CN106047763A - 鳗弧菌o3血清型菌株及其应用 - Google Patents

鳗弧菌o3血清型菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株鳗弧菌O3血清型菌株及其应用方法，该菌分离自大菱鲆鱼体内，是一株具有较强毒力的野生菌株，其保藏号为：CCTCC M 2016261。该菌的抗原制备方法包括灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、抗原亚单位、抗原基因表达产物的任何一种或一种以上；生产的疫苗可以是使用该菌株制备的抗原的单一成分，也可以是使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗的抗原加佐剂生产疫苗；疫苗应用中疫苗的接种方式可以采用注射免疫、浸浴免疫或口服免疫。

Description

鳗弧菌O3血清型菌株及其应用
技术领域
本发明涉及水产微生物学和免疫学领域，具体涉及一株鳗弧菌(Vibrioanguillarum)O3血清型菌株SMP3及其应用。
背景技术
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)也称鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)，是有鞭毛的革兰氏阴性弯曲短杆状细菌，生长需要盐，无荚膜，不形成芽孢，兼性厌氧，属于弧菌科弧菌属成员。鳗弧菌对多种海水和淡水鱼类有致病性，引起鱼类的出血性败血症，在世界范围内造成了严重的经济损失。已报道可感染的鱼类有：鲑鱼(Salmo salar L)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss,Walbaum)、大菱鲆(Scophthalmus maximus和Psetta maxima)、海鲈(Sparus aurata L)、真鲷(Sparus aurata)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)、欧洲鳗(Anguilla anguilla)、香鱼(Plecoglossus altivelis)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)、丝足鱼(Trichogaster trichopterus)、斑马鱼(Danio rerio)等。该菌也有感染双壳贝类(扇贝，牡蛎)和甲壳类(中国对虾)的报道。以往采用抗生素和化学药物等进行预防和治疗水产细菌病害，诸多问题已经出现，如病原的耐药性、药物残留、食品安全及环境污染等问题。近年来，采用疫苗免疫进行病害控制已被许多国家认可。
鳗弧菌的血清型分型主要依据菌体O抗原的凝集反应特征，各国学者针对对分离自不同鱼类、不同地理位置的鳗弧菌菌株进行了血清分型研究。Pacha(1969)等人将分离自美国太平洋西北鲑鱼的13株鳗弧菌分为3种血清型；Kitao(1983)等人将分离自日本香鱼、鳗鲡、虹鳟的267株鳗弧菌分为6种血清型(A,B,C,D,E,F)，分析结果表明有243株属于A型，均为非致病性菌株；(1986)将来自挪威、丹麦、法国、瑞典、西班牙、英国、意大利、德国、美国、加拿大、日本的495株鳗弧菌菌株分为10种血清型(O1-O10)，其中有270株菌分离自野生和养殖鱼，189株分离自环境，36株分离自无脊椎动物；Pedersen(1999)等人结合菌体O抗原和LPS图谱的特征，在等人研究的基础上将鳗弧菌血清型拓展到23种(O1-O23)，因而目前普遍认为鳗弧菌的血清型至少有23种，对鱼类有致病性的鳗弧菌通常为O1、O2和部分O3血清型菌株。Tiainen(1997)等人进一步结合O抗原凝集和LPS图谱的分析结果，对129株O2血清型菌株进行亚型分型，将其中86％的菌株定为O2a亚型，将12％的菌株定为O2b亚型，有2％的菌株未能定到亚型，说明还可能存在新的亚型。从海水、底泥和植物表面通常分离到O4-O23血清型菌株，它们是非致病性的环境菌株。
上世纪八十年代以来，国内外就开展了许多鳗弧菌疫苗的研究工作，在国际市场上有多种商品化疫苗用于预防鳗弧菌病，如MICROViB,ALPHA MARINETMVibrio，Vibrio，Vibriose Marine，这些疫苗均是为以鳗弧菌O1和O2血清型菌株为抗原组分的灭活二价疫苗，主要用于鲑鱼、虹鳟、鲈鱼、鳕鱼、鲷、鯵、黄魳的养殖，对预防鳗弧菌病具有极好的免疫保护效果。鳗弧菌疫苗的研究也在国内广泛开展，不同研究者采用各自分离的鳗弧菌菌株研制疫苗，其中一些成果已形成专利。如闫斌伦等(2010)的发明(201010290119.9)公开了1种鳗弧菌灭活疫苗的制备方法及其在半滑舌鳎的应用；莫照兰等(2016)的发明专利(C201310165116.6)公开了一种鳗弧菌O1血清型灭活疫苗和一种鳗弧菌二价灭活疫苗；马悦等(2003)的发明(200310109025.7)和孙黎(2012)等的发明(201210292485.7)各自公开了1种鳗弧菌减毒疫苗及其应用。文献报道中，有研究者进行了鳗弧菌疫苗的初步应用实验，如肖慧等人(2003)以分离自发病鲈鱼的1株鳗弧菌W-1制备灭活菌苗，分别浸泡免疫鲈鱼苗和注射成鱼，经疫苗浸泡免疫4周后的鲈鱼苗免疫保护力达64.7％，90d后同批次的鲈鱼再注射免疫，其免疫保护力(RPS)为78.9％，血清中抗体凝集效价为1:192；仅进行注射免疫组，其免疫保护力为57.9％，血清中抗体凝集效价为1：224。肖鹏等人(2007)以两株鳗弧菌为抗原制备了油乳化二价疫苗，通过饵料包埋后连续7天口服免疫大菱鲆鱼，在停止免疫后的第1天，在免疫鱼后肠即可检测到显著提高的溶菌酶和抗蛋白酶活性以及抗体水平，通过原位杂交在免疫鱼后肠粘膜皱褶内检测到IgM抗体，在免疫鱼血清也检测到显著提高的抗体水平，说明该口服疫苗不仅能够有效刺激大菱鲆产生非特异性和特异性反应，还能诱导局部和系统免疫反应，免疫鱼对M3和SMP1的感染分别获得100％和50％的免疫保护率，而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9％和0％。
国际市场上商品化的鳗弧菌疫苗以及部分涉及鳗弧菌疫苗的公开专利多是以O1和O2血清型菌株制备的单价或二价疫苗，国内的公开专利以及文献报道未涉及鳗弧菌疫苗O3血清型疫苗的研制和应用。根据疫苗的特异性免疫保护作用，由不同血清型病原引起的疾病用相应血清型抗原制备的疫苗能够提供较高效的免疫保护。因此有针对性地选择流行性的临床菌株用于疫苗开发是研究人员的共同意识。赵鲁宁等人(2015)的研究发现国内海水养殖鱼类和养殖环境中的流行性鳗弧菌有O1、O2、O3血清型，为开发有针对性的疫苗用于疾病的防治奠定提供了依据。
发明内容
本发明的目的是提供一株鳗弧菌(Vibrio anguillarum)O3血清型菌株SMP3及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种鳗弧菌菌株，鳗弧菌菌株SMP3，其保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武昌珞珈山，保藏日为2016年5月16日，保藏编号为：CCTCC M 2016261。
所述菌株是分离自海水养殖鱼类的野生鳗弧菌菌株SMP3，其O抗原血清型为O3血清型。
所述菌株的16sRNA、toxR、recA基因部分核酸序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3所示。
所述菌株对海淡水鱼类具有较强的致病性，注射攻毒的半数致死剂量为3.0×104-7.6×105CFU/尾。
该菌株可培养于TSB、LB、2216E或TCBS培养基，培养方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的琼脂平板，培养温度为25-30℃，在TSB和LB琼脂平板中，培养24h后可形成直径小于2mm的淡黄色、半透明圆形菌落；在2216E琼脂平板中，培养24h后可形成直径小于1mm的乳白色、半透明圆形菌落；在TCBS平板中，培养24h后可形成直径小于2mm的黄色、圆形凸起菌落。将单菌落接种于上述培养基的培养液中，在25-30℃、120r/min摇瓶条件下，培养12-18h可获得该菌株的新鲜菌液。
该菌株具有氨苄青霉素抗性，可培养于含有氨苄青霉素浓度范围为50-150μg/ml的培养基中。
一种鳗弧菌菌株SMP3在制备鳗弧菌疫苗中的应用。
进一步地说，以所述SMP3菌株抗原为成分，制备疫苗或微胶囊包囊疫苗；
或以所述SMP3菌株抗原再与其它细菌抗原混合作为混合抗原，以混合抗原制备联和疫苗或微胶囊包囊联和疫苗；
或以所述SMP3菌株抗原与佐剂混合制备疫苗；
或以所述SMP3菌株抗原与其它细菌抗原混合作为混合抗原，混合抗原与佐剂混合制备疫苗。
所述SMP3抗原或其它细菌的抗原通过灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、抗原亚单位、抗原基因表达产物的任何一种或一种以上的方式获得。
其中，其它细菌抗原通过灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、抗原亚单位、抗原基因表达产物的任何一种或一种以上的方式获得。
所生产的疫苗可以采用注射免疫、口服免疫、浸泡免疫等免疫接种方式。
其免疫接种的动物包括多种海水和淡水鱼类和其他动物水生动物，用于预防免疫接种的动物发生鳗弧菌病。
本发明所具有的优点在于:本发明获得具有较高毒力的鳗弧菌O3血清型菌株SMP3，SMP3灭活菌苗以108CFU/尾直接注射免疫牙鲆，对鳗弧菌O3血清型感染提供的RPS达到100％，对鳗弧菌O1、O2血清型的病原感染提供的RPS在46.7-56.7％，可见该菌株的抗原包含针对鳗弧菌O3血清型的保护性抗原和针对鳗弧菌O1血清型、鳗弧菌O2血清型的交叉保护性抗原，适合制备鳗弧菌O3血清型的各类疫苗抗原，用SMP3菌株制备的疫苗可通过注射、浸泡或口服途径对鳗弧菌O3血清型感染具有有效的免疫保护作用，对鳗弧菌O1血清型、鳗弧菌O2血清型的感染有较好的交叉免疫保护作用，该菌株可用于不同类型疫苗抗原的制备及其免疫技术中的应用，适合用作疫苗的生产和应用，其应用所产生的疫苗产品可用于海水和淡水养殖鱼类弧菌病的有效预防，降低养殖鱼类由于病害引起的损失，减少抗生素和消毒剂等化学试剂的滥用，防治耐药菌的产生，减少环境污染风险，提高养殖动物和水产品的安全。
附图说明
图1是本发明实施例提供的鳗弧菌SMP3的16SrRNA序列系统发育树。
图2是本发明实施例提供的鳗弧菌SMP3的toxR基因序列系统发育树。
图3是本发明实施例提供的鳗弧菌SMP3的recA基因的序列系统发育树。
图4是本发明实施例提供的鳗弧菌SMP3的hcp基因的克隆和体外表达图；其中，图4A是hcp基因的PCR扩增结果，泳道2为扩增得到的hcp条带；图4B是hcp在大肠杆菌的表达结果，泳道3为未纯化的蛋白，泳道4-6为纯化的Hcp蛋白。
具体实施方式
实施例1：鳗弧菌SMP3的分离和培养
取具有典型出血性败血症状的濒死大菱鲆，用70％酒精棉球对病鱼体表进行消毒，剖解取出病鱼脾、肾、肝等组织块放入1ml无菌EP管，加适量无菌生理盐水后，用研磨小棒研磨病灶组织，取50-100ul病灶组织的匀浆液涂布2216E海水琼脂平板(胰化蛋白胨5g，酵母浸出膏1g，FePO4 0.1g，琼脂20g，pH7.6-7.8，陈海水定容至1L)，25℃培养24-48h，从平板挑取优势菌落中的单菌落进行2-3次重复划线纯化，纯化后的菌落即为鳗弧菌SMP3，保存于试管斜面或重悬在15-20％甘油中保存于-80℃冰箱。
鳗弧菌SMP3在2216E海水琼脂平板生长24h的菌落直径小于1mm的乳白色、半透明、圆形凸起。纯化后的菌落可进行形态特征、生理生化、血清学和分子生物学的鉴定。
鳗弧菌菌株SMP3可以在LB培养基、TSB培养基和TCBS培养基中培养，培养方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的琼脂平板，培养温度为25-30℃，在TSB和LB琼脂平板中，培养24h后可形成直径小于2mm的淡黄色、半透明、圆形凸起的菌落；在TCBS琼脂平板中，培养24h后可形成直径小于2mm的黄色、圆形凸起菌落。将单菌落接种于20ml2216E海水培养基中，在25-30℃、180rpm振荡培养12-18h后作为种子液，将种子液转接于装有5L 2216E液体培养基的发酵灌中发酵培养，发酵温度25-30℃，发酵液OD540为1.6-1.8时终止培养，得到新鲜发酵菌液。
实施例2：鳗弧菌SMP3的生理生化特征和药敏特征
用API ID 32E细菌鉴定系统(法国bioMerieux)和用ATB VET(法国bioMerieux)比较SMP3和鳗弧菌标准菌株ATCC43307(O3血清型)的生理生化特征和药敏特征。菌株在TSA培养24h后，用ATB比浊仪制备浓度为0.5麦氏单位的菌悬液，分别转接入生化试纸条和药敏试纸条，在28℃恒温培养24h，用ATBTM ExpressionTM检测生化反应和药敏反应。生化结果如表1所示，在所测定的32项生理生化反应中，SMP3和ATCC43307有22项反应特征相同，有10项反应特征有所不同，即在鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、β-葡萄糖苷酶、吲哚、葡萄糖、L-阿拉伯糖、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、5-酮基葡萄糖酸钠、麦芽糖的反应不同，说明SMP3菌株的生理生化反应具有鳗弧菌的特征，同时具有该菌株自有的特征。
表1鳗弧菌SMP3的API ID 32E鉴定结果
药敏结果如表2所示，在所检测的28项药物中，SMP3和ATCC43307对氟甲喹、奥索利酸、依氟沙星、呋喃妥因、大观霉素、卡那霉素、庆大霉素、安普霉素等8种抗生素敏感，对红霉素、林可霉素、原始霉素、夫西地酸、甲硝唑、青霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢噻吩、头孢哌酮等11种抗生素不敏感，两株菌的药物敏感谱表现出该菌特有的遗传特征。SMP3对水产常用抗生素，如利福平、四环素等存在抗性，表明抗生素的应用带来了微生物耐药的风险。
表2鳗弧菌SMP3的ATB VET检测结果
MIC，最小抑制浓度；R，耐药；S，敏感
实施例3：鳗弧菌菌株SMP3的血清型分析
(1)标准鳗弧菌菌株O抗原制备。将5种血清型的鳗弧菌标准菌株ATCC43305(O1血清型)、ATCC43306(O2血清型)、ATCC43307(O3血清型)、ATCC43308(O4血清型)、ATCC43309(O5血清型)的菌种分别划线接种到TSA平板，在25-28℃培养24h，从每种菌株中挑取单个菌落分别培养在5ml TSB培养基中,在28℃、180rpm震荡培养12-18h后，分别转接100ml TSB，在25-28℃培养24h，每种培养物在4℃、4000rpm离心10min，收集细菌，用无菌PBS重悬至～108CFU/ml，置100℃水浴2～2.5h，即得到5种鳗弧菌标准血清型菌株的O抗原，放4℃冰箱存储备用。
(2)兔抗血清制备。1.5-2kg新西兰大白兔12只，平均分成6组，每组2只。每种O抗原与完全弗氏佐剂等量混合并乳化，制成乳化抗原，在对应组兔子的颈部、背部、后腿的肌肉和皮下进行多点注射，每只注射取1ml，对照组以同样的途径注射等量的生理盐水。一免后两周进行第二次免疫，每种O抗原与不完全弗氏佐剂等量混合并乳化，取0.5ml乳化抗原对每只兔子进行多点注射，另取不含佐剂的O抗原0.5ml通过耳缘静脉进行缓慢注射，对照组以同样的途径注射等量的生理盐水。二免后四周，以二免的程序对每组动物进行第三次免疫。三免后二周，对兔子进行采血并制备血清，每种O抗原血清用对照组血清进行吸附处理，得到5种鳗弧菌血清型的兔抗血清。用试管凝集法测定每种血清的凝集效价，分装成小份，在-80℃冰箱冻存。
(3)SMP3的血清型分析。将鳗弧菌SMP3和5株鳗弧菌标准菌株分别划线接种到TSA培养基，在25-28℃培养18-24h。将每种血清的浓度稀释到工作效价1：560，然后吸取稀释的血清15μl，依次置于同一块干净玻片上，在同一玻片上设置15μl PBS为阴性对照，从TSA培养基挑取2-3个鳗弧菌菌落分别与玻片上的每种血清和PBS混匀，肉眼观察1-3min，出现凝集颗粒的为阳性反应，不出现凝集颗粒的为阴性反应。上述实验重复3次以上。结果如表3所示，每种血清均与对应的标准鳗弧菌抗原发生凝集反应，SMP3抗原与O3血清发生凝集反应，因此SMP3鉴定为O3血清型鳗弧菌。
表3鳗弧菌SMP3的血清型鉴定
+,阳性反应；-，阴性反应
实施例4：鳗弧菌SMP3的16srRNA基因序列扩增与分析
(1)模板DNA的制备。将SMP3在TSA划线培养18-24h，挑取单菌落悬浮到50μL无菌双蒸水，在100℃进行水浴10min，在12000g条件下离心1min，将上清液转移至一个新的无菌EP管，作为PCR反应的DNA模板。
(2)PCR扩增。采用细菌通用的16srRNA引物(27F/1492R)进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μl，dNTP Mix(每种浓度2.5M)2.0μl，27F(10mM)0.5μl，1492R(10mM)0.5μl,DNA模板1.0μl,Taq酶(5U/μl)0.2μl,无菌双蒸水18.3μl。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，55℃退火45s，72℃延伸90S，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。PCR反应试剂购自大连宝生物有限公司(Takara，日本)，PCR产物用DNA琼脂糖胶回收试剂盒(Omega，美国)纯化，送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。
(3)序列分析。所测序列去除5’端和3’端20bp的碱基后得到1414bp的碱基序列(SEQ ID NO：1)，该序列在GenBank上进行Blast比对，结果显示同源性较高的前100个序列为弧菌属细菌的序列，SMP3的序列与它们的相似性为99～100％。选取25个Genbank数据库中弧菌属细菌的16srRNA序列用ClusterX1.83软件进行多序列比对，采用MEGA5.2软件中的Neighbour-joining程序构建系统进化树。如附图1所示，SMP3与16株鳗弧菌/鳗利斯顿氏菌和1株病鱼弧菌聚为一簇，与鳗弧菌PF4(KC579365.1)的亲缘关系最近，与Vibriocomitants NBRC 102077(AB681689.1)和Vibrio inusitatus NBRC 101082(NR_104031.1)的亲缘关系最远。根据Blast比对和系统进化树分析结果，SMP3可进一步鉴定为鳗弧菌。
实施例5：鳗弧菌SMP3的toxR基因序列扩增与分析
(1)模板DNA的制备。同实施例4。
(2)PCR扩增。根据鳗弧菌V.anguillarum775(GenBank：CP002284.1)全基因组序列设计扩增toxR的引物序列toxR-F(5’-GTGAACGCCCAAATGAAG-3’和toxR-F(5’-CACCCGAGAACTCAGAAC-3’)。
PCR扩增体系同实施例4。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，53℃退火45s，72℃延伸90S，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。所得PCR产物经实施例4相同的步骤，最终获得序列624bp的碱基序列(SEQ ID NO：2)。
(3)序列分析。将获得的序列在GenBank上进行Blast比对，结果显示SMP3的序列与6株鳗弧菌的toxR序列有最高相似性，为99％，表明得到的序列为鳗弧菌toxR序列。采用实施例4的方法，对SMP3的toxR序列与GenBank的11个弧菌属toxR序列进行多序列比对，构建系统进化树。如附图2所示，SMP3与6株鳗弧菌聚为一簇，与鳗弧菌NB10(LK021130.1)的亲缘关系最近，与藻胶弧菌a12(AB372534.1)、副溶血弧菌7110(AB300873.1)、坎贝氏弧菌NBRC15631(HQ318823.1)的亲缘关系最远。因此鳗弧菌SMP3的toxR基因具有其独特性。
实施例6：鳗弧菌SMP3的recA基因序列扩增与分析
(1)模板DNA的制备。同实施例4。
(2)PCR扩增。根据鳗弧菌V.anguillarum 775(GenBank：CP002284.1)全基因组序列设计扩增recA的引物序列recA-F(5’-TAATAGAGCCTGTACGACG-3’和recA-F(5’-GAGAAAGTAATGGACGAAA-3’)。
PCR扩增体系同实施例4。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，48℃退火45s，72℃延伸90S，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。所得PCR产物经实施例4相同的步骤，最终获得序列658bp的碱基序列(SEQ ID NO：2)。
(3)序列分析。将获得的序列在GenBank上进行Blast比对，结果显示同源性较高的前100个序列为弧菌属细菌的序列，其中SMP3的序列与5株鳗弧菌的相似性最高，为99％，表明得到的序列为鳗弧菌recA序列。采用实施例4的方法，对SMP3的recA序列与GenBank的19个弧菌属recA序列进行多序列比对，构建系统进化树。如附图3所示，SMP3与5株鳗弧菌和1株病海鱼弧菌聚为一簇，与鳗利斯顿522(AF311599.1)的亲缘关系最近，与霍乱弧菌(L42384.1)和牙鲆弧菌IGJ1.11(JQ283458.1)的亲缘关系最远。因此鳗弧菌SMP3的recA基因具有其独特性。
实施例7：鳗弧菌SMP3对鱼类的致病力
(1)鳗弧菌SMP3培养。挑取SMP3单菌落到5ml 2216E培养液中，25-30℃、180rpm振荡培养12-18h后，转接到200ml 2216E培养液中，25-30℃、180rpm振荡培养18-24h，所得培养液在4℃、5000g条件下离心10min，收集细菌，以无菌海水离心洗涤细菌3次，并用无菌海水重悬细菌，制成浓度为～109CFU/ml的菌悬液。
(2)实验鱼饲养和管理。大菱鲆体重12±0.4g，牙鲆体重10.0±0.3g，丝足鱼7.0±0.2g，养殖水温分别为18±0.3℃、20.0±0.3℃、24±0.3℃，定时投喂饲料暂养2周。暂养期间对鱼类健康状况进行检测，每种鱼随机取3-5尾进行无菌剖解，取鱼的脏器组织进行细菌分离，确证未检出细菌后，暂养鱼方可用于后续实验。
(3)感染实验。将步骤1制备的SMP3菌悬液用无菌海水进行10倍稀释，根据鱼的种类和预实验结果，取合适稀释度的菌液分别从鱼的腹腔肌肉处进行注射，注射量为每尾0.1ml，每个浓度组注射10尾，对照组腹腔注射等量PBS。同时取100ul各稀释度的菌悬液涂布2216E平板，在25-30℃培养24-48h,计算平板细菌数量，用以确定感染浓度。具体的结果为：5组大菱鲆的感染浓度分别1.6×104、1.6×105、1.6×106、1.6×107、1.6×108CFU/尾；5组牙鲆的感染浓度分别2.4×104、2.4×105、2.4×106、2.4×107、2.4×108CFU/尾；4组丝足鱼的感染浓度分别9.5×103、9.5×104、9.5×105、9.5×106CFU/尾。注射后观察每组鱼的发病症状和死亡情况。
(4)统计与分析。在不同鱼的感染实验中，对濒死鱼的内脏进行细菌分离，对分离得到的优势菌落，用玻片凝集试验分析其与兔抗鳗弧菌O3血清的凝集情况，并随机挑取3-5个优势菌落进行16srRNA序列分析，结果确定鱼类为感染鳗弧菌O3血清型菌株致死。试验观察14天，统计各组鱼的死亡情况，用Reed-Muench(1938)两氏法计算SMP3感染不同鱼类的半数致死量(LD50)。结果如表4所示，鳗弧菌SMP3感染大菱鲆、牙鲆、丝足鱼的LD50分别为2.5×105、7.6×105、3.0×104CFU/尾。
表4鳗弧菌SMP3人工感染鱼的实验结果
实施例8：鳗弧菌SMP3灭活菌苗的制备
(1)灭活菌苗制备。取-80℃保存的SMP3在2216E琼脂培养基中划线，在25-30℃培养24-36h获得单菌落，取单菌落接种于20ml 2216E海水培养基中，在25-30℃、180rpm振荡培养12-18h后作为种子液，将种子液转接于装有5L 2216E液体培养基的发酵灌中发酵培养，发酵温度为25-30℃，发酵液OD540为1.6-1.8时终止培养，得到新鲜发酵菌液；加入福尔马林至终浓度为0.5％，在室温灭活24-36h；在5000g条件下离心15min获取菌体，用无菌PBS重悬，制得SMP3灭活菌苗。
(2)安全性检验。取SMP3菌苗0.1ml分别接种至2216E琼脂平板和2216E液体培养基，在25-30℃培养24-48h，观察培养基平板和液体均没有细菌生长，表明菌苗灭活完全。取灭活菌苗腹腔注射健康大菱鲆10尾、健康牙鲆10尾或健康丝足鱼20尾，每尾0.1ml，对照组鱼注射0.1ml PBS，观察14天内鱼的健康与存活情况。与对照相比，注射菌苗的鱼摄食和活动正常，说明菌苗没有对实验动物造成不良反应，符合安全要求。
实施例9：鳗弧菌SMP3灭活菌苗在大菱鲆的应用
健康大菱鲆体重16±0.6g，养殖管理同实施例7。暂养后将大菱鲆分组进行如下免疫接种：
(1)注射免疫。将大菱鲆分为4组，每组60尾。将实施例8的鳗弧菌SMP3灭活菌苗用PBS制成浓度为107、108、109cells/ml的菌悬液，取各浓度的菌苗以腹腔注射的方式免疫大菱鲆，接种量0.1ml/尾，则每组鱼的免疫剂量分别106、107、108cells/尾，对照组注射0.1ml的PBS。免疫后4周，从各免疫组和对照组大菱鲆随机取30尾，从腹部肌肉途径注射攻毒10LD50 SMP3活菌(2.5×106CFU/尾)。攻毒后观察2周，每日统计大菱鲆死亡症状和死亡数量，计算累积死亡率和相对免疫保护率(RPS)。结果如表5所示，以剂量为106～108cells/尾的SMP3灭活菌苗注射接种大菱鲆，可显著减少鳗弧菌感染引起的死亡，为大菱鲆提供87～100％的RPS；RPS随着免疫剂量的增大而提高，剂量为108cells/尾时，RPS达到100％。
(2)口服免疫。用0.3％醋酸盐溶液溶解壳聚糖(购自美国Sigama-Aldrich公司)，制成浓度为3mg/ml的壳聚糖溶液；将实施例8制备的SMP3灭活菌苗与壳聚糖溶液等体积混合，在漩涡混合器上混合1h，在12000g、4℃离心30min，沉淀以PBS重悬，制成壳聚糖微包囊菌苗；将壳聚糖微包囊菌苗拌入饲料，制成每g饲料含为106、107、108cells的微包囊口服菌苗，分组投喂大菱鲆，各浓度组60尾，对照组投喂不含菌苗的饲料，连续投喂7天后转喂不含菌苗的饲料。停止口服免疫后第4周，从各免疫组和对照组大菱鲆随机取30尾，从腹部肌肉途径注射攻毒10LD50 SMP3活菌(2.5×106CFU/尾)。攻毒后观察2周，每日统计大菱鲆死亡症状和死亡数量，计算累积死亡率和相对免疫保护率RPS。结果如表5所示，与注射接种途径比较，SMP3灭活菌苗的口服接种途径比注射途径提供的免疫保护低，RPS随着免疫剂量的增大而有所提高，当口服免疫剂量为106～108cells/ml，连续免疫7天，对10LD50的鳗弧菌感染浓度可提供的RPS为10～43.3％。
(3)浸泡免疫。用海水将实施例8的鳗弧菌SMP3灭活菌苗制成浓度108cfu/ml的疫苗液，放入60尾大菱鲆，通气浸浴30min，另取60尾大菱鲆放入不加菌苗的海水为空白对照组。浸浴接种后4周，从免疫组和对照组牙鲆随机取30尾，从腹部肌肉途径注射攻毒10LD50SMP3活菌(2.5×106CFU/尾)，攻毒后观察2周，每日统计大菱鲆死亡症状和死亡数量，计算累积死亡率和相对免疫保护率RPS。结果如表5所示，与注射接种途径比较，SMP3灭活菌苗的浸泡接种途径比注射途径提供的免疫保护低，当浸泡免疫剂量为108cells/ml时，对10LD50的鳗弧菌感染浓度可提供的RPS为16.7％。
表5鳗弧菌SMP3灭活菌苗在大菱鲆的应用
实施例10：鳗弧菌SMP3灭活菌苗的交叉免疫保护
健康牙鲆体重12±0.4g，养殖水温维持20.0±0.3℃，养殖管理同实施例7。将牙鲆分为免疫组和未免疫对照组，每组200尾。用浓度为109CFU/ml鳗弧菌SMP3灭活菌苗注射免疫牙鲆，注射量为0.1ml/尾，则免疫剂量为108cells/尾，未免疫对照组注射0.1ml的PBS。免疫后4周，将免疫组和对照组牙鲆随机分为3组，每组30尾，用三株鳗弧菌活菌从腹部肌肉途径进行注射攻毒，攻毒剂量分别为：O3血清型SMP3(2.3×106CFU/尾)、O1血清型M3(1.7×106CFU/尾)、O2血清型M0(2.1×106CFU/尾)。攻毒后观察2周，每日统计大菱鲆死亡症状和死亡数量，计算累积死亡率和相对免疫保护率RPS。结果如表6，SMP3灭活菌苗以108cells/尾的剂量注射免疫牙鲆，可显著减少鳗弧菌O3血清型菌株感染引起的死亡，为牙鲆提供100％的RPS，同时还明显减少鳗弧菌O1血清型和O2血清型菌株感染引起的死亡，为牙鲆提供43.3％和53.3％的RPS，这些结果说明SMP3灭活菌苗不仅对鳗弧菌O3血清型菌株的感染提供有效的免疫保护，还对鳗弧菌O1血清型和O2血清型菌株的感染提供良好的交叉免疫保护。
表6鳗弧菌SMP3灭活菌苗注射免疫大菱鲆的免疫交叉保护效果
实施例10：鳗弧菌SMP3Hcp抗原蛋白在大菱鲆的应用
(1)hcp的克隆。同实施例4制备SMP3的DNA模板。根据鳗弧菌V.anguillarum 775(GenBank：CP002284.1)全基因组序列设计扩增hcp的引物序列hcp-F(5’-GGCGAATTCATGCCAACTGCATG
-3’，下划线处为EcoRI酶切位点)和hcp-F(5’-ATCGGTCGACTTACGCTTCAACAG-3’，下划线处为SalI酶切位点)，以SMP3的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系同实施例4；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，1个循环。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得一个500bp左右的DNA片段(附图4A)。PCR反应试剂购自大连宝生物有限公司(Takara，日本)。使用PCR产物纯化试剂盒(Invitrogen公司)回收目的片断。所得的目的片断用T4 DNA连接酶(Takara，日本)与pGMT(Tiangen，北京)载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的平板筛选阳性重组菌落；对阳性重组菌提取质粒并进行测序，经验证连接的DNA片段为序列正确的hcp基因片段，将此重组质粒命名为pGMT-hcp。
(2)Hcp的体外表达和纯化。将pGMT-hcp质粒和pET32a载体(Tiangen，北京)用限制性内切酶EcoRI和SalI(Takara，日本)进行双酶切，回收hcp的DNA片段和pET32a载体的DNA片段，酶切产物的目的片段，用T4 DNA连接酶(Takara，日本)将两个DNA片段连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，用氨苄青霉素平板(50mg/ml)重组菌落；将阳性菌落接种于50ml LB液体培养基中，在37℃下培养12-16小时，以1％(v/v)的接种量转接300ml LB液体培养基中，在37℃下培养3-4小时至OD540达0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4小时，在5000g、4℃离心收集菌体，用PBS洗涤两次，用PBS重悬，用超声波破碎细菌，超声破碎条件为：200W，超声5s间隔10s，破碎时间为60-100min，直至菌液澄清。用Ni-Sepharose(Qiagen，德国)对细菌破碎液进行蛋白纯化，按照产品说明书进行。得到的纯化蛋白经过SDS-PAGE电泳分析，确定蛋白纯化的纯度(附图4B)，再蛋白质质谱分析，确证纯化的表达蛋白为Hcp。
(3)Hcp免疫大菱鲆。健康大菱鲆体重16.7±0.5g，养殖管理同实施例7，分为4组，每组30尾。将纯化的Hcp蛋白与完全弗氏佐剂(Sigma，美国)等量混合，在漩涡混合器中搅拌20分钟进行乳化，制成的乳化抗原以0.5、1.0、2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，从大菱鲆腹腔进行注射接种，对照组注射等量的完全弗氏佐剂；第一次免疫30天后进行加强免疫，将纯化的Hcp蛋白与不完全弗氏佐剂(Sigma，美国)等量混合，同上步骤进行乳化制备乳化抗原，以同于初免的剂量和免疫途径对菱鲆进行二免，对照组注射不加Hcp蛋白的不完全弗氏佐剂。二免后第30天取免疫大菱鲆20尾，以浓度为2.2×107cells/ml的SMP3活菌进行注射攻毒，每尾注射0.1ml，则攻毒剂量为2.2×106cells/尾，攻毒后观察2周，每日统计大菱鲆死亡症状和死亡数量，计算累积死亡率和相对免疫保护率RPS。结果如表7所示，鳗弧菌SMP3的Hcp抗原蛋白以0.5-2.0蛋白/g体重的剂量注射免疫体重为16.7±0.5g的大菱鲆时，对2.2×106cells/尾的鳗弧菌感染可提供的RPS为6.3-37.5％。
表7鳗弧菌SMP3的Hcp抗原蛋白在大菱鲆的应用
实施例11：鳗弧菌SMP3和杀鲑气单胞菌二联灭活疫苗在大菱鲆的应用
(1)二联菌苗制备。取-80℃保存的SMP3和杀鲑气单胞菌MC5分别在TSA培养基中划线，在25-30℃培养24-36h获得单菌落，各取单菌落接种于20ml TSB培养基中，在25-30℃、180rpm振荡培养12-18h后作为种子液，将种子液各自转接于装有5L TSB培养基的发酵灌中发酵培养，发酵温度为25-30℃，发酵液OD540为1.6-1.8时终止培养，分别得到新鲜的SMP3和MC5的发酵菌液；在发酵菌液中加入福尔马林至终浓度为0.5％，在室温灭活24-36h；在5000g条件下离心15min，分别获取SMP3和MC5菌体，用无菌PBS重悬后分别获制得SMP3灭活菌苗和MC5灭活菌苗。按实施例8步骤(2)的方法，分别进行2种菌苗的安全性检验。确认菌苗的安全性后，用PBS将2种分别制成浓度为109cells/ml的菌悬液，按照体积比为1:1的比例将两种菌苗进行混合，得到鳗弧菌与杀鲑气单胞菌的二联灭活疫苗。
(2)免疫接种。健康大菱鲆体重21±0.5g，养殖管理同实施例7。暂养后将大菱鲆分为2组，组1为免疫组，组2为对照组，每组90尾。取步骤1的二联疫苗从腹腔注射免疫组1的大菱鲆，接种量0.1ml/尾，则接种浓度为108cells/尾；组2从腹腔注射0.1ml的PBS。接种后4周，将免疫组对照组鱼各分为2组，每组30尾，分别从腹部肌肉途径注射攻毒SMP3活菌和MC5活菌，攻毒浓度分别为3.6×106CFU/尾、2.3×106CFU/尾。攻毒后观察2周，每日统计大菱鲆死亡症状和死亡数量，计算累积死亡率和相对免疫保护率RPS。结果如表8所示，以剂量为108cells/尾的二联灭活菌苗注射接种大菱鲆，可显著减少鳗弧菌和杀鲑气单胞菌感染引起的死亡率，分别为大菱鲆提供93.3％和83.3％的相对免疫保护率。
表8鳗弧菌SMP3与杀鲑气单胞菌二联灭活疫苗在大菱鲆的应用
SEQ ID No:1
序列特征：
长度：1414个碱基对
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
分子类型：DNA
特异性名称：16SrRNA序列
最初来源：鳗弧菌SMP3
SEQ ID No:2
序列特征：
长度：623个碱基对
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
分子类型：DNA
特异性名称：toxR基因序列
最初来源：鳗弧菌SMP3
SEQ ID No:3
序列特征：
长度：658个碱基对
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
分子类型：DNA
特异性名称：recA基因序列
最初来源：鳗弧菌SMP3

Claims (6)

1.一种鳗弧菌菌株，其特征在于：鳗弧菌菌株SMP3，其保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武昌珞珈山，保藏日为2016年5月16日，保藏编号为：CCTCC M2016261。
2.按权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述菌株是分离自海水养殖鱼类的野生鳗弧菌菌株SMP3，其O抗原血清型为O3血清型。
3.按权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述菌株的16sRNA、toxR、recA基因部分核酸序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3所示。
4.一种权利要求1所述的鳗弧菌菌株SMP3在制备鳗弧菌疫苗中的应用。
5.按权利4所述的应用，其特征在于：以所述SMP3菌株抗原为成分，制备疫苗或微胶囊包囊疫苗；
或以所述SMP3菌株抗原再与其它细菌抗原混合作为混合抗原，以混合抗原制备联和疫苗或微胶囊包囊联和疫苗；
或以所述SMP3菌株抗原与佐剂混合制备疫苗；
或以所述SMP3菌株抗原与其它细菌抗原混合作为混合抗原，混合抗原与佐剂混合制备疫苗。
6.按权利5所述的应用，其特征在于：所述SMP3抗原或其它细菌的抗原通过灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、抗原亚单位、抗原基因表达产物的任何一种或一种以上的方式获得。
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