收集；立即进行所有组织样本在液氮中冷冻并储存在-80℃直至总RNA萃取。
(三)提取总RNA：
以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA，提取RNA过程中所使用的的镊子、剪刀、枪头、离心管等都需要经过Rnase Free处理。
①取2mLEP管，向离心管中加入580μlRNAiso Plus、15μl苏糖醇和5μlN-苄基奎宁氯化物，取100mg的各组织，用电动匀浆器研磨直到组织完全溶解，用RNAiso Plus定容至1mL，室温静置5min；
②加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，12000×g，离心15min；
③取上清液约500μl至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃过夜；
④4℃，12000×g，离心10min，除去上清液，得到白色沉淀；
⑤加入1ml的预冷的75％的乙醇，吹吸混匀，静置5min；
⑥4℃，7500×g，离心5min，除去上清液，将⑥⑦重复一次；
⑦干燥10min，加入50μl DEPC处理水，-80℃保存备用；
⑧电泳检测RNA质量，核酸蛋白仪检测RNA浓度。
作为改进，在离心管中加入RNAiso Plus的同时，加入微量的苏糖醇和N-苄基奎宁氯化物，细胞裂解后，微量的苏糖醇和N-苄基奎宁氯化物与异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、色素等物质发生协同增效作用，迅速抑制甚至变性细胞释放出的蛋白质与RNA酶活性，保持总RNA的完整性，同时将促使核蛋白复合体的解离，使得总RNA和蛋白质完全分离，并将总RNA释放到溶液中，保证RNAisoPlus的裂解能力；同时，苏糖醇和N-苄基奎宁氯化物还有助于降低溶液下层有机层中的RNA含量，避免RNA的流失，从而在整体上提高总RNA的得率和纯度，利于总RNA的提取和制得。
(四)合成cDNA第一链：同实施例1相应步骤。
(五)克隆核心序列：同实施例1相应步骤。
(六)克隆全长序列：同实施例1相应步骤。
(七)PCR产物的克隆及序列分析：同实施例1相应步骤。
(八)生物信息学分析：同实施例1相应步骤。
基于上述厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT的新型海洋生物污染检测标记物，利用上述新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测ARNT在消化腺和腮中的相对表达量，即可。厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中相对表达量最高，同时在铜离子和LPS刺激后，芳香烃受体核转位蛋白ARNT在氧化过程中发生显著作用，其含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
表达分析结果：
厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在鳃、外套膜、性腺、消化腺、肌肉、血细胞和肝胰腺等各种组织中的表达，通过PCR评估了厚壳贻贝ARNT同系物在七种不同厚壳贻贝组织中的组织特异性表达，并且在所有检查的组织中表达了厚壳贻贝ARNT同源物转录物。如图1所示，尽管组织之间存在差异，但与其他组织相比，鳃始终显示每个个体的最高水平。消化腺中的厚壳贻贝ARNT同系物的转录低于鳃，在内收肌中观察到最低的mRNA水平。
考虑到鳃是第一个组织屏障在海水中悬浮和溶解物质的过滤过程中，也表现出较高的ARNT mRNA表达水平，进行LPS或Cu2+挑战后，鳃被选定用于qPCR分析。qPCR在实时PCR上进行，使用ExTaq试剂盒的系统(TAKARA)，所有样品一式三份进行分析，在荧光定量仪上设置反应程序：95℃10min，95℃10s持续40个循环，60℃45s。收集荧光信号，然后进行数据处理，测量相对表达水平使用2-ΔΔCt方法，即可得到芳香烃受体核转位蛋白ARNT在腮中的相对表达量，分别如图2和图3所示。厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT在腮(或者消化腺)中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况，利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。本发明利用厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因ARNT具有灵敏性，易于检测分析，也可以用于厚壳贻贝的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，预防赤潮发生，减少经济损失。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2043
<212> DNA
<213> 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)
<400> 1
atggcctctt caacaatatc tccaggacca tcaggatctg gagatggagg caagggaggc 60
aacagaaaaa ggaaaggtgt taatcataaa gattctgatg atgaagatag ccagcaaagc 120
acaccatata accaggaaca aattgacaaa gaaaagtttg ctagggagag ccattgtgag 180
attgagagaa gaagaagaaa caagatgacc tcctacatta atgaactctg tgatatggta 240
ccaacatgca gtaccttagc taggaaacca gacaaactaa ccattcttag aatggctgtt 300
tctcacatga aaacactccg gggtactggc aatacaggaa ctgatgggtc gtataaacct 360
tctttcctca cagaccagga gttaaaacat ctcattctag aggcagcaga tggattcctg 420
tttgttgtac aatgtgatac ggggagaata atatatgtgt ctgactcagt gacaccagtt 480
cttcaccagt ctatgaatga atggtttgga aactgcgtct atgaactgat ccacccagat 540
gatatagaca aagtaagaga acagctttcc acgacagaat ctcaaaacac aggaagaatt 600
ctagatttga aaactggaac agttaaaaaa gacagtcatc aaacctctat tagactatgt 660
atggggtcca ggagaggttt tatatgtaga atgaagatgg gtaatgtcca ggttgatcca 720
atgacagcca atcattcctt acgtgtccgt cagcgtaaca ccattggtcc gtctaatgat 780
gggaatcatt atacggttgt acatgtcact gggtatataa agaactggcc accttcaggt 840
gtacagattg atagagatcc tgatgagaat tctggtcccg gcagccattg ttgtttggtt 900
gccattggta gactgcaggt gactagtgca cctaactgta atgatttaat gggagctaac 960
aatgccacag agttcgtttc cagacacagt atagagggca aatttacttt tgtcgaccag 1020
agggtaacag ctttacttgg ttatcaacca caggaattgc taggaaaatc agcttttgat 1080
ttttatcacc ctgaagataa aacacacatg aaggatactt ttgaacaagt gttaaagttg 1140
aaaggtcaag tgatgtctat aatgtacaga tttagagcag ctaataatga ctgggtatgg 1200
ttgagaacca gtagctttag tttccagaat ccttatactg atgaagtaga gtacattgtt 1260
tgtactaata catcagcaaa aacagctcaa caaggtgcag caggccagca gtctggaata 1320
cctaatccag ctgatcaggc acaagatcca cagataaata catttagtaa tccacctcgc 1380
ccattaccta cagacaatct gggcatgaca tcctcatcaa aggctgacta cactaatcag 1440
tatagtcatc cagaggctgc agggggatat ccatcagttc tcacaagtac aagacaggta 1500
gggcaggaca tgtatgggtt taactcgtct gcacagatga agtacccctc tcccaatgtg 1560
tctgcctcca tgtcaatgcc acaatctgcc tcagggagag gaggaggtat gtcacatctc 1620
aggagaagtc caaacccaga gagtagatgg caaaatcagg caggattctc acaaaatcag 1680
gcagcagatt ataccagcaa ttcacagtca ggattttctc agataagtcc caacagttca 1740
tctccagcag gtgcccctac ttatacacag ctaggaagta atcaaacagc accaaattca 1800
caacctaatt cattctctca ttcctccgct ggtggttctg gaccagttat atggccgaat 1860
gcttctcatt ggcagggagg tggagcagat gtgtcacagc agcagacaca acctcaacag 1920
cagacgacac cacaacagca gcagcagcag acagaagaat tcagtgacat gttacaaatg 1980
ttacaacagc ctggaggacc agaatttagt gattttacaa tgtttaatcc tctaggtgat 2040
taa 2043
<210> 2
<211> 680
<212> PRT
<213> 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)
<400> 2
Met Ala Ser Ser Thr Ile Ser Pro Gly Pro Ser Gly Ser Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gly Lys Gly Gly Asn Arg Lys Arg Lys Gly Val Asn His Lys Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Glu Asp Ser Gln Gln Ser Thr Pro Tyr Asn Gln Glu Gln Ile
35 40 45
Asp Lys Glu Lys Phe Ala Arg Glu Ser His Cys Glu Ile Glu Arg Arg
50 55 60
Arg Arg Asn Lys Met Thr Ser Tyr Ile Asn Glu Leu Cys Asp Met Val
65 70 75 80
Pro Thr Cys Ser Thr Leu Ala Arg Lys Pro Asp Lys Leu Thr Ile Leu
85 90 95
Arg Met Ala Val Ser His Met Lys Thr Leu Arg Gly Thr Gly Asn Thr
100 105 110
Gly Thr Asp Gly Ser Tyr Lys Pro Ser Phe Leu Thr Asp Gln Glu Leu
115 120 125
Lys His Leu Ile Leu Glu Ala Ala Asp Gly Phe Leu Phe Val Val Gln
130 135 140
Cys Asp Thr Gly Arg Ile Ile Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Pro Val
145 150 155 160
Leu His Gln Ser Met Asn Glu Trp Phe Gly Asn Cys Val Tyr Glu Leu
165 170 175
Ile His Pro Asp Asp Ile Asp Lys Val Arg Glu Gln Leu Ser Thr Thr
180 185 190
Glu Ser Gln Asn Thr Gly Arg Ile Leu Asp Leu Lys Thr Gly Thr Val
195 200 205
Lys Lys Asp Ser His Gln Thr Ser Ile Arg Leu Cys Met Gly Ser Arg
210 215 220
Arg Gly Phe Ile Cys Arg Met Lys Met Gly Asn Val Gln Val Asp Pro
225 230 235 240
Met Thr Ala Asn His Ser Leu Arg Val Arg Gln Arg Asn Thr Ile Gly
245 250 255
Pro Ser Asn Asp Gly Asn His Tyr Thr Val Val His Val Thr Gly Tyr
260 265 270
Ile Lys Asn Trp Pro Pro Ser Gly Val Gln Ile Asp Arg Asp Pro Asp
275 280 285
Glu Asn Ser Gly Pro Gly Ser His Cys Cys Leu Val Ala Ile Gly Arg
290 295 300
Leu Gln Val Thr Ser Ala Pro Asn Cys Asn Asp Leu Met Gly Ala Asn
305 310 315 320
Asn Ala Thr Glu Phe Val Ser Arg His Ser Ile Glu Gly Lys Phe Thr
325 330 335
Phe Val Asp Gln Arg Val Thr Ala Leu Leu Gly Tyr Gln Pro Gln Glu
340 345 350
Leu Leu Gly Lys Ser Ala Phe Asp Phe Tyr His Pro Glu Asp Lys Thr
355 360 365
His Met Lys Asp Thr Phe Glu Gln Val Leu Lys Leu Lys Gly Gln Val
370 375 380
Met Ser Ile Met Tyr Arg Phe Arg Ala Ala Asn Asn Asp Trp Val Trp
385 390 395 400
Leu Arg Thr Ser Ser Phe Ser Phe Gln Asn Pro Tyr Thr Asp Glu Val
405 410 415
Glu Tyr Ile Val Cys Thr Asn Thr Ser Ala Lys Thr Ala Gln Gln Gly
420 425 430
Ala Ala Gly Gln Gln Ser Gly Ile Pro Asn Pro Ala Asp Gln Ala Gln
435 440 445
Asp Pro Gln Ile Asn Thr Phe Ser Asn Pro Pro Arg Pro Leu Pro Thr
450 455 460
Asp Asn Leu Gly Met Thr Ser Ser Ser Lys Ala Asp Tyr Thr Asn Gln
465 470 475 480
Tyr Ser His Pro Glu Ala Ala Gly Gly Tyr Pro Ser Val Leu Thr Ser
485 490 495
Thr Arg Gln Val Gly Gln Asp Met Tyr Gly Phe Asn Ser Ser Ala Gln
500 505 510
Met Lys Tyr Pro Ser Pro Asn Val Ser Ala Ser Met Ser Met Pro Gln
515 520 525
Ser Ala Ser Gly Arg Gly Gly Gly Met Ser His Leu Arg Arg Ser Pro
530 535 540
Asn Pro Glu Ser Arg Trp Gln Asn Gln Ala Gly Phe Ser Gln Asn Gln
545 550 555 560
Ala Ala Asp Tyr Thr Ser Asn Ser Gln Ser Gly Phe Ser Gln Ile Ser
565 570 575
Pro Asn Ser Ser Ser Pro Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Thr Gln Leu Gly
580 585 590
Ser Asn Gln Thr Ala Pro Asn Ser Gln Pro Asn Ser Phe Ser His Ser
595 600 605
Ser Ala Gly Gly Ser Gly Pro Val Ile Trp Pro Asn Ala Ser His Trp
610 615 620
Gln Gly Gly Gly Ala Asp Val Ser Gln Gln Gln Thr Gln Pro Gln Gln
625 630 635 640
Gln Thr Thr Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Thr Glu Glu Phe Ser Asp
645 650 655
Met Leu Gln Met Leu Gln Gln Pro Gly Gly Pro Glu Phe Ser Asp Phe
660 665 670
Thr Met Phe Asn Pro Leu Gly Asp
675 680
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaccgggc ccatcaaagc ttggcc 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgtctgac taaggaggct gaaa 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgatctgtcc ttatacctcc g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggcaagag gaaacctcat 20

Claims (10)

1.芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的芳香烃受体核转位蛋白。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
4.权利要求1-3任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，包括：准备样品、提取总RNA、合成cDNA第一链、克隆核心序列、PCR产物的克隆及序列分析、生物信息学分析，其特征在于：所述芳香烃受体核转位蛋白ARNT克隆核心序列中PCR扩增的简并引物为：
ARNT 01F：5′-TGTACCGGGCCCATCAAAGCTTGGCC-3′和
ARNT 02R：5′-CACGTCTGACTAAGGAGGCTGAAA-3′。
5.根据权利要求4所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：
准备样品：取健康均匀的厚壳贻贝在温度20～25℃，pH值8.0条件下饲养；
提取总RNA：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA；
合成cDNA第一链：以获得的总RNA样品作为模板，oligo(dT)20为反转录引物反转录合成，获得cDNA第一链；
克隆核心序列：使用简并引物ARNT 01F和ARNT 02R，以上述cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)PCR扩增出核心序列；
克隆全长序列：分别设计引物扩增3′RACE和5′RACE未知片段，将3′端、5′端和核心片段序列进行拼接；
PCR产物的克隆及序列分析：PCR产物经电泳纯化、回收后克隆至pMD18-T载体，转化感受态E.coil DH5α，利用M13正反向引物，通过PCR反应得到阳性克隆，送检测序并分析；
生物信息学分析：芳香烃受体核转位蛋白ARNT cDNA片段大小为2043bp，共编码681个氨基酸。
6.根据权利要求5所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于：所述克隆核心序列中的PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。
7.根据权利要求5或6所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于：所述克隆核心序列中的PCR反应的程序为：94℃预变性3min，94℃1min，40℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：以厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，以厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物。
9.如权利要求1-7任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物在海洋污染检测中的应用。
10.一种利用权利要求8或9所述的新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，其特征在于包括：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相对表达量，即可。
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