CN106047783B - 杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用。所述突变株NB2011ΔExoU，保藏号为CGMCC No.12430，其制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将杀香鱼假单胞菌野生株NB2011的ExoU基因进行基因敲除，经PCR技术筛选鉴定确定所获得的菌株为基因敲除突变株。用本发明所述的突变株进行动物实验研究其致病性，其结果是对实验动物的毒力显著降低，可应用于杀香鱼假单胞菌弱毒性疫苗。

Description

杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用。
背景技术
大黄鱼是我国东部沿海网箱养殖的重要经济鱼类品种，近年来受到内脏白点病的危害，造成很高的死亡率和严重的经济损失。杀香鱼假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida) 是该病病原菌。致病株NB2011基因组测序和注释结果表明，该菌编码典型的三型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)，该系统存在于很多革兰氏阴性致病菌中，形态表现为跨越细菌外膜直接插入真核宿主细胞膜的一针形复合体，菌体通过此复合体将多种效应蛋白输送到宿主细胞中，发挥破坏宿主细胞骨架结构、改变信号传递和免疫反应类型，控制宿主细胞的应答等功能，从而建立感染、实现传播。NB2011的T3SS与人类条件性病原菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的相应系统最为接近。在铜绿假单胞菌中，ExoU作为该菌T3SS 分泌的4种效应蛋白之一，通过T3SS直接输送到宿主细胞中，与真核细胞膜结合，发挥磷脂酶A活性，裂解细胞，造成细胞和组织坏死，是重要的毒力因子；该基因的存在是铜绿假单胞菌强毒株的重要标志，基因缺失的突变株毒力显著减弱。本实验室已经验证了杀香鱼假单胞菌NB2011通过T3SS分泌一效应蛋白，其氨基酸序列与铜绿假单胞菌细胞毒素ExoU存在45％的同源性，同样具有磷脂酶A活性，可能是该菌的重要毒力因子。
大黄鱼内脏白点病流行和爆发于水温较低的冬春季节，鱼类不摄食，基本无法通过投喂药物的方式控制病情，目前尚无有效的防治方法。利用疫苗接种的方法预防鱼类感染性疾病的发生，已经有半个多世纪的历史，目前世界范围内成功使用的鱼类疫苗包括冷水性弧菌疫苗、鲑科鱼类红嘴病和肠炎病二联疫苗、鱼类传染性胰腺坏死病疫苗等，国内有草鱼病毒性出血病疫苗、淡水鱼类细菌性败血症疫苗、副溶血弧菌和溶藻弧菌二联疫苗等，获得了较好的防病效果。开发特异性良好的高效疫苗，也是预防大黄鱼内脏白点病的重要方法。针对杀香鱼假单胞菌致病株NB2011，前期研究结果表明，常规灭活疫苗和主要表面抗原免疫能够刺激显著水平的抗体应答，但不能提供有效保护；超微病理观察到了该菌在巨噬细胞内存活和增殖现象，提示了该菌可能是一种兼性胞内病原菌。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种典型的胞内寄生菌，可感染多种水产养殖动物，采用基因敲除技术联合缺失多种T3SS效应蛋白基因的突变株毒力大为减弱，作为弱毒苗能够提供有效保护。针对杀香鱼假单胞菌，我们也需要探索研制活的弱毒疫苗、DNA疫苗等新型疫苗，模仿自然感染途径，有效激活细胞免疫，才能对宿主提供足够保护。
本发明首次构建了杀香鱼假单胞菌NB2011三型毒力因子ExoU基因敲除突变株，显著降低了对大黄鱼的毒力，接种鱼体后可有效激发细胞免疫和体液免疫，预防侵袭和疾病的发生；避免了常规灭活疫苗或亚单位疫苗激发产生的体液抗体不能到达宿主细胞内，无法有效清除胞内病原的不足。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一株杀香鱼假单胞菌 ExoU基因敲除突变株。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供该突变株的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU，其特征在于，NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因被卡那霉素抗性基因盒KanR所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12430，保藏日期为2016年5 月12日；所述的NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因序列如 SEQ ID NO.1所示；所述的卡那霉素抗性基因盒KanR序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)根据如SEQ ID NO.3所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-5F和ExoU-5R；根据如SEQ ID NO.4所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的下游DNA序列，设计PCR 特异引物ExoU-3F和ExoU-3R；以pKD4质粒为模板，设计一对特异引物Kan-F和Kan-R；其中引物ExoU-5F序列如SEQ ID NO.5所示，引物ExoU-5R序列如SEQ ID NO.6所示，引物ExoU-3F序列如SEQ ID NO.7所示，引物ExoU-3R序列如SEQ ID NO.8所示，引物 Kan-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物Kan-R序列如SEQ ID NO.10所示；
(2)以NB2011基因组DNA为模板，分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R 为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；以pKD4质粒为模板，以 Kan-F/Kan-R为特异引物扩增得到两端含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR；以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，以纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打靶片段即上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段 FA-KanR-RA；
(3)打靶载体pCVD:ExoU的构建：将所述的FA-KanR-RA插入pCVD442载体的Sma I酶切位点间得打靶载体pCVD:ExoU；
(4)打靶载体pCVD:ExoU电转化转入大肠杆菌E.coliβ2155，获得供体菌β2155/pCVD442:ExoU；
(5)β2155/pCVD442:ExoU供体菌与受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011进行接合实验，在卡那霉素平板上筛选获得卡那霉素抗性的杀香鱼假单胞菌克隆，其基因组已整合打靶序列，称为NB2011/pCVD442:ΔExoU。
(6)在含10％蔗糖的LB平板上划线接种NB2011/pCVD442:ΔExoU，培养至单克隆形成，通过PCR技术筛选鉴定获得ExoU基因被Kan抗性基因取代的克隆，命名为 NB2011ΔExoU:Kan，即得到保藏号为CGMCC No.12430的杀香鱼假单胞菌型ExoU基因敲除突变株，简称NB2011ΔExoU。
进一步的上述杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于所述的基因敲除载体pCVD::ExoU的构建包含如下步骤：
(a)卡那霉素抗性基因盒KanR的克隆：以Kan-F/Kan-R为特异引物，以提取的pKD4质粒DNA为模板扩增得到两端分别含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR；
(b)ExoU上、下游同源片段的扩增：分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含SmaI酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；
(c)基因打靶片段的融合：ExoU基因上、下游同源重组臂和卡那霉素抗性基因表达框扩增产物经电泳、割胶纯化，以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，进行融合PCR反应，获得融合打靶片段FA-KanR-RA；
(d)打靶载体pCVD442:ExoU的构建：酚/氯仿法提取pCVD442质粒，溶于200μl TE缓冲液中，该TE缓冲液包含10mM Tris和pH为8.0的0.1mM EDTA；融合PCR产物经酚/氯仿处理后，异丙醇沉淀，并溶解于40μl去离子水；pCVD442质粒和融合PCR产物经 SmaⅠ酶切，酶切产物电泳，割胶纯化后建立连接反应，连接产物经异丙醇沉淀后，70％乙醇洗涤，溶解于5μl去离子水；通过电转化方法将其转入大肠杆菌DH5αλpir，在含25μg/ml 卡那霉素的LB平板上于37℃培养，至单克隆形成，挑选生长良好的克隆，接种入5ml含50μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培养基，37℃培养过夜；次日离心柱法提取质粒，此质粒即为打靶载体pCVD442:ExoU。
本发明还提供一种杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU在制备杀香鱼假单胞菌减毒疫苗中的应用。
所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株通过如下方法获得：
(a)在LB平板上划线接种受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011，30℃培养至单克隆形成，挑单克隆入5ml LB；挑β2155/pCVD442:ΔExoU单克隆入5ml含25μg/ml Amp的LB培养液，30℃，220rpm培养过夜。
(b)取500μl供体菌β2155/pCVD442:ΔExoU菌液与1000μl受体菌的菌液按照体积比为 1:2混合，该受体菌为杀香鱼假单胞菌NB2011，轻轻吹打混合后，6000rpm离心5min，收集菌体，以无抗性LB培养液洗涤1次，该无抗性LB培养液含0.5mM二氨基庚二酸DAP，菌体重悬于1ml含0.5mM DAP的LB培养液中，取100μl铺到0.22μm无菌滤膜上，30℃培养过夜。次日，滤膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗脱，取40μl菌液涂布于含有25μg/ml Kan的LB平板，30℃培养过夜；在Kan抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液采用外侧引物ExoU-outF/ExoU-outR进行PCR检测， ExoU-outF/ExoU-outR的序列如SEQ IDNO.11，12所示；选择扩增产物为弱或无扩增的克隆，此类克隆为ExoU基因打靶质粒一次重组克隆，需在蔗糖平板上继续进行二次重组克隆的筛选。
(c)取NB2011/pCVD442:ΔExoU菌液划线接种LB蔗糖平板，该LB蔗糖平板含10％的蔗糖且无氯化钠，30℃培养至单克隆形成；随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用外侧引物进行PCR检测；选择出现明亮的特异条带扩增的克隆，此克隆应发生了二次重组；再利用ExoU内部引物ExoU-inF/ExoU-inR进行PCR检测， ExoU-inF/ExoU-inR序列如SEQ ID NO.13，14所示；PCR验证的结果为阴性，因此可以判断此克隆为ExoU基因被卡那霉素抗性基因取代的克隆，命名为NB2011/ΔExoU::Kan，简写NB2011ΔExoU。
与现有技术相比，本发明具有如下优点:(1)本发明运用同源重组的原理，构建中间为卡那霉素抗性基因，两侧为ExoU基因上下游同源序列的基因敲除载体pCVD::ExoU，将构建的pCVD::ExoU基因敲除质粒电转化入大肠杆菌感受态细胞，与杀香鱼假单胞菌致病株NB2011接合后，通过体内同源重组，经基因水平、DNA测序和蛋白水平鉴定，成功获得突变株，命名为NB2011ΔExoU；(2)本发明对ExoU基因敲除突变株的相关生物学特性和致病性进行了分析，明确了ExoU基因与NB2011致病性的关系，NB2011ΔExoU较野生株相比，到达对数生长期时间和生长速率没有明显差异；突变株不分泌ExoU蛋白；大黄鱼毒力试验结果表明突变株NB2011ΔExoU的毒力下降，表明ExoU参与了致病过程，是一种重要的毒力相关因子，该突变菌株为弱毒疫苗的制备提供了重要基础，可应用于 P.plecoglossicida减毒疫苗的开发；(3)本发明构建的NB2011ΔExoU，为进一步研究杀香鱼假单胞菌的致病机制奠定了基础，为更有效的防控大黄鱼内脏白点病提供了技术支持；(4) 本发明成功构建的P.plecoglossicida NB2011的ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU，突变株不合成和分泌ExoU蛋白；在腹腔注射大黄鱼毒力实验中，突变株ΔExoU毒力显著下降，说明ExoU是杀香鱼假单胞菌的一个重要毒力因子；以一定剂量的突变菌作为弱毒疫苗免疫大黄鱼，获得了有效保护，表明突变株能够有效激发机体的保护性应答，为该菌疫苗的研制奠定了部分基础。
保藏说明
1、杀香鱼假单胞菌NB2011ΔExoU，分类命名：Pseudomonas plecoglossicida，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年5月12日，保藏号为CGMCC No.12430。
附图说明
图1为基因敲除载体PCR鉴定结果图(M:DNA分子量标准。泳道1以 ExoU-5F/ExoU-3R为引物对，以打靶载体pCVD446-ExoU质粒DNA为模板的PCR产物，目的片段为打靶片段FA-KanR-RA，长度3195bp)；
图2为突变菌的PCR初筛结果(M,DNA分子量标准；泳道1-16以ExoU外侧引物 ExoU-outF/ExoU-outR扩增的PCR结果)；
图3A为突变菌的复筛PCR结果(M,DNA分子量标准；泳道1-16以ExoU外侧引物ExoU-outF/ExoU-outR扩增的PCR结果；
图3B为图3-A中泳道15筛选PCR结果(M,DNA分子量标准；泳道+为杀香鱼假单胞菌NB2011原始菌株，而泳道1和2以ExoU内侧引物ExoU-inF/ExoU-inR扩增的PCR 结果，验证的结果为阴性)；
图4为突变株的组合PCR鉴定结果图(M,DNA分子量标准；泳道1和2为以NB2011 基因组DNA为模板，内部引物PCR扩增鉴定结果，目的片段为ExoU基因内部引物 ExoU-inF/ExoU-inR，长度511bp,平行管；泳道3和4为以NB2011ΔExoU基因组DNA 为模板，内部引物PCR鉴定结果，平行管；5、6为以NB2011基因组DNA为模板，外部引物PCR鉴定结果，目的片段为ExoU外部序列片段，野生株中长度为4707bp，平行管，泳道7和8为NB2011ΔExoU外部引物鉴定结果，突变株中长度为4164bp，平行管)；
图5A为野生株与突变株分泌蛋白的SDS-PAGE电泳图；M，蛋白分子量标准；1，野生株NB2011的分泌蛋白；2，突变株NB2011ΔExoU的分泌蛋白，从图5A中的结果可以看出，野生株NB2011和突变株NB2011ΔexoU均能分泌蛋白；
图5B为野生株与突变株分泌蛋白的Western-blotting鉴定图；以兔抗ExoU血清进行免疫印迹识别分泌蛋白；M，预染蛋白分子量标准；1，野生株NB2011分泌蛋白的印迹结果；2，突变株NB2011ΔExoU分泌蛋白的印迹，从图5B中的结果表明了野生株向培养液分泌ExoU蛋白，而ExoU基因缺失突变的NB2011ΔexoU菌株不分泌ExoU蛋白；
图6为野生株和突变株的24h生长曲线。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1基因敲除载体的构建
(1)根据P.plecoglossicida野生株NB2011基因组ExoU编码基因的上下游DNA序列，设计PCR特异引物，碱基序列如下：
ExoU-5F:5’-atacccgggCTGGCATTGCGGATTCCCAAG-3’(SEQ ID NO.5，下划线处为引入的SmaI酶切位点)
ExoU-5R:5’-ACCCTCTCCAACATCACAATTAACTATTG-3′(SEQ ID NO.6)
ExoU-3F:5’-TGGTTTCTTCTGATTGGCCAAGG-3′(SEQ ID NO.7)
ExoU-3R:5’-atacccggGCTGATCGAAATGCTCTTGATCAGTC-3′(SEQ ID NO.8，下划线处为SmaI酶切位点)。以NB2011基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段，PCR反应体系为NB2011基因组DNA 0.5μL，10×pfu缓冲液5μL，25mM dNTP 0.4μL，ExoU-5F/ ExoU-5R，ExoU-3F/ExoU-3R各0.5μL，pfu 0.5μL，双蒸水43μL，总共50μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30s，60℃45s，72℃90s，35个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水为阴性对照。利用ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R两对引物扩增所得PCR 产物经1％琼脂糖电泳检测分别获得目的片段大小为832bp和878bp。
(2)根据pKD4质粒序列，设计一对特异引物Kan-F/Kan-R，以pKD4质粒为模板扩增整个的kan表达盒，引物序列为:
Kan-F：5’-caatagttaattgtgatgttggagagggtCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC -3’(SEQ ID NO.9，小写字母代表与上游同源臂3’端同源序列)
Kan-R：5’-ccttggccaatcagaagaaaccaGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA-3’(SEQ ID NO.10，小写字母代表与下游同源臂5’端同源序列)
PCR反应体系为：pKD4质粒DNA 0.5μL，10×pfu缓冲液5μL，25mM dNTP 0.4μL,Kan-F/Kan-R，各0.5μL，pfu 0.5μL，双蒸水43μL，总共50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s，55℃45s，72℃70s，35个循环，最后 72℃延伸7min，以双蒸水为阴性对照。
(3)以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，以纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打靶片段上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段 FA-KanR-RA。
PCR反应体系为：上下游同源臂(10ng/μL)各1μL，10×pfu缓冲液10μL，25mM dNTP0.8μL，ExoU-5F/ExoU-3R(50pm/μL)各1μL，pfu 1μL，双蒸水85μL，总共100μL。 PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s，60℃45s，72℃4min，35个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水为阴性对照。利用ExoU-5F/ExoU-3R为引物扩增所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测分别获得目的片段大小为3195bp，结果如图1所示。
(4)打靶片段的克隆：将SmaI酶切后的FA-KanR-RA片段与用同样内切酶处理过的质粒pCVD442进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜，次日提取质粒DNA，即为重组质粒pCVD442-ΔExoU。
(5)基因敲除载体pCVD442-ΔExoU的鉴定：将得到的阳性重组基因敲除载体pCVD442-ΔExoU进行测序(上海生工生物工程有限公司)，测序结果表明在KanR基因两侧具有同源序列的ExoU目的基因，基因敲除载体pCVD442-ΔExoU的构建完全正确。
实施例2突变株的筛选与鉴定
(1)接合试验
①供体菌的构建：将打靶载体pCVD442-ΔExoU电转化进入大肠杆菌β2155菌株，铺LB平板(含Amp 50μg/ml，0.5mM DAP)，37℃培养至单克隆形成。此克隆即为用于接合实验的供体菌株β2155/pCVD442-ΔExoU。
②接合试验：
(1)在LB平板上划线接种受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011，28℃培养至单克隆形成。
(2)挑NB2011单克隆入3ml LB；挑β2155/pCVD442-ΔExoU单克隆入3ml LB(含Amp25μg/ml)，37℃，220rpm培养过夜。
(3)取500μl供体菌β2155/pCVD442-ΔExoU菌液与1000μl受体菌(杀香鱼假单胞菌) 菌液混合(体积比1:2)，轻轻吹打混合后，6000rpm离心5min，收集菌体，以无抗性LB培养液(含0.5mM二氨基庚二酸(DAP))洗涤1次，菌体重悬于1ml LB培养液(含0.5mM DAP)中，取100μl铺到0.22μm无菌滤膜上，30℃培养过夜。次日，滤膜上菌体在5ml 生理盐水中吹打洗脱，取40μl菌液涂布于含有25μg/ml Kan的LB平板，30℃培养过夜。
③突变菌的初筛：在Kan抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液行外侧引物PCR检测(结果如图2)。结果显示：第7、8和16号克隆的扩增产物为弱或无(原始菌株扩增长度：4707bp；ExoU被卡那霉素抗性基因替代菌株扩增长度：4164bp；通过单次交换于基因组上一侧手臂处插入整个打靶质粒的一次重组克隆为弱或无扩增)。如果ExoU基因被敲除，PCR扩增将会得到阴性结果，如果仍能扩增出预期大小(4707bp)的产物，说明ExoU基因未被敲除；其中，第7、8和16号扩增出的扩增产物大小为(4164bp)的ExoU，此三个克隆应该是ExoU基因打靶质粒一次重组克隆，需在蔗糖平板上继续进行二次重组克隆的筛选，通过这种方法以初步筛选获得基因敲除突变株；并选择第8号克隆命名为NB2011/pCVD442-ΔExoU，继续进行后续的实验。
(2)突变株的复筛：取NB2011/pCVD442-ΔExoU菌液划线接种LB蔗糖平板(含10％蔗糖，无NaCl)，30℃培养至单克隆形成。随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用外侧引物进行PCR检测(图3A)。结果显示：仅第15号克隆出现明亮的特异条带扩增，长度为4164bp，此克隆应发生了二次重组(通过一侧同源重组手臂插入基因组的载体序列经另一侧的手臂重组被剔除出基因组，局部序列可能回复到原始菌株的排列，也可能重组产生目标基因敲除的菌株)。ExoU内侧引物PCR验证的结果为阴性(图3B)，因此可以判断此克隆为ExoU基因被卡那霉素抗性基因取代的克隆，命名为 NB2011/ΔExoU::Kan。
(3)突变株的鉴定：
组合PCR鉴定：在ExoU敲除目的基因上下游同源序列的FA和RA的外侧和内侧分别再设计一对引物ExoU-outF/ExoU-outR，ExoU-inF/ExoU-inR,其引物序列为:
ExoU-outF:5’-gaactgtcgaagacgctttcagaaata-3’
ExoU-outR:5’-ttcttgagcacatgaaagctattctcc-3’
ExoU-InF:5’-atagacatgtgccggaaatcaa-3’
ExoU-InR:5’-aaattcacggtacctgtcagca-3’
基因敲除载体pCVD442-ΔExoU与细菌染色体可发生3种方式的重组：a.双交换同源重组事件(double cross-over)，即等位基因置换，此时KanR基因取代ExoU基因；b.3′端单交换重组事件(3′single cross-over)，此时整个载体DNA序列随着3′端同源序列而整合到细菌的染色体上；c.5′端单交换重组事件(5′single cross-over)，此时载体序列随着5′端同源序列而整合到细菌染色体上。若发生等位基因置换，通过一侧同源重组手臂插入基因组的载体序列经另一侧的手臂重组被剔除出基因组，局部序列可能回复到原始菌株的排列，也可能重组产生目标基因敲除的菌株的克隆。以突变株基因组为模板，分别用ExoU内外侧引物进行PCR扩增，结果如图4所示。用引物ExoU-outF/ExoU-outR能扩增出的4164bp的目的片段，结果各PCR产物的大小与理论值相符；以ExoU-inF/ExoU-inR为引物时则无产物，表明ExoU基因已被替换；经DNA测序验证(上海生工测序)，在基因水平证实 NB2011ΔExoU突变株构建成功。
蛋白水平鉴定：为了进一步对NB2011ΔExoU突变株进行蛋白水平验证，将野生株与突变株分别在T3SS诱导培养基(LB+5mM EGTA)中培养5h后，收集培养液上清，经三氯乙酸(TCA)法浓缩20倍，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；同时准备两块平行胶，一块经考马氏亮蓝染色，另一块经半干法转移到硝酸纤维素膜上后以ExoU多克隆抗体(兔抗)进行免疫印迹，结果如图5B所示，野生株培养上清液中检测到预期分子量的反应蛋白，突变株中无，表明突变株未分泌ExoU蛋白。
实施例3生长特性检测实验
在相同培养条件下,分别挑取NB2011ΔExoU(CGMCC No.12430 )和野生株NB2011单菌落分别接种于5mL含LB培养基中,28℃振荡培养过夜。次日取出过夜培养的细菌,测定600nm处吸光度值,用LB培养基将两者稀释至约1×108cells/mL浓度。然后各取500μL突变株和野生株分别接种于LB培养基5mL中,于28℃,200r/min振荡培养,24h内每隔3h 分别取样测定OD600,以培养时间为横坐标,OD600值为纵坐标,绘制突变株和野生株生长曲线(图6)，结果发现突变株NB2011ΔExoU(CGMCC No.12430)的生长速率与野生株没有显著性差异，提示了ExoU与菌株的生长性能关联不大。
实施例4动物致病性实验
平均体重75±15g的健康大黄鱼幼鱼，随机分成5组，每组10尾，充气暂养于直径1m的圆型水族箱中，试验开始前适应7天。1-4组每尾鱼在胸鳍基部注射0.2mL浓度分别为 1.0×105cells/mL、1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL和1.0×108cells/mL的NB2011ΔExoU活菌液，组5-8则注射相同剂量的1.0×105cells/mL、1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL和1.0×108cells/mL NB2011活菌液，对照组9注射0.2mL无菌生理盐水。记录10天内的发病和死亡情况，并进行病原的再分离确定死亡原因。经SPSS17.0的机率单位加权回归法 (Bliss)计算96h的LD50。从刚死病鱼内脏中重新分离出与NB2011形态和理化特性相同的细菌，表明死亡是由人工感染引起。突变菌株和野生株感染96h内的LD50分别为5.47×106cells/mL、1.40×105cells/mL，表明突变株的毒力显著下降。
实施例5突变株对大黄鱼的人工免疫作用
暂养试验鱼7d以便适应养殖环境后进行免疫试验。在体积为300L左右的水泥池中进行免疫试验，试验期间水温为25±2℃，试验期为3周。选取规格均匀的健康大黄鱼，体重为100g左右，按照每组15尾鱼随机分为3组。1组、2组注射突变菌体(1.0×104cells/mL, 每尾0.2mL)，对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。
在免疫后21天进行了人工攻击实验，观察了7天内的死亡情况，并统计了免疫保护率。突变菌免疫组在第6天出现2尾死亡，未免疫的攻击组100％死亡，注射生理盐水的空白对照组在试验期间出现了1尾死亡。NB2011ΔExoU菌体组的免疫保护率达75％。虽然死亡鱼未出现明显的内脏白点症状，但自病鱼内脏中重新分离到了杀香鱼假单胞菌，证明试验中的死亡由人工感染的菌体引起。

Claims (5)

1.杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU，其特征在于，NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因被卡那霉素抗性基因盒Kan所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.12430，保藏日期为2016年5月12日；所述的NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的卡那霉素抗性基因盒Kan序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种根据权利要求1所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU的构建方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)根据如SEQ ID NO.3所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-5F和ExoU-5R；根据如SEQ ID NO.4所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-3F和ExoU-3R；以pKD4质粒为模板，设计一对特异引物Kan-F和Kan-R；其中引物ExoU-5F序列如SEQ IDNO.5所示，引物ExoU-5R序列如SEQ ID NO.6所示，引物ExoU-3F序列如SEQ ID NO.7所示，引物ExoU-3R序列如SEQ ID NO.8所示，引物Kan-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物Kan-R序列如SEQ ID NO.10所示；
(2)NB2011基因组DNA为模板，分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；以pKD4质粒为模板，以Kan-F/Kan-R为特异引物扩增得到卡那霉素抗性基因盒KanR；以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，以纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打靶片段即上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段FA-KanR-RA；
(3)打靶载体pCVD:ExoU的构建：将所述的FA-KanR-RA插入pCVD442载体的Sma I酶切位点间得打靶载体pCVD:ExoU；
(4)打靶载体pCVD:ExoU电转化转入大肠杆菌E.coliβ2155，获得供体菌β2155/pCVD442:ExoU；
(5)β2155/pCVD442:ExoU供体菌与杀香鱼假单胞菌受体菌进行接合实验，在卡那霉素平板上筛选获得卡那霉素抗性的杀香鱼假单胞菌克隆，其基因组已整合打靶序列，称为NB2011/pCVD442:ΔExoU；
(6)在含10％蔗糖的LB平板上划线接种NB2011/pCVD442:ΔExoU，培养至单克隆形成，通过PCR技术筛选鉴定获得ExoU基因被Kan抗性基因取代的克隆，命名为NB2011ΔExoU:Kan，即得到保藏号为CGMCC No.12430的杀香鱼假单胞菌型ExoU基因敲除突变株，简称NB2011ΔExoU。
3.根据权利要求2所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU的构建方法，其特征在于所述的基因敲除载体pCVD::ExoU的构建包含如下步骤：
(a)卡那霉素抗性基因盒KanR的克隆：以Kan-F/Kan-R为特异引物，以提取的pKD4质粒DNA为模板扩增得到卡那霉素抗性基因盒KanR；
(b)ExoU上、下游同源片段的扩增：分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩增得到5’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU上游DNA序列片段FA和3’端含Sma I酶切位点的目的基因ExoU下游DNA序列片段RA；
(c)基因打靶片段的融合：ExoU基因上、下游同源重组臂和卡那霉素抗性基因表达框扩增产物经电泳、割胶纯化，以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，进行融合PCR反应，获得融合打靶片段FA-KanR-RA；
(d)打靶载体pCVD442:ExoU的构建：酚/氯仿法提取pCVD442质粒，溶于200μl TE缓冲液中，该TE缓冲液包含10mM Tris和pH为8.0的0.1mM EDTA；融合PCR产物经酚/氯仿处理后，异丙醇沉淀，并溶解于40μl去离子水；pCVD442质粒和融合PCR产物经SamⅠ酶切，酶切产物电泳，割胶纯化后建立连接反应，连接产物经异丙醇沉淀后，70％乙醇洗涤，溶解于5μl去离子水；通过电转化方法将其转入大肠杆菌DH5αλpir，在含25μg/ml Kan的LB平板上于37℃培养至单克隆形成，挑选生长良好的克隆，接种入5ml含Amp50μg/ml和Kan25μg/ml的LB培养基，37℃培养过夜，次日离心柱法提取质粒，此质粒即为打靶载体pCVD442:ExoU。
4.根据权利要求1所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011ΔExoU在制备杀香鱼假单胞菌减毒疫苗中的应用。
5.根据权利要求1中所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因突变株NB2011ΔExoU在制备减毒疫苗中的应用，其中所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株通过如下方法获得：
(a)在LB平板上划线接种受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011，30℃培养至单克隆形成，挑单克隆入5ml LB；挑β2155/pCVD442:ΔExoU单克隆入5ml LB含Amp25μg/ml，30℃，220rpm培养过夜；
(b)取500μl供体菌β2155/pCVD442:ΔExoU菌液与1000μl受体菌的菌液按照体积比为1：2混合，该受体菌为杀香鱼假单胞菌NB2011，轻轻吹打混合后，6000rpm离心5min，收集菌体，以无抗性LB培养液洗涤1次，该无抗性LB培养液含0.5mM二氨基庚二酸(DAP)，菌体重悬于1ml含0.5mM DAP的LB培养液中，取100μl铺到0.22μm无菌滤膜上，30℃培养过夜，次日，滤膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗脱，取40μl菌液涂布于含有25μg/ml Kan的LB平板，30℃培养过夜；在Kan抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用外侧引物ExoU-outF/ExoU-outR进行PCR检测，ExoU-outF/ExoU-outR的序列如SEQ IDNO.11，12所示；选择扩增产物为弱或无扩增的克隆，此类克隆为ExoU基因打靶质粒一次重组克隆，需在蔗糖平板上继续进行二次重组克隆的筛选；
(c)取NB2011/pCVD442:ΔExoU菌液划线接种LB蔗糖平板，该LB蔗糖平板含10％的蔗糖且无氯化钠，30℃培养至单克隆形成；随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用外侧引物进行PCR检测；选择出现明亮的特异条带扩增的克隆，此克隆应为发生二次重组；再利用ExoU内部引物ExoU-inF/ExoU-inR进行PCR检测，ExoU-inF/ExoU-inR序列如SEQ ID NO.13，14所示；PCR验证的结果为阴性，因此可以判断此克隆为ExoU基因被卡那霉素抗性基因取代的克隆，命名为NB2011/ΔExoU:Kan，简写NB2011ΔExoU。
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