CN103014051B - 鱼用多效价活疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鱼用多效价活疫苗及其应用。所述疫苗包含一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列。

Description

鱼用多效价活疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及鱼用细菌性载体活疫苗技术领域，具体是指一种抗迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的载体活疫苗相关制剂及应用。

背景技术

鉴于世界人口的不断增长及天然渔业资源的日益枯竭，水产业作为一种传统产业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中突现出其重要地位。据统计，2002年我国水产品总量占全球总产量的71%和总产值的49.8%，居世界第一位。据FAO统计，2004年我国的水产产品总量达4750万吨。然而，由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量难以持续发展。因此，规模化、集约化、高密度研制模式逐渐成为我国鱼类养殖业的发展主流。然而，随着渔业养殖的不断稳步发展，各种病害问题日益突出，对养殖产量及成长造成严重影响。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30%以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。

针对各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法对病害的控制和防治曾发挥了积极作用。但是，这种病害控制措施造成的环境污染、抗药病原的大量出现、水产品的药物残留等负面影响日趋严重。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易市场。日本也开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。

作为世界上的水产养殖大国，我国的海水养殖品出口量只占到了养殖总量的6%左右，一个主要的制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标严重，成为扩大出口的主要障碍。近几年我国水产品出口因质量安全问题受到欧盟、日本等国家和地区的限制。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。

为遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的发展趋势，推进海水养殖业的可持续发展，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验(Ormonde P.Fisheries resources:trends in production,utilization and trade.In:NomuraⅠ(ed.).The State of World Fishery and Agriculture2002.Rome:FAOInformation Division,2002,p3～p45)，倡导“系统管理途径”(System managementapproaches,SMA)养殖模式防治各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。

疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能为水产养殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了阻碍。

水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜在价值，也成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。

近年来，随着对病原基因背景的深入了解及重组DNA技术的不断发展，将编码某一特定病原体蛋白的外源基因插入无毒力病毒或者细菌疫苗株的基因组的某一部位，使其高效表达，但不影响疫苗株的正常生长与繁殖。用这种重组体作为活疫苗进行接种时，病毒或细菌能产生特定的外源蛋白，并诱发机体产生特异性免疫应答。目前，这种能针对多种病毒病害的多效价疫苗也已成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。其中，利用高效信号肽分泌表达外源病原蛋白已成为多效价疫苗开发中的一种重要技术手段，并且该技术已在大肠杆菌及沙门氏菌的疫苗开发中得到了成功应用(Gentschev I,et al.TheE.coliα-hemolysin secretion system andits use in vaccine development.Trends Microbiol,2002(10):39-45及Russmann H,etal.Delivery of epitopes by the Salmonella type III secretion system for vaccinedevelopment.Science,1998(281):565-568)，但在迟钝爱德华氏菌疫苗的研制中还未见相关技术应用的报道。

爱德华氏菌属是导致淡水、海水养殖鱼类细菌性疾病的一类常见的病原体，具体分为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)和保科爱德华氏菌(Edwardsiella hoshinae)。由其引起的鱼类出血性败血症统称为爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)。该病传播面积广，无明显季节性，感染率及死亡率高，危害的种类多，有鲤鱼，罗非鱼，鳗鲡，鲻鱼，鲑鱼，鳟鱼，鲆鲽等大多数具有较高经济价值的鱼种。此外，迟钝爱德华氏菌还感染贝类、爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类。值得注意，迟钝爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病原菌，它是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。目前，我国养殖鱼类爱德华氏菌病病害比较严重的病原体主要为迟钝爱德华氏菌，并有存在病原体向人体转移的巨大威胁。美国专利有利用利福平筛选得到野生毒株的自然减毒突变体作为减毒活疫苗的报道(Evans J J,Klesius,P H and Shoemaker C A2006Modified liveEdwardsiella tarda vaccine for aquatic animals;United States Patent7067122)。目前在我国尚无该病害的有效防治措施。

淡水、海水养殖业需要更有效的鱼用疫苗，尤其是能同时抵抗多种病原菌侵害多效价鱼用活疫苗。这样的多效价鱼用活疫苗具有非常重要的经济价值。

发明内容

本发明提供一种赋予疫苗株抗迟钝爱德华氏菌和抗嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)多效价抗性的重组载体，具有多效价抗性的载体活疫苗及它们的应用。本发明的重组载体或多效价活疫苗设计独特巧妙，与传统疫苗相比具有免疫保护效果更好的特点，使用简便、安全、费用低廉，为防治养殖鱼类的疾病提供一种安全、有效、经济的疫苗，有实际的商业开发应用价值，适于大规模推广应用。

本发明内容之一是一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列。

实施方式之一中，所述重组表达载体是以pUTt为起始载体构建而成。

实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌Tat信号肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽。

实施方式之一中，二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

实施方式之一中，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列如Genbank HQ697336所示。

实施方式之一中，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码序列如SEQID NO:3所示

实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的内容还包括一种含有本发明的重组表达载体的迟钝爱德华氏菌多效价活疫苗株。

实施方式之一中，所述多效价活疫苗株为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301，其保藏号为：CCTCC NO:M2012324。

本发明的内容还包括本发明重组载体或本发明疫苗株用于制造鱼用药物的用途，所述药物用于防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染。

本发明的有益效果包括但不限于：

1.本发明的迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株是在减毒活疫苗的基础上构建的表达异源蛋白的载体活疫苗，相对于其野生毒株EIB202具有明显的低毒性，免疫效果显著，可有效地保护鱼类免受迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的侵害，具有非常好的水产养殖中爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌病的防治效果；

2.本发明的迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株的遗传背景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境安全性和可控性，有实际的商业开发应用价值；

3.本发明的迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株为载体活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。

附图说明

图1是本发明重组载体实施方式之一pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA的结构图谱。其中，rrnBT1T2为强终止子，GapA表示嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码区，ssDmsA为二甲基亚砜还原酶A亚基(DmsA)信号肽编码区，Pdps为dps启动子，pBR322_origin为复制区，Amp^r为编码氨苄青霉素抗性基因区，EcoRI、BamHI、HindIII为对应的酶切位点。

图2是Western blotting法检测本发明实施例中构建的E.tarda WED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA菌株胞质、周质、胞外组分GapA定位情况。

图3是本发明疫苗株实施方式之一DmsA-GA对大菱鲆(Scophtalmus maximus)的免疫保护率，以迟钝爱德华氏菌WEB疫苗株或无菌生理盐水为对照。其中，A：免疫4周后用迟钝爱德华氏菌EIB202和嗜水气单胞菌LSA34联合攻毒，计算攻毒后18天内累计死亡率；B：免疫4周后用迟钝爱德华氏菌EIB202攻毒，计算攻毒后18天内累计死亡率；C：免疫4周后用嗜水气单胞菌LSA34攻毒，计算攻毒后18天内累计死亡率。

具体实施方式

本发明构建了一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps(简称Pdps)、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)编码序列

对于用来构建本发明重组表达载体的起始载体，本发明没有特别限制，只要能够在在迟钝爱德华氏菌内存活和/或复制即可。本领域技术人员可以根据转化的对象和转化目的，例如是为表达、扩增还是整合到基因组等，依照现有技术的教导做出合适的选择。例如，可以选用质粒载体，例如后文实施例所用的pUTt质粒。

迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps，在此简称Pdps，控制目的基因的启动表达。本发明实施方式之一中，迟钝爱德华氏菌Pdps来自保藏号CCTCC NO:M208068的迟钝爱德华氏菌EIB202，其序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明选用高效的迟钝爱德华氏菌Tat信号肽构建本发明的重组载体。所述信号肽的作用在于介导所述3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)的分泌和细胞定位。本发明实施方式之一选用迟钝爱德华氏菌双精氨酸运输系统底物二甲基亚砜还原酶A亚基(DmsA)信号肽(简称ssDmsA)构建得到重组质粒pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。用该质粒转化迟钝爱德华氏菌构建得到本发明的载体活疫苗株。实施方式之一中，用该载体转化减毒迟钝爱德华氏菌毒株WED，得到多效价载体活疫苗，以E.tardaWED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA表示，简写为DmsA-GA。

据信，嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)对鱼类具有良好的免疫保护效果。本发明实施方式之一中，采用嗜水气单胞菌LSA34的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapA)，其氨基酸序列如Genebank HQ697336所示。

本发明中，“操作性相连”的序列包括与感兴趣的基因毗连或相距一定距离的表达调控序列，该操作性连接方式使得所述调控序列能够控制感兴趣基因的表达，使得其中宿主细胞内得以转录和表达。

本发明重组载体的构建采用常规重组技术。例如，方法之一包括：克隆出具有酶切位点的3-磷酸甘油醛脱氢酶的核苷酸序列；酶切3-磷酸甘油醛脱氢酶编码核酸和起始载体；连接酶切的编码3-磷酸甘油醛脱氢酶编码核酸和载体，构成中间质粒；构建具有酶切位点的启动子-信号肽融合基因；酶切启动子-信号肽融合基因和含3-磷酸甘油醛脱氢酶编码核酸的中间质粒；连接酶切的启动子-信号肽融合基因和含3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列的载体，得到本发明的重组表达载体。

构建方法没有顺序依赖性。可以先将3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码核酸构建入载体，再将启动子-信号肽融合基因构建入载体。也可以先把启动子-信号肽的融合基因构建入载体，再将3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码核酸构建入载体。还可以先将启动子-信号肽融合基因与3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码核酸连接，然后将此连接产物构建入载体。这些过程本领域技术人员可以根据其掌握的技术结合合适的酶切位点即可完成。

本发明还提供一种迟钝爱德华氏菌多效价活疫苗株，其中含有本发明的重组表达载体。本发明的“多效价”活疫苗能够提供对多种鱼类致病菌的对免疫保护功效，尤其是对于钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌感染的免疫保护。本发明实施方式之一是命名为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301的多效价载体活疫苗株，已于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M2012324。

本发明的内容还包括采用本发明重组载体或本发明多效价疫苗防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染的方法以及该方法所用的药物。实施方式之一中，本发明提供了一种迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株的制剂，其中包含本发明迟钝爱德华氏菌多效价载体活疫苗株和在药理上可接受的载体。实施方式之一，所述载体活疫苗株的菌体细胞浓度数量级为10²～10⁹CFU/ml，或者10⁶～10⁹CFU/ml。实施方式之一中，所述载体是无菌生理盐水，例如NaCl9g/L，pH为7.2的生理盐水。

本发明的内容还包括采用本发明迟钝爱德华氏菌多效价载体、活疫苗株或本发明多效价载体活疫苗株制剂防治养殖鱼类的迟钝爱德华氏菌病和嗜水气单胞菌病中的方法。实施方式之一中，所述迟钝爱德华氏菌载体活疫苗株或所述制剂通过注射方式给药，其中菌体细胞浓度数量级为10²～10⁹CFU/ml，或者10⁶～10⁹CFU/ml。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本申请的保护范围。

实施例

材料与方法

pUTt质粒：发表于Xiao Y，Liu Q,Chen H,Zhang Y. A stable plasmid system forheterologous antigen expression in attenuated Vibrio anguillarum.Vaccine.2011,29(40):6986-6993。申请人保证从本申请申请日起二十年内向公众按需要发放该生物材料。

Escherichia coli Top10F’：购自Invitrogen。

E.coli BL21(GapA)菌株：发表于X.Li,H.Wu,M.Zhang,S.Liang,J.Xiao,Q.Wang,Q.Liu andY.Zhang.Secreted glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as abroad spectrum vaccine candidate against microbial infection in aquaculture.Lett ApplMicrobiol,2011,54:1-9。申请人保证从本申请申请日起二十年内向公众按需要发放该生物材料。

迟钝爱德华氏菌毒株EIB202：已于2008年5月1日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M208068。该菌株的相关记载另可见于“Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tardafrom mariculture in China”，肖婧凡等，《Aquaculture Research》，Vol.40，2009。

嗜水气单胞菌LSA34：已于2009年6月10日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M209124。该菌株的相关记载另可见于中国专利公开CN101659958(申请号：CN200910054113.9)。

迟钝爱德华氏菌减毒株WED：已于2010年10月24日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2010278。该菌株的相关记载另可见于中国专利申请公开CN101974472A。

迟钝爱德华氏菌载EIBAV12090301：已于2012年9月3日提交武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO:M2012324。

培养基与生理盐水组成：

LB液体培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，pH7.5

LB斜面培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，琼脂18g/L，pH7.5，氨苄青霉素100μg/ml；

种子培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，pH7.5，氨苄青霉素100μg/ml；

发酵培养基：胰蛋白胨(Difco)10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaCl5g/L，pH6.8，氨苄青霉素100μg/ml；

生理盐水：NaCl9g/L，pH7.2，121℃灭菌20分钟。

以下例实施例中，除非特别说明，所涉方法、操作或步骤皆按照本领域常识、常规中常用条件下据信，例如《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold SpringHarbor Laboratore Press,1989)中所述或厂商推荐的条件或流程。

实施例1重组表达载体的构建

构建重组表达载体pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。

(一)PCR扩增获得所需基因片段

以迟钝爱德华氏菌EIB202的基因组为模版，利用下列扩增引物进行PCR获得Pdps-ssDmsA融合片段。

Pdps-ssDmsA-P1：CCGGAATTCGCCGCATCAGCGCTGAAAAAAAC，SEQ ID NO:5

Pdps-ssDmsA-P2：CTGTTTTTTTTCATTCTGCATGCTCTCCTTGG，SEQ ID NO:6

Pdps-ssDmsA-P3：GGAGAGCATGCAGAATGAAAAAAAACAGTCGG，SEQ ID NO:7

Pdps-ssDmsA-P4：CGGGATCCCTTATTCTGCGCGGGCGTAG，SEQ ID NO:8

下划线所示为酶切位点。

首先分别用Pdps-ssDmsA-P1和Pdps-ssDmsA-P2，Pdps-ssDmsA-P3和Pdps-ssDmsA-P4扩增获得Overlap PCR所需的上下游片段Pdps，ssDmsA。回收各片段后，利用Overlap PCR技术采用Pdps-ssDmsA-P1和Pdps-ssDmsA-P4获得Pdps-ssDmsA融合片段。

以嗜水气单胞菌LSA34的基因组为模版，利用扩增引物GapA-F和GapA-R扩增得到GapA片段。

GapA-F：CGGGATCCACTATCAAAGTAGGTATTAACGG，SEQ ID NO:9

GapA-R：CCCAAGCTTTTACTTAGAGATGTGAGCGATCAGG，SEQ ID NO:10。

(二)回收片段

从PCR扩增产物中回收目标片段。采用TIANGEN公司的胶回收试剂盒。琼脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装入Eppendorf管并称取重量，加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；将得到的溶液加入吸附柱中离心(12,000rpm离心30sec)，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，再用500μl漂洗液PW12,000rpm离心30sec，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量出去漂洗液，再将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干后，将其放到一个干净地离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加不少于30μl的洗脱缓冲液EB buffer，室温放置2min，12,000rpm离心1min收集含目的片段的DNA溶液，电泳检测回收DNA浓度。

(三)构建重组质粒载体pUTt-GapA

将起始载体pUTt质粒的多克隆位点的BamHI位点和HindIII位点切开后，将片段GapA与切割后的质粒用T4DNA连接酶16℃连接过夜。CaCl₂转化法转化Escherichia coli Top10F’得到重组质粒载体pUTt-GapA。

(四)构建重组质粒载体pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA

将pUTt-GapA载体多克隆位点的EcoRI位点和BamHI位点切开后，将片段Pdps-ssDmsA与切割后的质粒pUTt-GapA用T4DNA连接酶16℃连接过夜。CaCl₂转化法转化Escherichia coli Top10F’得到质粒载体pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA，如图1所示。

实施例2重组疫苗株的构建及制备

（一）重组疫苗株的构建

用重组载体pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA转化迟钝爱德华氏菌减毒株WED，得到重组菌株，以E.tarda WED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA表示，简写为DmsA-GA。

将迟钝爱德华氏菌减毒株WED接种于50ml LB液体培养基中，与30℃振摇培养过夜后，再以1:100(v/v)转接于50ml新鲜LB液体培养基中，在30℃下以200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6时，离心收集菌体，将菌体在冰浴中放置20min后，用272mM的蔗糖缓冲液洗涤菌体三次，再用蔗糖缓冲液重悬菌体，是菌液终浓度为1×10⁹CFU/ml，得到迟钝爱德华氏菌减毒株WED的电转化感受态细胞。

将实施例1(四)中所得含有pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA的转化株Top10F’进行扩增培养，收集菌体并收获重组质粒pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA。

利用迟钝爱德华氏菌减毒株WED的电转化感受态细胞和重组质粒pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA制备重组菌株，具体过程如下：

取100μl感受态细胞于预冷的0.2cm电转化杯(Bio-Rad，USA)中，加入重组质粒DNA20μl，混匀后冰浴上放置10min，用电脉冲仪(Bio-Rad MicroPluser，USA)进行电脉冲，其中，脉冲场强V=2kV/cm，脉冲时间t=3ms。

电脉冲完毕后，菌悬液转入1.5ml离心管，并加入800μl预热LB培养液，在30℃，200rpm恢复培养3h后，涂布于LB抗性平板(含多粘菌素12.5μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml)，30℃静置培养16-20h，筛选阳性克隆，得到重组疫苗株E.tarda WED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA,简称DmsA-GA，命名为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301，LB斜面培养基保存。

（二）活疫苗制剂的配制

取一接种环保存于LB斜面培养基上的疫苗株种子，接种于装有100ml液体LB种子培养基的500ml摇瓶，在30℃下振荡培养(转速200转/分钟)。12小时后，取5ml生长旺盛的菌液(O.D=3.0左右)接种于100ml新鲜发酵培养基，30℃培养12小时。用无菌生理盐水洗涤3次，离心收获菌体(2,000×g，15min，15℃)，无菌生理盐水稀释成一定浓度悬液(10⁶-10⁹CFU/ml)，保藏于15℃备用。

实施例3：重组疫苗株GapA分泌检测

(一)细菌各组分蛋白的分离

将实施例2获得的重组菌株接种于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，200rpm，30℃过夜培养，次日按1:100(v/v)接种于50ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)。待OD₆₀₀达到0.4左右，用二联吡啶(终浓度200μg/ml)进行诱导，200rpm，30℃培养9h，在5,000g下离心10min，上清通过0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌，得到的过滤上清用Biomax-10K超滤膜(Millipore，USA)进行浓缩以获得胞外蛋白组分。将菌体沉淀重悬在800μl含有500mmol/L蔗糖和0.5mmol/L EDTA的100mmol/L、pH8.6的Tris-HCl缓冲液中，然后加入40μl40mg/ml的溶菌酶，温和地混合均匀，然后迅速加入含有2.5mmol/L MgCl2的3.2ml Tris-HCl缓冲液(50mmol/L,pH8.6)。温和振动一会后，将这个悬浮液在室温放置15min。将该悬浮液在7,000g，4℃离心6min，收获上清，并将上清经0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌，得到的过滤过上清即为周质蛋白组分。

将留下的细胞沉淀重悬在4ml Tris-HCl缓冲液中(20mmol/L,pH8.6)，用超声破碎仪对细胞进行破菌，然后将菌体裂解液在4°C，5,000g离心10min，收集上清部分作为胞内组分。

(二)DmsA-GA菌株GapA蛋白的Western blotting检测

用Western blotting法检测E.tarda WED::pUTt-Pdps-ssDmsA-GapA即DmsA-GA菌株GapA蛋白在所得重组疫苗株各细胞组分中的定位情况。以E.coli BL21(GapA)菌株含有表达质粒pET28a表达GapA蛋白的全菌裂解液作为阳性对照。结果显示待检测菌株的胞内组分、周质空间均能检测到GapA蛋白，说明GapA蛋白可以在DmsA信号肽的作用下被运送到周质空间或上清组分中(图2)。

实施例4：以大菱鲆(Scophthamus maximus(L.))为试验动物的半致死量LD₅₀

用健康大菱鲆考察DmsA-GA菌株的致病力，检测指标为半致死剂量LD₅₀。试验用鱼先置于SPF(Specific Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以剔除不正常个体。在感染试验前，再将SPF试验用鱼放养于感染实验室(Challenge Lab)中10L感染试验水槽，继续喂养1周，每槽放养10条(平均体长11-12cm，体重30g)。试验水槽每天使用无菌陈水替换2/3体积养殖水，水温16℃，上下波动2℃。

于12,000g离心收集EIB202和株候选疫苗菌株DmsA-GA的过夜培养物，然后用生理盐水洗涤3次以除去残留的培养基，将菌体用生理盐水进行重悬，同时将密度梯度调整至10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹和10¹⁰CFU/ml，采用平板计数的方式计算菌液中菌体的数量。

将实验动物进行分组，每组3个平行水槽，每槽10尾，实验鱼用MS-222溶液(80mg/L)进行麻醉，采用背部肌肉注射的方式进行人工感染，每组按照10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹CFU/尾注射动物。对照组则以同样的方式注射同样剂量生理盐水。注射完成后，将感染后的试验动物正常饲养，观察15天内鱼体的感染情况，记录每天实验动物死亡数，实验结束后用过量的MS-222溶液(200mg/L)杀死实验用鱼。用Reed-Muench法计算各菌株的半致死剂量(LD₅₀)，根据实验动物体重换算成CFU/g体重(见表2)。其计算公式如下：

LD₅₀=10^{[Xm-i(∑P-0.5)]}

其中：

Xm：最大剂量的对数值

i：相邻两组剂量对数值之差

P：各组动物死亡率，用小数表示(如：死亡率为80%则写成0.8)

∑P：各组动物死亡率之总和

表2迟钝爱德华氏菌野生株和载体活疫苗株对大菱鲆的半致死剂量LD₅₀

菌株	LD50(CFU/g)
		EIB202	4.75×102
DmsA-GA	高于1×108

结果显示DmsA-GA候选载体疫苗株的毒力低于迟钝爱德华氏菌野生毒株EIB202，在所检测的感染剂量范围内所引起的死亡数均未达到50%，减毒效果非常明显，符合疫苗株的要求。

实施例5：以大菱鲆为试验动物的免疫保护试验

以5×10³CFU/g剂量腹腔注射免疫健康大菱鲆，试验所用大菱鲆随机分为5组，每组3个平行水槽，30尾/槽。将制备的减毒活疫苗采用肌肉注射方式免疫。实验组注射DmsA-GA和WED，对照组注射等体积无菌生理盐水。免疫期为一个月，每天观察实验动物健康状况。在免疫1个月后，对照组注射无菌生理盐水没有出现死亡情况，将DmsA-GA和WED两个实验组存活的大菱鲆以迟钝爱德华氏菌EIB202(0.5×10²CFU/g)和嗜水气单胞菌LSA34(2.5×10⁶CFU/g)对其进行混合攻毒或单独攻毒，连续考察3周，统计累计死亡率并计算相对免疫保护力(图3)。其中，按下列公式计算免疫保护率：

相对免疫保护率(RPS)%=(对照组死亡率%–免疫组死亡率%)/对照组死亡率%×100%。

由图3A的结果可知，DmsA-GA载体活疫苗株在抵抗迟钝爱德华氏菌EIB202和嗜水气单胞菌LSA34混合感染时具有最好的免疫保护力，相对免疫保护率(RPS)在70%以上，可以有效地抵抗此两菌的联合感染，具有显著的免疫保护效果。另外考察了DmsA-GA载体活疫苗株在单独感染迟钝爱德华氏菌EIB202(1×10²CFU/g)(图3B)或嗜水气单胞菌LSA34(5×10⁶CFU/g)(图3C)时的情况。可见单独感染迟钝爱德华氏菌EIB202时，WED和DmsA-GA两组疫苗组的实验鱼表现稳定，18天观察期内死亡率均接近20%，对照组死亡率93%，RPS均接近78%(图3B)，免疫保护效果显著。在以嗜水气单胞菌LSA34攻毒后，WED免疫组的死亡率较高(达到70%)，DmsA-GA免疫组的死亡率达到32%，对照组死亡率接近90%，因此WED免疫组和DmsA-GA免疫组的RPS分别为22%和64%(图3C)，免疫保护效果显著。

以上，本发明参照特定的实施例对本发明进行作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (10)

1.一种重组表达载体，其特征在于，包含编码操作性相连的迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps、迟钝爱德华氏菌Tat信号肽编码序列和嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码序列。

2.如权利要求1所述的重组表达载体，是以pUTt为起始载体构建而成。

3.如权利要求1所述的重组表达载体，所述迟钝爱德华氏菌Tat信号肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，二甲基亚砜还原酶A亚基信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求1所述的重组表达载体，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列如Genbank HQ697336所示。

6.如权利要求1所述的重组表达载体，所述嗜水气单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码序列如SEQ ID NO:3所示。

7.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述迟钝爱德华氏菌铁诱导性启动子dps序列如SEQ ID NO:4所示。

8.一种迟钝爱德华氏菌多效价活疫苗株，含有以上权利要求中任一项所述的重组表达载体。

9.如权利要求8所述的疫苗株，命名为迟钝爱德华氏菌EIBAV12090301，其保藏号为：CCTCC NO:M2012324。

10.权利要求1至7中任一项所述重组表达载体或权利要求8或9所述疫苗株用于制造鱼用药物的用途，所述药物用于防治迟钝爱德华氏菌和/或嗜水气单胞菌感染。