CN101879317A - 哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联dna疫苗的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法和应用，其特征是将哈维氏弧菌oppA基因和副溶血弧菌tdh2基因通过6个核苷酸GAATTC相连成的tdh2-oppA融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；其制备方法包括：使基因tdh2和oppA克隆到线性载体pMD19-T Simple中；再通过双酶切技术，将该融合基因插入到真核表达载体pEGFP-N1中构建得到pEGFP-N1-tdh2-oppA融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；最后用常规的方法制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液，以100μl/尾的剂量对鱼类进行免疫。本发明操作性强重复率高，安全无毒副作用，可对鱼类双重免疫保护，免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及普通DNA疫苗高。

Description

哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域的疫苗及其制备技术，涉及基因工程及免疫学。具体地说是哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法和应用。

背景技术

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)均为革兰氏阴性菌，广泛分布于近岸海水环境，能感染海水鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，是世界许多国家和地区养殖对虾和鱼类的主要致病菌，每年都给水产养殖业造成重大经济损失。同时这两种菌也是夏、秋季沿海地区海产品食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的主要致病因子是寡肽结合蛋白、溶血素、胞外蛋白酶，副溶血性弧菌的主要致病因子是溶血素、丝氨酸蛋白酶等。

目前已制备的哈维氏弧菌和/或副溶血弧菌疫苗，主要有全菌灭活疫苗和重组蛋白疫苗。灭活疫苗的优点是安全，但其缺点是免疫效果较差。重组蛋白疫苗由于制备过程中涉及蛋白质提取纯化等步骤而造价昂贵。

研究表明，DNA疫苗是一种在重组蛋白疫苗后兴起的新型疫苗，其原理是将疫苗抗原基因克隆于一真核表达载体中，随后将该重组载体导入所要免疫的动物体内。疫苗抗原蛋白在动物体细胞内可以持续表达合成，从而刺激机体的免疫系统，达到免疫保护目的。因此，DNA疫苗具有灭活疫苗和重组蛋白疫苗两者的优点。但是，现有的普通DNA疫苗仍存细胞毒性、免疫保护率低等不利因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法及应用，以克服现有技术的不足。

本发明的二联DNA疫苗的原理是将针对两个细菌的两个重要致病因子的功能区域或亚单位蛋白基因融合克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对两种细菌的抗原融合蛋白的表达。将这种二联DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，就会产生针对两种细菌的融合蛋白抗体，其免疫效果优于普通DNA疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安全、方便、有效。本发明即是采用这种技术，将哈维氏弧菌和副溶血弧菌的两个主要致病因子的亚单位蛋白基因融合构建于真核表达载体中，制备成二联DNA疫苗，从而达到双重抵抗哈维氏弧菌和副溶血弧菌对水产鱼类侵染的目的。

一种哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗，其特征在于：所述的疫苗为副溶血弧菌溶血素亚单位基因tdh2，和哈维氏弧菌寡肽结合蛋白基因oppA，通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体疫苗，其中tdh2-oppA融合基因的DNA序列为：ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAGTTTTACGCATGTACAAGAATAAAATCACCAAAGCCCTTCTTCTAGGTGCTGGTCTGGCAGTGGCTGCCTCTTCTACTACTACCGCTTTCGCTGCTGACGTTCCGGCAGGCATTAAACTAGCTGAAAAACAAGAAATCGTTCGTGGTAACGGAACTGAAGTGGCTACGATTGATCCACATAAGTCGTCTGGAGTACCTGAATCTCATGTGATTCGCGACCTTCTTGAAGGCCTTGTTAACCAAGACGGTGATGGCAATACAATTCCTGGTGTAGCAGAGAGTTGGGAGACAACAGATAACCAGACATTTACTTTTCATTTACGCAAAGATGCAAAGTGGTCTAACGGCGATCCTGTAACAGCACAAGATTTTGTATACAGTTGGCAGCGCTTTGTCGATCCTGCTACAGCCTCTCCATATGCTTGGTACATGGAGTTTACCAAGATGGTCAATGCTAAAGAAATTATTGAAGGTAAAAAAGAAAAAAGTACTCTGGGTGTTAAGGCGGTAGATGCGCACACACTAGTTGTTGAACTTGAAACTGCTGTGCCTTATTTGTGATGATGGTAGGTCACACTTCAATGAAGCCAGTTCACAAGGCGACGATCGAGAAATACGGTGATCAATGGACTAAGCCTTGGTCATTTTGTTGGTAACGGTGCTTACGAACTTGATAAGTGGGTCGTAAACGAGCGTATGGTTCTGAAGCGCAACGTGCAGTACTGGGATAACGACAAGTCTGTGATTGATAAAGTAACGTTCCTTCCGATAGAAAATCAAAATGCGGAAATGAATCGCTTTTTGTCTGGCGAGATTGACTTCACAGATGATTTGCCGATTGAACACTTTAAGCGCATGCAAAAAGAGCACCCAGAAGATCTGTCCGTTGTTGGCAGTCTGTGTAGTTATTACTACATATTTAACACTAAGAAAAAGCCGTTTAACGACTCTCGTGTTCGCAAAGCAATTTCTTATGCGATTGATCGTGATATCGTAGCGAATGCTATTATGGGACAAGGACAAAAGCCAGCGTATTTCTTAACACCTGAGATAACAGCCGGCTTTGATCCTGAATTGCCAGCATATGGTAGGATGACGCAAAAAGAGCGCAACGCAGAAGCCTCCCGACTGCTAGCCGAAGCAGGATATGGTAAAGATAATCCCTTAGAGTTTACATTCCTGTATAACACAGATGAAAACCACAAAAAACTTGCCGTCGCACTTGGCTCCATGTGGAAAAAGACATTAGGCTTGAAAGTTACTCTAGAAAACCAAGAGTGGAAAACGTACTTATCTTCTACGAAGACTGGTGATTTTGAGGTAGCCCGTGCGGGATGGTGTGGCGATTACAATGAAGCTTCCACATTTTTGACACTGATGACAAGTGACAATACGAGCGCTGGTCAGCACTGGGGTAATAATGATTACGATATACTGATCGATAATGCCTTCCACTCAACTTCAGAAGAAGAGCGCACTAAGTTTTATTTAGACGCTGAAAAACTAATGGCAAAAGAAATGCCAATTGCTCCAATTTATCAATACGTGAAGACTCGTTTACTTAACCCTCACGTTGGTGGCTTCCCTTCCAATAATGCGCAAGAAATGATCTACACCAAAGATCTTTACATCAAAGCAGACTAA。

本发明的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法即具体步骤如下：

(1)分别制备副溶血弧菌的溶血素亚单位基因tdh2和哈维氏弧菌的寡肽结合蛋白基因oppA；

(2)再用DNA连接酶分别将基因tdh2和基因oppA克隆到载体pMD19-T Simple中；

(3)再通过内切酶双酶切技术，依次将基因tdh2和基因oppA克隆到同一个真核表达载体pEGFP-N1中，得到所要求的载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体；

(4)用常规的方法扩增培养并收获上述tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体，并制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液。

一、上述制备基因tdh2和基因oppA的制备方法：

1、以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2；引物a为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5’CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’

5’CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3’

2、以哈维氏弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA；引物b为人工设计的DNA片段，其序列如下：

5’CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’

5’CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’；

二、克隆基因tdh2和基因oppA：

1、将线性载体pMD19-T Simple与含有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-tdh2；

2、将线性载体pMD19-T Simple与含有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-oppA。

三、构建tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体：

1、将真核表达载体pEGFP-N1用XhoI和EcoRI双酶切，分离后得到线性载体pEGFP-N1；

2、将载体pMD19-T Simple-tdh2用XhoI和EcoRI双酶切，分离后得到基因tdh2；

3、将线性载体pEGFP-N1与基因tdh2混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到tdh2基因的真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2；

4、将上述真核表达载体pEGFP-N1-tdh2用EcoRI和BamHI双酶切，分离后得到线性的载体pEGFP-N1-tdh2；

5、将载体pMD19-T Simple-oppA用EcoRI和BamHI双酶切，分离后得到基因oppA；

6、将线性载体pEGFP-N1-tdh2与基因oppA混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA。

四、哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA亚单位疫苗悬液的制备：

1、将上述所得的tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体转化到大肠杆菌DH5α中，进行常规扩增培养，提取得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体，将该载体溶于0.05～0.20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200μg/ml，即得到哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联疫苗悬液。

2、按常规免疫方法，以100μl/尾的剂量对鱼类进行免疫。

本发明的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗应用于鱼类免疫。

本发明具有如下优点：

1、本疫苗制备方法简便，实验可操作性强，重复率高；融合基因真核表达构建的效率高；

2、使用两种致病菌的致病因子蛋白亚单位基因构建本二联DNA疫苗，专一性更强，且避免了产生细胞毒性的不利因素；

3、本二联DNA疫苗双基因融合蛋白表达，双重免疫保护；应用于鱼类的免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及一价DNA疫苗高；免疫保护率高于其他类型的疫苗；且只需一次免疫操作即可使鱼类获得对哈维氏弧菌和副溶血弧菌的免疫力；

4、哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗使用时不会对人体产生毒副作用。

附图说明

图1：tdh2-oppA融合基因PCR结果电泳图。

其中，M1：核酸DL2000Marker；

M2：核酸DL15000Marker；

1：阴性对照；

2：用引物a进行PCR扩增得到的基因tdh2；

3：用引物b进行PCR扩增得到的基因oppA；

4：融合基因tdh2-oppA

图2：ttdh2-oppA融合基因蛋白表达电泳图。

其中，M：蛋白Marker；

1：基因tdh2单独表达的结果；

2：基因oppA单独表达的结果

3：tdh2-oppA融合基因的表达结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如J.Sambrook et al：Molecular Cloning：ALaboratory manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按制造厂商建议的条件。所用载体与试剂皆可从相关厂商购得。

实施例1：制备tdh2-oppA融合基因：

一、制备基因tdh2和基因oppA：

1.制备基因tdh2：

(1)根据GeneBank中所收录的副溶血弧菌的热稳定溶血素亚单位基因tdh2的序列，设计了一对扩增基因tdh2的引物a，其序列为：

5’CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’

5′CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3′

(2)以副溶血弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到570bp的PCR产物；

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；如此反应30个循环；然后72℃延伸10分钟。

反应体系为：5μl的Buffer，3μl的MgCl₂，0.5μl的dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，各0.5μl的引物a，然后用灭菌去离子水补足到50μl；

(3)PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有570bp的目的片段的凝胶切下，回收纯化后得到含有XhoI和EcoRI酶切位点的基因tdh2。

2.制备基因oppA：

(1)根据GeneBank中所收录的的哈维氏弧菌的寡肽结合蛋白基因oppA的序列，设计了一对扩增基因oppA的引物b，其序列为：

5’CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’

5’CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’

(2)以哈维氏弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到1665bp的PCR产物。

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，61℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；如此反应30个循环；然后72℃延伸10分钟。

反应体系为：5μl的Buffer，3μl的MgCl₂，0.5μl的dNTP，0.5μl的Taq酶，2μl的模板DNA，各0.5μl的引物b，然后用灭菌去离子水补足到50μl。

(3)PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有1665bp目的片段的凝胶切下，回收纯化后得到含有EcoRI和BamHI酶切位点的基因oppA。

二、克隆基因tdh2和oppA：

1.克隆基因tdh2：

(1)取0.5μl的线性载体pMD19-T Simple，加入4.5μl纯化的基因tdh2，混合，再加入5μlDNA连接酶，于16℃连接反应16小时，得到基因tdh2连接产物；

(2)将基因tdh2连接产物转化到受体大肠杆菌DH5α中，并于含有1％氨苄青霉素、40μg/ml X-gal以及、40μg/ml IPTG的LB固体培养基上37℃培养12小时；

(3)培养后利用常规的蓝白斑筛选方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后，提取基因tdh2载体DNA；

(4)以提取的基因tdh2载体DNA为模板，以引物a进行PCR反应检测，并且用XhoI和EcoRI对基因tdh2载体进行双酶切检测，筛选得到含有工程载体pMD 19-T Simple-tdh2的阳性菌株，并测序确定。

2.克隆基因oppA：

(1)取0.5μl的载体pMD19-TSimple，加入4.5μl纯化的基因oppA，混合，再加入5μl DNA连接酶，于16℃连接反应16小时，得到基因oppA连接产物。

(2)将上述基因oppA连接产物转化到受体大肠杆菌DH5α中，并于含有1％氨苄青霉素、40μg/ml X-gal以及、40μg/ml IPTG的LB固体培养基上37℃培养12小时。

(3)培养后利用蓝白斑筛选的方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后，提取基因oppA载体DNA。

(4)依提出的上述基因oppA载体DNA为模板，以引物b进行PCR反应检测，并且用EcoRI和BamHI对基因oppA载体进行双酶切检测，筛选得到含有工程载体pMD 19-T Simple-oppA的阳性菌株，并测序确定。

实施例2：构建tdh2-oppA融合基因真核表达载体pEGFP-N1-tdh2-oppA：

1.按实施例1的方法制备带有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2载体DNA；

2.将真核表达载体pEGFP-N1和基因tdh2载体DNA用XhoI、EcoRI双酶切，分离后得到线性载体pEGFP-N1和线性基因tdh2；

3.取4.5μl线性基因tdh2，加入0.5μl线性载体pEGFP-N1，混合，再加入5μl DNA连接酶，16℃连接反应16小时，得到基因tdh2连接产物；

4.将基因tdh2连接产物转化到大肠杆菌DH5α中培养，挑取菌落培养后提取载体DNA，经PCR反应和XhoI、EcoRI双酶切检测后，筛选得到工程载体pEGFP-N1-tdh2；

5.按实例1的方法制备带有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA载体DNA；

6.将真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2和基因oppA载体DNA用EcoRI和BamHI双酶切，得到线性的工程载体pEGFP-N1-tdh2和线性基因oppA；

7.取4.5μl线性基因oppA，加入0.5μl线性载体pEGFP-N1-tdh2，混合，再加入5μl DNA连接酶，16℃连接反应16小时，得到pEGFP-N1-tdh2-oppA连接产物；

8.将融合基因tdh2-oppA连接产物转化到大肠杆菌DH5α中培养，挑取菌落培养后提取载体DNA，经PCR反应和XhoI、BamHI双酶切检测后，筛选得到融合基因真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA。

9.为了验证构建的真核表达载体pEGFP-N1-tdh2-oppA中同时包含基因tdh2和基因oppA，将含有上述真和表达的菌株接入到0.6％卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时后提取载体DNA，并经PCR和双酶切检测，用pEGFP-N-5’和pEGFP-N-3’这对引物进行PCR扩增并测序后，证明融合基因序列片段插入位置正确，且不存在移码突变和提前终止。PCR检测结果如图1所示。

10.为了验证tdh2-oppA融合基因的蛋白能正常表达，分别将基因tdh2、基因oppA和融合基因tdh2-oppA序列片段连接到原核表达载体pET28a中，再转化到受体大肠杆菌BL21中，通过异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导后，经SDS-PAGE电泳检测，得到了与预想的分子量大小相同的目的蛋白，证明这些蛋白都能正常表达，结果如图2所示。

实施例3：二联DNA亚单位疫苗悬液的制备和使用

将上述实施例2所得的pEGFP-N1-tdh2-oppA工程载体转化到大肠杆菌DH5α中，在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12-18小时后，提取工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA，对该载体进行去除内毒素处理后，将载体溶于0.05mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200μg/ml，即得到哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA亚单位疫苗悬液。

上述疫苗悬液可直接对鱼类进行免疫。以养殖的牙鲆为例进行免疫方法如下：免疫实验前两周购买同一批次的健康牙鲆，室温饲养于水箱中，通气并正常换水、投饵；用制备的工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA对实验牙鲆进行肌肉注射免疫，注射部位为靠近背鳍的肌肉较为厚实的地方，注射剂量为100μl/尾。同时设置注射等量灭菌磷酸盐缓冲液PBS的对照组。接种后不同时间尾静脉取血，制备血清用于抗体检测。当实验牙鲆免疫接种4～5周后，用哈维氏弧菌和副溶血弧菌对其进行肌肉注射攻毒，攻毒后观察并记录实验牙鲆的死亡情况，计算相对免疫保护率RPS为75％。

序列文件：

<110>中国海洋大学

 

<120>哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗制备方法和应用

 

<130>

 

<160>5

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>2241

<212>DNA

<213>Vibrio parahaemolyticus and Vibrio harveyi

 

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2241)

 

<400>1

atgaagtacc gatattttgc aaaaaaatca tttttattta tatccatgtt ggctgcattc     60

aaaacatttg cctttgagct tccatctgtc ccttttcctg cccccggttc tgatgagata    120

ttgtttgttg ttcgagatac aacttttaat accaatgcac cggtcaatgt agaggtctct    180

gacttttgga caaaccgtaa tgtaaaaaga aaaccgtaca aagatgttta tggtcaatca    240

gtattcacaa cgtcaggtac taaatggctg acatcctaca tgactgtgaa cattaatgat    300

aaagactata caatggcagc ggtgtctggc tataagcacg gtcattctgc tgtgttcgta    360

aaatcagatc aagtacagct tcaacattcc tatgattctg tagctaactt tgttggtgaa    420

gatgaagatt ctattccaag taaaatgtat ttggatgaaa ctccagaata ttttgttaat    480

gtagaagcat atgagagtgg tagtggtaat atattggtaa tgtgtatatc caacaaagaa    540

tcgttttttg aatgtaaaca tcaacaagaa ttcatggatg ctaatgaaaa acttggagtt    600

ttacgcatgt acaagaataa aatcaccaaa gcccttcttc taggtgctgg tctggcagtg    660

gctgcctctt ctactactac cgctttcgct gctgacgttc cggcaggcat taaactagct    720

gaaaaacaag aaatcgttcg tggtaacgga actgaagtgg ctacgattga tccacataag    780

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gacggtgatg gcaatacaat tcctggtgta gcagagagtt gggagacaac agataaccag    900

acatttactt ttcatttacg caaagatgca aagtggtcta acggcgatcc tgtaacagca    960

caagattttg tatacagttg gcagcgcttt gtcgatcctg ctacagcctc tccatatgct   1020

tggtacatgg agtttaccaa gatggtcaat gctaaagaaa ttattgaagg taaaaaagaa   1080

aaaagtactc tgggtgttaa ggcggtagat gcgcacacac tagttgttga acttgaaact   1140

gctgtgcctt attttgtgat gatggtaggt cacacttcaa tgaagccagt tcacaaggcg   1200

acgatcgaga aatacggtga tcaatggact aagcctggtc attttgttgg taacggtgct   1260

tacgaacttg ataagtgggt cgtaaacgag cgtatggttc tgaagcgcaa cgtgcagtac   1320

tgggataacg acaagtctgt gattgataaa gtaacgttcc ttccgataga aaatcaaaat   1380

gcggaaatga atcgcttttt gtctggcgag attgacttca cagatgattt gccgattgaa   1440

cactttaagc gcatgcaaaa agagcaccca gaagatctgt ccgttgttgg cagtctgtgt   1500

agttattact acatatttaa cactaagaaa aagccgttta acgactctcg tgttcgcaaa   1560

gcaatttctt atgcgattga tcgtgatatc gtagcgaatg ctattatggg acaaggacaa   1620

aagccagcgt atttcttaac acctgagata acagccggct ttgatcctga attgccagca   1680

tatggtagga tgacgcaaaa agagcgcaac gcagaagcct cccgactgct agccgaagca   1740

ggatatggta aagataatcc cttagagttt acattcctgt ataacacaga tgaaaaccac   1800

aaaaaacttg ccgtcgcact tggctccatg tggaaaaaga cattaggctt gaaagttact   1860

ctagaaaacc aagagtggaa aacgtactta tcttctacga agactggtga ttttgaggta   1920

gcccgtgcgg gatggtgtgg cgattacaat gaagcttcca catttttgac actgatgaca   1980

agtgacaata cgagcgctgg tcagcactgg ggtaataatg attacgatat actgatcgat   2040

aatgccttcc actcaacttc agaagaagag cgcactaagt tttatttaga cgctgaaaaa   2100

ctaatggcaa aagaaatgcc aattgctcca atttatcaat acgtgaagac tcgtttactt   2160

aaccctcacg ttggtggctt cccttccaat aatgcgcaag aaatgatcta caccaaagat   2220

ctttacatca aagcagacta a                                             2241

 

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(30)

 

<400>2

cgcctcgaga tgaagtaccg atattttgca                                    30

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(31)

 

<400>3

cgcgaattct tgttgatgtt tacattcaaa a                                  31

 

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

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<222>(1)..(34)

 

<400>4

cgcgaattca tggatgctaa tgaaaaactt ggag                               34

 

<210>5

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<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(35)

 

<400>5

cgcggatccc cttagtctgc tttgatgtaa agatc                              35

Claims (5)

1.一种哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗，其特征在于：在真核表达载体上连接入副溶血弧菌溶血素亚单位基因tdh2和哈维氏弧菌寡肽结合蛋白基因oppA通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2-oppA融合基因，其中tdh2-oppA融合基因的DNA序列为：

ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAGTTTTACGCATGTACAAGAATAAAATCACCAAAGCCCTTCTTCTAGGTGCTGGTCTGGCAGTGGCTGCCTCTTCTACTACTACCGCTTTCGCTGCTGACGTTCCGGCAGGCATTAAACTAGCTGAAAAACAAGAAATCGTTCGTGGTAACGGAACTGAAGTGGCTACGATTGATCCACATAAGTCGTCTGGAGTACCTGAATCTCATGTGATTCGCGACCTTCTTGAAGGCCTTGTTAACCAAGACGGTGATGGCAATACAATTCCTGGTGTAGCAGAGAGTTGGGAGACAACAGATAACCAGACATTTACTTTTCATTTACGCAAAGATGCAAAGTGGTCTAACGGCGATCCTGTAACAGCACAAGATTTTGTATACAGTTGGCAGCGCTTTGTCGATCCTGCTACAGCCTCTCCATATGCTTGGTACATGGAGTTTACCAAGATGGTCAATGCTAAAGAAATTATTGAAGGTAAAAAAGAAAAAAGTACTCTGGGTGTTAAGGCGGTAGATGCGCACACACTAGTTGTTGAACTTGAAACTGCTGTGCCTTATTTTGTGATGATGGTAGGTCACACTTCAATGAAGCCAGTTCACAAGGCGACGATCGAGAAATACGGTGATCAATGGACTAAGCCTGGTCATTTTGTTGGTAACGGTGCTTACGAACTTGATAAGTGGGTCGTAAACGAGCGTATGGTTCTGAAGCGCAACGTGCAGTACTGGGATAACGACAAGTCTGTGATTGATAAAGTAACGTTCCTTCCGATAGAAAATCAAAATGCGGAAATGAATCGCTTTTTGTCTGGCGAGATTGACTTCACAGATGATTTGCCGATTGAACACTTTAAGCGCATGCAAAAAGAGCACCCAGAAGATCTGTCCGTTGTTGGCAGTCTGTGTAGTTATTACTACATATTTAACACTAAGAAAAAGCCGTTTAACGACTCTCGTGTTCGCAAAGCAATTTCTTATGCGATTGATCGTGATATCGTAGCGAATGCTATTATGGGACAAGGACAAAAGCCAGCGTATTTCTTAACACCTGAGATAACAGCCGGCTTTGATCCTGAATTGCCAGCATATGGTAGGATGACGCAAAAAGAGCGCAACGCAGAAGCCTCCCGACTGCTAGCCGAAGCAGGATATGGTAAAGATAATCCCTTAGAGTTTACATTCCTGTATAACACAGATGAAAACCACAAAAAACTTGCCGTCGCACTTGGCTCCATGTGGAAAAAGACATTAGGCTTGAAAGTTACTCTAGAAAACCAAGAGTGGAAAACGTACTTATCTTCTACGAAGACTGGTGATTTTGAGGTAGCCCGTGCGGGATGGTGTGGCGATTACAATGAAGCTTCCACATTTTTGACACTGATGACAAGTGACAATACGAGCGCTGGTCAGCACTGGGGTAATAATGATTACGATATACTGATCGATAATGCCTTCCACTCAACTTCAGAAGAAGAGCGCACTAAGTTTTATTTAGACGCTGAAAAACTAATGGCAAAAGAAATGCCAATTGCTCCAATTTATCAATACGTGAAGACTCGTTTACTTAACCCTCACGTTGGTGGCTTCCCTTCCAATAATGCGCAAGAAATGATCTACACCAAAGATCTTTACATCAAAGCAGACTAA。

2.哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法，其特征在于：

(1)分别制备副溶血弧菌的溶血素亚单位基因tdh2和哈维氏弧菌的寡肽结合蛋白基因oppA；

(2)用DNA连接酶分别将基因tdh2和基因oppA克隆到载体pMD19-T Simple中，获得载体pMD19-T Simple-tdh2和pMD19-T Simple-oppA；

(3)利用DNA内切酶双酶切技术分别使pMD19-T Simple-tdh2和pMD19-TSimple-oppA获得粘性末端，再依次将具有粘性末端的基因tdh2和基因oppA克隆到同一个真核表达载体pEGFP-N1中，得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体；

(4)扩增培养并收获上述tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体，并制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液。

3.如权利要求2所述的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法，其特征在于上述tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体的构建方法如下：

(1)制备基因tdh2和基因oppA：

以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有BamHI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2；其引物a序列如下：

5’CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’

5’CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3’；

以哈维氏弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和XhoI双酶切位点的基因oppA；其引物b序列如下：

5’CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’

5’CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’；

(2)克隆基因tdh2和基因oppA：

将线性载体pMD19-T Simple与含有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-tdh2；

将线性载体pMD19-T Simple与含有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-oppA；

(3)构建tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体：

将真核表达载体pEGFP-N1和pMD19-T Simple-tdh2分别用XhoI和EcoRI双酶切，分离后得到线性载体pEGFP-N1和线性基因tdh2，再将线性载体pEGFP-N1和基因tdh2混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到工程载体pEGFP-N1-tdh2；

将工程载体pEGFP-N1-tdh2和pMD19-T Simple-oppA分别用EcoRI和BamH双酶切，分离后得到线性载体pEGFP-N1-tdh2和基因oppA，再将线性载体pEGFP-N1-tdh2和基因oppA混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA。

4.如权利要求2所述的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法，其特征在于上述步骤(4)中的二联DNA疫苗悬液的制备方法如下：

将载有tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA转化到大肠杆菌DH5α中，扩增培养后提取得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体pEGFP-N1-tdh2-oppA，将载体溶于0.05～0.20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200μg/ml，制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液。

5.哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液以50～200μl/尾的剂量应用于鱼类免疫。

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