CN1644680A - 一种鳗弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株及应用 - Google Patents

一种鳗弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种新型的用于养殖鱼类弧菌病防治的细菌性多效价减毒活疫苗。该疫苗主要以鳗弧菌无标记基因缺失减毒株组成，减毒株相对于其野生毒株MVM425具有明显的低毒性，但仍然保持了对鳗弧菌野生毒株的免疫原性，同时，该疫苗株对溶藻弧菌也具有很好的交叉免疫保护性。由其制备的减毒活疫苗可有效地防治鳗弧菌和溶藻弧菌野生毒株引发的试验用鱼弧菌病侵害。

Description

一种鳗弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株及应用
                                技术领域
本发明为水产养殖动物病害防治技术，涉及水产养殖鱼用细菌性多效价减毒活疫苗，具体的说是防治鳗弧菌和溶藻弧菌弧菌病的鳗弧菌(Vibiro anguillarum)多效价减毒活疫苗。
                                背景技术
鉴于世界人口的不断增长及天然渔业的日渐枯竭，水产养殖业显得日益重要。预计到2010年，我国的海水鱼类养殖产量将达到50万吨，才能满足人们对海水鱼产品的需求。由于水土资源有限，从提高养殖面积来增加产量难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度养殖模式逐渐成为我国海水鱼类养殖业的发展主流。然而随着海水养殖业的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖的产量及成长造成严重影响。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、暴发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30％以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。
针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易市场。日本也已开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。
作为世界上的水产养殖大国，我国的海水养殖品出口量只占到了养殖总量的6％左右，一个主要的制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标严重，成为扩大出口的主要障碍。近几年我国水产品出口因质量安全问题受到欧盟、日本等国家和地区的限制。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。
为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日趋严重的发展趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验(Ormonde P.Fisheries resources：trends in production，utilization and trade.In：Nomura I(ed.).The State of World Fishery and Agriculture 2002.Rome：FAO Information Division，2002，p3-45.)，倡导“系统管理途径”(System management approaches，SMA)养殖模式预防各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。
疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原细菌细胞灭活体为基本形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能为水产养殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了阻碍。
水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减毒活菌疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。
弧菌是导致海水养殖鱼类细菌性疾病的一种最为常见的病原体，可导致鱼类弧菌病(Vibriosis)。其发生温度范围大，季节长，地域广，危害的种类多，有鲈科、鲻科、鲀科以及鲆、鲽类等大多数海水鱼类。目前，我国养殖鱼类弧菌病病害比较严重的病原体主要为鳗弧菌(Vibiro anguillarum)、溶藻弧菌(Vibiro alginolyticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。其中，鳗弧菌主要严重危害我国北方水产养殖鱼类中的鲆类(如牙鲆和大菱鲆)、鲷类(如真鲷)和鲈鱼等名贵经济鱼种；溶藻弧菌在我国南方主要养殖经济鱼类中(如石斑鱼和大黄鱼等)为主要弧菌病病原体。这些弧菌病危害大、流行速度较快，目前在我国尚无有效的防治措施。
鳗弧菌主要导致养殖鱼类的出血性败血病，其主要致病毒力因子为鳗弧菌含有的pJM1类质粒编码的铁摄取系统(Wu H.，Ma Y.，et al.Complete sequences of virulenceplasmid pEIB1 from the marine fish pathogen Vibiro anguillarum strain MVM425 andlocation of its replication region.Journal of Applied Microbiology，2004，97：11021-1028)。国外已开发成功并商业化用于防治鳗弧菌弧菌病的灭活疫苗( http：//ag.ansc.purdue.edu/aquanic/index.htm)。由于养殖鱼类多同时遭受多种弧菌病原体的侵害，所以，在国外，弧菌病疫苗多以几种弧菌病病原体的灭活联苗产品居多。目前，我国未见任何形式的以鳗弧菌为主要防治对象的商品化弧菌病疫苗。美国专利有利用转座子插入突变技术构建鳗弧菌减毒活疫苗的报道(United State Patent5,284,653)。国内外(除本发明前期申请中国发明专利外)未见其它任何形式的鳗弧菌减毒活疫苗开发文献报道。
使用转座子等基因重组构建技术开发的减毒活疫苗含有抗生素抗性标记和外源基因片段，可能在使用时传播到其它病原体内，具有先天性的潜在环境危害风险。毒力易回复和不可控的环境传播风险是该种疫苗应用所必须重视和解决的。鉴于此，该类减毒疫苗被包括中国在内的各国生物制品安全检查管理机构审批法规认定为具有较高环境安全风险的生物制品而难以进入商业化开发进程。
基因无标记缺失减毒疫苗构建技术是目前国际上新兴起的活疫苗开发领域，是疫苗开发的国际前沿领域与主要发展方向之一，所开发的疫苗具有可靠的产品和环境安全性。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜在价值，也已成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。
本发明的鳗弧菌野生毒株MVM425从我国黄海海域养殖渔场内爆发性弧菌病的病鱼体内分离得到，是一种强弧菌病致病株(Vibrio anguillarum MVM425，马悦等，“海洋鱼类弧菌病疫苗的制备——新型简易鳗弧菌培养基优化”，《高技术通讯》Vol.11(7)，2001)。该野生毒株染色体含有芳香氨基酸代谢途径合成基因aroC(Q.Chen，et al.Chromosome-mediated 2，3-Dihydroxybenzoic acid is a prescursor in the biosynthesis of theplasmid-mediated siderophore anguibactin in Vibrio anguillarum.J.Bacteriol.1994，176：4226-4234)，该基因缺失突变株表现为芳香氨基酸营养缺陷型表征。已证实，该毒株携带有pEIB1毒性质粒，并已完成了其全序列测定工作(Genbank登录号AY255699)，该质粒属于pJM1类野生的内源性游离质粒，编码铁摄取系统，缺失该质粒导致突变株为铁营养缺陷型表征。angE基因是pEIB1介导编码的鳗弧菌铁摄取系统合成的重要基因，该基因缺失突变株表现为铁营养缺陷型表征(Qin L. Ma Y.et al.Cloning，identification and expression of an entE homologue angE from Vibiroanguillarum serotype O1.Arch Microbiol，2004，181：287-293)。
缺失上述靶基因可阻碍鳗弧菌野生毒株的芳香氨基酸合成、叶酸合成以及毒力因子铁载体anguibactin的合成，从而导致鳗弧菌野生毒株的毒力大大减弱和其在自然环境和鱼体宿主内的定殖能力，实现减毒目的。
                            发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的鳗弧菌无标记基因缺失减毒活疫苗，以消除传统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，并弥补灭活疫苗单一效价和给药不方便的技术应用缺陷，为养殖鱼类弧菌病病害防治提供一种多效价、安全和经济的疫苗。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种鳗弧菌无标记基因缺失减毒活疫苗，它是由鳗弧菌毒株MVM425的减毒株MVAV6203(ΔaroC，菌体细胞浓度为106-109CFU/ml)、MVAV6204(ΔaroC ΔangE，菌体细胞浓度为106-109CFU/ml)或MVAV6201(pEIB1质粒缺失株，菌体细胞浓度为106-109CFU/ml)和海水生理盐水组成。减毒株不携带任何抗生素抗性标记和其它标记，无任何外源基因片断。
其中MVAV6203(保藏号为CCTCC-M204066)缺失了染色体上芳香氨基酸合成代谢途径的aro C基因；MVAV6204(保藏号为CCTCC-M204067)缺失基因为野生毒株MVM425染色体上的aroC基因和其自身携带的内源性质粒pEIB1上的angE基因；MVAV6201(保藏号为CCTCC-M203069)完全缺失了野生毒株MVM425自身携带的内源性质粒pEIB1。
本发明所述的菌株已于2004年9月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，其中Vibrio anguillarum MVAV6203的保藏编号CCTCC NO：M204066；Vibrio anguillarum MVAV6204的保藏编号CCTCCNO：M204067；Vibrioanguillarum MVAV6201的保藏编号CCTCC NO：M203069。
疫苗株是鳗弧菌减毒株MVAV6203的传代株，表现为芳香氨基酸营养缺陷特征；是鳗弧菌减毒株MVAV6204的传代株，表现为芳香氨基酸和铁营养缺陷特征；是鳗弧菌减毒株MVAV6201的传代株，表现为铁营养缺陷特征。
本发明方法中，减毒疫苗株培养的培养基可选用LB培养基，其中的蛋白胨可以是酪蛋白胨、胰蛋白胨或大豆蛋白胨，补加NaCl至2.5％，同时补加下列氨基酸(20mg/L)：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、对氨基苯甲酸、对羟基苯甲酸。本发明选用大豆蛋白胨。培养基必须包含0.2-0.5mM的Fe3+。所述的Fe3+的形式可以是例如柠檬酸铁铵或FeCl3，本发明优选柠檬酸铁铵。
有益效果
本发明由野生毒株MVM425得到三株无标记基因缺失突变株，命名为MVAV6201(pEIB1质粒完全缺失)、MVAV6203(ΔaroC)和MVAV6204(ΔaroCΔangE)，相对于其野生毒株MVM425具有明显的低毒性，可有效地保护试验用鱼免受强弧菌病致病株鳗弧菌野生株和溶藻弧菌的侵害。后文试验表明，该活疫苗免疫效果显著，具有非常好的水产养殖鱼类弧菌病的防治效果，可同时交叉保护试验用鱼免受鳗弧菌和溶藻弧菌弧菌病侵害，表现为明显的多效价免疫保护力。特别是该疫苗可方便地实施浸泡给药免疫而获得高效的免疫保护力。同时，所有减毒疫苗株不含有任何外源基因片段和抗生素抗性标记，毒力和毒力相关基因大片段缺失，毒力不可回复，具有技术上的环境和产品安全性，有实际的商业开发应用价值。
该技术构建的减毒活疫苗与以往传统技术路线构建的减毒活疫苗相比具有如下优点：
a.开发的减毒活疫苗不带任何抗生素抗性标记，对环境不存在传播抗生素抗性的潜在危害；
b.采用基因缺失突变(特别是双缺失)手段，在理论上认为毒力不可回复，极大地消除了向环境传播大量毒性病原体的可能性；
c.突变的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生菌株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境安全性和可控性；
所有这些技术安全特征都为无标记基因缺失减毒活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。
                                具体实施方式
实施例1：减毒活疫苗制备
培养基与海水生理盐水组成：
1)LB斜面培养基：大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl25g/L，琼脂18g/L，pH7.5；
2)种子培养基：大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 25g/L，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，pH7.5；
3)发酵培养基：大豆蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl 25g/L，柠檬酸铁铵0.2-0.5mmol，苯丙氨酸20mg/L，酪氨酸20mg/L，色氨酸20mg/L，对羟基苯甲酸20mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，pH6.8；
4)海水生理盐水：NaCl 20，KCl 0.7，MgCl2·6H2O 4.8，NaHCO3 0.11，MgSO4·7H2O3.5，CaCl2·2 H2O 1.6，g/L，pH7.2，过滤除菌。
疫苗制备：取1接种环保存于LB斜面培养基上的减毒疫苗株种子，接种于装有100ml液体LB种子培养基的500ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(O.D＝4.0左右)接种于100ml新鲜发酵培养基，28℃培养12小时。用无菌海水生理盐水洗涤3次，离心收获菌体(2000×g，15分钟，15℃)，无菌海水生理盐水稀释成一定浓度悬液(106-109CFU/ml)，保藏于15℃备用。实施例2：以牙鲆(Paralichthys olivaceus)为试验动物的半数致死量LD50测定
试验用鱼先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以剔除不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(Challenge Lab)中20L感染试验水槽，继续喂养1周，每槽放养20条(平均体长12-15cm)。试验水槽每天使用无菌陈海水替换2/3体积养殖水，水温20℃，上下波动2℃。
将试验用鱼随机分组，每组2个水槽平行试验。在感染试验中，每组试验鱼分别用一定浓度梯度剂量(102～108CFU/尾)的鳗弧菌野生毒株和减毒疫苗株通过肌肉注射进行人工感染。记录10天内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD50值(见表1)。
    表1鳗弧菌毒性株MVM425和减毒株对牙鲆的致病力试验
组  别          感染剂量          死亡数(尾)  实验数(尾)    死亡率(％)
MVM425          1×103CFU/尾        10          20             50
MVAV6201        1×108CFU/尾        0           20             0
MVAV6203        1×108CFU/尾        0           20             0
MVAV6204        1×108CFU/尾        0           20             0
对  照  0.85％生理盐水，0.2ml/尾     0           20             0
注：以上数据为2组独立平行试验的平均值。
上述结果表明，所有减毒株相对于鳗弧菌野生毒株具有明显的减毒效应，在所试验浓度范围内对牙鲆基本无毒。
实施例3：以石斑鱼为试验动物的半数致死量LD50测定
试验用鱼应先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以剔除不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(Challenge Lab)中20L感染试验水槽，继续喂养1周，每槽放养10条(12-15cm)。试验水槽维持流动水流(300-400mL/min，无菌陈海水)，水温28℃，上下波动2℃。
将试验用鱼随机分组，每组3个水槽平行试验。在感染试验中，每组试验鱼分别用一定浓度梯度剂量(102～108CFU/尾)的溶藻弧菌野生毒株和减毒疫苗株通过肌肉注射进行人工感染。记录10天内，每组每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD50值(见表2)。
        表2溶藻弧菌毒性株和减毒株对石斑鱼的致病力试验
组  别          感染剂量          死亡数(尾)  实验数(尾)    死亡率(％)
                1×105CFU/尾        16           30           53.3
MVAV6201        1×108CFU/尾        0            30             0
MVAV6203        1×108CFU/尾        0            30             0
MVAV6204        1×108CFU/尾        0            30             0
对照      0.85％生理盐水，0.2ml/尾   0            30             0
注：以上数据为2批独立平行试验的平均值。
上述结果表明，所有减毒株相对于溶藻弧菌野生毒株具有明显的减毒效应，在所试验浓度范围内对石斑鱼基本无毒。
实施例4：以牙鲆为试验动物的注射给药免疫保护试验：
试验牙鲆随机分为14组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用肌肉注射方式免疫。注射免疫剂量为106CFU/尾和108CFU/尾，肌肉注射试验牙鲆。对照组注射无菌生理盐水。免疫4周后将各组免疫牙鲆用鳗弧菌野生毒株活菌(肌肉注射感染108CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，计算每组的免疫保护率(见表3)。
按下列公式计算免疫保护率：
免疫保护率％＝(对照组死亡率-免疫组死亡率％)/对照组死亡率×100％，
表3鳗弧菌减毒活疫苗注射免疫牙鲆4周后攻毒的免疫保护性试验
组别       免疫剂量    试验尾数    死亡尾数  累计死亡率(％)  免疫保护率(％)
MVAV6201  106CFU/尾       30         0         0                100
MVAV6203  108CFU/尾       30         0         0                100
MVAV6203  106CFU/尾       30         0         0                100
MVAV6204  108CFU/尾       30         0         0                100
MVAV6204  106CFU/尾       30         0         0                100
免疫对照  生理盐水         30         29        96.7               /
攻击对照      /            30         0         0                  /
注：以上数据为2批独立平行试验的平均值。
从上可以看出，所有减毒疫苗具有良好的鳗弧菌野生毒株感染防治效果，注射免疫4周后的免疫保护率为100％，在106-108CFU/尾接种剂量范围内表现出十分稳定的给药安全性。
实施例5：以牙鲆为试验动物的浸泡给药免疫保护试验：
试验牙鲆随机分为12组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用浸泡方式免疫。浸泡免疫是将制备好的疫苗原液用无菌陈海水稀释成106CFU/ml或108CFU/ml，放入浸泡用无菌空水槽至20L，然后将各组试验牙鲆依次浸泡处理，浸泡时间控制在1分钟至15分钟之间。对照组不做任何处理。免疫4周后将各组免疫牙鲆用鳗弧菌野生毒株活菌(肌肉注射感染108CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计对照组和免疫组死亡数，计算每组的免疫保护率(见表4)。
按下列公式计算免疫保护率：
免疫保护率％＝(对照组死亡率-免疫组死亡率％)/对照组死亡率×100％，
表4鳗弧菌减毒活疫苗浸泡免疫牙鲆4周后攻毒的免疫保护性试验
组别      免疫剂量            试验尾数  死亡尾数  累计死亡率(％)  免疫保护率(％)
MVAV6203  108CFU/ml，15min       30        0         0                100
MVAV6203  106CFU/ml，15min       30        0         0                100
MVAV6204  108CFU/ml，15min       30        0         0                100
MVAV6204  106CFU/ml，15min       30        0         0                100
免疫对照     /                    30        30        100              /
攻击对照     /                    30        0         0                /
注：以上数据为2批独立平行试验的平均值。
从上可以看出，减毒疫苗具有良好的鳗弧菌野生毒株感染防治效果，浸泡免疫4周后的免疫保护率为100％。浸泡给药剂量在106-108CFU/ml范围内表现出十分稳定的给药安全性。和注射给药效果相比，浸泡免疫表现出基本一致的免疫效果，说明本发明疫苗可方便地通过浸泡给药方式获得高效力的免疫保护性。
实施例6：以石斑鱼为试验动物的溶藻弧菌交叉免疫保护试验：
试验石斑鱼随机分为12组，每组3个平行水槽，10尾/槽。将制备的减毒活疫苗分别采用注射和浸泡给药方式免疫。注射免疫剂量为106CFU/尾和108CFU/尾，腹腔注射，对照组注射无菌生理盐水。浸泡免疫是将制备好的疫苗原液用无菌陈海水稀释成106CFU/ml或108CFU/ml，放入浸泡用无菌空水槽至20L，然后将各组试验石斑鱼依次浸泡处理，浸泡时间控制在1分钟至15分钟之间。对照组不做任何处理。免疫4周后将各组免疫石斑用溶藻弧菌野生毒株活菌(肌肉注射感染108CFU/尾)进行人工感染攻毒。在15天内观察统计各组死亡数，计算每组的免疫保护率(见表5和表6)。
表5鳗弧菌减毒活疫苗浸泡免疫石斑4周后溶藻弧菌攻毒的免疫保护性试验
组别      免疫剂量        试验尾数  死亡尾数  累计死亡率(％)  免疫保护率(％)
MVAV6201  108CFU/ml，1min    30        3         10.0               89.3
MVAV6201  106CFU/ml，1min    30        1          3.3               96.5
MVAV6203  108CFU/ml，1min    30        0           0                100
MVAV6203  106CFU/ml，1min    30        0           0                100
MVAV6204  108CFU/ml，1min    30        0           0                100
MVAV6204  106CFU/ml，1min    30        0           0                100
免疫对照       /              30        28          93.3              /
攻击对照       /              30        0            0                /
表6鳗弧菌减毒活疫苗注射免疫石斑4周后溶藻弧菌攻毒的免疫保护性试验
组别        免疫剂量    试验尾数  死亡尾数  累计死亡率(％)  免疫保护率(％)
MVAV6201    108CFU/尾    30            1        3.3              96.5
MVAV6203    108CFU/尾    30            0        0                100
MVAV6203    106CFU/尾    30            0        0                100
MVAV6204    108CFU/尾    30            0        0                100
MVAV6204    106CFU/尾    30            0        0                100
免疫对照       /          30            28       93.3              /
攻击对照       /          30            0        0                 /
注：以上数据为2批独立平行试验的平均值。
上述数据表明，所有减毒疫苗株对于石斑鱼有较好的免疫保护性，免疫原性好，用溶藻弧菌攻击经减毒疫苗株免疫的石斑鱼，显示具有很好的交叉保护性。注射免疫和浸泡免疫具有一致的免疫保护效力。

Claims (8)

1.一种鳗弧菌野生毒株MVM425的无标记基因缺失减毒突变株，其保藏号为CCTCCNO：M204066。
2.一种鳗弧菌野生毒株MVM425的无标记基因缺失减毒突变株，其保藏号为CCTCCNO：M204067。
3.一种鳗弧菌野生毒株MVM425的无标记基因缺失减毒突变株，其保藏号为CCTCCNO：M203069。
4.如权利要求1，2或3所述的鳗弧菌野生毒株MVM425的无标记基因缺失减毒突变株可用于养殖鱼类弧菌病防治的多效价减毒活疫苗的应用。
5.如权利要求4所述的用于养殖鱼类弧菌病防治的多效价减毒活疫苗，其特征在于，该疫苗由鳗弧菌野生毒株MVM425的无标记基因缺失减毒突变株和在药理上可接受的配体制备而来，其中所述的鳗弧菌野生毒株MVM425的无标记基因缺失减毒突变株的菌体浓度为106-109CFU/ml。
6.如权利要求4所述的用于养殖鱼类弧菌病防治的多效价减毒活疫苗，其特征在于，所述的在药理上可接受的配体为无菌海水生理盐水，其配方为：NaCl 20，KCl 0.7，MgCl2·6H2O 4.8，NaHCO3 0.11，MgSO4·7H2O 3.5，CaCl2·2H2O 1.6，g/L，pH7.2。
7.如权利要求5或6所述的多效价减毒活疫苗，其特征在于，可通过注射和浸泡给药途径防治由鳗弧菌和溶藻弧菌导致的养殖鱼类弧菌病。
8.如权利要求7所述的多效价减毒活疫苗，其特征在于，注射给药浓度为106-108CFU/尾，浸泡给药浓度为106-108CFU/ml，浸泡时间1min～15min。
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