CN104784684B - 一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌减毒活疫苗及构建方法 - Google Patents
一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌减毒活疫苗及构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌减毒活疫苗及构建方法。本发明将野生型约氏黄杆菌通过链霉素连续传代诱导突变致其毒力减弱，得到约氏黄杆菌减毒突变株M170，利用该减毒株制备的活疫苗通过注射、浸泡免疫草鱼、鳜鱼等免疫保护率均可达73.1%以上，免疫保护期达8个月以上，具有免疫剂量小、效价高、保护率高、保护期长等优点，且可通过浸泡方式进行免疫，可预防草鱼、鳜鱼等细菌性烂鳃病的发生，具有良好应用价值和广阔市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）减毒活疫苗及构建方法。
背景技术
中国是水产养殖大国，水产养殖产量占全球总产量的70%。随着我国水产养殖业的快速发展，养殖规模的扩大以及单位产量的提高，病害问题日益凸显。其中由黄杆菌引起的细菌性烂鳃病是水产养殖中最常见的疾病之一，具有危害养殖品种多、发病率高、发病范围广、流行时间长等特点，每年给我国水产养殖业带来严重的经济损失，打击了渔民的生产积极性，带来药物残留等水产品质量安全问题，制约了我国水产养殖业的可持续健康发展。
目前国内对于鱼类细菌性烂鳃病主要采用消毒剂、抗生素等化学药物进行治疗，然而化学药物的大量使用，导致耐药菌株的出现，对水产品质量安全和生态安全造成不利影响。疫苗免疫接种作为符合环境友好和可持续发展战略的病害防控措施，已成为国际现代水产养殖业的标准生产规范内容之一。黄杆菌主要寄生在鱼体的鳃组织, 鱼体的防御作用主要通过局部的粘膜免疫来实现, 而灭活疫苗、亚单位疫苗等由于缺乏主动粘附能力,故其免疫效果不确定，因此黄杆菌减毒活疫苗成为鱼类细菌性烂鳃病疫苗研发的重点。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种约氏黄杆菌减毒活疫苗。
本发明的另一个目的在于提供一种约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法。
本发明的另一个目的在于提供上述约氏黄杆菌减毒活疫苗的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种约氏黄杆菌减毒突变株的构建方法，将约氏黄杆菌野生株M168在含逐渐升高浓度的链霉素的培养基中培养，直至培养到培养基中链霉素浓度为128μg/mL，所得转化菌株为约氏黄杆菌减毒突变株。
一种约氏黄杆菌减毒突变株的构建方法，将约氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋白的86位点由精氨酸突变为色氨酸。优选将约氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋白的86位点的密码子由AGG突变为TGG。
所述约氏黄杆菌野生株为约氏黄杆菌野生株M168。
由以上所述的方法制备得到的氏黄杆菌减毒活疫苗。
约氏黄杆菌减毒突变株M170，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015112，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
以上约氏黄杆菌减毒突变株在制备预防鱼类烂鳃病制剂中应用。
一种用于预防鱼类烂鳃病的疫苗制剂，其含有以上所述的约氏黄杆菌减毒突变株。
本发明的有益效果是：
本发明采用链霉素连续传代诱导，建立了一种鱼类烂鳃病病原黄杆菌减毒活疫苗构建方法。采用该方法制备得到的约氏黄杆菌减毒活疫苗，具有免疫剂量小、效价高、保护率高、保护期长等优点，且可通过浸泡方式进行免疫，可预防草鱼、鳜鱼等细菌性烂鳃病的发生，具有良好应用价值和广阔市场前景。
附图说明
图1为两株约氏黄杆菌的溶血活性实验结果图；
图2为约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫鳜鱼后溶菌酶基因表达动力学图；
图3为约氏黄杆菌疫苗免疫草后抗体滴度动力学图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
一、约氏黄杆菌减毒突变株的诱导
从患烂鳃病的淡水鱼中分离病原约氏黄杆菌菌株（M168），经平板划线纯化培养后用灭菌等渗盐水将菌液浓度调整成107CFU / mL备用。在M-H肉汤培养基中分别添加0.005、0.01、0.02、0.03、0.06、0.13、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128μg / mL的链霉素，配制成不同链霉素浓度的培养基。取10μL上面制备的菌悬液接种于2 mL含 0.005μg / mL链霉素的肉汤培养基中，28℃温育24 h后如有细菌生长，将其转接于含 0.01 μg/mL 链霉素的培养基中，28℃ 温育24 h后如有细菌生长，转接下一浓度链霉素培养基中，如未见细菌生长，在上一浓度链霉素培养基中继续培养，直至能在下一浓度中链霉素培养基中可以生长，如此反复，最终诱导获得能在链霉素浓度为128μg/mL培养基中稳定生长的约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）减毒突变株M170。将其保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC），地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015112，保藏日期为2015年3月15日。
每传代一次采用PCR方法对菌株rpsL基因变异情况进行监测，结果显示当传代至链霉素浓度为32μg/mL时rpsL基因编码86位氨基酸由精氨酸突变为色氨酸（R86W）。
二、约氏黄杆菌减毒突变株的性状鉴定及分子生物学信息
1、胞外产物的制备及胞外酶活性检测
分别挑取斜面保存的菌株M168和菌株M170的单菌落接种于CYE液体培养基中，置于恒温培养箱中，摇床（180r/min）培养20h。4℃下10000r/min离心30min，上清液经孔径为0.22µm微孔滤膜过滤，获得约氏黄杆菌ECP（Extracellular product，ECP），4℃冰箱保存备用。
分别用蒸馏水配制含脱脂牛奶（10%）、酪蛋白（1%）、明胶（1.0%）、蛋黄（2.5%）、可溶性淀粉（0.2%）、吐温80（1.0%）、尿素（2.0%）酚红指示剂等7种琼脂平板（pH值7.5）。平板打孔后分别加入20µL 2种约氏黄杆菌的ECP，加等量生理盐水（0.65%）作阴性对照，每个处理设3个重复。放入湿盒28℃恒温孵育48h。向脱脂牛奶平板和酪蛋白平板中加入 10 % (w/ v)三氯乙酸溶液，向明胶平板中加入0.1mol/L酸性氯化汞溶液，向可溶性淀粉平板中加入鲁哥氏碘液，以出现透明圈（脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、可溶性淀粉平板）或者无透明圈（蛋黄、吐温80平板）或者红色（尿素平板）者为阳性反应。
在培养相同时间后，两株约氏黄杆菌酶活实验结果表明，菌株M168和M170菌有蛋白酶、酪蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性，无卵磷脂酶活性；菌株M168还具有脲酶活性，而菌株M170无脲酶活性。2株菌的酶活性圈大小也有一定的差别，具体见表1。
表1 菌株M168和M170保外产物酶活性比较
2、溶血性检测
测定约氏黄杆菌胞外产物对羊红细胞溶血活性。将配制好的羊血琼脂平板打孔后，加入20µL ECP，以等量生理盐水（0.65%）作为阴性对照，每个处理设3个重复。放入湿盒28℃恒温孵育48h。观察溶血结果。
两株约氏黄杆菌的胞外产物在绵羊血平板上28℃作用24h-48h后，菌株M168孔周围可见明显的溶血环，大小约为2.55cm，菌株M170孔周围有大约0.21cm溶血环，见图1。
3、分子生物学信息
经测序得知，M170株与M168株 16S rRNA 序列完全一致，如SEQ ID NO.1所示。M168株rps L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。M170株rps L基因编码蛋白的86位点的密码子由AGG突变为TGG。如SEQ ID NO.3所示。
三、约氏黄杆菌减毒突变株致病力评价
（1）浸泡感染毒力评价
分别将约氏黄杆菌减毒突变株（M170）和野生毒力株（M168）接种于0.5%胰蛋白胨平板，28℃培养48h，再将其转接到0.5%胰蛋白胨液体培养基中，28℃培养24h，将细菌浓度调整成表2所示浓度，将健康草鱼（每组20尾）在菌悬液中浸泡30min后，转到清洁水族箱中饲养，连续观察15天，记录鱼体发病与死亡情况。结果表明（见表1）不同浓度的诱导突变株（M170）浸泡感染后，草鱼活动和摄食情况正常，无发病症状，未见死亡情况。而野生毒力株（M168）各浓度浸泡组草鱼表现为活动缓慢，鳃丝末端溃烂，粘液增多，鳃丝及体表粘附有大量的混合物，草鱼死亡率与浸泡浓度存在正相关，采用寇氏法计算得到野生毒力株（M168）对草鱼的半致死浓度（LC50）为4.5×105CFU/mL。而PBS对照组无异常。以上结果表明约氏黄杆菌诱导突变株（M170）相对于野生毒力株（M168）致病力消失，可作为疫苗株制备约氏黄杆菌减毒活疫苗。
表2. 约氏黄杆菌诱导突变株和野生强毒株致病力试验
（2）注射感染毒力评价
分别将诱导约氏黄杆菌突变株以1×109CFU/尾、1×108CFU/尾、1×107CFU/尾、1×106CFU/尾剂量注射感染健康草鱼30尾，饲养于水族箱中，观察鱼体活动和摄食情况，试验期间（连续30天）鱼体活动和摄食正常，无发病症状，未见死亡情况发生，表明约氏黄杆菌诱导突变株（M170）通过注射感染无致病力，用于疫苗株制备减毒活疫苗对鱼体是安全的。
四、约氏黄杆菌减毒突变株毒力返强试验
将诱导约氏黄杆菌突变株M170通过注射（1×109CFU/尾）和浸泡（1×109CFU/mL，30min）感染草鱼（约10g），每组10尾鱼，饲养于水族箱中，每天观察鱼体活动和摄食情况。感染后3天，每组取3尾鱼，采用0.5%胰蛋白胨培养基（含50 ug/mL链霉素）分别从肝脾肾鳃等组织中分离细菌，并将其肝脾肾鳃等组织加等量灭菌生理盐水进行研磨，普通滤纸去除组织碎片等，取滤液以0.1mL剂量注射健康草鱼10尾，每天观察鱼体活动和摄食情况。同样，感染后3天，每组取3尾鱼，采用0.5%胰蛋白胨培养基（含128μg / mL链霉素）分别从肝脾肾鳃等组织中分离细菌，并取其肝脾肾鳃等组织加等量灭菌生理盐水进行研磨后普通滤纸去除组织碎片，取滤液以0.1mL剂量再注射健康草鱼10尾，每天观察鱼体活动和摄食情况，如此反复传代5次。结果表明，整个试验期间（30天），所有供试鱼活动和摄食情况正常，首次感染后3天能从注射感染草鱼肝脏和浸泡感染草鱼鳃中分离到少量约氏黄杆菌，第二次传代感染后，草鱼肝脾肾鳃等组织均未能分离到约氏黄杆菌。以上结果表明诱导突变株不存在毒力返强现象。
五、约氏黄杆菌减毒活疫苗免疫效果评价
将约氏黄杆菌减毒突变株（M170）接种于0.5%胰蛋白胨平板，28℃培养48h，再将其转接到0.5%胰蛋白胨液体培养基中，28℃培养24h，将细菌浓度调整为1010CFU/ml，制备成约氏黄杆菌减毒活疫苗，并采用约氏黄杆菌M168株制备灭活疫苗作为对照，约氏黄杆菌活疫苗（M170株）浸泡免疫鳜鱼，草鱼采用注射、浸泡2种方式进行免疫。鳜鱼免疫试验结果表明，黄杆菌活疫苗（M170株）浸泡免疫后48h肝脏中溶菌酶基因表达量达到最高（图2），免疫后28d采用野生型黄杆菌M168株进行攻毒，免疫保护率达85.9%（表3）。草鱼免疫试验结果表明，黄杆菌活疫苗（M170株）免疫后获得比黄杆菌灭活疫苗（M168株）更高的免疫效价，且持续时间更长（图3），免疫后28d采用野生型黄杆菌M168株进行攻毒, 黄杆菌活疫苗（M170株）的注射、浸泡免疫保护率分别为100%和73.1%，高于黄杆菌灭活疫苗（M168株）的82.1%和42.3%（表4），免疫后8个月（237天）采用野生型黄杆菌M168株进行攻毒其注射、浸泡相对免疫保护率分别为60%和34.8%（见表5），表明黄杆菌活疫苗注射免疫保护期可达8个月以上。
表3. 约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜鱼的免疫保护效果
表4. 约氏黄杆菌减毒活疫苗对草鱼的免疫保护效果
表5. 约氏黄杆菌减毒活疫苗对草鱼注射、浸泡免疫保护期试验
以上试验结果表明：本发明制备得到的约氏黄杆菌减毒活疫苗，具有免疫剂量小、效价高、保护率高、保护期长等优点。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 一种鱼类烂鳃病病原约氏黄杆菌减毒活疫苗及构建方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> Flavobacterium johnsoniae
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Claims (7)
1.一种约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，将约氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋白的86位点由精氨酸突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，将约氏黄杆菌野生株rpsL基因编码蛋白的86位点的密码子由AGG突变为TGG。
3.根据权利要求1或2所述的约氏黄杆菌减毒活疫苗的构建方法，其特征在于，所述约氏黄杆菌野生株为约氏黄杆菌野生株M168。
4.约氏黄杆菌减毒活疫苗，其特征在于，其是由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的。
5.约氏黄杆菌减毒突变株M170，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015112，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
6.权利要求4所述的约氏黄杆菌减毒活疫苗或权利要求5所述的约氏黄杆菌减毒突变株M170在制备预防鱼类烂鳃病制剂中应用。
7.一种用于预防鱼类烂鳃病的疫苗制剂，其含有权利要求4所述的约氏黄杆菌减毒活疫苗或权利要求5所述的约氏黄杆菌减毒突变株M170，或者含有由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的约氏黄杆菌减毒活疫苗。
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| TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列;刘礼辉等;《安徽农业科学》;20101231;第38卷(第32期);18074-18076 * |
| 约氏黄杆菌研究进展;胡钱东等;《生命科学研究》;20140228;第18卷(第1期);60-65 * |
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