CN108893480A - 毛蚶金属硫蛋白酶--一种新型海洋生物污染检测标记物 - Google Patents

毛蚶金属硫蛋白酶--一种新型海洋生物污染检测标记物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了毛蚶金属硫蛋白酶基因，毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；通过基因克隆技术克隆获得。本发明还公开一种新型海洋生物污染检测标记物，用毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，毛蚶金属硫蛋白酶用作海洋污染的检测标记物，再利用荧光定量技术检测毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量。本发明毛蚶金属硫蛋白酶在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶金属硫蛋白酶基因的相对表达量最高，克隆用PCR反应体系能保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率；本发明检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

Description

毛蚶金属硫蛋白酶--一种新型海洋生物污染检测标记物
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及毛蚶金属硫蛋白酶--一种新型海洋生物污染检测标记物。
技术背景
我国东海地区海域带处于海洋与陆地的过渡地带，陆地工农业生产、海洋产业开发等排放的废水多在此汇集。其中重金属、石油类(BAP)等污染物易通过吸附等作用结合到悬浮颗粒物或胶体表面而被沉淀富集，会对底栖生物产生较大的影响。有研究表明，生物组织中标志物活性（含量）与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。
毛蚶(Scapharcasubcrenata)俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子，属于软体动物门、瓣鳃纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，广泛分布于日本、朝鲜、中国沿岸;在中国北起鸭绿江，南至广西均有分布，以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅水区的资源尤为丰富。近年来，随着工农业的迅猛发展，近海遭到不同程度的污染，特别是石油工业和海上交通运输业的发展，使得石油成为近海中最主要的污染物，石油污染不仅能使鱼、虾、贝类海产品变味，严重时能产生毒性效应，给海洋生态环境和渔业资源带了严重危害；同时，由于重金属易在底质中蓄积，不易降解，往往被生物富集，对人体健康具有潜在的威胁，重金属污染也是当今世界普遍关注的环境问题之一，特别是1931年日本发生镉中毒以来，镉污染越来越受到人们的重视。
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸(Cys)的低分子量蛋白质，常含有Cys-Cys、Cys-Xn-Cys等结构，其Cys残基中的巯基(SH)能够螯合金属离子，通过降低其它功能蛋白关键靶位的金属浓度，减轻金属的毒性作用。研究发现，MT可被重金属、氧化损伤和免疫刺激等多种环境因素诱导产生，且受到重金属暴露时，机体内重金属含量与MT表达水平之间存在着显著相关性。目前，MT已被联合国环境规划署遴选为海洋环境监测的生物标志物之一(UNEP/RAMOGE)。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术克隆毛蚶金属硫蛋白酶的基因核心片段获得的毛蚶金属硫蛋白酶，其在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶金属硫蛋白酶基因的相对表达量最高，克隆用PCR反应体系能保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率。
本发明的目的之二在于提供一种利用毛蚶金属硫蛋白酶用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
毛蚶金属硫蛋白酶基因，毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；毛蚶金属硫蛋白酶基因通过基因克隆技术克隆获得。
作为优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因的克隆具体步骤为：
总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；
cDNA第一链的合成：以获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中贻贝毛蚶金属硫蛋白酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而扩增出毛蚶金属硫蛋白酶的核心序列，分别进行PCR扩增反应得到不同长度的产物片段，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；
毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长：基于获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；
筛选：将获得的PCR反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后送测序公司进行序列测定，获得毛蚶金属硫蛋白酶基因序列；由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对PCR片段进行克隆扩增；
生物信息学分析：将获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。生物信息学分析发现在毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中相对表达量最高，而基因在血细胞和腮中过量表达可以提高毛蚶中金属硫蛋白酶的表达量，从而可以提高毛蚶对抗生存的水体环境中污染的能力，提高其繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。
进一步优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤用引物序列为：Ss-MT-real-F2:5’-CGACGAAAGTTGTGCCAGTG-3’；Ss-MT-real-R2:5’-ACGCACACGAATTTGGCTTG-3’。
进一步优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、柠檬酸镁0.02μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.47μl、左旋葡萄糖0.01μl。该PCR反应体系中柠檬酸镁和左旋葡萄糖的加入能够提高rTaq酶的保真性和活性、减少碱基的堆积，使rTaq酶更容易作用于模板，且在30个或者30个以上PCR循环时其活力不受到过多损失，提高延伸速率，能有效扩增cDNA片段，不必过多依赖于3'-5'校正，降低突变的几率，提高PCR扩增的得到目标产物，同时也能和镁离子及dNTP发生增益作用，提高引物和模板的结合度，大幅度减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入，保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率。
进一步优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物。
进一步优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长步骤中5’RACE序列为SEQ IDNO.3；所述3’RACE序列为SEQ ID NO.4。
进一步优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因的全序列为SEQ ID NO.5；毛蚶金属硫蛋白酶基因编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
本发明还公开一种利用上述毛蚶金属硫蛋白酶基因用作新型海洋生物污染检测标记物，用毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，毛蚶金属硫蛋白酶基因用作海洋污染的检测标记物。本发明利用毛蚶金属硫蛋白酶基因用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因毛蚶金属硫蛋白酶基因具有灵敏性、易于检测分析，也可以用于毛蚶的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。
作为优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取血细胞和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量，即可。毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中相对表达量最高，同时在重金属和苯并芘刺激后，毛蚶金属硫蛋白酶基因在氧化过程中发生显著作用，使得毛蚶金属硫蛋白酶基因含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
作为优选，荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因cDNA全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因，配制25.0μl real-time PCR反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，收集荧光信号，然后进行数据处理，即可得到毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量。毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术，它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合，该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况。
作为优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明首次通过基因克隆技术克隆毛蚶金属硫蛋白酶的基因核心片段获得毛蚶金属硫蛋白酶，其生物信息学分析发现在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶金属硫蛋白酶基因的相对表达量最高，可以用于检测海洋污染；2）本发明PCR反应体系能够提高rTaq酶的保真性和活性、减少碱基的堆积，使rTaq酶更容易作用于模板，提高PCR扩增的得到目标产物，提高引物和模板的结合度，保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率；3）本发明利用毛蚶金属硫蛋白酶用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
毛蚶金属硫蛋白酶基因，毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；毛蚶金属硫蛋白酶基因通过基因克隆技术克隆获得。
毛蚶金属硫蛋白酶基因的克隆具体步骤为：
1）总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；
2）cDNA第一链的合成：以获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；
3）毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中贻贝毛蚶金属硫蛋白酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而扩增出毛蚶金属硫蛋白酶的核心序列，分别进行PCR扩增反应得到不同长度的产物片段，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；
4）毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长：基于获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；
5）筛选：将获得的PCR反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后送测序公司进行序列测定，获得毛蚶金属硫蛋白酶基因序列；由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对PCR片段进行克隆扩增；
6）生物信息学分析：将获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。生物信息学分析发现在毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中相对表达量最高，而基因在血细胞和腮中过量表达可以提高毛蚶中金属硫蛋白酶的表达量，从而可以提高毛蚶对抗生存的水体环境中污染的能力，提高其繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤用引物序列为：Ss-MT-real-F2:5’-CGACGAAAGTTGTGCCAGTG-3’；Ss-MT-real-R2:5’-ACGCACACGAATTTGGCTTG-3’。
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、柠檬酸镁0.02μl、2.5mM dNTP1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.47μl、左旋葡萄糖0.01μl。该PCR反应体系中柠檬酸镁和左旋葡萄糖的加入能够提高rTaq酶的保真性和活性、减少碱基的堆积，使rTaq酶更容易作用于模板，且在30个或者30个以上PCR循环时其活力不受到过多损失，提高延伸速率，能有效扩增cDNA片段，不必过多依赖于3'-5'校正，降低突变的几率，提高PCR扩增的得到目标产物，同时也能和镁离子及dNTP发生增益作用，提高引物和模板的结合度，大幅度减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入，保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率。
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物。
毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长步骤中5’RACE序列为SEQ ID NO.3；所述3’RACE序列为SEQ ID NO.4。
毛蚶金属硫蛋白酶基因的全序列为SEQ ID NO.5；毛蚶金属硫蛋白酶基因编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
一种利用上述毛蚶金属硫蛋白酶基因用作新型海洋生物污染检测标记物，用毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，毛蚶金属硫蛋白酶基因用作海洋污染的检测标记物。利用毛蚶金属硫蛋白酶基因用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因毛蚶金属硫蛋白酶基因具有灵敏性、易于检测分析，也可以用于毛蚶的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。
毛蚶金属硫蛋白酶基因检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取血细胞和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量，即可。毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中相对表达量最高，同时在重金属和苯并芘刺激后，毛蚶金属硫蛋白酶基因在氧化过程中发生显著作用，使得毛蚶金属硫蛋白酶基因含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因cDNA全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因，配制25.0μlreal-time PCR反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，收集荧光信号，然后进行数据处理，即可得到毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量。毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术，它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合，该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况。
毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
实施例2：
毛蚶金属硫蛋白酶基因，毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；毛蚶金属硫蛋白酶基因通过基因克隆技术克隆获得。
毛蚶金属硫蛋白酶基因的克隆具体步骤为：
1）总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；
取无RNA酶的2ml EP管，用的枪头加入500ul Trizol，用酒精泡过的镊子夹取脑组织样品溶于Trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满Trizol到1mL，4℃，12000rpm，10min离心，取上清液放进1.5mL EP管中，不能吸到杂质，然后加入200ul的氯仿，剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃，12000rpm，15min离心，取三层中的最上层液体到新的1.5mL EP管中，加入500ul异丙醇，室温10min或-20℃过夜，然在4℃、12000rpm下离心10min，除去上清液，白色片状物即RNA，再加入1mL的75%的乙醇，吹吸混匀，静置5min，然后在4℃，7500rpm下离心5min，除去上清液，干燥10min后加入20ul DEPC水，保存至-20℃备用；
2）cDNA第一链的合成：以获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；
0.2ml离心管中加入以下反应体系：总RNA 5.0ul、Oligo DT 1.0ul，混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束，然后加入RNA处理物6.0ul、5×M-MLV Buffer 2.0ul、DEPC处理水1.0ul、dNTP Mixture(10mM) 0.5ul、RRI(40u/ul) 0.25ul、M-MLV(200u/ul) 0.25ul，混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃ 15min，结束后迅速取出冰浴15min，保存至-20℃备用；
3）毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中贻贝毛蚶金属硫蛋白酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而扩增出毛蚶金属硫蛋白酶的核心序列，分别进行PCR扩增反应得到不同长度的产物片段，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；
4）毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长：基于获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；
5）筛选：将获得的PCR反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后送测序公司进行序列测定，获得毛蚶金属硫蛋白酶基因序列；
6）生物信息学分析：将获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤用引物序列为：Ss-MT-real-F2:5’-CGACGAAAGTTGTGCCAGTG-3’；Ss-MT-real-R2:5’-ACGCACACGAATTTGGCTTG-3’。
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、柠檬酸镁0.02μl、2.5mM dNTP1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.47μl、左旋葡萄糖0.01μl。
毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增步骤中PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物。
毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长步骤中5’RACE序列为：GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGTCGAAAGTTACATTACCGTTATAGTTATTTTGAGAACCAGCGGTACCTTGAACAGCTTGAGATCATGTCTGACCCATGTAAATGCATTGAAGGTGGGGAGTGCAAATGCGACGAAAGTTGTGCC；3’RACE序列为：CTGCCGATGTGATCCTGCTAAGTGCAAATGCAAATCTGGGTGTAAATGTTCTGGTTGTTGTGGGGTGAAATGCAAGTGTTCCGGTAATTGTGATTGTGGAAAAGGCTGCACTGGACCAGCGGATTGTAAATGCAAGCCAAATTCGTGTGCGTGTAATCAATGACGATAATCGTGAGAGAAAGCCATCTATAGACTGTAAAATATTTATGAACGAAAATGGGCTGTAACTAATTGTTGAGATCCAATTTCATATAAATATCATCTATTCATCAACAAACCATTAAAATCATCAAGAACTTTATTATCCATCTTTTTATTTCTACTGAGAAAAAAAGATTACAATAGGGTATAGACACAAACCATGACCCAGCCAGTTGCACGAACATTAAAATAAAAATATACATGCATAATATTGCAGCAACATGTTGTCAAGGGAACAGAAAACTTGTTAGTATCATCCAAAGTTGATTTTTCTATCATAGCAATGCAACATAAAATGTAATAAAATTGCATTTTAAACACCATGAAAATTTAATTTTCAATCAACCTGAGTTCAATTAATGTTCTTGAAACTGATGATCAAATTCTGGTGCTGCAAGTGTATGTATTGGAAATTGTTGAAATGTTAACAAATAAATAATTGTTAAAAAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAA。
毛蚶金属硫蛋白酶基因的全序列为：CGAAAGTTACATTACCGTTATAGTTATTTTGAGAACCAGCGGTACCTTGAACAGCTTGAGATCATGTCTGACCCATGTAAATGCATTGAAGGTGGGGAGTGCAAATGCGACGAAAGTTGTGCCAGTGATAACTGCCGATGTGATCCTGCTAAGTGCAAATGCAAATCTGGGTGTAAATGTTCTGGTTGTTGTGGGGTGAAATGCAAGTGTTCCGGTAATTGTGATTGTGGAAAAGGCTGCACTGGACCAGCGGATTGTAAATGCAAGCCAAATTCGTGTGCGTGTAATCAATGACGATAATCGTGAGAGAAAGCCATCTATAGACTGTAAAATATTTATGAACGAAAATGGGCTGTAACTAATTGTTGAGATCCAATTTCATATAAATATCATCTATTCATCAACAAACCATTAAAATCATCAAGAACTTTATTATCCATCTTTTTATTTCTACTGAGAAAAAAAGATTACAATAGGGTATAGACACAAACCATGACCCAGCCAGTTGCACGAACATTAAAATAAAAATATACATGCATAATATTGCAGCAACATGTTGTCAAGGGAACAGAAAACTTGTTAGTATCATCCAAAGTTGATTTTTCTATCATAGCAATGCAACATAAAATGTAATAAAATTGCATTTTAAACACCATGAAAATTTAATTTTCAATCAACCTGAGTTCAATTAATGTTCTTGAAACTGATGATCAAATTCTGGTGCTGCAAGTGTATGTATTGGAAATTGTTGAAATGTTAACAAATAAATAATTGTTAAAAAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAA；毛蚶金属硫蛋白酶基因编码的蛋白质对应的氨基酸序列为：
1 CGAAAGTTACATTACCGTTATAGTTATTTTGAGAACCAGCGGTACCTTGAACAGCTTGAG
61 ATCATGTCTGACCCATGTAAATGCATTGAAGGTGGGGAGTGCAAATGCGACGAAAGTTGT
21 M S D P C K C I E G G E C K C D E S C
121 GCCAGTGATAACTGCCGATGTGATCCTGCTAAGTGCAAATGCAAATCTGGGTGTAAATGT
41 A S D N C R C D P A K C K C K S G C K C
181 TCTGGTTGTTGTGGGGTGAAATGCAAGTGTTCCGGTAATTGTGATTGTGGAAAAGGCTGC
61 S G C C G V K C K C S G N C D C G K G C
241 ACTGGACCAGCGGATTGTAAATGCAAGCCAAATTCGTGTGCGTGTAATCAATGACGATAA
81 T G P A D C K C K P N S C A C N Q *
301 TCGTGAGAGAAAGCCATCTATAGACTGTAAAATATTTATGAACGAAAATGGGCTGTAACT
361 AATTGTTGAGATCCAATTTCATATAAATATCATCTATTCATCAACAAACCATTAAAATCA
421 TCAAGAACTTTATTATCCATCTTTTTATTTCTACTGAGAAAAAAAGATTACAATAGGGTA
481 TAGACACAAACCATGACCCAGCCAGTTGCACGAACATTAAAATAAAAATATACATGCATA
541 ATATTGCAGCAACATGTTGTCAAGGGAACAGAAAACTTGTTAGTATCATCCAAAGTTGAT
601 TTTTCTATCATAGCAATGCAACATAAAATGTAATAAAATTGCATTTTAAACACCATGAAA
661 ATTTAATTTTCAATCAACCTGAGTTCAATTAATGTTCTTGAAACTGATGATCAAATTCTG
721 GTGCTGCAAGTGTATGTATTGGAAATTGTTGAAATGTTAACAAATAAATAATTGTTAAAA
781 AGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAA。
一种利用上述毛蚶金属硫蛋白酶基因用作新型海洋生物污染检测标记物，用毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，毛蚶金属硫蛋白酶基因用作海洋污染的检测标记物。
毛蚶金属硫蛋白酶基因检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取血细胞和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量，即可。
荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因cDNA全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因，配制25.0μlreal-time PCR反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，收集荧光信号，然后进行数据处理，即可得到毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量。
β-actin为：actin-real-F1：CGATCTGTCCGAATACCTCCG；actin-real-R1：CCGGCAAGATCCAACCTCAT。
毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
实施例3：
采用15天龄毛蚶作为监测水污染的生物样本，将毛蚶分成2组，分为无污染对照组与待测水域组，将毛蚶分别放入无污染水体和待测水域水体中饲养，每组3个平行进行，饲养7天后，每个平行取3个样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组毛蚶的结果。
利用实施例2步骤测量毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量。检测结果：对照组在血细胞和腮的相对表达量值分别为3.03和2.34，待测组在消化腺的相对表达量值为2.47和1.94，结果显示对照组的相对表达量值大于待测组的值，所以待测水域已经受到了污染，需及早进行水域治理，而化学的方法测试只能单一测试一种污染源，如测试镉浓度一般采用原子分光光度计法测试，原子分光光度计法先做标准曲线，然后制作样品再测试样品的吸光度后，在标准曲线上找去相应浓度，该方法误差大，并且只适合较大浓度测试，微量级浓度无法测试出；苯并芘也是一般采用气质联用法测试，该方法成本高，误差相对本发明来说也较大。本实施例所提到的空白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。
对比例1：
毛蚶金属硫蛋白酶，克隆步骤中PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。其余和实施例2一致。该对比例1纯化回收得到的PCR反应产物远远低于实施例2，这说明PCR反应体系中柠檬酸镁和左旋葡萄糖的加入能够提高PCR扩增的得到目标产物，保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；所述毛蚶金属硫蛋白酶基因通过基因克隆技术克隆获得。
2.根据权利要求1所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述毛蚶金属硫蛋白酶基因的克隆具体步骤为：
1）总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；
2）cDNA第一链的合成：以步骤1获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；
3）毛蚶金属硫蛋白酶基因核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中贻贝毛蚶金属硫蛋白酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而扩增出毛蚶金属硫蛋白酶的核心序列，分别进行PCR扩增反应得到不同长度的产物片段，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；
4）毛蚶金属硫蛋白酶基因RACE扩增全长：基于步骤3获得的毛蚶金属硫蛋白酶基因序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；
5）筛选：将步骤4获得的PCR反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后进行序列测定，获得毛蚶金属硫蛋白酶基因序列；
6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。
3.根据权利要求2所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述步骤3用引物序列为：Ss-MT-real-F2:5’-CGACGAAAGTTGTGCCAGTG-3’；Ss-MT-real-R2:5’-ACGCACACGAATTTGGCTTG-3’。
4.根据权利要求2所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述步骤3中PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH2O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl2 2.5μl、柠檬酸镁0.02μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.47μl、左旋葡萄糖0.01μl。
5.根据权利要求2所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述步骤3中PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物。
6.根据权利要求2所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述步骤4中5’RACE序列为SEQ ID NO.3；所述3’RACE序列为SEQ ID NO.4。
7. 根据权利要求1或2所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因，其特征在于：所述毛蚶金属硫蛋白酶基因的全序列为SEQ ID NO.5；所述毛蚶金属硫蛋白酶基因编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
8.一种利用权利要求1至7任一项所述的毛蚶金属硫蛋白酶基因用作新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：用毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，毛蚶金属硫蛋白酶基因用作海洋污染的检测标记物。
9.根据权利要求8所述的一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：所述毛蚶金属硫蛋白酶基因检测海洋生物污染的方法为：通过对受到污染区域毛蚶的解刨提取血细胞和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量，即可。
10.根据权利要求9所述的一种新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：所述毛蚶金属硫蛋白酶基因在血细胞和腮中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
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