CN101491671B - 一种交叉保护疫苗及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌交叉保护性疫苗、其抗原表达载体的构建及应用方法。具体为所述交叉保护性疫苗抗原具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其构建方法：构建质粒pPT6和pT6VH，在此基础上构建含有哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌交叉保护性疫苗抗原的质粒pT6VH18。pT6VH18转化入大肠杆菌，于常规条件下培养后即得保护性疫苗。本发明所得疫苗不但具有交叉保护效应，而且不需要任何纯化过程。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌交叉保护疫苗及其构建方法。
背景技术
哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌为世界上，包括我国，水产养殖生物重要病原，二者皆具有广泛的宿主范围，能够感染多种水产养殖动物，如鱼、虾、贝等。另外，迟缓爱德华氏菌尚可感染人类，是一种人/畜共患菌。目前对于哈氏弧菌和爱德华氏菌病的防治主要依赖于抗生素(包括各种化学品、农药等)和传统疫苗免疫，即简单的灭活疫苗。针对这两种病原的重组亚单位疫苗，虽有研究报道，但尚未见于实际应用。灭活疫苗需要一定的制备过程，而且在这一过程中通常部分抗原结构被破坏，由此影响免疫效果。相对而言，以蛋白质为基础的重组亚单位疫苗则具有特异性强、免疫效应较高等特点，但常规亚单位疫苗的缺点是需要提取、纯化大量蛋白，因而制备较昂贵。
发明内容
本发明目的在于提供一种哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌交叉保护疫苗及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
交叉保护疫苗：具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
交叉保护疫苗的构建方法：
1)质粒pPT6构建：以质粒pTrcHis为模板，用引物TRF1和TRR1进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒pBSTR；将pBSTR与质粒pBR322用EcoRI/BamHI双酶切后连接转化入大肠杆菌DH5，得质粒pBSTR1；将pBTR1用NdeI酶切，与寡聚核苷酸NDEF连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pPTN；将pPTN用BamHI/XhoI酶切，与寡聚核苷酸BNSNX连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pPT6；
所述寡聚核苷酸NDEF：5’-TACAATAGTATAGTGGTAGCTTGTAGATCTAGATAG-3’寡聚核苷酸BNSNX：5’-GATCCAAGGAGACCATGGGAGCTCGCGGCCGCAC-3’；
2)质粒pT6VH的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用引物GDF5和GDR1PCR进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，得质粒pBSVH；将pBSVH和质粒pPT6用NcoI/XhoI双酶切，连接转化入大肠杆菌DH5，得质粒pT6VH；
3)质粒pT6VH18的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ETF6和ETR1进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5
α，得质粒pBS18，将pBS 18和pT6VH用XhoI酶切，连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒即为具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列交叉保护疫苗。
步骤1)中用EcoRI/BamHI双酶切回收的段为130bp和4kb片段，将两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，而后转化入大肠杆菌DH5α。步骤2)中用NcoI/XhoI双酶切回收590bp和4kb片段，将两段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α。步骤3)中用XhoI酶切回收520bp和4.6kb片段，将两段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α。所述转化入大肠杆菌DH5α后均在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选白色转化子质粒。步骤3)所得具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列交叉保护疫苗在含有100ug/ml的Ap的LB液体培养基中过夜培养，取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的LB液体培养基中，于37℃下摇动培养至OD600为0.8，而后离心，收集菌液，即得表达含有序列表SEQ ID No1中的碱基序列的疫苗抗原Vhe18。所述以160-200rpm摇动培养，离心条件为5000g，4℃，10min。
本发明具有如下优点：
1.交叉免疫保护性。本发明的交叉保护疫苗能够在一定程度上同时防御哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌感染，构建针对哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌的融合型重组亚单位疫苗抗原Vhe18，能够同时保护牙鲆抵御哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌感染。
2.高保护率。本发明的交叉保护疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达82％。
3.应用简单。本发明的疫苗抗原制备过程简单，毋需蛋白质提取、纯化等。本发明运用分子生物学技术构建了该抗原的细菌表面展示型表达载体，从而使得抗原载体菌可以直接作为疫苗接种，避免了蛋白质提取、纯化过程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1
本发明保护性疫苗抗原由序列表SEQ ID No.1中的vhe18碱基序列所示。
疫苗抗原表面展示载体的构建方法：
1)质粒pPT6的构建
以质粒pTrcHis(购自于美国Invitrogen公司)为模板，用下列引物PCR：TRF1(5’-GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG-3’，划线碱基为EcoRI位点)，TRR1(5’-GGATCCGATATCATTATACGAGCCGGATG-3’，划线碱基为BamHI/EcoRV位点)，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，48℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，57℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10mi n。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选出白色转化子，即为质粒pBSTR。将pBSTR与质粒pBR 322(购自“纽英伦生物技术有限公司”，北京)用EcoRI/BamHI双酶切后分别回收130bp和4kb片段；将该2片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取1个转化子，提取质粒，将其命名为pBTR1。将pBTR1用NdeI酶切，将酶切片段与寡聚核苷酸NDEF(5’-TACAATAGTATAGTGGTAGCTTGTAGATCTAGATAG-3’)用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取1个转化子，提取质粒，将其命名为pPTN。将pPTN用BamHI/XhoI酶切，将酶切片段与寡聚核苷酸BNSNX(5’-GATCCAAGGAGACCATGGGAGCTCGCGGCCGCAC-3’)用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取1个转化子，提取质粒，将其命名为pPT6。
2)质粒pT6VH的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用下列引物PCR：GDF5(5’-AGTACCATGGATGAAGAGAAGGAATCCTC G-3’，划线碱基为NcoI位点)，GDR1(5’-CTGTCTCGAGTTTCAATCTAGTTGGTTTTG-3’，划线碱基为XhoI位点)，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，52℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，62℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养24-30小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为pBSVH。将pBSVH和上述步骤1)的质粒pPT6用NcoI/XhoI双酶切后分别回收590bp和4kb片段；将上述两段DNA片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取2个转化子，提取质粒，将该质粒命名为pT6VH。
所述LB固体培养基组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，琼脂1.5％，97.5％蒸馏水；所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985。
3)质粒pT6VH18的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用下列引物PCR：ETF6(5’-CTCGAGGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCGTCGCCGCCGT-3’，划线碱基为XhoI位点)，ETR1(5’-CTCGAGCCCGGGCTTCAGCAGCGAGAACGCG-3’，划线碱基为XhoI位点)，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，58℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，72℃100s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml Ap、40ug/ml Xgal和24ug/mlIPTG的LB固体培养基上培养24-30小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为pBS18。将pBS18和上述步骤2)的质粒pT6VH用XhoI酶切后分别回收520bp和4.6kb片段；将上述两段DNA片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24-30小时，挑取2个转化子，提取质粒，测序验证为正确重组质粒。将该质粒命名为pT6VH18。
其中所述迟缓爱德华氏菌TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330。
ATGTGCGTCGCCGCCGTGATCGGCAGTGCGACCATGGCAACCCAGGCGGCCAGCGATCCCCGCAGCGTGGGTACCCAGGT
CGACGATGGTACGCTGGAGGCCCGCATCTCCAACGCCCTGAGCAAAGACGCACAGCTGAAGAAAGAGGCGCGCGTCGTGG
TAACCGCCTATCAGGGGCAGGTGCTGCTGACCGGTCAGGCGCCAAGCCAGGCGCTGATTAGCCGCGCCAAGCAGATCGCG
ATGGGCGTTGAAGGCACCAAGGCGGTCTATAATGAGATCCGTTTAGGCCAGCCGGTCAGCCTGGGCACTGCCTCGGCCGA
TGCCTGGATCACCACCAAGGTCCGCTCCCAGCTGCTGGCCAGCGACCAGGTGAAATCCACCAACGTGAAGGTGACCACCG
AAAATGGCGAGGTCTTCCTGCTGGGGCTGGTGACGCCCAAAGAGGGACAGGCCGCCGCGCAAACGGCCAGTAAAGTCAGC
GGGGTAAAACATGTCACTACCGCGTTCTCGCTGCTGAAGTGCGTCGCCGCCGTGATCGGCAGTGCGACCATGGCAACCCA
GGCGGCCAGCGATCCCCGCAGCGTGGGTACCCAGGTCGACGATGGTACGCTGGAGGCCCGCATCTCCAACGCCCTGAGCA
AAGACGCACAGCTGAAGAAAGAGGCGCGCGTCGTGGTAACCGCCTATCAGGGGCAGGTGCTGCTGACCGGTCAGGCGCCA
AGCCAGGCGCTGATTAGCCGCGCCAAGCAGATCGCGATGGGCGTTGAAGGCACCAAGGCGGTCTATAATGAGATCCGTTT
AGGCCAGCCGGTCAGCCTGGGCACTGCCTCGGCCGATGCCTGGATCACCACCAAGGTCCGCTCCCAGCTGCTGGCCAGCG
ACCAGGTGAAATCCACCAACGTGAAGGTGACCACCGAAAATGGCGAGGTCTTCCTGCTGGGGCTGGTGACGCCCAAAGAG
GGACAGGCCGCCGCGCAAACGGCCAGTAAAGTCAGCGGGGTAAAACATGTCACTACCGCGTTCTCGCTGCTGAAGTAA
(a)序列特征：
●长度：1038bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：双链DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：哈氏弧菌T4和迟缓爱德华氏菌TX1
(f)特异性名称：vhe18
4)疫苗制备方法：将含有上述步骤3)的质粒pT6VH18的大肠杆菌DH5α在含有Ap(100ug/ml)的LB培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的LB液体培养基中，于37℃下转速160-200rpm摇动培养至OD600为0.8。而后将细菌培养液离心(5000g，4℃，10mi n)，收集菌液，即得表达含有序列表SEQ ID No1中的碱基序列的疫苗抗原Vhe18的大肠杆菌，即疫苗。所述LB液体培养基组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水。
实施例2
疫苗的免疫应用
步骤1)疫苗的免疫注射。将上述所收集的菌体悬浮于PBS中至终浓度为5x108cfu/ml，即为疫苗制备液。将120条牙鲆(每条重约13g)随机分为4组，每组30条。将这4组分别命名为A，B，C，和D组。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述疫苗制备液。将B和D组的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。
其中PBS组成成分为：0.8g NaCl，0.02g KCl，0.358g Na2HPO4.12H2O，0.024g NaH2PO4。
步骤2)哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养哈氏弧菌T4和迟缓爱德华氏菌TX1至OD600为0.6，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度分别为5x108cfu/ml(T4)和1x107cfu/ml(TX1)，即为哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌悬液。
步骤3)交叉保护性疫苗针对哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌的免疫保护效应检测。在步骤1)第一次免疫注射后的第34天，用上述步骤2)的哈氏弧菌悬液腹腔注射步骤1)的A和B两组鱼，用上述步骤2)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤1)的C和D两组鱼，每条鱼的注射量为100u l。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，4条；B组，22条；C组，11条，D组，24条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
由此得出疫苗Vhe18针对哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率分别为82％和54％，故其能够在不同程度上保护牙鲆抵御哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌侵染。
序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种交叉保护疫苗及其构建方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1038
<212>DNA
<213>哈氏弧菌T4和迟缓爱德华氏菌TX1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1038)
<223>
<400>1
atg tgc gtc gcc gcc gtg atc ggc agt gcg acc atg gca acc cag gcg 48
Met Cys Val Ala Ala Val Ile Gly Ser Ala Thr Met Ala Thr Gln Ala
1 5 10 15
gcc agc gat ccc cgc agc gtg ggt acc cag gtc gac gat ggt acg ctg 96
Ala Ser Asp Pro Arg Ser Val Gly Thr Gln Val Asp Asp Gly Thr Leu
20 25 30
gag gcc cgc atc tcc aac gcc ctg agc aaa gac gca cag ctg aag aaa 144
Glu Ala Arg Ile Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Ala Gln Leu Lys Lys
35 40 45
gag gcg cgc gtc gtg gta acc gcc tat cag ggg cag gtg ctg ctg acc 192
Glu Ala Arg Val Val Val Thr Ala Tyr Gln Gly Gln Val Leu Leu Thr
50 55 60
ggt cag gcg cca agc cag gcg ctg att agc cgc gcc aag cag atc gcg 240
Gly Gln Ala Pro Ser Gln Ala Leu Ile Ser Arg Ala Lys Gln Ile Ala
65 70 75 80
atg ggc gtt gaa ggc acc aag gcg gtc tat aat gag atc cgt tta ggc 288
Met Gly Val Glu Gly Thr Lys Ala Val Tyr Asn Glu Ile Arg Leu Gly
85 90 95
cag ccg gtc agc ctg ggc act gcc tcg gcc gat gcc tgg atc acc acc 336
Gln Pro Val Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp Ile Thr Thr
100 105 110
aag gtc cgc tcc cag ctg ctg gcc agc gac cag gtg aaa tcc acc aac 384
Lys Val Arg Ser Gln Leu Leu Ala Ser Asp Gln Val Lys Ser Thr Asn
115 120 125
gtg aag gtg acc acc gaa aat ggc gag gtc ttc ctg ctg ggg ctg gtg 432
Val Lys Val Thr Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val
130 135 140
acg ccc aaa gag gga cag gcc gcc gcg caa acg gcc agt aaa gtc agc 480
Thr Pro Lys Glu Gly Gln Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Lys Val Ser
145 150 155 160
ggg gta aaa cat gtc act acc gcg ttc tcg ctg ctg aag tgc gtc gcc 528
Gly Val Lys His Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys Cys Val Ala
165 170 175
gcc gtg atc ggc agt gcg acc atg gca acc cag gcg gcc agc gat ccc 576
Ala Val Ile Gly Ser Ala Thr Met Ala Thr Gln Ala Ala Ser Asp Pro
180 185 190
cgc agc gtg ggt acc cag gtc gac gat ggt acg ctg gag gcc cgc atc 624
Arg Ser Val Gly Thr Gln Val Asp Asp Gly Thr Leu Glu Ala Arg Ile
195 200 205
tcc aac gcc ctg agc aaa gac gca cag ctg aag aaa gag gcg cgc gtc 672
Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Ala Gln Leu Lys Lys Glu Ala Arg Val
210 215 220
gtg gta acc gcc tat cag ggg cag gtg ctg ctg acc ggt cag gcg cca 720
Val Val Thr Ala Tyr Gln Gly Gln Val Leu Leu Thr Gly Gln Ala Pro
225 230 235 240
agc cag gcg ctg att agc cgc gcc aag cag atc gcg atg ggc gtt gaa 768
Ser Gln Ala Leu Ile Ser Arg Ala Lys Gln Ile Ala Met Gly Val Glu
245 250 255
ggc acc aag gcg gtc tat aat gag atc cgt tta ggc cag ccg gtc agc 816
Gly Thr Lys Ala Val Tyr Asn Glu Ile Arg Leu Gly Gln Pro Val Ser
260 265 270
ctg ggc act gcc tcg gcc gat gcc tgg atc acc acc aag gtc cgc tcc 864
Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp Ile Thr Thr Lys Val Arg Ser
275 280 285
cag ctg ctg gcc agc gac cag gtg aaa tcc acc aac gtg aag gtg acc 912
Gln Leu Leu Ala Ser Asp Gln Val Lys Ser Thr Asn Val Lys Val Thr
290 295 300
acc gaa aat ggc gag gtc ttc ctg ctg ggg ctg gtg acg ccc aaa gag 960
Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val Thr Pro Lys Glu
305 310 315 320
gga cag gcc gcc gcg caa acg gcc agt aaa gtc agc ggg gta aaa cat 1008
Gly Gln Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Lys Val Ser Gly Val Lys His
325 330 335
gtc act acc gcg ttc tcg ctg ctg aag taa 1038
Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys
340 345
<210>2
<211>345
<212>PRT
<213>哈氏弧菌T4和迟缓爱德华氏菌TX1
<400>2
Met Cys Val Ala Ala Val Ile Gly Ser Ala Thr Met Ala Thr Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ser Asp Pro Arg Ser Val Gly Thr Gln Val Asp Asp Gly Thr Leu
20 25 30
Glu Ala Arg Ile Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Ala Gln Leu Lys Lys
35 40 45
Glu Ala Arg Val Val Val Thr Ala Tyr Gln Gly Gln Val Leu Leu Thr
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Ser Gln Ala Leu Ile Ser Arg Ala Lys Gln Ile Ala
65 70 75 80
Met Gly Val Glu Gly Thr Lys Ala Val Tyr Asn Glu Ile Arg Leu Gly
85 90 95
Gln Pro Val Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp Ile Thr Thr
100 105 110
Lys Val Arg Ser Gln Leu Leu Ala Ser Asp Gln Val Lys Ser Thr Asn
115 120 125
Val Lys Val Thr Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val
130 135 140
Thr Pro Lys Glu Gly Gln Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Lys Val Ser
145 150 155 160
Gly Val Lys His Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys Cys Val Ala
165 170 175
Ala Val Ile Gly Ser Ala Thr Met Ala Thr Gln Ala Ala Ser Asp Pro
180 185 190
Arg Ser Val Gly Thr Gln Val Asp Asp Gly Thr Leu Glu Ala Arg Ile
195 200 205
Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Ala Gln Leu Lys Lys Glu Ala Arg Val
210 215 220
Val Val Thr Ala Tyr Gln Gly Gln Val Leu Leu Thr Gly Gln Ala Pro
225 230 235 240
Ser Gln Ala Leu Ile Ser Arg Ala Lys Gln Ile Ala Met Gly Val Glu
245 250 255
Gly Thr Lys Ala Val Tyr Asn Glu Ile Arg Leu Gly Gln Pro Val Ser
260 265 270
Leu Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Trp Ile Thr Thr Lys Val Arg Ser
275 280 285
Gln Leu Leu Ala Ser Asp Gln Val Lys Ser Thr Asn Val Lys Val Thr
290 295 300
Thr Glu Asn Gly Glu Val Phe Leu Leu Gly Leu Val Thr Pro Lys Glu
305 310 315 320
Gly Gln Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Lys Val Ser Gly Val Lys His
325 330 335
Val Thr Thr Ala Phe Ser Leu Leu Lys
340 345
Claims (8)
1.一种交叉保护疫苗，其特征在于：由序列表SEQ ID No.1中的碱基序列组成。
2.一种按权利要求1所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：
1)质粒pPT6构建：以质粒pTrcHis为模板，用引物TRF1和TRR1进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，得质粒pBSTR；将pBSTR与质粒pBR322用EcoRI/BamHI双酶切后连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pBTR1；将pBTR1用NdeI酶切，与寡聚核苷酸NDEF连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pPTN；将pPTN用BamHI/XhoI酶切，与寡聚核苷酸BNSNX连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pPT6；
所述TRF1：5’-GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG-3’；所述TRR1 5’-GGATCCGATATCATTATACGAGCCGGATG-3’；
所述寡聚核苷酸NDEF：5’-TACAATAGTATAGTGGTAGCTTGTAGATCTAGATAG-3’寡聚核苷酸BNSNX：5’-GATCCAAGGAGACCATGGGAGCTCGCGGCCGCAC-3’；
2)质粒pT6VH的构建：以哈氏弧菌T4为模板，用引物GDF5和GDR1 PCR进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，得质粒pBSVH；将pBSVH和质粒pPT6用NcoI/XhoI双酶切，连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pT6VH；所述GDF5：5’-AGTACCATGGATGAAGAGAAGGAATCCTCG-3’；GDR1：5’-CTGTCTCGAGTTTCAATCTAGTTGGTTTTG-3’；
3)质粒pT6VH18的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ETF6和ETR1进行PCR扩增，产物与载体pBS-T连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，得质粒pBS18，将pBS18和pT6VH用XhoI酶切，连接转化入大肠杆菌DH5α，得质粒即为具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列交叉保护疫苗；
所述ETF6：5’-CTCGAG GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCGTCGCCGCCGT-3’，ETR1：5’-CTCGAGCCCGGGCTTCAGCAGCGAGAACGCG-3’。
3.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：步骤1)中用EcoRI/BamHI双酶切回收的段为130bp和4kb片段，将两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，而后转化入大肠杆菌DH5α。
4.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：步骤2)中用NcoI/XhoI双酶切回收590bp和4kb片段，将两段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α。
5.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：步骤3)中用XhoI酶切回收520bp和4.6kb片段，将两段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α。
6.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：所述转化入大肠杆菌DH5α后均在含有100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xga1和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选白色转化子质粒。
7.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：步骤3)所得具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列交叉保护疫苗在含有100ug/ml的Ap的LB液体培养基中过夜培养，取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的LB液体培养基中，于37℃下摇动培养至OD600为0.8，而后离心，收集菌液，即得表达含有序列表SEQ ID No1中的碱基序列的疫苗抗原Vhe18。
8.按权利要求7所述的交叉保护疫苗的构建方法，其特征在于：所述于37℃下摇动培养是以160-200rpm摇动培养，离心条件为5000g，4℃，10min。
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