CN103275890A - 一株鳗弧菌（鳗利斯顿氏菌）强毒菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鳗弧菌菌株及其应用方法，具体涉及一种鱼类鳗弧菌MN菌株，该菌株分离自大菱鲆(Scophthamus maximus)鱼体中，是一种具有较强毒力的野生菌株，其保藏编号为：CGMCC No.7198。该菌株制备的灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上的疫苗抗原可应用于该菌免疫技术的应用中；免疫应用中疫苗抗原的接种可以采用注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫或口服免疫的方式，疫苗抗原可以单独使用，也可以与佐剂混合使用，也可以制成单一制剂但与佐剂同时使用，还可以与佐剂不同时使用。

Description

一株鳗弧菌(鳗利斯顿氏菌)强毒菌株及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖动物的病原菌学和免疫学领域，具体涉及一种鱼类鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，也称为鳗利斯顿氏菌，即Listonella anguillarum菌株MN及其应用。 

背景技术

鳗弧菌或称鳗利斯顿氏菌为革兰氏阴性略微弯曲的短杆菌，最早于1893年由意大利人Canestrini首次从鳗鲡中分离并鉴定，1985年MacDonell和Colwell等提议建立利斯顿氏菌属，将鳗弧菌分类划归鳗利斯顿氏菌属(Listonella anguillarum)，但习惯上人们仍然广泛使用鳗弧菌的原种属名称。鳗弧菌是一种水产动物的条件致病菌，在世界范围内流行。鳗弧菌能够感染大多数海水鱼和淡水鱼及其他养殖动物。现在已报道至少有40多种鱼可被鳗弧菌感染，其中重要的养殖品种有大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus keta)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、花鲈(Lateolabrax japonicus)、香鱼(Plecoglossus altivelis)、鳕鱼(Pollachius pollachius)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)、欧洲鳗鱼(Anguilla anguilla)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Brachydanio rerio)等。感染牙鲆后可造成鱼苗和成鱼全身性出血为特征的败血症。在2216E培养基上鳗弧菌菌落为半透明圆形状，而在TCBS培养基上菌落呈黄色，根据这个特性，可以用于鳗弧菌的初步鉴定。鳗弧菌的感染途径有多种，主要通过皮肤、鳃、侧线以及肠道来侵染鱼体。感染鳗弧菌后的病鱼临床表现各不相同，除慢性感染和体表溃烂外，更多的是急性和亚急性感染。主要症状是出血性败血症、鳍部严重出血、肠道充血、体表肿胀、体表溃烂、发炎、摄食量减少、有时甚至出现肛门红肿和脱肛现象。Lightner(1975)等对美国德克萨斯州地区对虾进行病原菌调查，发现鳗弧菌也是对虾最常被检出的病原菌之一；陈翠珍等(2006)报道河北的某水产养殖场养殖一年生河蟹经病原菌学检验，其中一个养殖场病因由鳗弧菌单独感染引起，另一养殖场的河蟹发病经由鳗弧菌、维氏气单胞菌、费氏柠檬酸杆菌的混合感染所致；目前已发现的鳗弧菌毒力因子有铁获取系统、外金属蛋白酶、鞭毛、溶血素等。 

鳗弧菌具有菌体(O)抗原、被膜(K)抗原和鞭毛(H)抗原。Srensen和Larsenal(1986)根据对495株分离菌的检验认为鳗弧菌O抗原血清型有10个，另有报道认为其中O1、O2、O3血清型是导致目前世界范围内野生及养殖鱼类弧菌病最主要的3类血清型。其中已报道的 标准菌株鳗弧菌ATCC 43305(O1血清型)、鳗弧菌ATCC 43306(O2血清型)、鳗弧菌ATCC43308(O4血清型)、鳗弧菌MN(O1血清型)、鳗弧菌3101(O1血清型)和鳗弧菌M3(O1血清型)等。 

疫苗作为抗生素的替代品，对养殖产品无毒副作用、无残留和抗药性，能显著提高水产动物健康水平，大大减少抗生素的使用，保证水产品质量及促进水产养殖业的可持续发展，具有显著的社会效益和经济效益，在发达国家已经成为养殖鱼类病害预防的主要技术手段，是保障我国未来海淡水鱼类养殖健康可持续发展的重要技术产品。 

疫苗具有特异性免疫保护作用，不同种类的病原所引起的疫病需要相应种类的病原材料所制备的疫苗才能有效预防，这种特异性还与具体病原的血清型甚至株型有关。一方面特定菌株的感染可能需要相应菌株的疫苗才能起到有效的免疫保护作用，我们前期对国外生产的一种鳗弧菌(O1血清型)灭活疫苗的免疫保护测试表明，国外生产的这种鳗弧菌(O1血清型)灭活疫苗无法预防鳗弧菌MN的感染，这说明使用特定菌株研制生产的疫苗对鱼类的免疫保护作用具有现实意义；另一方面，某些菌株的制备的疫苗比另一些菌株制备的疫苗的免疫保护作用会更有效，潘燕华等(2009)采用鳗弧菌野生强毒株(MVM425)制备福尔马林灭活疫苗，注射免疫牙鲆，其保护率只有60％；肖慧等(2003)在用福尔马林灭活的鳗弧菌制备疫苗腹腔注射免疫鲈鱼，90d后加强免疫一次，其相对保护率也只有78.9％；而经过我们多次的实验证明，鳗弧菌MN菌株的抗原包含针对鳗弧菌的保护性抗原，制备的灭活疫苗抗原对鳗弧菌的感染具有更好的免疫保护效果，灭活疫苗直接注射免疫牙鲆和大菱鲆的RPS均达到89％以上。此外，我们前期对鳗弧菌MN和鳗弧菌3101的比较表明，这两株鳗弧菌虽然种类和血清型相同，但两者在致病力、蛋白组和毒力基因等方面都存在明显差异。上述事实表明，对特定病原的鱼类疫苗的免疫保护力的强弱与制备疫苗所用的病原材料的种株特性密切相关，病原材料的具体种株是疫苗研制的关键要素。鉴于疫苗自身的免疫效果在免疫技术中的决定性作用，而不同疫苗的免疫原性会因其菌株资源不同而导致明显差异，因此，菌株资源在疫苗开发中具有着重要的作用。我们的研究证明，鳗弧菌菌株MN(保藏编号为CGMCC7198)是一株适合制备鳗弧菌疫苗的菌株，该菌株在具有较好的疫苗开发应用价值。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鳗弧菌菌株及其应用，该菌株可以用于制备全菌灭活疫苗，用于不同免疫途径，可有效提高鲆鲽类的体液免疫水平，发挥抗御病原菌感染的作用。 

一种鳗弧菌菌株MN，所述菌株的分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，所述菌株于2013年1月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏 编号为CGMCC No.7198，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 

所述鳗弧菌菌株分离自患败血症的大菱鲆体内，分离时根据其分离地点命名菌株代号为MN。采用AFLP和血清学测定，分别与标准菌株ATCC43305(O1血清型)和ATCC43306(O2血清型)行比较，确定鳗弧菌MN菌株血清型为O1型。 

经测试表明，鳗弧菌菌株MN为革兰氏阴性，弯或直短杆状，具单根或多根极生鞭毛，可运动，大小(见图1)为(0.5-0.8)μm×(1.5-2.0)μm，无芽孢。在TSB(0.3％植物蛋白胨，1.7％胰蛋白胨，0.25％ K₂HPO₄，0.5％ NaCl，0.25％葡萄糖，pH7.3±0.2)和2216E(0.1％酵母提取物，0.5％胰化蛋白胨，0.01％ FePO₄，3.4％ NaCl，pH7.6-7.8)培养平板上菌落呈圆形光滑，半透明，边缘整齐，表面光滑略隆起，呈浅橘黄色；TCBS培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，北京陆桥技术有限责任公司)上呈半透明、圆形、黄色菌落。 

本发明制备了鳗弧菌MN菌株的灭活疫苗，采用该灭活疫苗进行鱼体的免疫应用实验表明，鳗弧菌MN菌株的抗原包含针对鳗弧菌的保护性抗原，适于作为鳗弧菌疫苗的生产菌株得到应用。在实际免疫应用中，根据受免鱼的个体存在差异，抗原的有效剂量的范围，应根据实验数据来进行确定。制备的灭活疫苗抗原通过单纯的腹腔注射免疫牙鲆、大菱鲆的RPS达到80-90％，在本研究中的牙鲆的注射剂量分别为1×10⁷CFU/尾和1×10⁶CFU/尾，结果显示，免疫剂量为1×10⁷CFU/尾的腹腔注射组效果要高于后组，结合免疫佐剂如黄芪皂苷等的RPS能达到90％以上；与之相比，采用一种鳗弧菌(O1血清型)的商品化灭活疫苗对大菱鲆幼鱼进行免疫接种，5周后采用我们分离的鳗弧菌进行攻毒(攻毒剂量50LD50)，与生理盐水免疫的对照组相比，受免鱼在2周内的死亡速度减缓，但最终RPS不到8％。灭活鳗弧菌MN疫苗抗原通过结合平平加通过浸浴免疫大菱鲆，浸浴时间10min，免疫剂量为1×10⁸CFU/尾，免疫30d后，用鳗弧菌MN菌液按照4个浓度梯度攻毒大菱鲆，平平加组在10d内的死亡速度比较缓慢，相比较空白对照组的RPS约为66％，显著高于浸泡免疫组的RPS(17％)，提高了大菱鲆抗鳗弧菌的免疫应答。口服免疫对疫苗的免疫剂量要求很大，根据试验证明，连续投喂大菱鲆使其免疫剂量达到1×10⁹CFU/尾时，疫苗的RPS可以达到27-34％要高，灭活疫苗结合免疫佐剂黄芪皂苷添加于配合饲料中，口服免疫接种大菱鲆的RPS能达到58-65％；采用微囊包裹灭活疫苗进行口服免疫牙鲆，RPS也达到40-55％以上，免疫程序为连续投喂大菱鲆 

经过我们的多次的实验证明，用该菌株的灭活的细胞、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物等制备的疫苗主要引起体液免疫反应，可以有效预防致病性鳗弧菌的感染，其中产生的抗体在防止感染及随后的症状中起 主导作用，能够提高海水养殖鱼类抵御病原菌感染能力等多种生物学功能。采用注射免疫、创伤免疫浸泡免疫和口服免疫等方式对养殖鱼类进行免疫接种，对牙鲆，大菱鲆等海水养殖鱼类都具有很高的免疫保护效果。制备的疫苗抗原在免疫应用中可以单独使用，也可以与佐剂混合使用，也可以制成单一制剂但与佐剂同时使用，还可以与佐剂不同时使用。 

本发明的鳗弧菌MN菌株的灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物等制备的疫苗可免疫接种于多种鱼类，包括海水养殖鱼类(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河纯等)、半咸水养殖鱼类(如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等)、洄游鱼类(如鳗鲡、小黄鱼等)、淡水养殖鱼类(如青鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鳜鱼、鲟鱼、澳洲宝石鲈等)、观赏鱼(如金鱼、锦鲤等)。不同的鱼种的免疫接种时，鱼体的种类、年龄、接种方式直接影响着疫苗的免疫效果，同时抗原的免疫剂量有所不同对免疫效果也产生很大影响，对于特定水生动物及特定抗原的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。 

本发明的积极效果在于：本发明找到了具有较高毒力的鳗弧菌菌株MN具有鳗弧菌的保护性抗原，适合用于制备鳗弧菌的疫苗抗原，用该鳗弧菌菌株所制备的疫苗能能通过注射、浸泡或口服途径在受免疫的海水养殖鱼类体内引发有效地免疫保护反应，使受免动物获得很高的免疫保护力。因此本发明所涉及的鳗弧菌MN菌株的特征使其具有很好的疫苗开发应用价值，其应用所产生的疫苗产品可用于海水养殖鱼类的弧菌病的安全有效预防，降低养殖产业因病害所导致的损失，减少或消除由于弧菌病发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，显著提高水产养殖动物及其产品的安全，防止病原菌抗药性增加所带来的生物安全风险。 

附图说明

图1鳗弧菌MN原子力显微镜三维图。 

图2鳗弧菌MN的脂肪酸图谱：横坐标表示色谱相对保留时间(min)，纵坐标表示色谱峰高值；第1个色谱峰为溶剂波峰。 

图3是鳗弧菌MN菌株16SrRNA序列系统发育树。 

图4是基于鳗弧菌MN菌株OmpU基因序列构建的系统发育树。 

图5是基于鳗弧菌MN菌株PrtV基因序列构建的系统发育树。 

图6是鳗弧菌MN的InDel在鳗弧菌I染色体的分布图。 

图7是鳗弧菌MN的InDel在鳗弧菌II染色体的分布图。 

图8是鳗弧菌MN的SNP在鳗弧菌I染色体的分布图。 

图9是鳗弧菌MN的SNP在鳗弧菌II染色体的分布图。 

具体实施方式

实施例1：鳗弧菌MN的分离 

取患出血病症状典型的濒死大菱鲆，用70％酒精棉球对病鱼体表消毒后，用1m无菌注射器尾静脉采血后立即于超净工作台上涂布TSB培养基平板；然后用无菌剪刀剪开腹腔并取出病鱼肝、肾、脾等组织小块于1mL无菌离心管中，在超净工作台上用无菌生理盐水反复冲洗组织块，以减少体表细菌的污染干扰，剪碎后划线接种于TSB培养基平板；28℃下恒温培养24h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行分离纯化，斜面保存，同时将纯化后的优势菌接种至TSB和TCBS培养基上28℃培养24-48h，鳗弧菌MN在TSB培养平板上菌落呈圆形光滑，半透明，边缘整齐，表面光滑略隆起，呈浅橘黄色；TCBS培养平板上呈半透明、圆形、黄色菌落。 

实施例2：鳗弧菌MN的培养 

鳗弧菌MN可以在胰大豆蛋白胨培养基(TSB)、2216E海水培养基和TCBS培养基中进行培养，培养方法如下：从-80℃保存的菌种复苏，活化，挑取少量划线于上述培养基的固体平板，培养温度为28℃。该菌在胰大豆蛋白胨培养基(TSB)和2216E琼脂平板中，28℃培养24h后可形成直径大于0.5mm的浅橘黄色菌落，形态呈圆形光滑，半透明，边缘整齐，表面光滑略隆起；在TCBS培养基上28℃培养24h后可形成直径约0.5mm的黄色半透明圆形菌落。取一单菌落接种于装有10ml鳗弧菌MN种子培养液(酵母膏0.1％，胰蛋白胨0.5％，FePO4 0.0001％，陈海水，pH为7.6-7.8，121℃高压灭菌15min)中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养12h，获得种子液并转接到装有200ml鳗弧菌MN种子培养液的锥形瓶中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养12h，再把扩大培养到种子液转接于装有鳗弧菌MN发酵液的50L在位发酵罐中发酵培养，发酵温度控制在28±2℃；发酵液OD₆₀₀值达到1.8时，终止发酵；获得新鲜发酵菌液。 

实施例3：鳗弧菌MN的碳源代谢分析 

鳗弧菌MN在2216E培养20h后，将培养物分别接种到BuG Agar培养基(

France)上，28℃恒温培养24h。转接入Eco板(

France)培养24h。用Biolog细菌鉴定仪上进行检测，在31种供试碳源中如表1所示：鳗弧菌MN可利用的有：β-甲基 D-葡萄糖苷、a-环式糊精、N-乙酰基-D-葡萄胺等13种碳源，不可利用的有D-半乳糖内酯、L-精氨酸、y-羟基丁酸等18种碳源。碳源代谢特征符合鳗弧菌属性，同时具有该菌株自身的特征。 

表1鳗弧菌MN碳源反应鉴定结果 

注：“+”为阳性，“-”为阴性。 

实施例4：鳗弧菌MN菌株药敏试验 

采用纸片扩散法，将培养24h的鳗弧菌MN菌株以无菌PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，10mM KH₂PO₄，调pH为7.4，121℃高压灭菌15min)从固体平板上洗下，制成1.5×10⁸CFU/mL的菌悬液，取80μL 菌悬液涂布于2216E培养基平板，用无菌镊子将抗生素纸片(杭州微生物试剂有限公司)贴在平板表面，28℃恒温培养48h后观察抑菌圈直径的大小。试验结果见表2所示，鳗弧菌在所试14种抗生素中，以菌必治、庆大霉素、链霉素、阿奇霉素、氟哌酸、多粘霉素B和痢特灵等7种抗生素的抑制作用极强。鳗弧菌MN药敏谱表现出该菌株部分遗传特征，该菌对水产养殖常用抗生素，如四环素、利福平等存在抗性，表明抗生素的滥用可能带来微生物抗药性扩散的风险。 

表2药敏试验结果 

注：S为高度敏感；I为中度敏感；R为不敏感。 

实施例5：鳗弧菌MN的脂肪酸分析 

(1)鳗弧菌MN培养物的脂肪酸提取：将鳗弧菌MN培养物接种于TSBA固体培养基(北京陆桥技术有限责任公司)上，28℃培养约24h；将收集的约40mg的菌落悬浮于1.0mL溶液I(45g氢氧化钠溶于150mL甲醇及150mL蒸馏水)中，沸水浴5min，震荡5-10s，再沸水浴25min；冷却后，加入2.0mL溶液II(97.5mL浓盐酸，137.5mL甲醇溶于6mL蒸馏水)，震荡5-10s，80℃水浴加热10min，快速冷却至常温；在冷却的样品管中加入1.25mL溶液III(200mL正己烷与200mL甲基叔丁基醚混合均匀)，快速振荡10min左右，弃去下层水相；在剩余有机相中加入3mL溶液IV(10.8克氢氧化钠溶于900mL蒸馏水)及几滴溶液V(饱和氯化钠溶液)，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。 

(2)细菌脂肪酸分析：取一支6850气相色谱仪(Agilent Technologies)的样品内插管置于样品瓶中，快速加入样品溶液250μL，使内插管液面达到样品瓶的1.0-1.5mL左右，并立即将瓶盖拧紧。在6850气相色谱仪自动进样器上放置含样品和标准品(脂肪酸甲酯)的样品瓶，在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯标样和待检样本：二阶程序升高柱温，载体为氢气(42cm/sec)，柱箱温度为150℃保持4min，250℃，再以4℃/min的速度升温至250℃，分流进样1∶100，氮气尾吹气为30mL/min。所得脂肪酸分析数据在细菌脂肪酸细菌鉴定系统(AgilemTechnologies)中比对，同时根据所得脂肪酸图谱分析菌株的特征性脂肪酸。 

(3)特征性脂肪酸结果分析：用气相色谱仪分析鳗弧菌MN(图1)，结果表明，鳗弧菌MN在1.735-15.945min的保留时间范围内出现38个脂肪酸洗脱峰，根据与标准品的比对，表明其中最主要的脂肪酸包括12∶0、12∶0 3OH、14∶0、16∶0iso、16∶0、17∶1w8c和18∶0(表3)，符合鳗弧菌的鉴定标准，也具有该菌株自身特有的特征。 

表3鳗弧菌MN主要特征性脂肪酸出峰相对保留时间 

注：RRT为相对保留时间(min)。 

实施例6：鳗弧菌MN菌株16S rRNA基因扩增及其序列分析 

(1)细菌DNA的制备：细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行DNA提取。 

(2)PCR扩增：采用细菌16S rRNA基因的通用引物(27F/1492R)进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下： 

上述的反应体系中的

(Version 2.0)购自Takara生物工程有限公司。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸8min，1个循环。所获DNA片段用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化后，由济南力戈科技有限公司进行DNA测序。考虑测序中，荧光染料的干扰可导致引物3′端后面的几十个碱基不一定能够准确判读的因素，实际序列比对中，对所获得的测序序列(1437bp)起始和末尾的20bp碱基进行了去除，对剩下的1397bp碱基的序列(SEQ ID NO：1)进行了系统发育学分析，结果可以确定扩增的PCR产物序列是鳗弧菌16S rRNA基因的序列，同时鳗弧菌MN的16S rDNA序列也反映出该菌株与其他鳗弧菌株存在差异。 

(3)测得的鳗弧菌MN菌株的16S rRNA在GenBank上进行BLAST，对获得的同源序列进行序列分析，结果表明，同源性较高的前100个序列为弧菌属细菌或不可培养的细菌，MN与它们的同源性在99％～100％，鳗弧菌MN的16S rRNA序列只与Vibrio anguillarum _CP002284.1的相似性达100％。选取24条GenBank数据库中弧菌属菌株16S rRNA序列用Clustalx1.83软件进行多序列比对进行分析，采用MEGA 4.0软件中的邻接法(Neighbor-joining，Saito，1987)构建系统进化树。见图2，鳗弧菌MN与弧菌属的鳗弧菌自然聚为一簇。根据BLAST比对和系统发育树结果，在传统鉴定结果的基础上可进一步确定MN菌为鳗弧菌。 

实施例7：鳗弧菌MN灭活菌体疫苗制备 

(1)从-80℃保存的菌种复苏，活化，挑取少量划线于2216E固体培养基，在28℃培养24h获得单菌落，取一单菌落接种于鳗弧菌MN种子培养液中，28℃摇瓶培养24h获得种子液，再把种子液接种于装有鳗弧菌MN发酵液的50L在位发酵罐中发酵培养，发酵温度控制在28±2℃；发酵液OD₆₀₀值达到1.8时，终止发酵；获得新鲜发酵菌液；以体积比为0.5％福尔马林溶液(37％)常温灭活24h；高速离心机8000g离心10min，无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，制得鳗弧菌MN疫苗。 

(2)疫苗的安全性检测：取0.1mL鳗弧菌MN疫苗涂布于2216E平板上，28℃恒温培养箱培养48h，观察没有菌落长出，及证明菌液灭活完全。灭活疫苗以无菌PBS配制的菌液浓度分别为4×10⁷CFU/mL、4×10⁸CFU/mL和4×10⁹CFU/mL。各浓度灭活疫苗分别腹腔注射10尾健康的健康供试养殖鱼类，接种量为0.1mL/尾，注射0.1mL的PBS为空白对照，观测14天内鱼的健康状况及存活情况。与对照相比，各种接种浓度的鱼均无不良反应，生存良好其摄食、运动等无异常，说明疫苗符合安全要求的，可用于后续试验。 

实施例8：鳗弧菌MN对牙鲆半致死剂量(LD₅₀)测定 

(1)鳗弧菌MN培养：取一单菌落接种于装有10ml鳗弧菌MN种子培养液中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养12h；获得种子液并转接到装有200ml鳗弧菌MN种子培养液的锥形瓶中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养12h；发酵液OD₆₀₀值达到1.0时，终止发酵；获得新鲜发酵菌液；6000rpm，4℃离心10min收集菌体，以无菌PBS(pH7.4)洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成1×10⁹CFU/mL菌悬液。 

(2)试验鱼饲养及管理：健康牙鲆体长10.0±2.0cm，体重18.0±2.7g。水温19±1℃，盐度28±2，流水养殖，全天连续充气，并定时投喂颗粒饲料驯化暂养2周。暂养期间需要对购买牙鲆进行健康检测。 

(3)试验分组：将新鲜培养的菌液(1×10⁹CFU/mL)用无菌PBS对菌液进行10倍系列稀释，分为5组，另设一组腹腔注射无菌PBS作为对照组。每组牙鲆20尾。定时观察牙鲆发病的症状并记录死亡情况。 

(4)统计与分析：随机取1尾人工感染后濒死牙鲆的内脏器官进行细菌的再分离观察，在TCBS培养基上呈半透明、圆形、黄色菌落，可以初步确定为牙鲆感染弧菌致死。对特征性优势菌落纯化后进行16S rRNA基因部分序列，结果确定牙鲆感染鳗弧菌致死。实验观察2 周，各组牙鲆死亡数见表4，用加减距离比方法可计算出鳗弧菌在水温20±1℃时，LD50为1时，每尾实验牙鲆的接种剂量是1.58×10⁵CFU。 

表4牙鲆人工感染实验结果 

实施例9：鳗弧菌MN对大菱鲆半致死剂量(LD₅₀)测定 

(1)鳗弧菌MN培养：取一单菌落接种于装有10ml鳗弧菌MN种子培养液中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养12h；获得种子液并转接到装有200ml鳗弧菌MN种子培养液的锥形瓶中，28℃恒温培养箱，180rpm振荡培养12h；发酵液OD₆₀₀值达到1.0时，终止发酵；获得新鲜发酵菌液；6000rpm，4℃离心10min收集菌体，以无菌PBS洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成1.5×10⁹CFU/mL菌悬液。 

(2)试验鱼饲养及管理：选用健康大菱鲆(7.0±2.7g)，体长8.0±1.0cm cm。养殖管理同实施例8。 

(3)试验分组：将新鲜培养的菌液(1.5×10⁹CFU/mL)用无菌PBS对菌液进行10倍体积系列稀释，分为5组，另设一组腹腔注射无菌PBS作为对照组。每组大菱鲆30尾。定时观察牙大菱鲆发病的症状并记录死亡情况。 

(4)统计与分析：随机取1尾人工感染后濒死大菱鲆的内脏器官进行细菌的再分离观察，在TCBS培养基上呈半透明、圆形、黄色菌落，可以初步确定为大菱鲆感染弧菌致死。对特征性优势菌落纯化后进行16S rRNA基因部分序列，结果确定大菱鲆感染鳗弧菌致死。实验观察2周，各组大菱鲆死亡数见表5，用加减距离比方法可计算出鳗弧菌在水温20±1℃时，LD50为1时，每尾实验大菱鲆的接种剂量是8.51×10⁴CFU。 

表5大菱鲆人工感染实验结果 

实施例10：鳗弧菌MN灭活疫苗的腹腔注射免疫牙鲆应用 

(1)试验用鱼及养殖管理：牙鲆200尾，体长10.0±2.0cm，体重18.0±2.7g。养殖管理同实施例8。 

(2)将鳗弧菌MN灭活疫苗用灭菌的PBS稀释成菌液浓度分别为4×10⁷CFU/mL、4×10⁸CFU/mL和4×10⁹CFU/mL。各浓度灭活疫苗分别腹腔注射10尾健康的牙鲆，接种量为0.1mL/尾，注射0.1mL的PBS为空白对照，观测14天内鱼的健康状况及存活情况。与对照相比，各种接种浓度的鱼均无不良反应，生存良好其摄食、运动等无异常，说明疫苗符合安全要求的，可用于后续试验。 

(3)实验设计：暂养期过后将实验牙鲆分为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组有30尾牙鲆，实验组为腹腔注射鳗弧菌MN灭活疫苗，注射剂量为0.1mL，浓度为4×10⁸CFU/mL，注射0.1mL的PBS为空白对照投组。免疫30d后，以10LD50/尾的剂量分别对实验组和对照组牙鲆进行腹腔注射攻毒，记录鳗弧菌感染阶段每日牙鲆的死亡数量，并计算感染14d内牙鲆的累计死亡率及腹腔注射鳗弧菌MN灭活疫苗免疫14d后牙鲆的相对保护率。 

结果显示：与对照组相比，鳗弧菌MN灭活疫苗可以显著降低对牙鲆的死亡率，相对免疫达到89.7％，有效保护了牙鲆抗鳗弧菌的感染能力。 

实施例11：鳗弧菌MN灭活疫苗的腹腔注射免疫大菱鲆应用 

(1)大菱鲆150尾，体长6.8±1.2cm，体重4.4±1.8g。养殖管理同实施例8。 

(2)将鳗弧菌灭活疫苗用灭菌的PBS(pH7.4)稀释成菌液浓度分别为4×10⁷CFU/mL、4×10⁸CFU/mL和4×10⁹CFU/mL。各浓度灭活疫苗分别腹腔注射10尾健康的大菱鲆(4.4±1.8g)，接种量为0.1mL/尾，注射0.1mL的PBS为空白对照，观测14天内鱼的健康状况及存活情况。与对照相比，各种接种浓度的鱼均无不良反应，生存良好其摄食、运动等无异常，说明疫苗符合安全要求的，可用于后续试验。 

暂养期过后将实验大菱鲆分为实验组和对照组2个处理组，每个处理组有3个平行，每个平行组有20尾大菱鲆，实验组为腹腔注射鳗弧菌MN灭活疫苗，注射剂量为0.1mL，浓度为4×10⁸CFU/mL，注射0.1mL的PBS为空白对照投组。免疫30d后，以10LD50/尾的剂量分别对实验组和对照组大菱鲆进行腹腔注射攻毒，记录鳗弧菌感染阶段每日大菱鲆的死亡数量，并计算鳗弧菌感染14d内大菱鲆的累计死亡率及腹腔注射鳗弧菌MN灭活疫苗免疫大菱鲆的相对保护率。 

结果显示：与对照组相比，鳗弧菌MN灭活疫苗可以显著降低对大菱鲆的死亡率，相对免疫达到89.5％，有效保护了大菱鲆抗鳗弧菌的感染能力。 

实施例12：微囊包裹鳗弧菌MN灭活疫苗的口服免疫牙鲆应用： 

(1)试验用鱼及养殖管理：体长10.0cm±2.0cm，体重18.0g±2.7g。养殖管理同实施例8。 

(2)微囊处方：以浓度为5％的Eudragit S100作为囊材，用于包裹囊心物；单硬脂酸甘油脂作为抗粘剂，以减少微囊间的粘连及防止微囊粘在喷雾干燥机雾化室的壁上，保证微囊的质量；PEG6000作为增塑剂增加微囊的机械性能。疫苗：糊精(1∶9)作为囊心物，囊心物(淀粉和疫苗的总量)与囊材的比为1∶3。 

(3)微囊包裹鳗弧菌MN灭活口服疫苗饲料。 

将制备好的鳗弧菌全菌灭活疫苗干粉放在高速万能粉碎机中，在转速24000r/min的条件下粉碎，将粉碎物过80目筛得到粉末。将过筛后的粉末与糊精按1∶9的比例混匀，然后放到粉碎机中，在转速24000r/min的条件下再次粉碎，以便疫苗与糊精得到更充分均匀的混合，以疫苗与糊精(1∶9)的混合粉末作为喷雾干燥的囊心物。 

试验随机分为9组，每组100尾，投喂普通饲料组作为空白对照组；腹腔注射免疫组作为阳性对照组，注射剂量为0.1mL/尾；口服疫苗免疫组和微囊包裹口服疫苗免疫组作为实验组。免疫试验分组见表6。 

表6牙鲆免疫试验分组 

(4)免疫方法：试验期间用以上各组饲料连续投喂牙鲆。 

(5)免疫后攻毒：免疫30天后，牙鲆采用10倍LD₅₀剂量的新鲜鳗弧菌MN菌液进行人工感染试验，感染方式为腹腔注射(2.58×10⁶CFU/尾)感染。 

攻毒后14天统计各试验组相对保护率，根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS，结果见表7。 

表7免疫牙鲆相对保护率 

用1×10⁶CFU/尾的鳗弧菌剂量对免疫的牙鲆进行攻毒，结果表明发病症状的鱼较对照组要少，腹腔注射免疫组以1×10⁷CFU/尾和1×10⁶CFU/尾剂量免疫牙鲆，其相对保护率达到89.7％，86.2％。微囊口服疫苗免疫剂量1×10⁸CFU/尾，1×10⁷CFU/尾时比普通口服疫苗效果要好，但是在免疫剂量为1×10⁶CFU/尾时两种口服免疫都不具有保护力，因此在口服免疫中免疫剂量与免疫的效果成正相关性。 

实施例13：鳗弧菌MN灭活疫苗联合黄芪甲苷的口服免疫接种大菱鲆 

(1)试验用鱼及养殖管理：选用健康大菱鲆(7.0±2.7g)，体长8.0±1.0cm cm。养殖管理同实施例8。 

(2)黄芪皂苷对大菱鲆口服安全剂量的确定：将不同浓度的黄芪皂苷添加于粉碎后的大菱鲆配合饲料中，混匀后制成颗粒饲料，连续投喂大菱鲆，每组20尾，观察14天，确定黄芪皂苷对大菱鲆口服安全剂量为20mg/尾，即2857.1μg/g(黄芪皂苷/鱼体重)。 

(3)试验分组：对健康大菱鲆进行随机分组，各组设3个平行组，每平行组60尾。试验设对照组(投喂配合饲料)、鳗弧菌MN灭活疫苗组、不同剂量黄芪皂苷组、不同剂量的黄芪皂苷与鳗弧菌MN灭活疫苗配伍组，免疫试验分组见表8。 

表8大菱鲆免疫试验分组 

(4)免疫方法：试验期间用以上各组饲料连续投喂大菱鲆。 

(5)免疫后攻毒：免疫30天后，大菱鲆采用10倍LD₅₀剂量的新鲜鳗弧菌MN菌液进行人工感染试验，感染方式包括腹腔注射(2.58×10⁶CFU/尾)和浸泡(5×10⁷CFU/mL)感染。 

攻毒后14天统计各试验组相对保护率，根据公式RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。计算RPS，结果见表9。 

表9黄芪皂苷为鳗弧菌灭活疫苗免疫佐剂对大菱鲆的免疫保护效果(平均值±标准差) 

试验结果表明，单纯用鳗弧菌MN灭活疫苗口服免疫对大菱鲆的免疫保护效果较低，其注射攻毒和浸泡攻毒RPS为21.2％和27.5％，单纯在饲料中分别添加714.3、1428.6和2857.1μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷时，其产生的免疫保护效果与灭活疫苗相近。将714.3、1428.6和2857.1μg/g(佐剂剂量/体重)黄芪皂苷与灭活疫苗配伍添加至饲料中，口服免疫大菱鲆可以提高RPS，其中以1428.6μg/g(佐剂剂量/体重)的黄芪皂苷与灭活疫苗配伍时具有较好的免疫保护作用，其注射攻毒和浸泡攻毒的RPS分别达到53.8％和58.8％。该剂量黄芪皂苷也具有相对较好的适口性。以上结果证明添加佐剂的鳗弧菌MN灭活疫苗通过口服免疫接种对海水鱼具有较好的免疫保护效果。 

实施例14：鳗弧菌MN灭活疫苗的浸浴免疫大菱鲆应用 

(1)大菱鲆360尾，平均体长11.8cm，平均体重为41.2g。养殖管理同实施例8。 

(2)鳗弧菌灭活疫苗制备参见实施例11。 

(3)免疫程序设计：实验鱼随机分为8组，每组45尾，注射免疫组作为阳性对照组，注射剂量为0.1mL，浸浴时间10min，见表10。 

表10实验分组设计 

(4)攻毒实验和结果：免疫30d后用鳗弧菌攻毒大菱鲆，每组设置4个攻毒梯度，注射剂量为0.1mL，记录攻毒10d内各组的死亡情况，并计算免疫保护指数(Protection indices，PI)。 

PI＝免疫鱼的LD50/对照鱼的LD50 

表11免疫试验感染结果 

由上表11可以看出，浸浴免疫组的PI值为1.63，相比较空白对照组提高了大菱鲆抗鳗弧菌的免疫应答，此外两组高盐浸泡免疫的PI值都为2.57，显著高于浸泡免疫组，而平平加浸泡免疫组(39.3mg/L)的PI值为6.61，在2.2×10⁶CFU的攻毒剂量下，RPS约66％。在浸泡免疫中的免疫效果最高，不过其PI值却低于注射免疫组的33.6。 

实施例15：鳗弧菌MN的OmpU基因扩增、测序及其系统发育树的构建 

霍乱弧菌和费氏弧菌在肠道的定殖过程中，主要外膜蛋白(OmpU)起着重要的粘附作用(Sperandino，1995)，同时OmpU能够抑制胆汁的分泌而使鳗弧菌能够在在肠道内生存和定殖(Aeckersberg，2001)。通过鳗弧菌蛋白组学的2D电泳比对，相对于本实验室分离的一 株鳗弧菌弱毒株3101，OmpU能够在强毒株鳗弧菌MN中高表达(Zhao，2012)，表明OmpU是鳗弧菌MN的一个特征性表达的蛋白，OmpU在鳗弧菌MN的致病力和免疫保护力方面有可能起着重要的作用。 

(1)细菌DNA的制备：同实施例6。 

(2)PCR扩增：根据鳗弧菌MN菌株(GenBank：FJ573227.1)的序列，设计用于扩增OmpU基因序列的引物，引物序列如下： 

OmpU-F 5’-CTGGTGAGCTATACAACCAAGACGG-3’ 

OmpU-R 5’-ACCATCAACAAAAGTACCAGCGAAG-3’ 

PCR扩增反应体系 

PCR方法反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。所获PCR产物经实施例5中的相同步骤，最终获得DNA序列(SEQ ID NO：2)，系统发育学分析结果表明该650bp碱基的扩增序列即为鳗弧菌MN菌株OmpU基因的序列。 

(3)将测得的鳗弧菌MN菌株OmpU基因ompU序列在GenBank上进行BLAST，对获得的同源序列进行序列分析.鳗弧菌MN菌株ompU与鳗弧菌弱毒株3101的ompU和下载的16条NCBI GenBank数据库中弧菌属菌株ompU序列用Clustalx1.83软件进行多序列比对进行分析，采用MEGA 4.0软件中的邻接法(Neighbor-joining，Saito，1987)构建系统进化树，构建ompU的系统发育树。结果(图3)显示鳗弧菌MN强毒菌株的ompU与其他5条鳗弧菌株的ompU聚成一簇，但只与Listonella anguillarum(EU376524)和Listonella anguillarum(AY157299.1)的亲缘较近，与鳗弧菌弱毒株3101的ompU的亲缘性较远，与Vibrio splendidus (AFWG01000011.1)和Vibrio tubiashii(AHHF01000098.1)的ompU的亲缘性最远。鳗弧菌MN的ompU具有一定的独特性。 

实施例16：鳗弧菌MN菌株PrtV基因的扩增、测序及其系统发育树的构建 

金属蛋白酶PrtV具有细胞毒性效应，能够杀死细胞(Vaitkevicius，2006)，同时它可以降解细胞外基质中的小型元件，如纤连蛋白、纤维蛋白原和纤溶酶原等(Vaitkevicius，2008)，最新研究还证明了prtV在鳗弧菌的致病机理当中发挥了重要作用(Mo，2010)，通过两株鳗弧菌比较蛋白组学的2D电泳比对，相对于鳗弧菌弱毒株3101，PrtV能够在强毒株鳗弧菌MN中高表达(Zhao，2012)，表明PrtV是鳗弧菌MN的一个特征性表达的蛋白，PrtV在鳗弧菌MN的致病力和免疫保护力方面有可能起着重要的作用。 

(1)细菌DNA的制备：同实施例6。 

(2)PCR扩增：根据鳗弧菌MN菌株(GenBank：GQ118991)的序列，设计用于扩增PrtV基因序列的引物，引物序列如下： 

PrtV-F 5’-CTATAGCGCTCAGTCGTATGGAAATC-3’ 

PrtV-R 5’-CGAGGCGTTGGAAAGGTTAAGT-3’ 

PCR扩增反应体系参见实施例5。PCR方法反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。所获PCR产物经实施例3中的相同步骤，最终获得DNA序列(SEQ ID NO：3)，系统发育学分析结果表明该575bp碱基的扩增序列即为鳗弧菌MN菌株PrtV基因prtV的序列。 

(3)将测得的鳗弧菌MN菌株的金属蛋白酶基因prtV序列在GenBank上进行BLAST，对获得的同源序列进行序列分析.鳗弧菌MN强毒菌株的prtV与鳗弧菌3101弱毒株的prtV和下载的16条NCBI GenBank数据库中弧菌属菌株prtV序列用clustalx1.83软件进行多序列比对进行分析，采用MEGA 4.0软件中的邻接法(Neighbor-joining，Saito，1987)构建系统进化树。结果(图4)显示鳗弧菌MN菌株的prtV与Listonella anguillarum(GQ118991.1)、Listonella anguillarum(EU984502.1)和Vibrio furnissii(CP002378.1)3条弧菌菌株的prtV聚成一簇，但是确与Vibrio furnissii(CP002378.1)的亲缘最近，与Vibrio anguillarum 3101弱毒株的PrtV基因的亲缘性较远，同时鳗弧菌MN菌株的prtV与Listonella anguillarum(EU650390.1)和Vibrio anguillarum(CP002285.1)的prtV序列分别聚成一簇，亲缘性相差很远。由此可以说明，在弧菌菌株中prtV的序列比较中，鳗弧菌MN菌株具有其一定的独特性。 

实施例17：鳗弧菌MN菌株细菌基因组与已知参考序列基因组比较 

采用Miseq技术平台对鳗弧菌MN菌株进行全基因组重测序。测得的数据进行质量过滤后，以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)775(NC_015633.1和NC_015637.1)为参考序列基因组，对鳗弧菌MN菌株测得数据进行分析。其中，InDel和SNP的检测采用Breseq(0.21version)管道系统，对鳗弧菌MN得到的数据进行整理(见图5-8)，其中Insertion位点数量为122，Deletion位点数量为159，SNP位点数量为559。由此表明，鳗弧菌MN菌株与鳗弧菌775在全基因组序列中存在一定的差异，具有其独特的特征。 

Claims (10)

1.一种鳗弧菌菌株，其特征在于，所述菌株保藏编号为：CGMCC No.7198。

2.如权利要求1所述的鳗弧菌菌株，其特征在于所述菌株牙鲆的毒力为：LD50为1时，接种剂量是1.58×10⁵CFU/尾；对大菱鲆的毒力为：LD50为1时，接种剂量是8.51×10⁴CFU/尾。

3.如权利要求1所述的菌株，其特征在于所述菌株的基因16s rDNA、ompU和prtV，碱基序列分别见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，这些基因具有该菌株的特征性。

4.如权利要求1所述的菌株，其特征在于所述菌株为鳗弧菌血清型O1，该菌株可培养于TCBS、TSB或2216E培养基，培养方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，在28℃培养16-24h在平板上获得单菌落，取一表面光滑略隆起的单菌落接种于上述培养基的培养液中，28℃，180r/min摇瓶培养至OD₆₀₀为0.5-0.6即可获得该菌株的新鲜菌液。

5.权利要求1所述的鳗弧菌菌株在制备预防鳗弧菌感染的疫苗中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述疫苗为用所述菌株制备得到的抗原。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的抗原包括灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于使用该菌株制备的抗原的单一成分生产疫苗可或使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产联合疫苗，或将制备成微胶囊包裹疫苗，或将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产疫苗。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所生产的疫苗可以采用注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫等免疫接种方式。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于免疫接种的对象包括多种鱼类，例如海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类、淡水养殖鱼类、观赏鱼类和其它养殖水产动物用于预防经免疫接种的水生动物发生鳗弧菌病。

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