CN106232806A - 新型噬菌体以及包含其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)以及包含该噬菌体作为有效成分的组合物。此外，本发明涉及通过使用噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)或组合物预防和/或治疗由非人类动物的产肠毒性大肠杆菌(ETEC)引起的感染性疾病的方法。

Description

新型噬菌体以及包含其的组合物
技术领域
本发明涉及对产肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)具有特异性杀伤活性的新型噬菌体、包含其的组合物，以及使用所述新型噬菌体或组合物预防或治疗动物的感染性疾病的方法。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli，下文中也被称为E.coli)是肠杆菌科埃希氏菌属的革兰氏阴性短杆菌，并且是在各种动物(包括哺乳动物)的肠道中发现的正常菌群之一。大肠杆菌的大多数菌株是非致病性的，并且可以引起机会性感染，但一些高度致病的菌株引起包括人的动物体内肠道疾病和脓毒症。
大肠杆菌可以被分为产肠毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠集聚性大肠杆菌(EAEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、产坏死性毒素大肠杆菌(necrotoxigenic Escherichia coli，NTEC)等，并且具体来说，已知产肠毒性大肠杆菌在猪中引起感染性疾病。
目前，随着在养猪业中大规模群养的趋势，猪大肠杆菌已经成为养猪场中最常见且困扰的疾病。最近，猪的大肠杆菌病的发病在韩国一直增长，由腹泻引起的仔猪生长缓慢以及死亡给养猪场造成巨大的经济损失。
尽管在相关领域中已经给猪施加多种抗生素用于预防和治疗猪大肠杆菌，但抗生素的滥用或使用不当会在猪中引发抗生素抗性或者会引起抗生素残留在猪体内，因此目前全球性地限制抗生素的使用。
同时，噬菌体是指能够感染特定细菌并抑制和阻碍该细菌生长的细菌特异性病毒。由于噬菌体具有比抗生素更强的宿主特异性，而且最近出现对抗生素有抗性的细菌和动物体内残留抗生素等问题越来越严重，噬菌体的应用已经引起高度关注。
在许多国家正在积极进行对噬菌体的研究，并且除了噬菌体的专利申请外，从美国食品药品管理局(FDA)获得对使用噬菌体的组合物的批准的趋势也在增加。
然而，由于，用于预防和/或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病(在包括养猪业在内的畜牧业中感染性疾病是非常重要的问题)的噬菌体相关的技术仍然不足，因而需要这样的噬菌体和相关技术的发展。
发明内容
技术问题
作为旨在克服对抗生素有抗性的细菌的出现以及肉类中的抗生素残留问题并有效地预防和治疗由大肠杆菌引起的感染性疾病的持续研究的结果，本发明人从自然界分离出一种对产肠毒性大肠杆菌具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)。
此外，本发明人通过鉴定新噬菌体的形态特征、生物化学性质和遗传性质，证实了该噬菌体具有优异的耐酸性、耐热性等，以致于开发了使用噬菌体的抗生素、消毒剂、饲料用添加剂、其他组合物等，用于预防或治疗由大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，以及使用其来预防或治疗疾病的方法。
本发明的一个目的是提供对产肠毒性大肠杆菌具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)。
本发明的另一个目的是提供用于预防和/或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，其包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
本发明的又一个目的是提供包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的抗生素、饲料用添加剂、饮用水用添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或洗涤剂。
本发明的又一个目的是提供使用噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)或包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的组合物在非人类动物中预防和/或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。
技术方案
本发明的一个方面提供对产肠毒性大肠杆菌具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)。
本发明的另一个方面提供用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，其包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
本发明的又一个方面提供包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的抗生素、饲料用添加剂、饮用水用添加剂、饲料、饮用水、消毒剂或洗涤剂。
本发明的又一个方面提供预防和/或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，其包括：给非人类动物施用噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)或包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的组合物。
有益效果
根据本发明的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)具有对产肠毒性大肠杆菌具有特异性杀伤活性的效果。
而且，根据本发明的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)具有优异的耐酸性和耐热性，因此不仅能够被用作在各种范围的温度和pH下预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的物质，而且能够被用作包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的抗生素、饲料用添加剂、饮用水用添加剂、饲料、饮用水、消毒剂、洗涤剂等。
而且，根据本发明的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)或包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的抗生素，并且所述抗生素所具有效果在于：抗生素与现有的抗生素相比对产肠毒性大肠杆菌的特异性较高，从而选择性地杀死特定致病细菌而不杀死有益细菌；并且抗生素不引发药物抗性，这使得与现有的抗生素相比产品的有效期延长。
而且，本发明具有通过给非人类动物施施用噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)或包含噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分的组合物来预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的效果。
附图说明
图1是新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)(在下文中被称为“ΦCJ27”)的电子显微镜图像。
图2示出了新型噬菌体ΦCJ27的脉冲场凝胶电泳(PFGE)的结果。
图3示出了新型噬菌体ΦCJ27的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。
图4是描绘新型噬菌体ΦCJ27的耐酸性实验的结果的图。
图5是描绘新型噬菌体ΦCJ27在60℃下的耐热性实验的结果的图。
具体实施方式
在下文中，更详细地描述本发明的实施方式。在本文中将忽略对本领域普通技术人员来说充分了解且能够推导出的细节描述。
本发明的一个实施方式提供对产肠毒性大肠杆菌(ETEC)具有特异性杀伤活性的新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)(在下文中简称为“ΦCJ27”)。
产肠毒性大肠杆菌是革兰氏阴性短杆菌并且是分解乳糖和果糖以产生酸和气体的需氧或兼性厌氧细菌。产肠毒性大肠杆菌在普通培养基上生长良好，并且能够在约7℃至约48℃的温度下生长，其中理想的生长温度范围为约35℃至约37℃。而且，产肠毒性大肠杆菌可以在4.5至9.0的pH范围下生长。
由于产肠毒性大肠杆菌产生与由霍乱弧菌(Vibrio cholera)产生的那些肠毒素相似的肠毒素，若被产肠毒性大肠杆菌感染，表现出与被霍乱弧菌感染的情况相似的症状。所产生的肠毒素能够大致分类为热不稳定肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)。热不稳定肠毒素在约60℃下加热约10分钟时失去其活性，而热稳定肠毒素即使在约100℃下加热约30分钟也不失去其活性。
产肠毒性大肠杆菌在小肠的上部增殖，并且当产肠毒性大肠杆菌的浓度达到每单位体积(1ml)肠液约107菌落形成单位(cfu)至约108cfu时，产肠毒性大肠杆菌可引起大肠杆菌感染性疾病，包括大肠杆菌病。
噬菌体是能够感染特定细菌并抑制细菌生长的细菌特异性病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。
具体而言，根据本发明的实施方式的噬菌体ΦCJ27是具有如下特征的噬菌体：其具有选择性感染产肠毒性致病大肠杆菌的物种特异性，并且形态学上属于具有伸长的头部和可收缩尾部的肌病毒科(参见图1)。
对噬菌体ΦCJ27的核苷酸序列与其他噬菌体的解码的核苷酸序列之间的同源性进行比较，并且结果示于表1中。噬菌体ΦCJ27示出在pH2.0至pH 5.0下稳定的耐酸性，而不会失去活性(图4)，并且在耐热性方面，当暴露于60℃一个小时的情况下，噬菌体ΦCJ27显示出约1个对数(1log)或更少的活性下降(图5)。噬菌体ΦCJ27的DNA核苷酸序列展示于序列表的序列号1中。
噬菌体ΦCJ27是由本发明人分离出的一种新型的噬菌体，并且在2013年十月25日存放于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(361-221,Hongje 1-dong,Seodaemun-gu,Seoul,Korea))，保藏号为KCCM 11465P。
本发明的另一种实施方式提供用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，其包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分。
由于噬菌体ΦCJ27展现出能够特异性地杀死产肠毒性大肠杆菌的抗菌活性，噬菌体ΦCJ27能够被用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌的感染引起的疾病。利用噬菌体ΦCJ27预防或治疗的由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的例子包括但不限于大肠杆菌病、特别是猪大肠杆菌病。
本文中，术语“大肠杆菌病”指的是由于动物体内感染致病性大肠杆菌而发生的疾病，并且其症状包括脓毒症、腹泻(小儿腹泻和断奶后腹泻)、毒血症(水肿和脑脊髓血管病)等。其中，脓毒症是具有高死亡率的急性全身感染症，其主要发生在出生后两到三天内的婴儿期。腹泻是经常在一周至两周龄内哺乳期间发生以及在断奶后直接发生的胃肠道感染症状，其是死亡或发育障碍的一个原因。毒血症主要发生在8周至12周龄的仔猪断奶后，并且经常会在出现水肿和神经症状后引起猝死。
本文中，术语“预防”指的是通过给动物施用噬菌体ΦCJ27和/或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物抑制相应疾病或者延缓相应疾病发生的所有措施。
本文中，术语“治疗”指的是通过给动物施用噬菌体ΦCJ27和/或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物改善或减轻感染性疾病的症状的所有措施。
根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物中的噬菌体ΦCJ27的含量可以是5×102pfu/ml至5×1012pfu/ml，具体而言1×106pfu/ml至1×1010pfu/ml。
根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物还可以包含药学上可接受的载体，并且可以与载体一起配制以提供食品、药物、饲料用添加剂或饮用水用添加剂等。本文中，术语“药学上可接受的载体”指的是不刺激生物体并且不抑制所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
适用于该实施方式的载体的类型不受特别限制，并且可以使用本领域中常用的任何药学上可接受的载体。载体的例子可以包括，但不限于，盐水、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇，但不限于此。这些可以单独使用或组合使用
此外，根据需要，可以向根据本发明的组合物中添加其他常见添加剂，例如抗氧化剂、缓冲溶液和/或细胞抑制剂，并且还可以向根据本发明的组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂，来配制诸如溶液、悬浮液和乳液的可注射的制剂、丸剂、胶囊、颗粒和片剂。
施用根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的方法不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何方法。施用方法的一个例子可以包括口服施用或非肠道施用。
用于口服施用的剂型的例子可以包括锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、片剂、水溶性悬浮液、油性悬浮液、配制粉末、颗粒、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆和酏剂。
为了将根据该实施方式的组合物配制成诸如片剂或胶囊的剂型，还可以包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素和明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉和甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠和聚乙二醇蜡，并且对于胶囊剂型来说，除了上述物质外，还可以进一步包含液体载体，例如脂肪油。
非肠道施用该实施方式的组合物的方法可以包括，例如静脉注射、腹膜内施用、肌肉施用、皮下施用和局部施用，以及涂敷或喷雾根据本发明的组合物到受感染区域的方法，但不限于此。
为了配制非肠道施用剂型，例如可以将该实施方式的组合物配制成用于注射的剂型，例如皮下注射、静脉注射和肌肉注射；栓剂；或者用于喷雾的剂型，例如气雾剂，从而允许通过吸入器吸入，但不限于此。为了配制用于注射的剂型，可以在水中将该实施方式的组合物与缓冲试剂或稳定剂混合，以制备溶液或悬浮液，其被配制成用于单位施用的剂型，例如安瓿或小瓶。当组合物被配制成用于喷雾的剂型(诸如气雾剂)时，组合物可以与推进剂等一起与添加剂配制，以使分散于水中的浓缩物或者润湿粉末分散于其中。
除了配制组合物的方法、施用方法、施用时间和/或施用途径外，根据不同的因素，例如施用对象动物的性别、年龄、体重、疾病症状的程度、所摄入的食物、排泄速率等，改变涂敷、喷雾或施用根据该实施方式的用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物的适当用量。而且，本领域普通技术人员能够容易地确定和指定对所预期的治疗有效的剂量。
本发明的又一实施方式提供包含噬菌体ΦCJ27A作为有效成分的抗生素。
本文中，术语“抗生素”指的是以药物形式施用于包括人在内的动物并展现出杀灭细菌的功效的制剂，而且其被用作防腐剂、杀菌剂和抑菌剂的总称。
该实施方式的包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的抗生素所具有的效果是：该抗生素与典型的抗生素相比对产肠毒性大肠杆菌的特异性较高，因此杀死特定的致病细菌，但不杀死有益细菌；并且该抗生素不引发抗生素抗性，这使得与典型的抗生素相比产品的有效期延长。
本发明的又一个实施方式提供饲料用添加剂或饮用水用添加剂，其包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分。
饲料用添加剂或饮用水用添加剂可以通过如下来使用：使用噬菌体ΦCJ27或包含其的组合物单独制备饲料用添加剂或饮用水用添加剂，并将饲料或饮用水与添加剂混合，或者在制备饲料或饮用水的过程中直接添加噬菌体ΦCJ27或包含其的组合物。
以根据该实施方式的饲料用或饮用水用的添加剂的形式使用的噬菌体ΦCJ27或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物可以是液体形式或干燥形式，例如干燥粉末形式。
例如，基于饲料用添加剂的重量，根据本发明的噬菌体ΦCJ27以0.05重量％(wt％)至10wt％、具体地0.1wt％至2wt％的量混合于粉末形式中。
用于干燥根据该实施方式的饲料用添加剂或饮用水用添加剂以得到干燥粉末的方法不受特别限制，并且可以采用相关领域中常用的任何方法。干燥方法的例子可以包括通风干燥、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥，但不限于此。这些方法可以单独使用或者以其组合使用。
根据该实施方式的饲料用添加剂或饮用水用添加剂还可以包含其他非致病性微生物。微生物的非限制性实例可以选自由如下组成的组：芽孢杆菌，例如能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖基转移酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；乳酸菌，例如乳杆菌属，其具有生理活性和在厌氧条件(例如牛的胃)下具有分解有机物质的能力；丝状菌，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)，其具有增加动物体重、增加牛奶产量以及增加饲料的消化吸收率的效果；以及酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。这些微生物可以单独使用或以其组合使用。
根据需要，包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的根据该实施方式的饲料用添加剂或饮用水用添加剂可以进一步包含其他添加剂。可用的添加剂的例子可以包括用于防止饲料或饮用水质量恶化而添加的粘合剂、乳化剂和防腐剂；为了增加饲料或饮用水的效用所添加的氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白含氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、萃取剂或寡糖；以及饲料混合剂等。这些添加剂可以单独使用或以其组合使用。
基于100重量份的饲料，根据本发明的饲料用添加剂的含量可以为0.05重量份至10重量份、具体地0.1重量份至2重量份。基于100重量份的饮用水，根据本发明的饮用水用添加剂的含量可以为0.0001重量份至0.01重量份、具体地0.001重量份至0.005重量份。在这些范围内，添加剂允许噬菌体ΦCJ27对抗产肠毒性大肠杆菌的活性被充分显示出。
本发明的又一个实施方式提供通过向饲料或饮用水添加包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的饲料用添加剂或饮用水用添加剂或者向其中直接添加噬菌体ΦCJ27制备得到的饲料或饮用水。
在该实施方式中使用的饲料不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何饲料。饲料的例子可以包括植物饲料，如谷物、根类蔬菜、食品加工副产物、藻类、纤维、医药副产物、油脂、淀粉、谷物的副产物或残余物等；和动物饲料，如蛋白质、无机物质、油脂、矿物质、单细胞蛋白和动物浮游生物或食品。这些饲料可以单独或以其组合使用。
在该实施方式中使用的饮用水不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何饮用水。
本发明的又一个实施方式提供包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的消毒剂或洗涤剂。消毒剂或洗涤剂的剂型不受特别限制，并且可以使用相关领域中常用的任何剂型。
为了去除产肠毒性大肠杆菌，可以将消毒剂喷洒于动物的住处、屠宰场，死亡区域、厨房和烹饪设备，但不限于此。
洗涤剂可以被用于洗涤暴露于或有可能暴露于产肠毒性大肠杆菌的动物的身体部位或真皮的表面上，但不限于此。
本发明的又一个实施方式提供使用噬菌体ΦCJ27或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法。
具体而言，该实施方式的预防方法或治疗方法包括被产肠毒性大肠杆菌感染或容易被感染的非人类动物施用药学有效量的噬菌体ΦCJ27或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物。噬菌体ΦCJ27或包含其的组合物的每天的合适总用量可以由兽医在适当的医学判断范围内确定，这对于本领域技术人员来说是明显的。
噬菌体ΦCJ27或包括噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物的具体的药学有效量可以通过考虑如下内容来确定：要实现的反应的种类和程度，相应个体的饮食、性别、一般健康状况、体重、年龄、噬菌体ΦCJ27或包括其的组合物的施用途径和施用时间、以及组合物的分泌速率和治疗时期等，并且可以根据包括同时使用或者不同时使用的各药物组分在内的多种因素和药物领域中公知的相似因素，来改变上述具体的药学有效量。
噬菌体ΦCJ27或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物可以药物制剂的形式通过鼻内喷雾施用给动物或者直接添加到动物的饲料或饮用水以便被摄食，并且可以以饲料用添加剂或饮用水用添加剂的形式与饲料或饮用水混合，然后施用给动物。
施用噬菌体ΦCJ27或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物的途径和方法不受特别限制，并且可以通过任何途径和方法实现施用途径，只要该施用允许噬菌体ΦCJ27或包含其的组合物到达所期望的组织即可。即，噬菌体ΦCJ27或包含噬菌体ΦCJ27作为有效成分的组合物可以通过各种口服途径或非肠道途径来施用，并且施用的例子可以包括口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、经皮、鼻内和吸入，但不局限于此。
下文中，将参考优选的实例更详细地描述本发明。应当理解的是，这些实例不应以限制本发明的任何方式来解释。
[实施例1]–感染产肠毒性大肠杆菌的噬菌体的分离
<实施例1-1>
噬菌体筛选和单噬菌体分离
对50ml的从位于忠清道(Chungcheong)洪城郡(Hongsung-gun)广川(Gwangcheon)的Samwhawonjong养殖场周围收集的猪粪便获得的试样和环境样品以4000rpm进行离心分离10分钟，并且将所获得的上清液通过0.45μm过滤器过滤，以制备试样液，其被用于进行软琼脂覆盖法(soft agar overlay method)。软琼脂覆盖法是指使用在顶层琼脂(使用0.7％琼脂粘在固体培养基)上生长的宿主细胞观察噬菌体裂解的方法。
具体而言，将150μl的由建国大学(Konkuk University)兽医学院分离的产肠毒性大肠杆菌(UK27)的振荡培养液(OD600＝2)和2ml的10×LB培养基(10g/l的色氨酸；5g/l的酵母提取物；10g/l的NaCl)与18ml的经过滤的试样液混合，然后在30℃下培养18小时，并对所获得的培养液以4000rpm进行离心分离10分钟，并且将所获得的上清液通过0.45μm过滤器过滤。随后，使由5ml的0.7％(w/v)琼脂和150μl的产肠毒性大肠杆菌(UK27)的振荡培养液(OD 600＝2)组成的混合溶液纯化并在LB培养基板上固化，向其逐滴添加10μl的试样液，然后在30℃下培养18小时，从而确认形成噬斑。
由于已知每个噬斑均存在一种噬菌体，发明人试图从所形成的噬斑分离单一的噬菌体。具体而言，将噬斑放入400μl的SM溶液(5.8g/l的NaCl；2g/l的MgSO47H2O；50ml的1MTris-HCl(pH 7.5))，并在室温下放置4小时，从而获得噬菌体溶液。随后，将100μl的噬菌体溶液与5ml的0.7％(w/v)琼脂和150μl的产肠毒性大肠杆菌(UK27)的振荡培养液(OD600＝2)混合，对其进行使用150mm直径的LB培养基板的软琼脂覆盖法，其中进行培养直至噬菌体完全裂解。培养完成后，向LB培养基板添加5ml的SM溶液，并在室温下放置4小时，从而获得噬菌体溶液。
向所获得的溶液添加1％(v/v)氯仿，并混合10分钟，然后以4000rpm进行离心分离10分钟，从而获得上清液，该上清液通过0.45μm过滤器过滤，从而获得最终试样。
<实施例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用产肠毒性大肠杆菌(UK27)大量培养在实施例1-1中获得的噬菌体，然后从中纯化噬菌体。
具体而言，振荡培养产肠毒性大肠杆菌(UK27)，并在1.5×1010cfu下接种，然后以4000rpm进行离心分离10分钟，并在4ml的SM溶液中重新悬浮。在1.5×107pfu下，向该溶液中添加噬菌体，感染复数(MOI)为0.001，然后在室温下放置20分钟。接种在150ml的LB培养基中，并在30℃培养5小时。
培养完成后，以最终体积的1％的体积(v/v)添加氯仿，接着搅拌20分钟，向其中以1μg/ml的最终浓度分别添加作为限制酶的DNase I的RNase A，并在30℃下放置30分钟。随后，分别以1M和10％(w/v)的最终浓度添加氯化钠和聚乙二醇，并在4℃下放置3小时，然后在4℃以12000rpm进行离心分离20分钟，从而获得沉淀物。
将获得的沉淀物悬浮在5ml的SM溶液中，然后在室温下放置20分钟，向其中添加1ml的氯仿并搅拌，然后采用4000rpm在4℃下进行离心分离20分钟，从而获得上清液。将该上清液通过0.45μm过滤器过滤，然后使用甘油密度梯度法(密度：40％，5％甘油)进行超离心分离(35000rpm，1小时，4℃)，从而纯化噬菌体。
本发明人从猪粪收集得到的样品分离出对产肠毒性大肠杆菌具有特异性杀伤活性的噬菌体，其被命名为“噬菌体ΦCJ27”并于2013年10月25日存放于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(361-221,Hongje 1-dong,Seodaemun-gu,Seoul,Korea))，保藏号为KCCM 11465P。
<实施例2>
ΦCJ27的形态观察
将实施例1中所纯化的噬菌体ΦCJ27稀释于0.01％明胶溶液中，然后用2.5％戊二醛溶液固定。将所获得的噬菌体逐滴添加碳包覆的云母板(大约2.5mm×2.5mm)上，驯化10分钟，然后用蒸馏水洗涤。将碳膜安装到铜网上，用2％乙酸铀酰染色60秒并干燥后，在透射电子显微镜(JEM-1011，120kV，放大倍率为200000)下检查(图1)。
图1是噬菌体ΦCJ27的电子显微镜图像，其中噬菌体ΦCJ27具有伸长的头部和可收缩尾部，这表明噬菌体属于肌病毒科。
<实施例3>
ΦCJ27的总基因组DNA尺寸分析
从实施例1中纯化的噬菌体ΦCJ27中提取基因组DNA。
具体而言，向经纯化的噬菌体ΦCJ27的培养液中，添加20mM乙二胺四乙酸(EDTA)、50μg/ml蛋白酶K和0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，并在50℃下放置一个小时，向其中添加等量的苯酚(pH 8.0)并搅拌，随后在室温以12000rpm进行离心分离10分钟，从而获得上清液。
将上清液与等体积的PC(苯酚:氯仿＝1:1)混合，随后在室温以12000rpm进行离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与等体积氯仿混合，随后在室温以12000rpm进行离心分离10分钟，从而获得上清液。将上清液与基于总体积的10％(v/v)的量的3M乙酸钠混合，随后添加2倍体积的冷95％乙醇并混合后，在-20℃下维持1小时。在0℃以12000rpm对所获得的物质进行离心分离10分钟，从中去除上清液以获得沉淀物，将沉淀物溶解于50μl的TE缓冲溶液(Tris-EDTA,pH 8.0)中。将提取的DNA稀释10倍，然后通过在OD260下测量吸光度来确定DNA的浓度。
接下来，将1μg的DNA加样到1％PFGE(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶上，并在室温下使用BIORAD PFGE系统7号程序(尺寸范围从25kb到100kb；转换时间斜坡(time ramp)0.4秒至2.0秒，直线型；正向电压，180V；反向电压，120V)20个小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ27的基因组DNA的电泳凝胶照片，并且可以看出，噬菌体ΦCJ27的基因组DNA尺寸为约98kbp或更多。在图2中，M对应于作为用于尺寸测量的标准的DNA梯状条带。
<实施例4>
ΦCJ27的蛋白质图谱分析
将15μl的经纯化的噬菌体ΦCJ27溶液(1011pfu/ml效价)与3μl的5×SDS样品溶液混合，然后煮沸5分钟，以进行12％SDS-PAGE(图3)。
图3是在噬菌体ΦCJ27上进行的SDS-PAGE结果的电泳照片，并且可以看出主要蛋白质具有约27.9kDa、约51.8kDa和约74.5kDa的尺寸。
<实施例5>
ΦCJ27的遗传特性分析
为了确定实施例1中所纯化的噬菌体ΦCJ27的遗传特性，使用FLX TitaniumSequencer(Roche)作为基因分析仪来分析噬菌体ΦCJ27的DNA。使用Macrogen Inc.株式会社的GS和de novo汇编软件(Roche)重组基因。使用GeneMark.hmm,Glimmer v3.02和FGENESB确认了开放阅读框。使用BLASTP和InterProScan程序对开放阅读框进行命名。
噬菌体ΦCJ27的核苷酸序列显示出与之前报道的噬菌体(肠杆菌属噬菌体HX01，全基因组)的多种核苷酸序列相似性，但可以看出没发现其中所有片段100％一致的噬菌体。因此，可以看出，该噬菌体是新分离的噬菌体。
下表1示出了噬菌体ΦCJ27的核苷酸序列与现有技术中之前报道的噬菌体的解码的核苷酸序列之间的比较结果。
表1
使用DNA测序仪分析所制备的噬菌体ΦCJ27的DNA，并且全核苷酸序列展示于序列号1中。
<实施例6>
相对于pH的ΦCJ27的稳定性
为了鉴定噬菌体ΦCJ27是否能够在低pH(如胃部条件)下保持稳定性，在多种pH(pH 2.0，3.0，4.0，5.0)下测定噬菌体ΦCJ27的稳定性。
以0.2M的浓度制备多种pH溶液(乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0和pH 5.0)和柠檬酸钠缓冲溶液(pH 2.0和pH 3.0))。
将180μl的每个pH溶液与20μl的具有3.8×109PFU/ml效价的噬菌体溶液混合，以允许每个pH溶液具有1M的浓度，然后将所获得的溶液在室温下放置2小时。对于对照组，通过相同的方法将20μl的具有3.8×109PFU/ml效价的噬菌体溶液与180μl的SM溶液混合，然后将所获得的溶液在室温下放置2小时。此后，对溶液进行分步骤的稀释，并且利用软琼脂覆盖方法，在30℃下培养在每个稀释步骤中的10μl的每种溶液18小时，从而基于噬菌体是否裂解来确定噬菌体效价(图4)。
图4示出了噬菌体ΦCJ27的耐酸性的实验结果。在图4中，可以看出噬菌体ΦCJ27与对照组相比没有失去其活性，并且在pH 2.0至pH 5.0下保持稳定。
<实施例7>
相对于温度的噬菌体ΦCJ27的稳定性
如果在噬菌体的众多剂型中，噬菌体被配制成饲料用添加剂，在配制过程中会产生热量，因而为了确定噬菌体的热稳定性而进行如下实验。
具体而言，将200μl的具有3.8×108PFU/ml效价的噬菌体ΦCJ27溶液在60℃下分别放置0分钟、30分钟、60分钟和120分钟。此后，对获得的实验培养液进行分步骤的稀释，并利用软琼脂覆盖方法，在30℃下培养在每个稀释步骤中的10μl的每种溶液18小时，从而基于噬菌体是否裂解来确定噬菌体效价(图5)。
图5示出了噬菌体ΦCJ27的耐热性的实验结果。如在图5中所示，可以看出噬菌体ΦCJ27展现出约1个对数(1log)或更少的活性下降，直到噬菌体ΦCJ27暴露于60℃一个小时，并且当噬菌体ΦCJ27暴露于60℃超过120分钟时，活性下降1个对数或更多。
<实施例8>
对产肠毒性大肠杆菌的野生型分离菌株的噬菌体ΦCJ27的感染范围检查
除了本实验中所使用的产肠毒性大肠杆菌(UK27)外，还对99株由韩国动植物检疫局(KAPQA)、建国大学兽医学院、首尔大学(SNU)兽医学院分离的野生型产肠毒性大肠杆菌，确认噬菌体ΦCJ27是否具有裂解活性。分离的菌株由37株F-血清型F4型、31株F5型、7株F6型、19株F18型和5株其他型组成。
具体而言，将150μl的每个菌株的振荡培养液(OD600＝2)混合，并且利用软琼脂覆盖方法，在30℃下培养10μl的具有109pfu/ml效价的噬菌体ΦCJ27溶液18小时，然后观察噬斑形成与否。
结果示于表2中。
表2
如表2中所示，噬菌体ΦCJ27展现出感染F-血清型F4、F5、F6、F18型的活性，这些是在一般的养猪场中引起猪腹泻的主要病原性细菌，因此当应用于现场时预期展现出优异的功效。
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(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)。

Claims (12)

1.一种噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)，所述噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)为新型噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)且对产肠毒性大肠杆菌具有特异性杀伤活性。
2.一种用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，其包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的用于预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的组合物，其中所述感染性疾病是大肠杆菌病。
4.一种抗生素，其包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
5.一种饲料用添加剂，其包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
6.一种饲料，其包含根据权利要求5所述的饲料用添加剂。
7.一种饮用水用添加剂，其包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
8.一种饮用水，其包含根据权利要求7所述的饮用水用添加剂。
9.一种消毒剂，其包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
10.一种洗涤剂，其包含根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)作为有效成分。
11.一种预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，其包括：
给非人类动物施用根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ27(KCCM11465P)或根据权利要求2所述的组合物。
12.根据权利要求11所述的预防或治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的感染性疾病的方法，其中所述感染性疾病是大肠杆菌病。
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