CN100402666C

CN100402666C - 鉴定入侵南美红火蚁的方法及所用的核酸序列、探针与试剂盒

Info

Publication number: CN100402666C
Application number: CNB2005101005200A
Authority: CN
Inventors: 屈良鹄; 袁洁; 周惠; 王莹; 庞虹; 陈月琴
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2025-10-21
Also published as: CN1772922A

Abstract

本发明公开了鉴定入侵南美红火蚁的方法及所用的核酸序列、探针与试剂盒。本发明提供了入侵南美红火蚁rDNA转录间隔区全长的核酸序列，以及来源于该序列的多套特异性DNA分子探针。利用本发明中的一系列特异性分子探针，能够快速、准确的对入侵南美红火蚁进行检测和鉴定。本发明可以直接应用于外来入侵南美红火蚁的海关检疫、花卉进出口贸易检测，以及入侵南美红火蚁疫情的预警和控制等方面，具有快速性、客观性和准确性等优点。

Description

鉴定入侵南美红火蚁的方法及所用的核酸序列、探针与试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说涉及一种利用分子生物学方法快速检测外来入侵南美红火蚁的方法及其用到的特异性核酸序列、探针与试剂盒。

背景技术

2005年1月17日，农业部将入侵南美红火蚁列为我国进境植物检疫性有害生物和全国植物检疫性有害生物。目前，该疫情在我国广东省吴川、深圳等部分地区都有发生。为防止疫情传出，国家质检总局高度重视，发出紧急通知，要求各检验检疫机构加强检疫工作。

据农业植物检疫部门报道，入侵南美红火蚁(Red Imported Fire Ant，RIFA，Solenopsis invicta)是一种危害性昆虫，属膜翅目、蚁科、切叶蚁亚科、火蚁属。原分布于南美洲巴拉那河流域的巴西、巴拉圭、阿根廷等国家，1930年以来，已传入美国、波多黎各、新西兰、澳大利亚和我国台湾省的部分地区。入侵南美红火蚁是一种杂食性害虫，危害农业生产，捕食发生区的昆虫及蚯蚓等土栖生物，破坏生态平衡，筑巢破坏供电、电信、农田设施、堤坝等设备设施，当受到干扰时，还会叮蜇人、畜。

目前由于缺乏可靠的客观的分子生物学指标，国内各个进出口口岸检验检疫部门对入侵南美红火蚁的检测主要是根据其形态学特征进行判断。但是入侵的红火蚁与其近缘种的形态十分相似，又易随环境产生变化。而且形态学鉴定比较依赖于检测人员的经验，为了避免其主观性，往往要经过多位专家的重复鉴定才能最终确定。除了准确性难以充分保证，而且耗时久。鉴于我国农业部要求各级检验检疫部门进一步加强入侵南美红火蚁的疫情检验和控制工作，研制开发一种新方法新技术及时、快速的对红火蚁入侵物种的准确鉴定是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是针对现有入侵南美红火蚁检测方法上存在的不足，提供准确快速鉴定入侵南美红火蚁的方法。

本发明的另一个目的是提供上述鉴定方法所用到的核酸序列。

本发明的另一个目的是提供上述鉴定方法所用到的核酸分子探针。

本发明的进一步目的是提供上述鉴定方法所用到的试剂盒。

本发明的发明人在对入侵南美红火蚁及其它相关近似物种的研究中发现，入侵南美红火蚁的rDNA间隔区(ITS区)具有区别于其它蚂蚁物种的核酸序列，可作为入侵南美红火蚁的特征性核酸序列，用于鉴定外来入侵南美红火蚁。根据该特征序列，可以设计制备入侵南美红火蚁rDNA基因间隔区的专一性分子探针。并且建立快速、准确鉴定入侵南美红火蚁的分子生物学方法。

本发明具体包括：

一、本发明提供基因甄别标准用于鉴定入侵南美红火蚁的核酸序列；本发明提供的用于鉴定入侵南美红火蚁的核苷酸序列来源于入侵南美红火蚁的rDNA间隔区(即入侵南美红火蚁核糖体rRNA基因转录间隔区)序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该核苷酸序列可通过以下方法得到：

取1只酒精浸泡保存的入侵南美红火蚁标本放入1.5ml离心管。少量液氮冷却，冻脆。稍许研磨，粉碎样品。加入500ul提取缓冲液(20mM Tris-Cl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，400mM NaCl，1％SDS)，蛋白酶K(20mg/ml)10ul。55℃温育，震荡(750rpm)消化5小时以上。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提。乙醇沉淀过夜。以适量TE回溶，获得入侵南美红火蚁的总DNA。然后进行ITS区的PCR，所用引物分别为LH2(5’CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATC 3’)和Sm73(5’TTCGCTCGCCGTTACTAGGGGAATC 3’)。取一个200ul的PCR管，加入20ulPCR反应液(其中含2.0mM MgCl₂，200uM dNTP，10×Taq DNA缓冲液2ul，1UTaq DNA聚合酶，每个引物各10pmol)。然后加入红火蚁的总DNA 0.1ul。按下列程序进行PCR：94℃ 5分钟，94℃ 1分钟、50℃ 1分钟和72℃ 2.5分钟，30个循环，然后72℃ 10分钟，完成反应。反应产物即为长度约2500bp的入侵南美红火蚁rDNA基因间隔区(ITS)。

二、本发明还提供来源于上述核苷酸序列的入侵南美红火蚁的分子探针；所述分子探针来源于上述核酸序列的全序列或者其中一段不少于18个寡核苷酸序列，或者上述序列经修饰、变化且核苷酸变化量不超过5％的序列。所述核酸分子探针特别优选的入侵南美红火蚁专一性核酸分子探针为SEQ ID NO：2～6所示的5个序列，分别称为In244F、In434F、In756F、In862R、In1567R。

In244F、In434F、In756F、In862R、In1567R这5个专一性核酸分子探针，可通过常规的DNA化学合成方法而得到。这些探针可以通过放射性同位素、酶、生物素、荧光剂或化学荧光素结合进行标记。

另外，由于该5个专一性探针具有极强的物种特异性，能够与入侵南美红火蚁发生专一性反应，而与其它红火蚁相近物种的DNA不发生反应。因此，利用该5种探针组成的3对特异性PCR引物(In244F与In862R、In434F与In862R、In756F与In1567R)，通过PCR的方法也能实现快速、准确的鉴定目标蚂蚁是否为入侵南美红火蚁。

三、本发明还提供一种由上述入侵南美红火蚁专一性探针、样品总DNA提取试剂和PCR相关引物及试剂组成的入侵南美红火蚁鉴定试剂盒。可广泛用于海关、农林和进出口检疫部门对于入侵南美红火蚁的快速鉴定工作。该试剂盒具体包括：

1、5个入侵南美红火蚁专一性的核酸分子探针(同位素或者荧光标记)，分别为In244F、In862R、In434F、In756F和In1567R。

2、3对PCR引物，分别为：In244F与In862R、In434F与In862R、In756F与In1567R。

3、快速制备入侵南美红火蚁总DNA的相关试剂。总DNA制备试剂主要包括针对蚂蚁的总DNA提取缓冲液。该提取缓冲液的组成为：20mM Tris-Cl(pH 8.0)、20mM EDTA(pH 8.0)、400mM NaCl和1％(M/V)SDS。

四、本发明最终目的是提供利用上述核苷酸、核酸分子探针或试剂盒快速鉴定入侵南美红火蚁的方法。

利用上述试剂盒，按照常规的PCR方法即可方便、快速且准确的鉴定入侵南美红火蚁。本发明所提供的鉴定入侵南美红火蚁的方法，可以采用核酸分子杂交法或PCR方法。分述如下：

核酸分子杂交法：采用如前所述的5种分子探针，以通用的核酸分子杂交方式对入侵南美红火蚁的总DNA进行检验鉴定。具体步骤和过程(包括探针的标记和待测样品的预处理)均按照常规的分子生物学方法进行。

PCR方法：以3对入侵南美红火蚁特异PCR引物(In244F与In862R、In434F与In862R、In756F与In1567R)对样品的总DNA进行PCR实验。反应步骤与过程均按照常规PCR方法进行。采用PCR方法，可以快速、准确的鉴定入侵南美红火蚁，而且所需样品量小，一只待测蚂蚁样品的总DNA，就足够进行10次以上的常规PCR检测需要。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、蚁科各个物种之间的rDNA基因间隔区(ITS)是高变区，不同种的蚁类ITS区有很大差异，甚至在长度上都有所区别。入侵南美红火蚁的ITS区不但有长度特异性，而且其序列中大量的插入/缺失现象，以及大量的类似微卫星的短的多次重复序列等序列特征，都有利于进行计算机化、仪器化的客观分析，而且可以进行精确到种的特异性探针的设计。

2、所需样品量少，利用本发明中提供的蚂蚁总DNA提取方法得到的DNA，足够进行十几次常规PCR方法的检测。如果采用其它方法，例如探针的同位素/荧光标记，巢式PCR，或毛细管电泳等技术，还可以进一步降低检测样品的用量。

3、简单快捷。只通过简单的DNA提取和常规的PCR实验，就可以准确的判断被检蚁种是否为入侵南美红火蚁。

4、适合一般分子生物学检验人员使用，不要求丰富的形态学知识。整个实验操作对于实验仪器和试剂的要求都不高。而且排除了主观性，也不要求检验人员具有对蚂蚁形态学鉴定的经验。

5、检验标准严紧。因为本发明包括三对特异性引物组合，可以同时平行进行独立的检验，可以最大限度的排除实验操作误差。使结果更加严紧、准确。

6、不涉及有毒、有害的试剂。

7、本发明可以直接应用于外来入侵南美红火蚁的海关检疫、花卉进出口贸易检测，以及入侵南美红火蚁疫情的预警和控制等方面，具有快速性、客观性和准确性等优点。

附图说明

图1为核糖体rRNA基因结构示意图；

图2为入侵南美红火蚁专一性探针以及PCR特异引物组合在其ITS区DNA序列上的相互位置、方向关系示意图；

图3为入侵南美红火蚁rDNA的ITS区与专一性探针位置关系示意图；

图4为入侵南美红火蚁特异性PCR引物对于4种蚂蚁总DNA模板的扩增；

图5为入侵南美红火蚁特异性PCR引物(In756F/In1567R)对于4种蚂蚁总DNA模板的扩增；

其中，图4中，M为2kb分子标准，1为入侵南美红火蚁，2为热带红火蚁，3为近缘巨首蚁，4为双齿多刺蚁，N为空白对照；图中，左半部为特异性引物组合In244F/In862R进行PCR扩增的产物；右半部为特异性引物组合In434F/Ing62R进行PCR扩增的结果；

图5中，M为2kb分子标准，1为入侵南美红火蚁，2为热带红火蚁，3为近缘巨首蚁，4为双齿多刺蚁，N为空白对照。

具体实施方式

实施例1入侵南美红火蚁rDNA间隔区(ITS区)核酸序列的制备

取1只酒精浸泡保存的入侵南美红火蚁标本放入1.5ml离心管。少量液氮冷却，冻脆。稍许研磨，粉碎样品。加入500ul提取缓冲液(20mM Tris-Cl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，400mM NaCl，1％SDS)，蛋白酶K(20mg/ml)10ul。55℃温育，震荡(750rpm)消化5小时以上。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提。乙醇沉淀过夜。以适量TE回溶，获得入侵南美红火蚁的总DNA。

然后进行ITS区的PCR，所用引物分别为LH2(5’CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATC 3’)和Sm73(5’TTCGCTCGCCGTTACTAGGGGAATC 3’)。取一个200ul的PCR管，加入20ul PCR反应液(其中含2.0mM MgCl₂，200uM dNTP，10×Taq DNA缓冲液2ul，1U Taq DNA聚合酶，每个引物10pmol)。然后加入红火蚁的总DNA0.1ul。按下列程序进行PCR：94℃ 4分钟，94℃ 1分钟、50℃ 1分钟和72℃ 2.5分钟，30个循环，然后72℃ 10分钟，完成反应。反应产物即为长度约2500bp的红火蚁的rDNA基因间隔区(ITS)。纯化后的PCR产物于商业化DNA自动测序仪上测定，获得序列如SEQ ID No：1所示。位置和结构特征如图1所示，图1中，ITS区包括TIS1、5.8S rRNA基因和ITS2三个部分，也就是18S rRNA基因与28S rRNA基因之间的间隔区部分。

实施例2专一性探针的设计和制备

在获得入侵南美红火蚁rDNA间隔区核酸序列的基础上，将其与相近其它蚁种的同源序列进行排列比较，针对入侵南美红火蚁区别于其它蚁种的独有序列特征，设计出专一性良好的探针(寡核苷酸片段)。根据寡核苷酸片段的序列，在商业化的DNA合成仪上进行化学合成。合成核酸分子探针五种，如下所示：

In244F：5’ATCTTGGTGGAATTGACGAC 3’

In434F：5’GACGGGAGGGAAGAAAAGAC 3’

In756F：5’TGCTTAGCACGCTGGGAT 3’

In862R：5’AGAGACCGCCGAGAAGTGC 3’

In1567R：5’ACAACCGCGAGAGGGACTAT 3’。

入侵南美红火蚁专一性探针以及PCR特异引物组合在其ITS区DNA序列上的相互位置、方向关系示意图如图2所示，图2中，指示了5个专一性探针在ITS区基因上的铆钉位置，3对PCR特异引物组合进行PCR扩增得到预期产物的示意图。

入侵南美红火蚁rDNA的ITS区与专一性探针位置关系示意图如图3所示。图3中，阴影的黑体字部分序列，分别是5个专一性探针结合的精确位置，序列上部的箭头方向代表PCR引物的扩增方向。

实施例3入侵南美红火蚁的鉴别(常规PCR方法)

一、样品总DNA的提取。

取每种待测蚂蚁样品各1只，分别放入1.5ml离心管。加少量液氮冷却，冻脆。稍许研磨，粉碎样品。加入500ul提取缓冲液(20mM Tris-Cl pH 8.0，20mM EDTApH 8.0，400mM NaCl，1％SDS)，蛋白酶K(20mg/ml)10ul。55℃温育，震荡(750rpm)消化5小时以上。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提。乙醇沉淀过夜。以适量TE回溶，获得待测样品的总DNA。

二、PCR检测

(1)PCR反应程序：

为一般通用的反应程序，但针对每一对不同的引物，要采用相应的最适退火温度。最适退火温度与引物组合的对应关系见表1。

表1三对入侵南美红火蚁特异性PCR引物组合与最佳反应条件

(2)PCR反应体系：

10×PCR buffer(without Mg2+ TAKARA公司) 2.0μlMgCl2(25mM TAKARA公司) 1.2μldNTP(10mM each TAKARA公司) 1.25μlDMSO 1.0μlPrimer1(0.2r/μl) 0.5μlPrimer2(0.2r/μl) 0.5μlDNA模板(稀释10倍) 2.0μlTaq(5U/μl TAKARA公司) 0.2μl3dH2O up to 20μl

(3)PCR产物的检测与结果分析：

以1％的琼脂糖电泳检测PCR产物。图4和图5分别显示了用3对不同的入侵南美红火蚁专一性引物对包括入侵南美红火蚁在内的四种不同蚁种进行PCR检测的结果。

(4)从图4和图5中可以看出，三对特异性引物组合对入侵南美红火蚁都为阳性结果，而对其它蚁种均为阴性结果。说明这三对引物组合均能够良好的区分入侵南美红火蚁与其它相近蚁种，具有针对入侵南美红火蚁的特异性。

鉴定入侵南美红火蚁的方法及所用的核酸序列、探针与试剂盒序列表

<110>中山大学

<120>鉴定入侵南美红火蚁的方法及所用的核酸序列、探针与试剂盒

<160>6

<210>1

<211>2499

<212>DNA

<213>南美红火蚁(Solenopsis invicta)

<220>

<221>rRNA

<222>(25)...(2474)

<223>核糖体rRNA基因转录间隔区

<400>1

cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattaac gttccggagg ctgcgctctg ctccgcgcgc 60

gcgcactcgt gtgtgctgcg gcagtgtgag acggcggcga ctggaagagg acgacgcgcg 120

cctttttctc agaaaaggcg atgcgcgtcg cagacagaaa gaacgcaccg tggcgagcgc 180

gacagcgcga gccaacgcgt gcgagatctc gcgtggaatt gacggataga gagagcaagc 240

gagatcttgg tggaattgac gactgtttga acgaggagag cgtcgcggtg ttcggtcgcc 300

ccgcgagggg cggctctcac ctccgagcgc gcactgcctc tcgactctcg ccgtcgcgtc 360

gcccgtcccc gcgcgtcgcc ggcgcgcgct ctcgtcagcg cgcgccgccg ccggggaatt 420

ggtgagcgat gtcgacggga gggaagaaaa gacccaaaga tattcggact aaccgagtgg 480

ttgtcgatgc gcgacccgca ccacgcacca ccgaacgtgt gcgccgatcc gtccgtccga 540

tcggtccgcg cgcgccacaa cgcgtcgtcg cgacgcgttg cgtctggctc gcacccgcgg 600

atcggaggag attgagaacg gagaggaccg cgccgtcgtt gtgtgccgtg cgtctgccgt 660

tggtcgcgcg tcgacgcgtt ccgcgcgtcc ggtgccgtcg cgcaccgcgc gttggatcgc 720

gggcgatgga ggagcgaggc gccgcgcccc gcgcgtgctt agcacgctgg gataagcgcg 780

cgcttaccgg tggtaacctg agagccgcgt tttcgcacgc gtgtcgtgtg cgttacgcgc 840

gctgcagggg cgagagcagc cgcacttctc ggcggtctct cgcgcccgat ggtttttcaa 900

agacttccgc cccggctctc gcgctcgtgc cccgtgctcg cgtgctctcc gcgagacggg 960

cgatgagccg agagacgctc cgttcgctcg accaagtggc accgccaccg cggaccgcgt 1020

agtcggtccg cgcgcgttgc ggtgccaccg gtgtcccgtt gtgccgtagc ccccgtaaac 1080

ggggcggcgg tccgcgcgtg ctcggacgcg cggccaggct gatcgaaggg ccccacaaag 1140

cacacatgag acgcacaagg gaggatgaaa gctcgctcgc acaagttgtc gagatggagc 1200

tcccgcgtag cgggaagaat gtacaaacga ttaccctgaa cggtggatca cttggctcgt 1260

gggtcgatga agaacgcagc taattgcgcg tcaacttgtg aactgcagga cacatgaaca 1320

tcgacatttc gaacgcacat tgcggtccac ggatacaatt cccggaccac gcctggctga 1380

gggtcgtttt aacgaaagca cactgcttgc gccgtcgcgc gcacgcggct cggcgtcgcg 1440

cctcgacacg cacgtgtcga gcgcgcgcgc gcgcagggcc gcgttacgcg cgcgcacacg 1500

gcgtacgagc gatcgttgga cgctcgcccc gaaaaacgac gaagacgcaa acgccgcaga 1560

ggacggatag tccctctcgc ggttgtcgac tcgttggagc gcgcgcgagc gcacagggca 1620

ccacgggacc gctcctcgca tcctcgcttc ttcccgtagg gaaggaggag atataggcga 1680

gcgattgccg gtctcgcgcc gctgtttagc gccgcgtcgt ccgcaccaca aatcggggcg 1740

tcgtccgaaa tgacggaagg gaaacgtgac gagagcgaag cgcgcgcgcc tcttctctcg 1800

gtgcgcgcat attcgcgcgc gcgtgcgccg cgaggtgtcg gtgccgccgt cgccgcccgg 1860

ggacccaccc gcgcccgccc gtaataaggg tataggcgca ggcagtaggg tctcgcggag 1920

ctgcgtgcga gcgcgcccag caacacccgg cgtatcgtcg tacgcgcgaa gcgtgtcatc 1980

ttcgagcgag agagagcgcg cgaggagagc tcgtattgga actcgcggcg agccggccgc 2040

gtgtccgagt ccacgaaaga gtcttcttct ctttcctctt ccccggttcg cccggcgcgc 2100

gctaccgcgc gccgaggttg taaacccgcg agtgggagga taacggaaag aagagagact 2160

tgggaccggc gcgcacggtc gcgtgtactc gtcgcgcgaa gagtgtccga ttcgtcgtcg 2220

tcgttgagcc ctttcagcac gcgcacacgc gcggtgcccg gttgcgagcg tcgccgtccg 2280

cccgttctac ctactcgatt atatctataa gatatagaga gaaggtggga ggtgtttgcg 2340

cgcggtacgg agcgacgcgc agcctacgcg ccgtcgtcgt cgtcgtcgtc gcacaatttc 2400

gacgacctca gagcaggcga gatcacccgc tgaatttaag catattatta agcggaggaa 2460

aagaaactaa ccaggattcc cctagtaacg gcgagcgaa 2499

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>南美红火蚁(Solenopsis invicta)

<220>

<221>rRNA

<222>(1)...(20)

<223>根据核糖体rRNA基因转录间隔区相关序列而设计的专一性探针

<400>2

atcttggtgg aattgacgac 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>南美红火蚁(Solenopsis invicta)

<220>

<221>rRNA

<222>(1)...(20)

<400>3

gacgggaggg aagaaaagac 20

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>南美红火蚁(Solenopsis invicta)

<220>

<221>rRNA

<222>(1)...(18)

<400>4

tgcttagcac gctgggat 18

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>南美红火蚁(Solenopsis invicta)

<220>

<221>rRNA

<222>(1)...(19)

<400>5

agagaccgcc gagaagtgc 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>南美红火蚁(Solenopsis invicta)

<220>

<221>rRNA

<222>(1)...(20)

<400>6

acaaccgcga gagggactat 20

Claims

1.一种用于鉴定入侵南美红火蚁的核酸序列，其特征是该核酸序列来源于广东吴川入侵南美红火蚁rDNA转录间隔区，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一组用于鉴定入侵南美红火蚁的核酸分子探针，其特征是所述核酸分子探针为如下五种：In244F、In434F、In756F、In862R、In1567R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2～6所示。

3.一种用于鉴定入侵南美红火蚁的试剂盒，其特征是该试剂盒包括权利要求2所述的核酸分子探针、三对PCR引物及用于制备入侵南美红火蚁总DNA的相关试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述三对PCR引物分别为：In244F与In862R、In434F与In862R、In756F与In1567R。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述用于制备入侵南美红火蚁总DNA的相关试剂为针对蚂蚁的总DNA提取缓冲液，其组成为：20mM Tris-Cl、pH8.0，20mM EDTA、pH8.0，400mM NaCl和1％(M/V)SDS。

6.一种鉴定入侵南美红火蚁的方法，其特征是采用PCR方法或采用核酸分子杂交法或采用权利要求3所述试剂盒，按照常规的PCR方法鉴定入侵南美红火蚁；所述PCR方法为：以3对入侵南美红火蚁特异PCR引物：In244F与In862R、In434F与In862R、In756F与In1567R，对样品的总DNA进行PCR实验，反应步骤与过程均按照常规PCR方法进行；所述核酸分子杂交法为：采用权利要求2所述的分子探针，以通用的核酸分子杂交方式对入侵南美红火蚁的总DNA进行检验鉴定，具体步骤和过程均按照常规的分子生物学方法进行。