CN102274494A - 副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：先扩增目的基因tdh：再将目的基因片段tdh克隆至载体pET-28，构建表达载体pET-28-TDH，pET-28-TDH质粒转入表达菌株BL21；培养，诱导表达后，得克隆表达产物；对克隆表达产物斑点印迹反应检测，得到副溶血性弧菌类毒素；将副溶血性弧菌类毒素与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，即得副溶血性弧菌类毒素疫苗。本发明方法制得的副溶血性弧菌类毒素疫苗可用于受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类的免疫药物的用途，其免疫保护率可达50%左右。

Description

副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法与用途

技术领域

 本发明涉及一种海洋微生物和海产养殖的交叉领域，特别是一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法；本发明还涉及前述方法制备的副溶血性弧菌类毒素疫苗的用途。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemotytifus，Vp)为革兰氏阴性菌，隶属于弧菌科弧菌属，形态呈球杆状、杆状、弧状、丝状等多形性，分散排列，常两端浓染，无芽抱，菌体一端有单鞭毛，运动活泼，为嗜盐性细菌，是一种人畜共患病菌。主要存在于近海岸的海水、海底沉积物及鱼贝类等海产品中，可引起食物中毒和腹泻。副溶血弧菌侵害的水产动物主要是海水鱼类、虾类、贝类、蟹类等。可导致海鲷、九孔鲍、斑节虾、对虾及文蛤等水产经济动物致病, 间接影响人类的健康。病害已成为水产动物健康养殖和可持续发展的制约因素。

在己查明的水产动物细菌性疾病中，副溶血弧菌是主要致病菌之一，病鱼以体表溃疡为主要特征，鱼体肝、脾肿大，肠道严重出血，出现大量血性积水，7-8月份为此病高发期，给水产动物养殖造成了巨大损失，成为困扰和阻碍沿海海水网箱养殖行业发展的因素之一。2002 年6 月, 山东海阳、荣成地区养殖牙鲆大量死亡。镜检发现体表和内脏均有大量运动细菌。经分离、纯化和分类, 又经科赫法则鉴定, 确定导致该疾病的细菌为致病性副溶血弧菌。因此，有效防治副溶血弧菌病将是水产动物健康养殖的关键一环。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后, 会引发突发性食物中毒, 可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。由其引起的食物中毒在日本居首位，约占日本全国食物中毒例数的30%，食物中毒总人数的20%左右，因此日本学者对有关副溶血性弧菌的研究报道较多。据我国1983－1984 年沿海部分地区细菌性食物中毒流行情况资料统计，在412起食物中毒中，副溶血性弧菌居首位，占26%。浙江省1993－2002年在调查确诊病原因子或病种的所有食物中毒中，有29%为副溶血性弧菌食物中毒。

目前研究认为, 与副溶血性弧菌致病力相关的主要毒力因子为溶血素类, 包括耐热直接溶血素(Thermostable DirectHemolysin, TDH) 、TDH- 相关溶血素(TDH-related Hemolysin, TRH) 和不耐热直接溶血素(Thermolabile Hemolysin, TLH), 它们分别由tdh、trh 及tl 基因编码, tdh 阳性菌株可以使氯化钠血琼脂平板产生β-溶血现象, 而trh 阳性菌株一般表现为脲酶阳性, tl 基因的表型特征还未见报道。副溶血弧菌通过水产品为进入人体引发人类疾患，反之，人类的不良行为又加剧了自然界中弧菌数量的增长。众所周知，早前我国沿海特别是近岸、河口、内湾等处水体污染、营养富集化程度较重，这和人类未经处理的生活污水、工业废水大量倾注入海和高密度养殖区的失控发展造成的自污染有很大关系。再加上养殖生产中抗生素的滥用，造成了自然水域中菌群失衡，当环境条件适合副溶血弧菌的生长时，就会大量繁殖，加之养殖个体抗逆能力降低时，就会引发各种水产动物病害的发生。   

鱼用疫苗具有安全、卫生、高效的特点, 能够有效克服化学药物在鱼病防治中的多种局限,在生产中前景广阔。而在鱼用疫苗中, 研究的最多且应用最广的是灭活疫苗。相关研究表明,在由革兰氏阴性菌制备的灭活疫苗中, 能激发机体产生免疫保护作用的主要抗原成分为位于细胞壁上的脂多糖。Kawai等用从鳗弧菌(V.anguillarum ) 中提取的脂多糖对香鱼的口服免疫, Salati等使用从Edwardsiellatarda 菌中提取的脂多糖对日本鳗鲡(Anguillajaponica) 肌肉注射免疫的结果都表明使用一定量的脂多糖, 对于鱼类非但没有毒性, 反而能使鱼类产生显著的免疫反应, 从而获得对该种病原较强的免疫能力。目前，水产动物养殖业上普遍使用药物来控制副溶血性弧菌引起的各种病害，在一定程度上发挥了积极作用，但是抗生素等化学药物的长期使用，会使该病原对这些药物产生抗药性，而且对环境会造成严重的污染和破坏，另外，药物残留还会对食用者构成潜在的威胁。随着对绿色环保食品和环境保护的要求及免疫学技术的发展，国内外已有通过接种疫苗进行水生生物疾病控制的报道。近年来，国内外对副溶血性弧菌毒力因子及免疫疫苗的研究基本都集中于溶血毒素基因克隆及全菌灭活疫苗、细胞胞外产物、脂多糖疫苗方面，而利用毒素基因表达产物作为免疫原，研究其对海洋水产动物的免疫效应，特别是在用毒素基因表达产物免疫动物获取抗体，研究水产养殖动物免疫保护率方面，迄今为止未见报道。

由于副溶血性弧菌可以引起人类食物中毒，故目前国内外对副溶血性弧菌的研究较为集中于医学方面，对水产经济动物免疫效应方向研究极少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、可操作性强的副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，用该方法制得的副溶血性弧菌类毒素疫苗可以用于鱼类免疫。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，其特点是：其步骤如下：

（1）扩增目的基因tdh：

引物1：5’-GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3’，

引物2：5’-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3’，

    在引物1、2的5’端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点；以副溶血性弧菌基因组DNA为模板，扩增副溶血性弧菌溶血毒素基因tdh；反应体系为50 μl，引物各200 nmol／L，dNTP各50 μmol／L，模板50 ng，95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃ 30秒、53 ℃ 40秒、72 ℃ 50秒循环35 次，72℃终止延伸10分钟，产物割胶回收，得到目的基因片段tdh；

（2）克隆表达：将目的基因片段tdh克隆至载体pET-28，构建表达载体pET-28-TDH，pET-28-TDH质粒转入表达菌株BL21；接种于LB培养液中，37℃、180r/min过夜，次日将该菌液以2％比例接种于5ml LB培养基中，37℃、180r/min培养2小时后，取1ml菌液，OD600为0.5-0.7测吸光度，并收集菌体作为诱导表达前的对照菌体，其余菌液中加0.1mol／L的IPTG至终浓度为1mmol／L，20℃、200r/min诱导10小时后，5000r/min、5min收集菌体；用100μl重蒸水悬浮菌体，加等体积2×蛋白上样缓冲液，沸水浴10分钟，进行10％SDS-PAGE电泳分析；以没有克隆tdh的pET-28空质粒及未经诱导表达的质粒作为阴性对照；诱导表达后，离心收集沉淀，超声波破壁，按非变性条件抽提纯化蛋白过程进行纯化，聚乙二醇8000浓缩后，测其OD260、OD280，计算蛋白含量；得克隆表达产物；

（3）斑点印迹反应检测：取10μl 克隆表达产物滴加在醋酸纤维膜上，50℃烘干10 分钟，后用5％脱脂牛奶封闭1小时；TBS缓冲液洗3次后，晾干；用封闭液稀释第一抗体His-tag，稀释倍数为1：5000，37℃下脱色摇床上缓慢摇动1小时；用TBS洗膜三次，每次5 分钟；封闭液稀释第二抗体碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠抗体IgG，稀释比例为1：20000，37 ℃下脱色摇床上缓慢摇动1 小时；TBS洗膜一次；AP底物缓冲液洗膜二次；在10 mL AP底物缓冲液中加入BCIP 33 μl、NBT 66μl，显色至斑点清楚，确认克隆表达产物为TDH蛋白；该TDH蛋白即为副溶血性弧菌毒素；将TDH蛋白经0.3%甲醛脱毒处理，得到副溶血性弧菌类毒素；

（4）疫苗制备：将副溶血性弧菌类毒素与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，即得副溶血性弧菌类毒素疫苗。

本发明所述的tdh为公知基因，该基因在Genbank的登录号为：X54341。

本发明以上方法制备的副溶血性弧菌类毒素疫苗可以用于受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类的免疫药物的用途。所述的海洋鱼类可以为真鲷、墨鱼、海鱼、海虾、海蟹或者海蜇等容易受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类。

副溶血性弧菌是一种危害鱼类的重要的条件性病原菌，溶血毒素TDH被认为是副溶血性弧菌的主要致病因子之一。本发明首先针对目的基因设计特异性扩增引物，接着以副溶血性弧菌为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）调出目的溶血毒素（tdh）基因，通过限制性内切酶的酶切，连接到克隆载体后，进一步将目的基因克隆至表达载体，进行大肠杆菌融合表达，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 证实，表达的TDH融合蛋白在相对分子质量约为21 kDa处有表达条带，与tdh编码融合蛋白的理论推算值得到相对分子质量完全一致。TDH的成功表达，为利用常规的基因工程技术表达纯化TDH蛋白、研制其多克隆抗体和抗副溶血性弧菌的保护性疫苗等研究提供了理论依据。

用纯化后的TDH蛋白作为免疫原，辅以免疫佐剂注射海洋鱼类，一段时间后，血清中的各种免疫活性因子都有升高，表明TDH蛋白有效激活了动物体内的免疫系统。在病原菌的攻毒试验中，TDH类毒素抗原的抗血清效价远远高于对照组，TDH蛋白免疫后的动物能够抵抗病原菌的感染，存活率明显提高。

鱼类的体液免疫系统由非特异性免疫（主要由体液因子参与）和特异性免疫（主要由抗体分子参与）两部分组成，在病原感染的早期阶段，鱼类主要依赖非特异性体液免疫因子作为抵御各种微生物及其有毒有害物质等感染与侵蚀的第一道防线。本发明中，真鲷在注射副溶血性弧菌类毒素后，免疫后5小时、12小时的SOD活性与对照组略有增加，48小时达到最高，72小时下降到与对照同等水平。在正常情况下，SOD清除活性氧自由基,保护动物免受自由基伤害；注射免疫原后,诱导产生大量的自由基，SOD酶活性也在自由基的诱导下随之升高，以清除过量的自由基。由于免疫原刺激机体，真鲷体内引起呼吸爆发，导致血液中ACP 、AKP、CAT酶活性在5-48小时内均有不同程度的升高，24小时均达到最高点，分别高于对照组328% 、75%、381%，特别是ACP、CAT酶活性在12小时已有显著增加，实验结果认为，副溶血性弧菌的类毒素对真鲷的免疫系统具有较强的刺激作用。

本发明研究类毒素免疫原对副溶血性弧菌病原攻毒的免疫保护作用，实验结果表明，其免疫保护率达50%左右。

附图说明

图1为PCR扩增(tdh)结果图；其中：1、DNA Marke(EcoRI/HindIII)；2、PCR结果（570 bp）；

图2 为重组质粒PCR鉴定结果图；其中：1．DNA Marke(EcoRI/HindIII)；2．pET-28质粒；3．tdh基因；

图3为SDS—PAGE鉴定结果图；其中：1、重组质粒(pET-28 -TDH)经诱导（IPTG）；2、重组质粒(pET-28 -TDH)未诱导；3、蛋白Marke；

图4为斑点印迹反应检测结果图；其中：1、经IPTG诱导表达；2、未经IPTG诱导表达；3、空质粒样品（pET-32a）；

图5为类毒素免疫后SOD活性的变化图；

图6为类毒素免疫后ACP活性的变化图；

图7为类毒素免疫后AKP活性的变化图；

图8为类毒素免疫后CAT活性的变化图；

图9为真鲷抗血清效价检测图；

图10为疫苗对副溶血性弧菌攻毒的保护效率图。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，其步骤如下：

（1）扩增目的基因tdh：

引物1：5’-GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3’，

引物2：5’-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3’，

    在引物1、2的5’端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点；以副溶血性弧菌基因组DNA为模板，扩增副溶血性弧菌溶血毒素基因tdh；反应体系为50 μl，引物各200 nmol／L，dNTP各50 μmol／L，模板50 ng，95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃ 30秒、53 ℃ 40秒、72 ℃ 50秒循环35 次，72℃终止延伸10分钟，产物割胶回收，得到目的基因片段tdh；

（2）克隆表达：将目的基因片段tdh克隆至载体pET-28，构建表达载体pET-28-TDH，pET-28-TDH质粒转入表达菌株BL21；接种于LB培养液中，37℃、180r/min过夜，次日将该菌液以2％比例接种于5ml LB培养基中，37℃、180r/min培养2小时后，取1ml菌液，OD600为0.5-0.7测吸光度，并收集菌体作为诱导表达前的对照菌体，其余菌液中加0.1mol／L的IPTG至终浓度为1mmol／L，20℃、200r/min诱导10小时后，5000r/min、5min收集菌体；用100μl重蒸水悬浮菌体，加等体积2×蛋白上样缓冲液，沸水浴10分钟，进行10％SDS-PAGE电泳分析；以没有克隆tdh的pET-28空质粒及未经诱导表达的质粒作为阴性对照；诱导表达后，离心收集沉淀，超声波破壁，按非变性条件抽提纯化蛋白过程进行纯化，聚乙二醇8000浓缩后，测其OD260、OD280，计算蛋白含量；得克隆表达产物；

（3）斑点印迹反应检测：取10μl 克隆表达产物滴加在醋酸纤维膜上，50℃烘干10 分钟，后用5％脱脂牛奶封闭1小时；TBS缓冲液洗3次后，晾干；用封闭液稀释第一抗体His-tag，稀释倍数为1：5000，37℃下脱色摇床上缓慢摇动1小时；用TBS洗膜三次，每次5 分钟；封闭液稀释第二抗体碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠抗体IgG，稀释比例为1：20000，37 ℃下脱色摇床上缓慢摇动1 小时；TBS洗膜一次；AP底物缓冲液洗膜二次；在10 mL AP底物缓冲液中加入BCIP 33 μl、NBT 66μl，显色至斑点清楚，确认克隆表达产物为TDH蛋白；该TDH蛋白即为副溶血性弧菌毒素；将TDH蛋白经0.3%甲醛脱毒处理，得到副溶血性弧菌类毒素；

（4）疫苗制备：将副溶血性弧菌类毒素与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，即得副溶血性弧菌类毒素疫苗。

实施1所述的方法制得的副溶血性弧菌类毒素疫苗用于受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类的免疫药物的用途。所述的海洋鱼类包括真鲷、墨鱼、海鱼、海虾、海蟹或者海蜇等容易受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类。

实施例2，副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法实验。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  实验材料

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemotytifus，VP）菌株(200027)购自江苏省疾病控制中心；

pET-28质粒、大肠杆菌BL21均为本室保存；健康真鲷（平均250 g）购自连云港市赣榆东方水产养殖有限公司，饲养条件：水温：14-16 ℃；光照：室内弱光；盐度：25/1000；循环水养殖，每天傍晚投喂一次人工配合软颗粒饲料（购自山东华隆生物科技有限公司），投饵率3%（相对于体重）。

1.1.2  试剂

pMD18-T-Vector、DNAMarker、ProteinMarker、限制性内切酶、DNA连接酶、购自大连宝生物有限公司（TaKaRa）；DNA胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、Taq DNA polymerase购自申能博彩生物科技有限公司；PCR产物测序由上海申能博彩生物科技有限公司完成；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT) 、酸性磷酸酶(ACP) 和碱性磷酸酶(AKP)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；实验用常规化学试剂均为分析纯，各种缓冲液由本室配置。

1.1.3  培养基  LB培养基

1.2 方法

1.2.1  PCR扩增tdh

据Genbank发表的序列（登录号：X54341）设计引物;

引物1：5’^-GC  GAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3’，

引物2：5’-GC  AAGCTT  TTATTGTTGATGTTTACATTC-3’，在引物1、2的5’端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点。以VP基因组DNA为模板，扩增tdh，反应体系为50 μl，引物各200 nmol／L，dNTPs各50 μmol／L，模板50 ng，95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃ 30 S、53 ℃ 40 S、72 ℃ 50 S循环35 次，72℃终止延伸10 min，产物割胶回收，得到目的基因。

1.2.2  原核表达载体(pET-28 -TDH)构建与鉴定

回收的PCR产物经上海申能博彩生物科技有限公司测序。将测序正确目的基因片段（tdh），克隆至载体pET-28，构建表达载体(pET-28 -TDH) ，PCR分析鉴定。

1.2.3  TDH融合表达及SDS—PAGE电泳分析检测及纯化

鉴定准确的pET-28-TDH质粒转化至大肠杆菌BL21中，LB/Amp抗性平板筛选。从转化平板上挑取转化子单克隆菌落摇床培养过夜，次日按1：100比例转接至200 mL LB/Amp中，于37 ℃ 200 r/min摇菌培养，培养至OD600=0.5_-0.7时，加IPTG至终浓度0.4 mmol/L ，并改为20 ℃诱导10 h。吸取1 mL菌液5000 r/min离心5 min 收集菌体，弃上清，50 μl ddH₂O悬浮沉淀，加30 μl 2XSDS上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。大量诱导表达后，离心收集沉淀，超声波破壁，按非变性条件抽提纯化蛋白过程进行纯化。聚乙二醇8000浓缩后，测其OD260/OD280，计算蛋白含量。

1.2.4  抗原制备及免疫真鲷实验

融合蛋白经0.3%甲醛脱毒，与等量的弗氏完全佐剂(Sigma) 混合，以3 μg/g腹腔注射真鲷，对照组注射等量无菌生理盐水。注射后5 h、24 h、48 h、72 h ,尾椎取血法分别收集血淋巴于1.5 mL于无菌eppondorf管中，4 ℃、24 h析出血清，5000 r/min、4 ℃离心10 min ,上层血清保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.5  血清中免疫活性因子测定

血清中过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶（SOD）和碱性磷酸酶(AKP) 活性测定采用江苏省南京建成生物研究所生产的试剂盒,测定方法参考说明书进行。

1.2.6  攻毒实验及免疫保护效率检测

1.2.6.1  免疫接种  

每组取20尾真鲷，共3组。其中一组免疫类毒素(3 μg/g腹腔注射真鲷)；一组注射等量PBS溶液(3 μL/g腹腔注射)；一组注射等量生理盐水(3 μL/g腹腔注射)。三周后同等剂量加强免疫。

1.2.6.2  ELISA 测定抗血清效价

取TDH类毒素免疫过的真鲷血清10倍稀释后,与等量的弗氏完全佐剂(Sigma) 混合,采用皮下多点(颈、背、后肢内侧) 注射免疫法对两只新西兰白兔(平均体重1. 2 kg ,连云港市第一人民医院分子免疫实验室提供) 进行初次免疫(注射量为0.2 mL),7 d后加强免疫一次，剂量同首免，用弗氏不完全佐剂(Sigma) 乳化,加强免疫后7 d,由耳静脉采血0.3 mL,分离血清,用ELISA法进行兔血清抗体的效价检测。

取TDH类毒素抗原,配成1∶10 稀释液,加抗原液100 μl包被酶标板,置4 ℃过夜、洗涤（PBST）。分别用封闭液(1% 脱脂牛奶)、二倍系列稀释的鱼血清、兔抗鱼血清（自制）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(Sigma) 分步孵育、洗涤；最后加底物溶液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH5. 0 ；OPD 0. 4 mg/ mL ；H₂O₂ 1. 5 μl/ mL) ，置室温暗处显色20 min ;每孔加终止液(2 mol/ L H₂SO₄  50 μl ) ,然后于酶标仪上测定490 nm 处的OD值。同时设阴性对照，样品设置平行孔，测定结果取平均值。以样品孔的OD 值(P) 与阴性对照孔的OD 值(N) 之比大于2 (即P/ N > 2) 时定为阳性。

1.2.6.3  病原菌攻毒试验

加强免疫三周后, 以副溶血性弧菌菌悬液（浓度为10⁷-10⁸，注射量 500 μl）腹腔注射免疫鱼, 并设对照, 每2 d观察一次死鱼情况，持续20 d。

2  结果与分析

2.1  PCR扩增目的基因(tdh)

按1.2.1方法进行PCR扩增，tdh的PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳，结果表明大小与预期的570 bp相符，参见图1。

2.2  原核表达载体(pET-28 -TDH)构建与鉴定

测序结果经Dnastar软件分析，与GenBank(CAA38229)的序列完全一致。目的基因片段（tdh）克隆至载体pET-28，构建表达载体(pET-28 -TDH) ， PCR法对重组质粒鉴定，电泳检测，结果表明所插入片段与预期的一致，参见图2。

2.3    SDS—PAGE电泳分析及斑点反应检测

SDS—PAGE电泳显示经IPTG诱导后的重组质粒有表达条带，表达条带的相对分子质量约为21 kDa，与tdh编码融合蛋白的理论推算值一致，结果见图3、图4。

2.4  血清中免疫活性因子测定

2.4.1  SOD活性测定

用TDH类毒素免疫真鲷后, 血清中的SOD自12 h逐渐上升, 至48 h达到最高点, 高出对照组77%, 后逐渐下降; 72 h恢复至对照组水平; 注射生理盐水组, SOD值至第12 h略有上升, 24 h下降至对照组水平, 基本没有变化。经分析显示: 第24 h、48 h实验组与对照组相比具显著性差异( P＜0.05)，参见图5。

2.4.2  ACP活性测定

图6显示,类毒素免疫组ACP活性自12 h开始有升高, 在24 h达到最高, 与生理盐水对照组相比高出328%, 后开始下降，72 h恢复至对照组水平。第12、24、48 h三组结果, 实验组与对照组相比具显著性差异( P＜0.05), 其它两组差异性均不显著。

2.4.3  AKP活性测定

类毒素免疫组AKP活力自5 h就有明显上升趋势,5、12、24、48 h均高于对照组, 至24 h达到最高, 高出对照组75%, 后开始下降，72 h恢复至对照组水平。第5、12、24、48 h四组结果, 实验组与对照组相比具显著性差异( P＜0.05), 72 h差异性不显著，结果参见图7。

2.4.4  CAT活性测定

TDH类毒素免疫真鲷后CAT活性增强, 据图7可知, CAT活力在12、24、48 h均高于对照组, 至24 h达到最高, 高出对照组381%, 后开始降低, 至72 h恢复至对照组水平。第12、24、48 h三组结果, 实验组与对照组相比具显著性差异( P＜0.05), 72 h无差异性，参见图8。

2.5  攻毒实验及免疫保护效率检测

图9显示ELISA 测定抗血清效价结果，TDH类毒素抗原的抗血清效价达到1∶10 240，稀释度为10、20、40倍时，吸光度均在1.81以上（SE分别为±0.014、0.015、0.02. n=3），稀释度为5120、10240倍时，吸光度达0.63、0.58（SE分别为±0.01、0.02. n=3）。经t检验分析，每个稀释度的实验组与对照组相比均具显著性差异（P＜0.05）。

图10显示类毒素疫苗免疫真鲷后对副溶血性弧菌攻毒具有明显的保护, 保护率与对照组相比高达50%左右。

Claims (3)

1.一种副溶血性弧菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于：其步骤如下：

（1）扩增目的基因tdh：

引物1：5’-GCGAATTC ATGAAGTACCGATATTTTGCA-3’，

引物2：5’-GCAAGCTTTTATTGTTGATGTTTACATTC-3’，

    在引物1、2的5’端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点；以副溶血性弧菌基因组DNA为模板，扩增副溶血性弧菌溶血毒素基因tdh；反应体系为50 μl，引物各200 nmol／L，dNTP各50 μmol／L，模板50 ng，95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃ 30秒、53 ℃ 40秒、72 ℃ 50秒循环35 次，72℃终止延伸10分钟，产物割胶回收，得到目的基因片段tdh；

（2）克隆表达：将目的基因片段tdh克隆至载体pET-28，构建表达载体pET-28-TDH，pET-28-TDH质粒转入表达菌株BL21；接种于LB培养液中，37℃、180r/min过夜，次日将该菌液以2％比例接种于5ml LB培养基中，37℃、180r/min培养2小时后，取1ml菌液，OD600为0.5-0.7测吸光度，并收集菌体作为诱导表达前的对照菌体，其余菌液中加0.1mol／L的IPTG至终浓度为1mmol／L，20℃、200r/min诱导10小时后，5000r/min、5min收集菌体；用100μl重蒸水悬浮菌体，加等体积2×蛋白上样缓冲液，沸水浴10分钟，进行10％SDS-PAGE电泳分析；以没有克隆tdh的pET-28空质粒及未经诱导表达的质粒作为阴性对照；诱导表达后，离心收集沉淀，超声波破壁，按非变性条件抽提纯化蛋白过程进行纯化，聚乙二醇8000浓缩后，测其OD260、OD280，计算蛋白含量；得克隆表达产物；

（3）斑点印迹反应检测：取10μl 克隆表达产物滴加在醋酸纤维膜上，50℃烘干10 分钟，后用5％脱脂牛奶封闭1小时；TBS缓冲液洗3次后，晾干；用封闭液稀释第一抗体His-tag，稀释倍数为1：5000，37℃下脱色摇床上缓慢摇动1小时；用TBS洗膜三次，每次5 分钟；封闭液稀释第二抗体碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠抗体IgG，稀释比例为1：20000，37 ℃下脱色摇床上缓慢摇动1 小时；TBS洗膜一次；AP底物缓冲液洗膜二次；在10 mL AP底物缓冲液中加入BCIP 33 μl、NBT 66μl，显色至斑点清楚，确认克隆表达产物为TDH蛋白；该TDH蛋白即为副溶血性弧菌毒素；将TDH蛋白经0.3%甲醛脱毒处理，得到副溶血性弧菌类毒素；

（4）疫苗制备：将副溶血性弧菌类毒素与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，即得副溶血性弧菌类毒素疫苗。

2.一种用权利要求1所述的方法制得的副溶血性弧菌类毒素疫苗用于受到副溶血性弧菌攻击的海洋鱼类的免疫药物的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的海洋鱼类为真鲷、墨鱼、海鱼、海虾、海蟹或者海蜇。

Images