CN109010816A - 一种杀鲑异弧菌疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明从我国养殖的牙鲆中分离得到一株杀鲑异弧菌(Alivibrio salmonicida)，该菌株对牙鲆和大西洋鲑具有较强的致病性，其保藏编号为CCTCC M 2018086，实验中使用该菌株制备的灭活疫苗可以获得80％以上的免疫保护率，免疫保护持续期持续6个月以上，说明杀鲑异弧菌PO‑1制备的疫苗具有杀鲑异弧菌的免疫保护性，具备适宜用于制备疫苗的能力及疫苗开发的应用前景。

Description

一种杀鲑异弧菌疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及水产养殖动物的微生物学及免疫学领域，具体涉及一种杀鲑异弧菌(Alivibriosalmonicida)疫苗及其应用。
背景技术
杀鲑异弧菌(Alivibriosalmonicida)是海水养殖鱼类的重要致病菌，可以造成养殖大西洋鲑(Salmo salar)、大西洋鳕(Gadus morhua)和虹鳟 (Oncorhynchusmykiss)的冷水性弧菌病，其感染后造成的养殖鱼类死亡率达到50-90％。在挪威水产养殖历史上，曾经超过80％的疾病损失与杀鲑异弧菌有关。杀鲑异弧菌是革兰氏阴性短杆菌，菌体大小约1μm(直径)×2-3μm(长度)。目前在我国尚无该菌感染的病例报道。杀鲑异弧菌在海水环境中广泛存在，在冬季水温较低时发病频繁，多发于网箱和围堰池养殖鱼类，其感染温度为一般在10℃以下，大多养殖鱼类已不摄食或摄食量下降，无法采用投喂的方式施用抗生素。由于养殖水体较大或为开放式养殖，采用浸泡施药方式成本极高，治疗效果不明显，反而会带来病原的耐药性、药物残留、食品安全及环境污染等诸多问题，发展疫苗免疫技术为基础的综合防控技术体系将是该病原防治的重要手段。
根据LPS分类，杀鲑异弧菌至少存在2种血清型亚群：来自大西洋鲑宿主的血清型(Serotype C1)和来自大西洋鳕鱼的血清型(Serotype C2)。目前临床分离的杀鲑异弧菌主要来源于大西洋鲑和大西洋鳕，尚无鲆鲽类来源的临床分离株，其疫苗研究也仅集中于大西洋鲑和大西洋鳕，尚无实验室和商品化的鲆鲽类杀鲑异弧菌疫苗产品，且已报道大西洋鲑和大西洋鳕疫苗对鲆鲽类鱼种如大菱鲆副作用极大，不适合鲆鲽类使用。
发明内容
为了解决现有鲆鲽类疫苗缺乏的问题，我们提出了一种杀鲑异弧菌疫苗及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
为实现上述目的，本发明提供一种杀鲑异弧菌疫苗，杀鲑异弧菌 (Alivibriosalmonicida)分离自山东青岛市黄岛区一海水养殖场海水养殖鱼类牙鲆(Paralichthysolivaceus)成体鱼中，是一种具有较强毒力的野生菌株，采用注射攻毒测试方法，对海水养殖鱼类的半数致死量(LD50)在 1.0×102—9.9×103CFU/g(菌落形成单位/鱼体体重)的范围，菌株的分类命名为：杀鲑异弧菌(Alivibrio salmonicida)；于2018年2月5日在布达佩斯条约国际确认的微生物保藏单位中国典型培养保藏中心保藏；保藏编号为： CCTCC M2018086；保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型微生物保藏中心。杀鲑异弧菌菌株PO-1可培养于 2216E海水培养基、血琼脂培养基或胰大豆蛋白胨培养基(TSB)，培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，培养温度范围为10-25℃。该菌在2216E和TSB琼脂平板中，16℃培养24h后可形成直径约0.5mm的淡黄色半透明菌落；在血琼脂平板中，16℃培养24h 后可形成直径约0.5mm的黄褐色半透明圆形菌落。取上述单菌落接种于上述培养基的培养液中，10-25℃，180r/min摇瓶培养至OD600为0.5-0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。
优选地，上述疫苗抗原的制备方法为灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物中的至少一种。
优选地，上述疫苗的产品为以下三种：
(1)使用该菌株制备的抗原的单一成分制成的疫苗；
(2)使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产的联合疫苗；
(3)将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产的疫苗。
优选地，上述疫苗的接种方式为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫中的一种。
优选地，上述注射免疫使用的剂量为104-109CFU/尾(菌落形成单位/鱼)；创伤免疫和浸浴免疫使用的水体中疫苗浓度为105-109CFU/mL(菌落形成单位/浸泡水体体积)，浸泡时间为2-60min；口服免疫配合于饲料中，浓度为 105-1010CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14-30天。抗原的剂量与免疫效果密切相关，剂量过低，不能诱导足够强的免疫应答，剂量过高，也可能会导致机体的免疫耐受，另外，抗原在应用中也应考虑诸如动物生长阶段、抗原种类、疫苗剂型及接种次数等因素对其剂量需求的影响。因此，在实际免疫应用中，抗原的有效剂量的范围，应根据实验数据来进行确定。以上灭活疫苗在使用中，也可根据实际情况对受免疫鱼实施加强免疫2-3 次，两次免疫的时间间隔为14-90天。
优选地，上述疫苗应用于海水养殖鱼类(如牙鲆、大菱鲆、圆斑星鲽、半滑舌鳎、大西洋鲑、太平洋鲑、王鲑、红鲑、粉鲑、银鲑、虹鳟、硬头鳟、裸盖鱼、鲈鱼、真鲷、河鲀等)、半咸水养殖鱼类(如罗非鱼、虹鳟、鲻鱼等)、洄游鱼类(如鳗鲡、小黄鱼、大马哈鱼)的疫苗接种。不同的水生动物的抗原的免疫剂量有所不同，对于特定水生动物及特定抗原的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次在我国北方鲆鲽类中找到了具有较高毒力的杀鲑异弧菌菌株PO-1，该菌株的抗原包含针对杀鲑异弧菌的保护性抗原，适合用于制备杀鲑异弧菌的各类疫苗抗原，用PO-1菌株制备的疫苗可通过注射、浸泡或口服途径对杀鲑异弧菌感染具有良好的免疫保护作用，适于用作疫苗的生产和应用。
(2)杀鲑异弧菌对多种抗生素的抗药性较强，本发明所涉及的杀鲑异弧菌PO-1菌株的特征使其具有针对杀鲑异弧菌疫苗的开发应用价值，其疫苗产品可对养殖鱼类的杀鲑异弧菌病进行有效安全预防，降低水产养殖业中因病害所导致的损失，减少或消除由于杀鲑异弧菌病发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，显著提高水产养殖动物及其产品的安全，以及病原菌抗药性增加所带来的生物安全风险。
附图说明
图1为发病牙鲆照片；
图2为本发明杀鲑异弧菌PO-1革兰氏染色图；
图3为本发明杀鲑异弧菌PO-1菌株16s rDNA序列进化树；
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
患病牙鲆中杀鲑异弧菌菌株PO-1的分离
挑选出患出血病症状典型的濒死牙鲆(见图1)，用70％酒精棉球对病鱼体表进行消毒，用无菌剪刀剪开腹腔并取出病鱼肝、肾、脾等组织小块(约 0.2×0.2×0.2cm3)于1mL无菌离心管中，在超净工作台上用无菌PBS(pH7.2) 反复冲洗，用接种环蘸取上述病灶组织，划线接种于添加2％琼脂的海水 2216E培养基(酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO40.1g，海水定容至1L， pH 7.6-7.8)，16℃培养5天，从平板上挑取优势菌落中的单菌落，再次进行平板划线，进行纯化培养。纯化后的菌落可进行细菌形态特征，生理生化特性检测及分子生物学的鉴定(见图2)。
实施例2：
杀鲑异弧菌菌株PO-1的培养
杀鲑异弧菌菌株PO-1可培养于TSB培养基(胰蛋白胨大豆肉汤30g， NaCl 10g，去离子水定容至1L，pH 7.0)、或2216E培养基(酵母提取物1g，胰化蛋白胨5g，FePO40.1g，海水定容至1L，pH 7.6-7.8)，上述培养基的固体平板的配制中则需要另外添加2％琼脂。菌株培养方法如下：从-80℃保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，在10-25℃培养1天，即可在平板上获得单克隆菌落，取一单菌落接种于上述培养基的培养液中， 10-25℃，180r/min摇瓶培养至OD600为0.5—0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。
实施例3：
杀鲑异弧菌菌株PO-1的生理生化特征
杀鲑异弧菌菌株PO-1的生理生化试验，参照Biolog(美国BIOLOG公司)自动板使用说明进行鉴定，结果与杀鲑异弧菌(Alivibrio salmonicida) 符合。
表1杀鲑异弧菌PO-1菌株BIOLOG生化鉴定结果
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性；“w”表示弱阳性反应。
实施例4：
基于杀鲑异弧菌菌株PO-1的16S rRNA基因的PCR扩增及其序列分析
(1)细菌DNA的制备：细菌样品DNA的制备采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit) 进行DNA提取。
(2)PCR扩增：采用细菌16S rRNA基因的通用引物(27F/1492R)进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
上述的反应体系中的Premix Ex (Version 2.0)购自Takara生物工程有限公司。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性 30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸8min，1个循环。所获DNA片段用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(Zymo，美国)进行纯化后，由上海桑尼测序有限公司进行DNA测序。
(3)系统发育学分析：考虑测序中，荧光染料的干扰可导致引物3'端后面的几十个碱基不一定能够准确判读的因素，实际序列比对中，对所获得的测序序列(1446bp)起始和末尾的20bp碱基进行了去除，对剩下的1406bp 碱基的序列(SEQ ID NO：1)在NCBI上进行同源性检索，从中选取17个相关菌株的16S rRNA基因序列，采用Clustalx(1.83)软件进行多序列比对，进一步采用MEGA4软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发生树(见图3)。
结果表明PO-1菌株与杀鲑异弧菌聚类，与其他种类菌均无聚类。其中与NCIMB2262T株杀鲑异弧菌16S rRNA基因同源性相似性超过99％，结合实施例3中的菌株PO-1的生理生化特征结果，可准确地将菌株PO-1鉴定为杀鲑异弧菌。
实施例5：
杀鲑异弧菌菌株PO-1对牙鲆LD50测定
(1)细菌的培养：将对数生长期的杀鲑异弧菌PO-1(约1×105CFU/mL) 以1：100的比例接种至2216e液体培养基中，16℃恒温培养箱，180rpm 振荡培养48h，6000rpm，4℃离心10min收集菌体，以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成1×108CFU/mL菌悬液。
(2)试验鱼饲养及管理：选用健康牙鲆(体重约30g)，置于20L水槽中，水温为8±2℃。每日换水，清污2次，投喂2次，每天配合饲料投喂量为鱼体重的1％。实验前暂养2周。
(3)试验分组：将新鲜培养的菌液(1×108CFU/mL)用PBS(PH7.2) 10倍系列稀释，分为7组，另设一组注射PBS作为对照组。每组10尾，置于20L槽内，经MS222麻醉后，各组分别腹腔注射100μL的108、107、106、 105、104、103、102CFU/mL及PBS(pH7.2)，实验重复3次。
(4)统计与分析：实验观察8周，各组牙鲆死亡数见表3。实验中对各组中濒死鱼随机取1-3尾，浸泡于MS222(1:5000)过量麻醉致死后，加入适量2216e匀浆后涂布于2216e培养基，16℃培养5天，参照Pressley等(2005) 的方法进行牙鲆感染杀鲑异弧菌致死认定。杀鲑异弧菌PO-1对牙鲆的LD50的计算方法采用Reed-Muench法。
表2杀鲑异弧菌PO-1对牙鲆LD50实验死亡鱼记录表
试验期间对照组中牙鲆鱼无死亡，牙鲆为杀鲑异弧菌PO-1感染至死。3 次LD50重复实验结果分别为103.7CFU/尾、103.4CFU/尾和103.4CFU/尾，即杀鲑异弧菌PO-1对牙鲆LD50剂量为103.52CFU/尾，该数值表明杀鲑异弧菌 PO-1对牙鲆具有强致病性。
实施例6：
杀鲑异弧菌菌株PO-1对大西洋鲑LD50测定
(1)杀鲑异弧菌菌株PO-1的培养：同实施例5
(2)试验鱼饲养及管理：健康大西洋鲑(体重约30g)，置于100L水槽中，水温为10±2℃。每日换水，清污2次，投喂2次，每天配合饲料投喂量为鱼体重的1％。实验前暂养2周。
(3)试验分组：将新鲜培养的菌液(1×108CFU/mL)用PBS(pH7.2) 10倍系列稀释，分为8组，另设一组注射PBS作为对照组。每组10尾，经 MS222麻醉后，各组分别腹腔注射100μL的108、107、106、105、104、103、 102CFU/mL及PBS(pH7.2)，实验重复3次。
(4)统计与分析：实验观察8周，各组大西洋鲑死亡数见表4。濒死大西洋鲑浸泡于MS222过量麻醉致死后，参见Pressley等(2005)的方法取内脏组织用于大西洋鲑感染杀鲑异弧菌致死认定。杀鲑异弧菌PO-1菌株对大西洋鲑的LD50的计算方法采用Reed-Muench法。
表3杀鲑异弧菌PO-1对大西洋鲑LD50实验死亡鱼记录表
试验期间对照组中大西洋鲑鱼无死亡，大西洋鲑为杀鲑异弧菌菌株PO-1 感染至死。3次LD50重复实验结果分别为104.2CFU/尾、104.3CFU/尾和104.2 CFU/尾，即杀鲑异弧菌菌株PO-1对大西洋鲑LD50剂量为104.24CFU/尾，该数值表明杀鲑异弧菌菌株PO-1对大西洋鲑具有强致病性。
实施例7：
弗氏不完全佐剂与灭活杀鲑异弧菌菌株PO-1疫苗配伍免疫牙鲆或大西洋鲑的应用方式
用福尔马林制备杀鲑异弧菌PO-1菌株2×108CFU/mL灭活疫苗，将等量的疫苗与弗氏不完全佐剂(Freund’sAdjuvant Incomplete，Sigma)分别吸入两个无菌注射器内，两注射器之间以无菌胶管相连，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。制备好的乳化剂滴入冷水中，乳滴若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即视为合格。腹腔注射用MS222(1:9000)进行浸泡麻醉处理后的牙鲆或大西洋鲑，接种剂量为100μL/尾，移入新鲜海水中正常养殖。对照组则腹腔注射无菌PBS(pH7.2)，免疫后30-60天，对牙鲆或大西洋鲑腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜杀鲑异弧菌菌液，进行人工感染试验。感染后8周，统计死亡率，并计算RPS。其RPS值超过70％，则视为合格。
本应用方式中所用的福尔马林灭活杀鲑异弧菌疫苗也可用其他物理或化学的灭活病原的方法加以制备，物理方法如热灭活、细胞破碎、紫外、超声或反复冻融等，化学方法如采用强酸、强碱或戊二醛等试剂。免疫方法及评估同上。
实施例8：
杀鲑异弧菌菌株PO-1浸泡免疫牙鲆或大西洋鲑的应用方式
首先制备杀鲑异弧菌菌株PO-1的抗原，该抗原的制备方法包括灭活菌体、菌蜕成分、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物的任何一种或一种以上。应用中，选择健康牙鲆或大西洋鲑，各试验组均设3个平行组，20尾/平行组。免疫实施中，在养殖水体中加入一定数量的抗原(105-109CFU/mL)，放入健康牙鲆或大西洋鲑浸泡2-60min 后，取出牙鲆或大西洋鲑正常饲养，实验各组每天按鱼体体重的1％投喂合成饲料。30天后，各组进行加强免疫一次，方法同上。60天后，对牙鲆或大西洋鲑腹腔注射10倍LD50剂量的新鲜杀鲑异弧菌菌株PO-1菌液，进行人工感染试验。感染后14-30天，统计死亡率，计算RPS，并综合抗原制备成本的考虑，进行杀鲑异弧菌菌株PO-1抗原在牙鲆或大西洋鲑浸泡免疫中用量的确定。
实施例9：
含有杀鲑异弧菌菌株PO-1灭活疫苗的多联疫苗，免疫牙鲆或大西洋鲑的应用方式
首先用传统灭活方法(如福尔马林灭活、热灭活、高压灭活等)对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和杀鲑异弧菌菌株PO-1进行灭活，再将三者按1：1：1的比例配制成三联疫苗，该疫苗中三种灭活细菌的终浓度均为108CFU/mL。应用中，牙鲆或大西洋鲑腹腔注射100μL制备的三联疫苗，30天后将实验鱼随机分成三小组，各小组分别用10倍LD50剂量的新鲜鳗弧菌、杀鲑气单胞菌和杀鲑异弧菌菌液，进行人工感染试验，感染采用腹腔注射方式。感染后14-30天，统计死亡率，并计算RPS，感染实验结果中对以上三种菌的任何一种其RPS超过70％，即视为该三联疫苗具有较好的免疫效果。

Claims (6)

1.一种杀鲑异弧菌疫苗，其特征在于：杀鲑异弧菌(Alivibriosalmonicida)分离自山东青岛市黄岛区一海水养殖场海水养殖鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)成鱼，菌株PO-1保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏日期2018年2月5日，保藏编号CCTCCM2018086。
2.如权利要求1所述的一种杀鲑异弧菌疫苗，其特征在于：所述疫苗抗原的制备方法为灭活菌体、菌蜕成分、减毒菌株、保护性抗原、抗原亚单位、抗原决定簇或抗原基因表达载体的表达产物中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的一种杀鲑异弧菌疫苗，其特征在于：所述疫苗的产品为以下三种：
(1)使用该菌株制备的抗原的单一成分制成的疫苗；
(2)使用该菌株制备的抗原与其他细菌的抗原混合生产的联合疫苗；
(3)将制备的单一或联合疫苗的抗原添加佐剂生产的疫苗。
4.如权利要求1或2所述的一种杀鲑异弧菌疫苗，其特征在于：所述疫苗的接种方式为注射免疫、创伤免疫、浸浴免疫和口服免疫中的一种。
5.如权利要求4所述的一种杀鲑异弧菌疫苗，其特征在于：所述注射免疫使用的剂量为104-109CFU/尾(菌落形成单位/鱼)；创伤免疫和浸浴免疫使用的水体中疫苗浓度为105-109CFU/mL(菌落形成单位/浸泡水体体积)，浸泡时间为2-60min；口服免疫配合于饲料中，浓度为105-1010CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂14-30天。
6.一种杀鲑异弧菌疫苗的应用，其特征在于：所述疫苗应用于海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类的疫苗接种。
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