CN102296044B

CN102296044B - 一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用

Info

Publication number: CN102296044B
Application number: CN 201110266453
Authority: CN
Inventors: 王启要; 刘欢; 张元兴; 刘琴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2011-09-08
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2031-09-08
Also published as: CN101948791A; CN102296044A

Abstract

本发明涉及一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，它是溶藻弧菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侣蛋白基因hfq，溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏号为：CCTCC NO：AB 209306，还提供了上述溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，及相关的在防治养殖鱼类的溶藻弧菌病中应用，本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株或相关制剂消除了传统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的溶藻弧菌病的一种安全、有效、经济的疫苗。

Description

一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用

技术领域

本发明涉及减毒突变株技术领域，特别涉及鱼用细菌性减毒活疫苗技术领域，具体是指一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用。

背景技术

随着世界人口的不断增长及人类对海产品需求的持续增强与天然渔业资源的日益枯竭这对矛盾的日益突出，水产养殖作为一种传统产业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中突现出其重要地位。据统计，2002年我国水产品总量占全球总产量的71％和总产值的49.8％，居世界第一位。据农业部统计，2009年我国的水产品总产量达5120万吨，同比增长4.5％左右，其中，养殖水产品产量3635万吨。水产品总量连续20年位居世界第一位，连续7年成为世界第一水产品出口国。但是，由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量难以实现持续发展。因此，规模化、集约化、高密度养殖模式已成为我国鱼类养殖业的主要发展方向。然而，伴随着渔业养殖的稳步发展，随之而来的便是各种水产养殖病害问题。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30％以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。

为了防治各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法曾发挥了积极作用。但是，由于盲目投药，过量用药，不但污染了水质，增强了病原体的抗药性，提高了养殖成本，还直接危害到人类健康。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易市场。日本也开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。

2002-2006年，我国水产品及制品出口保持了年均14.8％的增速。但是自2007年以来，由于国内渔业生产成本上升、质量安全问题受到关注，以及日美欧等主要进口市场提高了进口的技术门槛，导致我水产品出口频频受阻。2008年中国水产品出口量为296.5万吨，同比下降3.2％，水产品出口量只占国内生产量6.1％。一个主要的制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标严重，对中国水产品质量信用造成严重的负面影响，成为扩大出口的主要障碍。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。

为了实现海水养殖业的可持续发展，遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的发展趋势，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验(OrmondeP.Fisheries resources：trends in production，utilization and trade.In：Nomura I(ed.).The State ofWorld Fishery and Agriculture2002.Rome：FAO Information Division，2002，p3～p45)，倡导“系统管理途径”(System management approaches，SMA)养殖模式预防各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。

目前，接种疫苗因其安全性，可靠性和持久性，已成为世界范围内防治水产养殖病害发生及暴发的主要手段。疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能被水产养殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了阻碍。

水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。

弧菌是引起海水养殖鱼类细菌性疾病危害的一种重要的病原体，可导致鱼类弧菌病(Vibriosis)，具有地域广，周期长，发生温度范围大等特点，且危害种类多，包括鲆类，鲽类，鲈科等多种海洋鱼类。目前，我国海水养殖产业中危害比较严重的病原菌主要为溶藻弧菌(Vibrio algnolyticus)，鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。其中溶藻弧菌是我国南方水产养殖鱼类弧菌病爆发的主要病原体，危害的鱼类主要有石斑鱼和大黄鱼等；而鳗弧菌则为北方水产养殖鱼类弧菌病的主要病原体，危害的鱼类包括牙鲆，大菱鲆，真鲷和鲈鱼等名贵经济鱼种。目前弧菌病在我国尚无有效的防治方法。

溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量位居海水类弧菌之首，也是我国南方海水养殖中鱼，虾，贝类等海水养殖动物弧菌病暴发的主要病原菌，导致被感染鱼体表发白，感染部位，尾部及鳍末端充血，发炎，严重时感染部位溃烂，并能引起内脏器官充血肿大，给水产养殖业带来巨大的经济损失。值得注意的是溶藻弧菌还会对人类带来威胁，可以引发创伤面感染，腹泻以及中耳炎等。目前对于溶藻弧菌的致病机理研究尚处于探索阶段，已鉴定的毒力相关因子包括胞外蛋白酶类、脂多糖、鞭毛和铁摄取相关系统等。

目前国内用专利报道利用病原菌外膜蛋白及抗菌肽构建的亚单位疫苗对多种弧菌具有防治作用(吴灶和，庞欢瑛，姚绍云，简纪常，2007，海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备和使用方法；中国专利200610124342.X)。但由于亚单位疫苗不具有感染性，只能采取注射给药的方式进行免疫，而不能通过浸泡的方式给药，操作不便。且由于其只具有病原体的一种或几种抗原，而不含有病原体的其他抗原和遗传信息，仅利用单一的抗原分子诱导免疫反应，免疫效果不及活疫苗。此外，亚单位疫苗需要辅以佐剂，免疫剂量及成本相对较高，效果较差。

基因无标记缺失减毒疫苗构建技术是目前国际上新兴起的活疫苗开发领域，是疫苗开发的国际前沿领域与主要发展方向之一，所开发的疫苗家具有可靠的产品和环境安全性。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜在价值，也成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。

本发明涉及的溶藻弧菌野生毒株EPGS020401从我国福建省厦门养殖渔场内爆发的弧菌病的病鱼体内分离得到，是一种毒性的溶藻弧菌菌株，于2009年10月24日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：AB 209306。在利用Tn5转座子构建含有约12000个突变株的溶藻弧菌突变体文库中(Qiyao Wang et al.Isolation，sequencing andcharacterization of cluster genes involved in the biosynthesis and transportation of the siderophoreofmarine fish pathogen Vibrio alginolyticus.Arch Microbiol.2007，188：433-439)，用CAS平板检测限铁环境下铁载体产量变化时筛选到一株铁载体产量明显下降的插入失活菌株，经过测序及比对鉴定插入部位为sRNA分子伴侣蛋白Hfq，其编码基因即hfq基因大小为264bp。sRNA是一类长度在40-400个核苷酸，广泛存在于从细菌到哺乳动物等不同生物体内，执行多种生物学功能的非编码RNA分子。同真核生物一样，原核生物中的sRNA绝大多数也是通过与靶标mRNA配对来影响其稳定性或翻译，进而对细胞的各种生理功能进行调控。Hfq蛋白作为sRNA的伴侣分子，通过改变sRNA分子和/或靶标mRNA分子的构象折叠而促进两者之间的配对。Hfq广泛存在于真核生物和原核生物体内，具有较高的保守性，作为一个转录后调控因子，协同sRNA分子通过碱基配对的方式与多种靶标mRNA进行结合，影响其稳定性或翻译，对于生物的多种生理功能具有重要的调控作用(Fantappie`L.et al.The RNA chaperone Hfqis involved in stress response and virulence in Neisseria meningitidis and is a pleiotropic regulatorof protein expression.Infect Immun，2009，77：1842-1853；Sittka et al.The RNA chaperone Hfq isessential for the virulence of Salmonella typhimurium.Mol Microbiol，2007，63：193-217.2007)。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用，该减毒突变株或相关制剂消除了传统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的溶藻弧菌病的一种安全、有效、经济的疫苗。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，其特点是，它是溶藻弧菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侣蛋白基因hfq。因此，减毒突变株不携带任何抗生素抗性标记和其它标记，无任何外源性基因片段。

所述溶藻弧菌毒株可以是任何合适的溶藻弧菌毒株。较佳地，所述溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏号为：CCTCC NO：AB 209306。

在本发明中，减毒疫苗株培养的培养基可选用LB培养基，其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨，胰蛋白胨或大豆蛋白胨，补加NaCl至3％，本发明的具体实施例选用了胰蛋白胨。

在本发明的第二方面，还提供了一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，其特点是，包括上述的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株和在药理上可接受的配体。

所述无标记基因缺失减毒突变株的菌体细胞浓度可以任意。较佳地，所述无标记基因缺失减毒突变株的菌体细胞浓度为10⁶～10⁹CFU/ml。

所述配体可以是任何合适的配套。较佳地，所述配体是无菌生理盐水。其配方可以是：NaCl9g/L，pH为7.2。

在本发明的第三方面，还提供了上述的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株或上述的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂在防治养殖鱼类的溶藻弧菌病中的应用。

所述无标记基因缺失减毒突变株或所述制剂可以采用任何合适的方式及合适的剂量给药。较佳地，所述无标记基因缺失减毒突变株或所述制剂通过注射方式给药，其中菌体细胞浓度为10⁴～10⁶CFU/ml。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株缺失了sRNA分子伴侣蛋白基因hfq，相对于其野生毒株EPGS020401具有明显的低毒性，可有效地保护鱼类免受溶藻弧菌病致病株溶藻弧菌的侵害，免疫效果显著，具有非常好的水产养殖中溶藻弧菌病的防治效果；

2、本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株不携带任何抗生素抗性标记和其它标记，对环境不存在传播抗生素抗性的潜在危险；无任何外源性基因片段，毒力相关基因大片段缺失，毒力不可回复，极大消除向环境传播大量毒性病原体的可能性，具有技术上的环境和产品安全性，有实际的商业开发应用价值；

3、本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的突变的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境安全性和可控性；

4、本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株为无标记基因缺失减毒活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。

附图说明

图1是本发明采用Overlap PCR方法扩增获得hfq基因缺失片段F1F2的流程图。

图2是本发明利用图1所示方法获得的hfq基因缺失片段F1F2构建自杀质粒pDM4并筛选获得hfq基因缺失菌株流程图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实施例1无标记基因缺失减毒突变株的构建

(一)hfq基因缺失菌株的构建

1)PCR扩增获得所需基因片段

如图1所示，以溶藻弧菌毒株EPGS020401(保藏号为：CCTCC NO：AB 209306)的基因组为模版，利用下列扩增引物：

P1(TTAGTCGACCCGACAGATGTGGGAGTATTTAGAT)，

P2(TGTGGACGCTCGTCTTGTAGAGATTGCCCCTTAGCC)，

P3(CTCTACAAGACGAGCGTCCACAAGAGAAATCTGAAG)，

P4(GCTACTAGTGATATCGAGAATAAGACCAGTGCGG)，

首先分别用P1和P2、P3和P4扩增获得Overlap PCR所需的上下片段F1，F2。回收各片段后，利用Overlap PCR技术采用P1和P4获得hfq缺失片段F1F2。

2)回收各片段

从所要研究的对象上回收目标基因片段，采用TIANGEN公司的胶回收试剂盒。琼脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装入Eppendorf管并称取重量，加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；将得到的溶液加入吸附柱中离心(12,000rpm离心30sec)，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，再用500μl漂洗液PW12,000rpm离心30sec，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量出去漂洗液，再将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干后，将其放到一个干净地离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加不少于30μl的洗脱缓冲液EB buffer，室温放置2min，12,000rpm离心1min收集含目的片段的DNA溶液，电泳检测回收DNA浓度。

3)构建自杀工具质粒

将pDM4载体(Wang et al.A ToxR homolog from Vibrio anguillarum serotype O1 regulatesits own production，bile resistance，and bioWlm formation.J Bacteriol，2002，184：1630-1639)多克隆位点的SalI位点和SpeI位点切开后，将目的片段F1F2与切割后的质粒用T4DNA连接酶16℃连接过夜。CaCl₂转化法转化SM10，得到质粒载体pDM4hfq。

4)接合

将携带有pDM4hfq质粒的SM10按体积比3比1的比率与野生菌株EPGS020401混合离心，去除上清液，用50微升新鲜含1％NaCl的LB培养基重悬沉淀。将0.22微米灭菌后的水性滤膜平整铺放在新鲜半固体含1％NaCl的LB培养基上，取出全部菌悬液点置于水性膜中央。30摄氏度培养12小时后，用0.2M的MgCl₂将水性膜上的菌落洗脱下，涂布于氯霉素，氨苄青霉素双重抗性平板。

5)正向筛选hfq基因插入失活克隆

如图2所示，自杀质粒pDM4hfq插入到基因组上hfq基因中。利用氯霉素，氨苄青霉素双重抗性平板筛选，及以P1/P4为引物的PCR扩增可获得hfq基因插入失活的克隆。

6)筛选hfq基因缺失菌株

如图2所示，在20％蔗糖LB半固体培养基平板上，利用pDM4上SacB基因可反向筛选获得发生第二次同源重组的菌株。以引物P1，P4通过PCR验证可获得缺失突变菌株，命名为hfq缺失突变株。

(二)减毒活疫苗制备

培养基与生理盐水组成：

1)LB斜面培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，琼脂15g/L，pH7.5；

2)种子培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，pH7.5；

3)发酵培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 30g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，pH6.8；

4)生理盐水：NaCl 9g/L，pH7.2，121℃灭菌20分钟。

疫苗制备：取一接种环保存于LB斜面培养基上的减毒疫苗株种子，接种于装有100ml液体LB种子培养基的500ml摇瓶，在30℃下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(O.D＝4.0左右)接种于100ml新鲜发酵培养基，30℃培养9小时。用无菌生理盐水洗涤3次，离心收获菌体(2000×g，15分钟，15℃)，无菌生理盐水稀释成一定浓度悬液(10⁶-10⁹CFU/ml)，保藏于15℃备用。

实施例2：以斑马鱼(Danio rerio)为试验动物的半致死量LD₅₀测定：

试验用鱼先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以剔出不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(Challenge Lab)中0.5L感染试验水槽，继续喂养1周，每槽放养10条(平均体长2.5-3cm，体重0.2g)。试验水槽每天使用无菌陈水替换1/2体积养殖水，水温28℃，上下波动2℃。

将试验用鱼随机分组，每组2个水槽平行试验。在感染试验中，每组试验鱼用一定梯度剂量(10²-10⁷CFU/尾)的溶藻弧菌野生毒株和减毒疫苗株通过尾部肌肉注射进行人工感染。记录10天内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD₅₀值，取三组试验的平均值(见表1)。

表1溶藻弧菌毒株EPGS020401和减毒株对斑马鱼的LD₅₀

感染菌株	LD₅₀	备注
			EPGS020401	9.5×10⁴CFU/ml	2天达到半数致死
hfq基因缺失疫苗	1.6×10⁶CFU/ml	试验浓度(10²-10⁵CFU/ml)均未达到半数致死

注：以上数据为2组独立平行试验平均值。

上述结果表明，所有减毒株相对于溶藻弧菌野生毒株具有明显的减毒效应，在所试验浓度范围内对斑马鱼基本无毒。

实施例3：以斑马鱼为试验动物的注射给药免疫保护试验

试验斑马鱼随机分为3组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用肌肉注射方式免疫。注射免疫剂量为7×10⁵CFU/g，肌肉注射试验斑马鱼。对照组注射无菌生理盐水。免疫4周后将各组免疫斑马鱼用溶藻弧菌野生毒株活菌(肌肉注射感染5×10⁵CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫死亡数计算每组的免疫保护率(见表2)。

其中，按下列公式计算免疫保护率：免疫保护率％＝(对照组死亡率-免疫组死亡率％)/对照组死亡率×100％。

表2溶藻弧菌减毒活疫苗注射免疫斑马鱼4周后攻毒的免疫保护试验

从上述数据可以看出，该减毒疫苗具有良好的溶藻弧菌野生毒株感染防治效果，注射免疫4周后的免疫保护率高于70％，而没有接种疫苗的鱼类死亡率高达93.3％，说明本发明疫苗具有明显的减毒效果和良好的免疫保护力，可以用于制备鱼类活菌疫苗的制剂。

本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株缺失sRNA分子伴侣蛋白基因hfq，缺失上述基因片段可影响溶藻弧菌野生毒株的运动能力，胞外蛋白酶合成以及对环境应激的响应能力等多种生理功能，从而导致溶藻弧菌野生毒株大大减毒和其在自然环境和鱼体宿主内的定殖能力，实现减毒目的。

综上，本发明的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株或相关制剂消除了传统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的溶藻弧菌病的一种安全、有效、经济的疫苗。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，其特征在于，它是溶藻弧菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侣蛋白基因hfq，所述溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏号为：CCTCC No.AB209306。

2.一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，其特征在于，包括根据权利要求1所述的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株和在药理上可接受的配体。

3.根据权利要求2所述的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，其特征在于，所述无标记基因缺失减毒突变株的菌体细胞浓度为10⁶～10⁹CFU/ml。

4.根据权利要求2所述的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，其特征在于，所述配体是无菌生理盐水。