CN101843899B

CN101843899B - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN101843899B
Application number: CN2010101806977A
Authority: CN
Inventors: 周维英; 邹全明; 周红; 石云; 陈晓红; 郭刚; 毛旭虎; 向云; 潘夕春; 李斌; 李军; 蔡昌芝
Original assignee: CHONGQING YUANLUN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd; Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: CN101843899A

Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法。该疫苗选用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA和IsdB两个抗原分子的活性功能片段与MRSA较特异的肠毒素C突变体重组融合表达，构建获得基因工程重组融合多价抗原蛋白，辅以铝佐剂，制备基因工程重组多亚单位疫苗。该基因工程疫苗构建方法独特，制备工艺简捷、容易放大、重复性好，所获疫苗蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及用于人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染免疫和治疗的基因工程疫苗及其多价亚单位疫苗制备方法。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20％，自1961年被首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。2005年美国的MRSA感染监控資料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。中国CHINET 2005年度的调查结果，各大医院MRSA的检出率平均为69％。因其传播途径广泛，易暴发流行；又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。

目前，万古霉素是治疗MRSA的最后一道防线，但1997以来年耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。因此，研发一种有效的疫苗可能是预防和控制MRSA感染及其耐药性发展有效途径。

但是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程单独IsdB亚单位疫苗已进入II期临床试验阶段。与此同时，多亚单位融合蛋白疫苗也越来越受到人们的关注。Ruggiero等认为在细菌感染过程中，由于宿主和致病菌之间有着复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生完全有效的保护作用，在MRSA单个保护性抗原疫苗研究基础上，构建的多亚单位疫苗具有MRSA多个抗原组分，能够激发机体产生比单一亚单位成分更强的免疫反应，抗原成分相对于全菌疫苗更为简单，能够减少机体变态反应的发生。

细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。新近研究证明，在MRSA所有致病作用因子中，ClfA是MRSA非常重要的外膜蛋白，在MRSA感染的第一步粘附定植中起重要作用。针对ClfA单克隆抗体用于被动免疫接种的疫苗已完成II期临床试验。IsdB不仅是MRSA一个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。以IsdB为组分的基因工程疫苗正在进行II期临床试验。

肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)是超抗原外毒素，通常由致病性金葡菌特别是MRSA产生。SE可通过促使多数T细胞释放大量细胞因子而产生生物学效应，引起毒素休克综合征等临床症状。目前SE有SEA、SEB、SEC、SED和SEE等5个血清型，其中SEC又可分为SEC1，SEC2和SEC3三个亚型。MRSA常为C、D型肠毒素。有学者构建无毒的缺乏超抗原活性的突变体(mSEC)注射免疫小鼠，疫苗诱导了保护性Th2反应，并能抵抗MRSA的攻击。说明无毒无超抗原特性的mSEC可以作为MRSA的疫苗候选抗原分子。

ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。SEC主要是由致病MRSA分泌表达，具有一定特异性，目前尚未见使用ClfA、IsdB和mSEC三个亚单位以任何一种方式组合或者选择三个亚单位的活性功能片段的融合蛋白作为免疫原性材料，制备MRSA多价疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的针对现有疫苗存在的不足，旨在提供一种高效安全的MRSA基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案是：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗的活性成分是MRSA抗原组分ClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体。

所述活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活性功能片段通过接头序列与肠毒素C突变体连接在一起后，再通过接头序列与IsdB活性功能片段连接在一起而得到的融合蛋白质。

所述活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活性功能片段首先与肠毒素C突变体的融合基因，再与IsdB活性功能片段在基因水平上通过接头序列融合在一起形成的多亚单位基因工程重组融合蛋白质。

采用MRSAClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体基因制备的疫苗制剂，由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗活性成分与Al(OH)₃佐剂组成。

为了得到本发明的MRSA基因工程疫苗，首先针对MRSA保护性抗原成分ClfA、IsdB、mSEC进行单基因克隆，获得单个重组蛋白。然后，将ClfA亚单位活性功能片段(ClfA_484-559)与mSEC进行基因水平连接后，再与IsdB亚单位活性功能片段(IsdB_337-462)进行基因水平连接；或者先将IsdB_337-462与mSEC进行基因水平连接后，再与IsdB_337-462进行基因水平连接，构建表达基因工程重组多价融合蛋白疫苗。该疫苗适用于注射免疫接种，可激发产生较强的系统免疫应答，达到免疫预防MRSA感染的目的。因此，作为本发明MRSA因工程疫苗的活性成分，是ClfA_484-559、mSEC、IsdB_337-462在基因水平上通过接头序列融合在一起形成的基因工程重组融合蛋白质。

可以使用本领域技术人员熟知的方法(参见Sambrook，ed.Molecular Cloning：ALaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；Current Protocols In MolrcularBiology，Ausubel，ed.John wiley&Sons，Inc.NewYork(1997))，该方法包括以下步骤：

(1)提供MRSA ClfA、IsdB、mSEC亚单位保护性抗原的PCR扩增、基因克隆与序列分析；

(2)将步骤(1)的MRSA的ClfA、IsdB、mSEC单独的片段及活性功能片段ClfA_484-559、IsdB_337-462与mSEC进行基因水平连接的三个亚单位融合的片段连接到原核表达质粒中；

(3)用步骤(2)的得到的重组表达质粒转化转化适当的宿主细菌细胞，得到基因工程重组菌株，

(4)在适于表达所需蛋白质的条件下，大规模发酵培养步骤(3)的基因工程重组菌。

(5)分离并纯化步骤(4)产生的重组蛋白质，即得到抗MRSA的基因工程疫苗。

本发明的一个优选实施方案，所说的步骤1中克隆ClfA、IsdB、mSEC基因所使用的引物分别是：

ClfA P1 5′TCGGGATCC

ATGGTAGCTGCAGATGCACCGGCTG 3′

BamH I

P2 5′GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCAC 3′

XhoI

IsdB P3 5′TCGGGATCC

ATGAACAAACAGCAAAAAGAATT 3′

BamH I

P3’5′GCGCTCGAGGTTTTTACGTTTTCTAGGTAATAC 3′

XhoI

mSEC P7 P1：sense primer：

5′

-GTGTTAAGTCTTGCAGCTTACTATTTATGTTAAATGGCGCTCCTAAAC-3′

P7’P2：Antisense primer：5′TTATTTTTTGGTTAAATGAACTTCTAC 3′

P7”5′ATGAAGTTATTTGCTTTTATCTTCATATGTGTTAAGTCTTGCAGC 3′

本发明的一个另优选实施方案，所说的步骤2中构建融合基因所使用的合成引物分别是：

P1 5′

-TCGGGATCC

ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3′

ClfA484-559

BamH I

P2 5′-TGAACCGCCTCCACCCTCTGGAATTGGTTC-3′

mSEC P3 5′-GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3′

P4 5′-TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3′

P1 5′

-TCGGGATCC

ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3′

CS加Linker

BamH I

P5 5′-TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3′

P6 5′-GGTGGAGGCGGTTCACCAACAAATGAAAAAATG-3′

IsdB337-462 P7 5′-GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3′

XhoI

P1 5′

-TCGGGATCC

ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3′

CSI BamH I

P7 5′-GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3′

XhoI

P8 5′-TCGGGATCC

ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3′

IsdB337-462 BamH I

P9 5′-TGAACCGCCTCCACC AGATTTATCGGTATTG-3′

P8 5′-TCGGGATCC

ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3′

IS加Linker BamH I

P5 5′-TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3′

P10 5′-GGTGGAGGCGGTTCAACAACACCATATATTG-3′

ClfA484-559 P11 5′-GCGCTCGAG CTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3′

XhoI

P8 5′-TCGGGATCC

ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3′

ISC BamH I

P 115′-GCGCTCGAG CTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3′

XhoI

本发明的再一个优选实施方案，所说的步骤4中纯化融合蛋白所用的阴离子填料选自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Q Sepharose XL；镍离子亲和纯化填料选自Chel atingSepharose HP或Chelating Sepharose FF；凝胶过滤层析柱填料选自Superdex 75、Superdex 200或Superdex HR 10/30。

本发明采用基因工程技术克隆表达保护性抗原成分，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。该重组蛋白可以直接与佐剂(如Al(OH)₃佐剂、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)按常规配比组成疫苗制剂配合使用，适用于注射免疫接种。

本发明的基因工程重组蛋白的表达与基本特性：①本发明中所构建的重组表达质粒均在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达。②重组蛋白ClfA、IsdB、mSEC的表达率约分别为32％、25％和5％；重组融合蛋白CSI(ClfA_484-559-mSEC-IsdB_337-462)表达率约20％；重组融合蛋白ISC(IsdB_337-462-mSEC-ClfA_484-559CSI)表达率约10％；③各重组蛋白均以包涵体形式表达，纯化后的纯度大于80％。④各重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。

本发明的疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，本发明的基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗研究打下基础。

本申请人在前期研究中以ClfA_484-559亚单位活性片段代替全长蛋白，以IsdB_337-462亚单位活性片段代替全长蛋白，并达到预期的实验目的。在本发明中，ClfA_484-559以及IsdB_337-462亚单位活性片段作为多亚单位融合蛋白的组分之一。

附图说明

图1为ClfA(图A)、mSEC(图B、IsdB(图C)基因PCR扩增结果：

图中，A：泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2-4为目的基因ClfA(1023bp)；B：泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2-4为目的基因mSEC(786bp)；C：泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2-4为目的基因IsdB(1938bp)的PCR扩增产物。

图2为表达载体PQE30-ClfA(图A)、PQE30-mSEC(图B，786bp)、PQE30-IsdB(图C，1938bp)的酶切鉴定结果。图A：泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2-4为重组表达质粒PQE30-ClfA经酶切后片段(3400bp和1023bp)；图B：泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2-4为重组表达质粒PQE30-mSEC经酶切后片段(3400bp和786bp)；图C：泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2-4为重组表达质粒PQE30-IsdB经酶切后片段(3400bp和1938bp)。

图3为SDS-PAGE检测ClfA(图A)、mSEC(图B)、IsdB(图)蛋白表达。

图中，A：泳道1-2为pET-28a(+)/BL21诱导前后，泳道3-9分别为pET-28a-ClfA/BL21经IPTG诱导0-6h(36.8Dr)，泳道10为蛋白分子量标准，UVP扫描分析目的蛋白表达量为32％；B：泳道1为蛋白分子量标准，泳道2-3为E.coli BL21诱导前后，泳道4-5分别为pET-28a(+)/BL21诱导前后，泳道6，7，9为pET-28a-mSEC/BL21诱导前；泳道8，10分别为pET-28a-mSEC/BL21经IPTG诱导6h(30.5Dr)，UVP扫描分析目的蛋白表达量为25％；C：泳道1为pET-28a(+)/BL21经IPTG诱导4小时，泳道2-4为pET-28a-IsdB/BL21经IPTG诱导4h(72.2Dr)，泳道5为蛋白分子量标准，UVP扫描分析目的蛋白表达量为5％。

图4为SDS-PAGE检测ClfA(图A)、mSEC(图B)、IsdB(图C)抗原纯化质量鉴定。

图中，A：泳道1-6为纯化蛋白ClfA(36.8Dr)，泳道7为蛋白分子量标准；B：泳道1为蛋白分子量标准，泳道2-3为纯化蛋白mSEC(30.5Dr)；C：泳道1为蛋白分子量标准，泳道2-3为纯化蛋白IsdB(72.2Dr)。

图5为ClfA_484-559、mSEC、IsdB_337-462三个亚单位融合基因CSI(图A)和ISC(图B)重叠延伸PCR扩增结果。图中，A：泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2-3为目的基因CSI的PCR扩增产物(1425bp)；B：泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因ISC的PCR扩增产物(1425bp)。

图6为三亚单位融合基因表达载体pET28a-CSI(图A)和pET28a-ISC(图B)酶切鉴定结果。

图中A：泳道1为核酸分子量标准(Marker)，泳道2为pET28a-CSI重组质粒经双酶切产物，泳道3为pET28a质粒；B：泳道1为pET28a质粒，泳道2为pET28a-ISC重组质粒经双酶切产物，泳道3为核酸分子量标准(Marker)。

图7为以SDS-PAGE方法检测CSI(图A)和ISC(图B)融合蛋白表达。

图中，A：泳道1为pET-28a(+)/BL21诱导前；泳道2为pET-28a(+)/BL21经IPTG诱导后；泳道3，5为重组pET28a-ISC/BL21诱导前；泳道4，6分别为pET28a-ISC/BL21诱导4小时和6小时；泳道7为蛋白分子量标准。

B：泳道1为pET-28a(+)/BL21诱导前；泳道2为pET-28a(+)/BL21经IPTG诱导后；泳道3为重组pET28a-ISC/BL21诱导前；泳道4为pET28a-ISC/BL21诱导6小时；泳道5为蛋白分子量标准。

图8为SDS-PAGE检测CSI和ISC融合蛋白纯化质量鉴定结果。

图中，泳道1-2为融合蛋白CSI，重组工程菌；泳道3-4融合蛋白ISC；泳道5为蛋白分子量标准。

具体实施方式

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗采用ClfA的活性功能片段与肠毒素C突变体融合，获得融合重组蛋白，再与IsdB的活性功能片段在基因水平融合，制备MRSA的基因工程疫苗。

下面结合附图及实施例对本发明作详细描述本发明。

实施例1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA、IsdB、mSEC基因的克隆

1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WHO-2(第三军医大学药理学教研室保存)

2.液氮罐中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WHO-2菌株涂布于WHO-2专用固体培养基上，于37℃，培养过夜。基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。

3.采用PCR方法自MRSA基因组分别扩增ClfA、IsdB、mSEC的编码基因。

1)引物设计合成如下(下划线示酶切位点碱基序列，灰色为接头碱基序列)

根据GenBank公布的基因序列及引物设计原则，设计相应的引物，引入酶切位点。

ClfA P1 5′TCGGGATCC

ATGGTAGCTGCAGATGCACCGGCTG 3′

BamH I

P2 5′GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCAC 3′

XhoI

IsdB P3 5′TCGGGATCC

ATGAACAAACAGCAAAAAGAATT 3′

BamH I

P4 5′GCGCTCGAGGTTTTTACGTTTTCTAGGTAATAC 3′

XhoI

mSEC P7 P1：sense primer：

5′GTGTTAAGTCTTGCAGCTTACTATTTATGTTAAATGGCGCTCCTAAAC3′

P8 P2：Antisense primer：5′TTATTTTTTGGTTAAATGAACTTCTAC 3′

P9 5′ATGAAGTTATTTGCTTTTATCTTCATATGTGTTAA GTCTTGCA GC 3′

2)目的基因的PCR扩增：

以MRSA基因组DNA为模板，P1和P2，P3和P4，P7、P8和P9引物分别扩增ClfA、IsdB、mSEC基因，采用如下PCR体系和程序：

模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；上、下游引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5l，加去离子水至终体积50μl。

将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火1min秒，72℃延伸1min秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。

3)PCR产物的回收(回收试剂盒购自北京天为时代公司，按试剂盒使用说明书操作)

(1)灌制1.0％的琼脂糖凝胶；

(2)将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳；

(3)在紫外线灯下分离含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP管；

(4)加入DNA结合缓冲液，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间；

(5)将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；

(6)加入500μl洗涤缓冲液，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；

(7)重复步骤(6)；

(8)12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1.5ml EP管，加入20μl的TE缓冲液，65℃孵育10分钟，12000g离心1分钟，取2μl电泳，UVP紫外扫描检查回收效果。PCR扩增ClfA、IsdB、mSEC基因结果分别如附图1A、图1B、图1C所示。图1的图示结果表明，目的基因ClfA(1023bp)、mSEC(786bp)、IsdB(1938bp)的PCR扩增是成功的。

4.PCR产物的克隆

1)连接反应

根据PCR回收产物浓度分别与pMD18-T载体按外源片段与载体摩尔数比为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

目的片段连接：

回收片段(200ng/μl) 1μl

pMD18-T(50ng/μl) 1μl

ddH₂O 3μl

连接溶液 5μl

总体积 10μl

16℃连接3小时。

2)连接产物转化及重组子的筛选、鉴定

(1)大肠杆菌DH5α感受态菌的制备(CaCl₂法)

无菌接种环蘸取-70℃冻存的DH5α保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。

挑取单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养12～16小时。

将过夜培养的DH5α按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，800g离心5分钟收集细菌。

加入1ml预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴3小时。4℃800g离心5分钟，弃上清。

加入100μl预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。

(2)含有X-Gal、IPTG的Amp⁺LB平板的制备

LB固体培养基用前熔化，待温度降至50℃左右加入Amp至终浓度为100mg/L，混匀后倾到平板，自然凝固。使用前2～3小时取Amp⁺LB平板，加入40μl X-Gal(20mg/ml)、5μlIPTG(200mg/ml)，用L棒涂布均匀，置于37℃孵箱备用。

(3)连接产物转化

同时分别取三管感受态菌液各100μl，第一管加入连接反应产物，第二管加入对照插入段(control insert)DNA连接产物，作为阳性对照，第三管不加外源DNA，作为阴性对照，冰水浴60分钟。42℃水浴热休克90秒，迅速放置冰水浴1～2分钟。每管各加700μl LB培养液，37℃摇床培养1小时。各管以800g离心1分钟，吸弃400μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布Amp⁺LB平板，37℃孵箱培养过夜。

(4)目的重组子的筛选与鉴定

①挑取连接产物转化平板上分隔良好的蓝、白斑菌落分别接种Amp⁺LB平板，37℃培养12～16小时。转种于Amp⁺LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

②质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)分别抽提蓝白斑质粒

取菌液分装于1.5ml离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀。

每管加100μl溶液Ⅰ悬浮，充分振荡混匀。

加入100μl溶液Ⅱ，轻柔混匀，冰水浴5分钟。

加入250μl溶液Ⅲ，轻振混匀，室温放置10分钟。

4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中。

12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液。

加入500μl洗涤缓冲液于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。

重复步骤7。

12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发。

将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE缓冲液，65℃水浴5分钟，12000g离心1分钟。

取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

③酶切鉴定：分别对蓝斑质粒DNA和白斑质粒DNA进行双酶切。(限制性内切酶购自大连TaKaRa公司)

蓝斑质粒DNA 1μl

BamHI 1μl

10×缓冲液(K) 1μl

ddH₂O 7μl

总体积 10μl

重组质粒DNA 5μl

NdeI或NcoI 0.5μl

XhoI 0.5μl

10×缓冲液(K) 1μl

ddH₂O 3μl

总体积 10μl

混匀后，37℃水浴4小时。

5.PCR产物的序列分析

将TA克隆阳性转化菌株送至公司，按常规方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。

实施例2 ClfA_484-559与mSEC融合基因ClfA_484-559--mSEC(CS)的获得引物设计与合成

ClfA_484-559 P1 5′

-TCGGGATCC

ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3′

BamH I

P2 5′-TGAACCGCCTCCACCCTCTGGAATTGGTTC-3′

mSEC P3 5′-GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3′

P4 5′-TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3′

分别以实施例1回收的ClfA和mSEC为模板，用P1和P2、P3和P4引物分别扩增ClfA_484-559和mSEC基因，PCR扩增体系为：模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl；加去离子水至终体积50μl。

将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。

以回收的带有的Linker的目的条带中ClfA_484-559和mSEC基因为模板，P1和P4为引物进行重叠延伸PCR反应，获得CS片段。PCR扩增体系为同前。

重叠延伸PCR扩增反应：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。

实施例3 CS与IsdB_337-462融合基因CS-IsdB_337-462(CSI)的获得

引物设计与合成

给CS加 P1 5′-TCGGGATCC ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3′

Linker BamH I

P5 5′-TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3′

IsdB_337-462 P6 5′-GGTGGAGGCGGTTCACCAACAAATGAAAAAATG-3′

P7 5′-GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3′

XhoI

分别以实施例1回收的IsdB和实施例2回收的CS为模板，用P6和P7、P1和P5为引物，分别扩增带有Linker的IsdB_337-462和CS基因。PCR扩增体系为：模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。

以回收的带有Linker的IsdB_337-462和CS基因为模板，P1和P7为引物进行重叠延伸PCR反应获得三个亚单位的融合基因CSI。PCR扩增体系为同前。

重叠延伸PCR扩增反应：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。融合基因CSI PCR产物的克隆及序列分析同前，重叠延伸结果见附图5A所示。

实施例4 IsdB_337-462与mSEC融合基因IsdB_337-462-mSEC(IS)的获得

引物设计与合成

IsdB_337-462 P8 5′-TCGGGATCC

ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3′

BamH I

P9 5′-TGAACCGCCTCCACC AGATTTATCGGTATTG-3′

mSEC P3 5′-GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3′

P4 5′-TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3′

以实施例1回收的IsdB和mSEC基因为模板，分别以P8和P8、P3和P4为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系为：模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。

以回收的带有Linker的IsdB_337-462和mSEC基因为模板，P8和P4为引物进行重叠延伸PCR反应，获得IS基因片段。PCR扩增体系同前。

重叠延伸PCR扩增反应：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒s，60℃退火30秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。

实施例5 ClfA_484-559与IS基因融合获得IS-ClfA_484-559(ISC)的获得

引物设计与合成

给IS加 P8 5′-TCGGGATCC

ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3′

linker BamH I

P5 5′-TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3′

ClfA484-559 P10 5′-GGTGGAGGCGGTTCAACAACACCATATATTG-3′

P11 5′-GCGCTCGAG CTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3′

XhoI

以实施例1回收的ClfA为模板，以实施例4回收的IS基因为模板，以P10和P11，P8和P5为引物扩增活性功能片段ClfA_484-550和IS基因。PCR扩增体系为：模板DNA1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。

将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。

以回收的带有Linker的IS和活性功能片段ClfA_484-550为模板，P8和P11为引物进行重叠延伸PCR反应，获得三个亚单位的融合基因ISC。PCR扩增体系同前。

重叠延伸PCR扩增反应：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。

融合基因ISC PCR产物的克隆及序列分析同前，重叠延伸结果见附图5B所示。

图5的图示结果表明，重叠延伸PCR扩增三个亚单位融合目的基因CSI和ISC成功。

实施例6 重组基因表达质粒及高效表达工程菌的构建及筛选

1.重组质粒的构建

将含目的基因的pMD-18T载体及表达载体pQE-30(+)或pET-28a(+)(购自美国Novagen公司，本室保存)双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

有关操作具体步骤如下：

1.1质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒，按试剂盒使用说明书操作)

(1)挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；

(2)取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀；

(3)每管加100μL溶液Ⅰ悬浮，充分振荡混匀；

(4)加入100μL溶液Ⅱ，轻柔混匀，冰水浴5分钟；

(5)加入250μL溶液Ⅲ，轻振混匀，室温放置10分钟；

(6)4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中；

(7)12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液；

(8)加入500μL洗涤缓冲液于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液，重复洗涤一次；

(9)12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发；

(10)将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE缓冲液，65℃水浴5分钟，12000g离心1分钟；

(11)取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

1.2琼脂糖凝胶电泳：

1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。

50×TAE储存液配方：2.0mol/L Tris碱，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸调节pH8.3。

1.3质粒DNA的酶切反应：

1μg质粒DNA

1μl 10×缓冲液(见上海生工公司产品说明书)

1μl限制性内切酶Nco I/XhoI或NdeI/XhoI(10u/μl)

用双蒸水补至10μl

混合后37℃温育1-2小时。

1.4琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化：

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mL EP管。

加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA结合缓冲液，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。

加入配套的洗涤缓冲液，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。

12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1.5mL EP管，加入一定体积的TE缓冲液，65℃孵育10分钟，12000g离心1分钟，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。

1.5连接反应(使用上海生工公司连接试剂盒)

通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

目的DNA 1μl；质粒载体1～2μl；连接溶液5μl；ddH₂O 2～3μl，总体积10μl。22℃连接12-16小时。

1.6感受态菌的制备(CaCl₂法)

(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16h。

(2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。

(3)将过夜培养的DH5a按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀至0.2～0.4时，8000g离心5分钟收集细菌。

(4)加入1ml预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬沉淀，冰水浴3小时。4℃8000g离心5分钟，弃上清。加入100μl预冷的0.1mol/L CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。

1.7连接产物转化

(1)取感受态菌液100μl，加入连接反应产物；冰水浴60分钟，42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2分钟。

(2)加100μl LB培养液，37℃摇床培养1小时。

(3)以8000g离心10分钟，吸弃100μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布平板，37℃孵箱培养过夜。

1.8阳性工程菌的筛选鉴定

(1)挑取转化平板单菌落培养

(2)抽提质粒(方法同前)

(3)双酶切鉴定(方法同前)

PQE30-ClfA、PQE30-mSEC、PQE30-IsdB双酶切鉴定结果分别见附图2A、图2B、图2C。

图2的图示结果表明，酶切的片段大小与预期一致(ClfA1023bp、mSEC786bp、IsdB1938bp)，表达载体构建成功。

pET28a-CSI和pET28a-ISC双酶切鉴定结果分别见附图6A、图6B

图6的图示结果表明，酶切的片段大小与预期一致(1425bp)，表明融合基因表达载体的构建成功。

2.高效表达融合蛋白工程菌的诱导及蛋白表达

取经鉴定的重组菌接种于3ml含Amp的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20ml或Amp的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。

PQE30-ClfA、PQE30-mSEC、PQE30-IsdB蛋白诱导表达结果分别见附图3A、图3B、图3C。

pET28a-CSI和pET28a-ISC蛋白诱导表达结果分别见附图7A、图7B

图7A的结果显示经UVP扫描分析目的蛋白表达量为20％；图7B的结果显示经UVP扫描分析目的蛋白表达量为10％。

实施例7 基因重组表达工程菌的发酵

发酵工艺如下：

采用德国B.Bron 10L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持45％溶氧、温度37℃、pH7.4，待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4～6小时收菌。

发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。

发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl₂·4H₂O、2mg/LCoCl₂·4H₂O、4mg/L FeSO₄·16H₂O、5mg/L H₃BO₃、1.6mg/LMnCl₂·4H₂O、4mg/L CuSO₄而成。

发酵后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。

结果：10L发酵菌液可以收获细菌湿重600克左右。

实施例8 重组目的蛋白的纯化及剂型制备

1.可溶性上清和包涵体提取：将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液(20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0)1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4～6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500×g离心30分钟，弃沉淀，再以15,000×g离心40分钟，收集沉淀即为包涵体。包涵体以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A(20mmol/LTris，5mmol/LEDTA，pH 8.0)和洗涤液B(20mmol/LTris、2mol/L尿素，pH 8.0)各洗涤2次。洗涤条件为：4℃搅拌20分钟，15,000×g离心40分钟，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液(1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素pH 8.0)以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3小时，15,000×g离心45分钟，取上清作为下一步纯化的原料。

包涵体提取所用缓冲液：

1)TE缓冲液：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0

2)包涵体洗涤液A：5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.0

3)包涵体洗涤液B：20mmol/L Tris、2mol/L尿素，pH 8.0

4)包涵体溶解液：1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH 8.0)

2.金属离子螯合层析：选择亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化，使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH7.0～9.0对目的蛋白进行纯化，采用咪唑梯度洗脱。

3.阴离子柱纯化：选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化，使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH7.0～9.0对目的蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。

4.Superdex凝胶过滤层析脱盐：步骤3所获目标蛋白经葡聚糖PEG透析袋内浓缩或超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex过滤脱盐，脱尿素及咪唑。

5.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。其中，步骤2所述镍离子亲和纯化填料包括Chelating Sepharose HP、Chelating SepharoseFF；

步骤3所述阴离子纯化填料包括Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL；

步骤4所述凝胶过滤层析柱包括Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30。

纯化结果如附图3所示。

6.上述方法获得的重组蛋白分别被制备成冷冻干燥剂型或胶囊剂。其中冷冻干燥剂型加纯化水或注射用水溶解后供口服。冷冻干燥剂型制备方法为：向纯化所获得的目的蛋白中加入适当比例(5％～20％)的稳定剂甘露醇(果糖或山梨醇)，混匀，除菌过滤分装后冷冻干燥；胶囊剂型制备方法为：首先向纯化所获得的目的蛋白中加入适当比例(5％～20％)的稳定剂甘露醇，混匀，除菌过滤分装后冷冻干燥，再装填入肠溶胶囊。

目的蛋白ClfA、mSEC、IsdB纯化结果分别见附图4(A、B、C)

目的蛋白CSI与ISC纯化结果见附图8

实施例9 动物免疫及抗体检测

目的蛋白经过纯化后免疫Balb/c小鼠，100μg/只，100μl抗原与等量Al(OH)₃佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。每周一次，分别于免疫3、4次后的4天采血，ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。

结果免疫3次后的抗体阳性率在90％，免疫4次后的抗体阳性率达到98％。实施例10免疫动物的攻毒保护

同实施例9的免疫方案，免疫4次后的第10天采用致死剂量的MRSA菌超声上清液(含SEC毒素及其他致病物质，蛋白浓度1mg/mL)0.05ml腹腔注射对免疫小鼠及对照小鼠进行攻毒实验，观察各组小鼠的死亡情况，在10天的观察期后计算免疫小鼠的死亡/生存率，如表1。

表1 注射免疫BALB/c小鼠后攻毒免疫保护效果

结果显示，ClfA、IsdB和mSEC单亚单位免疫组的免疫保护率分别为13.3％、31.0％和27.6％，而三个亚单位的物理混合或融合免疫组的免疫保护率提高到60.1％和65.6％和62.1％，经统计分析结果显示，多亚单位抗原组较单一亚单位组的免疫保护率高，且相差显著；融合蛋白组免疫保护率比多亚单位物理混合组免疫保护率略高，但差异不显著。结果证实单一抗原很难诱导有效和全面的保护性免疫应答，多种抗原组合能够诱导更有效的保护性免疫应答。

结论：基因工程多亚单位融合疫苗抗原CSI和ISC免疫BALB/c小鼠较其他各组可产生针对MRSA活菌攻击有效的保护作用，同时融合方式的疫苗便于生产操作，避免了多个亚单位分别生产、纯化的缺点，使制作工艺更加简单。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法

<130>

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1023

<212>DNA

<213>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA蛋白编码的基因序列

<400>1

atggtagctg cagatgcacc ggctgctggc aaagatatta cgaatcagtt gacgaatgtg 60

acagttggta ttgactctgg agatacagtt tatccgcacc aagcaggcta tgtcaaactg 120

aattatgggt tctcagtacc aaatgaggct gttcaaggtg acacattcaa aataactgtg 180

cccaaagaat taaacttaaa tggtgtaact tcaactgcta aagtgccacc aattatggcc 240

ggagatcaag tattggcaaa tggtgtaatc gatagtgatg gtaatgttat ttatacattt 300

acagactatg taaatactaa agatgatgtt aaagcaactt tgaccatgcc cgcttatatt 360

gaccctgaaa atgttacaaa gacaggtaat gtgacattgg ctactggcat aggtagtaca 420

acagcaaaca aaacagtatt agtagattat gaaaaatatg gtaagtttta taacttatct 480

attaaaggta caattgacca aatcgataaa acaaataata cgtatcgtca gacaatttat 540

gtcaatccaa gtggagataa cgttattgcg ccggttttaa caggtaattt aaaaccaaat 600

acggatagta atgcattaat agatgcacaa aatactagta ttaaagtata taaagttgat 660

aatgcatcag acttgtctga aagttattat gtgaatccag ataactttga agatgtcact 720

gatagtgtga atattacatt cccaaatcca aatcaatata aagtagagtt caatacgcct 780

gatgatcaaa taacaacacc atatattgta gttgttaatg ggcatattga tcctaatagt 840

aaaggtgatt tagctttacg ttcaacttta tatggatata attcgaatat aatttggcga 900

tcaatgtcat gggataatga agtagcattt aataacggat caggttctgg tgacggtatc 960

gataaacctg ttgttcctga acaacctgat gagccgggtg aaattgaacc aattccagag 1020

taa 1023

<210>2

<211>340

<212>PRT

<213>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA蛋白的氨基酸序列

<400>2

Met Val Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Lys Asp Ile Thr Asn Gln

1 5 10 15

Leu Thr Asn Val Thr Val Gly Ile Asp Ser Gly Asp Thr Val Tyr Pro

20 25 30

His Gln Ala Gly Tyr Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn

35 40 45

Glu Ala Val Gln Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr Val Pro Lys Glu Leu

50 55 60

Asn Leu Asn Gly Val Thr Ser Thr Ala Lys Val Pro Pro Ile Met Ala

65 70 75 80

Gly Asp Gln Val Leu Ala Asn Gly Val Ile Asp Ser Asp Gly Asn Val

85 90 95

Ile Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asn Thr Lys Asp Asp Val Lys Ala

100 105 110

Thr Leu Thr Met Pro Ala Tyr Ile Asp Pro Glu Asn Val Thr Lys Thr

115 120 125

Gly Asn Val Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys

130 135 140

Thr Val Leu Val Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser

145 150 155 160

Ile Lys Gly Thr Ile Asp Gln Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg

165 170 175

Gln Thr Ile Tyr Val Asn Pro Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Pro Val

180 185 190

Leu Thr Gly Asn Leu Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile Asp

195 200 205

Ala Gln Asn Thr Ser Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ser Asp

210 215 220

Leu Ser Glu Ser Tyr Tyr Val Asn Pro Asp Asn Phe Glu Asp Val Thr

225 230 235 240

Asp Ser Val Asn Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gln Tyr Lys Val Glu

245 250 255

Phe Asn Thr Pro Asp Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val

260 265 270

Asn Gly His Ile Asp Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser

275 280 285

Thr Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp

290 295 300

Asp Asn Glu Val Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile

305 310 315 320

Asp Lys Pro Val Val Pro Glu Gln Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu

325 330 335

Pro Ile Pro Glu

340

<210>3

<211>786

<212>DNA

<213>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肠毒素C突变体mSEC蛋白编码的基因序列

<400>3

atgaagttat ttgcttttat cttcatatgt gttaagtctt gcagcttact atttatgtta 60

aatggcgctc ctaaaccaga acaattgaat aaagcgagtg aattcactgg tctaatggat 120

aatatgaggt atttgtatga tgataaacac gtatcagaaa taaacattaa agcccaagag 180

aagtttttac aacatgattt attatttaaa ataaatggct ctaaaattga tggttctaaa 240

attttaaaaa cagaatttaa taataatagc ctttcggata aatacaaaaa taaaaacata 300

gatttgtttg ggacaaacta ttattatcaa tgctattttt cagcggataa tatggaatta 360

aatgatggta gactaattga aaaaacgtgt atgtatggcg gtgtgaccga gcatgatgga 420

aatcaaatag ataaaaataa ttcaactgat aactctcata atatcttaat taaagttttt 480

gaaaacgaga gaaattcatt atcttttgat atacctacta ataagaaaaa cataacagca 540

caagaaatag attataaagt tagaaactat ttacttaagc ataaaaattt atatgaattt 600

aatagttcgc cttatgagac tggctatata aagtttatcg aaggaaatgg tcattctttt 660

tggtatgata tgatgcctga atctggtgaa aaattttatc cgactaaata tttactaatt 720

tataatgata ataagacagt tgagagtaaa tctattaatg tagaagttca tttaaccaaa 780

aaataa 786

<210>4

<211>261

<212>PRT

<213>耐甲氧西林金黄色葡葡球菌肠毒素C突变体mSEC的氨基酸序列

<400>4

Met Lys Leu Phe Ala Phe Ile Phe Ile Cys Val Lys Ser Cys Ser Leu

1 5 10 15

Leu Phe Met Leu Asn Gly Ala Pro Lys Pro Glu Gln Leu Asn Lys Ala

20 25 30

Ser Glu Phe Thr Gly Leu Met Asp Asn Met Arg Tyr Leu Tyr Asp Asp

35 40 45

Lys His Val Ser Glu Ile Asn Ile Lys Ala Gln Glu Lys Phe Leu Gln

50 55 60

His Asp Leu Leu Phe Lys Ile Asn Gly Ser Lys Ile Asp Gly Ser Lys

65 70 75 80

Ile Leu Lys Thr Glu Phe Asn Asn Asn Ser Leu Ser Asp Lys Tyr Lys

85 90 95

Asn Lys Asn Ile Asp Leu Phe Gly Thr Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr

100 105 110

Phe Ser Ala Asp Asn Met Glu Leu Asn Asp Gly Arg Leu Ile Glu Lys

115 120 125

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln Ile Asp

130 135 140

Lys Asn Asn Ser Thr Asp Asn Ser His Asn Ile Leu Ile Lys Val Phe

145 150 155 160

Glu Asn Glu Arg Asn Ser Leu Ser Phe Asp Ile Pro Thr Asn Lys Lys

165 170 175

Asn Ile Thr Ala Gln Glu Ile Asp Tyr Lys Val Arg Asn Tyr Leu Leu

180 185 190

Lys His Lys Asn Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly

195 200 205

Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Gly Asn Gly His Ser Phe Trp Tyr Asp Met

210 215 220

Met Pro Glu Ser Gly Glu Lys Phe Tyr Pro Thr Lys Tyr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Glu Ser Lys Ser Ile Asn Val Glu Val

245 250 255

His Leu Thr Lys Lys

260

<210>5

<211>1938

<212>DNA

<213>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白编码的基因序列

<400>5

atgaacaaac agcaaaaaga atttaaatca ttttattcaa ttagaaagtc atcactaggc 60

gttgcatctg tagcaattag tacactttta ttattaatgt caaatggcga agcacaagca 120

gcagctgaag aaacaggtgg tacaaataca gaagcacaac caaaaactga agcagttgca 180

agtccaacaa caacatctga aaaagctcca gaaactaaac cagtagctaa tgctgtctca 240

gtatctaata aagaagttga ggcccctact tctgaaacaa aagaagctaa agaagttaaa 300

gaagttaaag cccctaagga aacaaaagaa gttaaaccag cagcaaaagc cactaacaat 360

acatatccta ttttgaatca ggaacttaga gaagcgatta aaaaccctgc aataaaagac 420

aaagatcata gcgcaccaaa ctctcgtcca attgattttg aaatgaaaaa gaaagatgga 480

actcaacagt tttatcatta tgcaagttct gttaaacctg ctagagttat tttcactgat 540

tcaaaaccag aaattgaatt aggattacaa tcaggtcaat tttggagaaa atttgaagtt 600

tatgaaggtg acaaaaagtt gccaattaaa ttagtatcat acgatactgt taaagattat 660

gcttacattc gcttctctgt atcaaacgga acaaaagctg ttaaaattgt tagttcaaca 720

cacttcaata acaaagaaga aaaatacgat tacacattaa tggaattcgc acaaccaatt 780

tataacagtg cagataaatt caaaactgaa gaagattata aagctgaaaa attattagcg 840

ccatataaaa aagcgaaaac actagaaaga caagtttatg aattaaataa aattcaagat 900

aaacttcctg aaaaattaaa ggctgagtac aagaagaaat tagaggatac aaagaaagct 960

ttagatgagc aagtgaaatc agctattact gaattccaaa atgtacaacc aacaaatgaa 1020

aaaatgactg atttacaaga tacaaaatat gttgtttatg aaagtgttga gaataacgaa 1080

tctatgatgg atacttttgt taaacaccct attaaaacag gtatgcttaa cggcaaaaaa 1140

tatatggtca tggaaactac taatgacgat tactggaaag atttcatggt tgaaggtcaa 1200

cgtgttagaa ctataagcaa agatgctaaa aataatacta gaacaattat tttcccatat 1260

gttgaaggta aaactctata tgatgctatc gttaaagttc acgtaaaaac gattgattat 1320

gatggacaat accatgtcag aatcgttgat aaagaagcat ttacaaaagc caataccgat 1380

aaatctaaca aaaaagaaca acaagataac tcagctaaga aggaagctac tccagctacg 1440

cctagcaaac caacaccatc acctgttgaa aaagaatcac aaaaacaaga cagccaaaaa 1500

gatgacaata aacaattacc aagtgttgaa aaagaaaatg acgcatctag tgagtcaggt 1560

aaagacaaaa cgcctgctac aaaaccaact aaaggtgaag tagaatcaag tagtacaact 1620

ccaactaagg tagtatctac gactcaaaat gttgcaaaac caacaactgc ttcatcaaaa 1680

acaacaaaag atgttgttca aacttcagca ggttctagcg aagcaaaaga tagtgctcca 1740

ttacaaaaag caaacattaa aaacacaaat gatggacaca ctcaaagcca aaacaataaa 1800

aatacacaag aaaataaagc aaaatcatta ccacaaactg gtgaagaatc aaataaagat 1860

atgacattac cattaatggc attattagct ttaagtagca tcgttgcatt cgtattacct 1920

agaaaacgta aaaactaa 1938

<210>6

<211>645

<212>PRT

<213>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白氨基酸序列

<400>6

Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

1 5 10 15

Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr

35 40 45

Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr

50 55 60

Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser

65 70 75 80

Val SerAsn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala

85 90 95

Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys

100 105 110

Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu

115 120 125

Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser

130 135 140

Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly

145 150 155 160

Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val

165 170 175

Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly

180 185 190

Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro

195 200 205

Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg

210 215 220

Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr

225 230 235 240

His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe

245 250 255

Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp

260 265 270

Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu

275 280 285

Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu

290 295 300

Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala

305 310 315 320

Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln

325 330 335

Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val

340 345 350

Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys

355 360 365

His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met

370 375 380

Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln

385 390 395 400

Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile

405 410 415

Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys

420 425 430

Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile

435 440 445

Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys

450 455 460

Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr

465 470 475 480

Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln

485 490 495

Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu

500 505 510

Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys

515 520 525

Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val

530 535 540

Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys

545 550 555 560

Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys

565 570 575

Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly

580 585 590

His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys

595 600 605

Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro

610 615 620

Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro

625 630 635 640

Arg Lys Arg Lys Asn

645

<210>7

<211>1425

<212>DNA

<213>耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA、IsdB的活性功能片段与肠毒素C融合后的CSI编码基因序列

<400>7

atgacaacac catatattgt agttgttaat gggcatattg atcctaatag taaaggtgat 60

ttagctttac gttcaacttt atatggatat aattcgaata taatttggcg atcaatgtca 120

tgggataatg aagtagcatt taataacgga tcaggttctg gtgacggtat cgataaacct 180

gttgttcctg aacaacctga tgagccgggt gaaattgaac caattccaga gggtggaggc 240

ggttcaatga agttatttgc ttttatcttc atatgtgtta agtcttgcag cttactattt 300

atgttaaatg gcgctcctaa accagaacaa ttgaataaag cgagtgaatt cactggtcta 360

atggataata tgaggtattt gtatgatgat aaacacgtat cagaaataaa cattaaagcc 420

caagagaagt ttttacaaca tgatttatta tttaaaataa atggctctaa aattgatggt 480

tctaaaattt taaaaacaga atttaataat aatagccttt cggataaata caaaaataaa 540

aacatagatt tgtttgggac aaactattat tatcaatgct atttttcagc ggataatatg 600

gaattaaatg atggtagact aattgaaaaa acgtgtatgt atggcggtgt gaccgagcat 660

gatggaaatc aaatagataa aaataattca actgataact ctcataatat cttaattaaa 720

gtttttgaaa acgagagaaa ttcattatct tttgatatac ctactaataa gaaaaacata 780

acagcacaag aaatagatta taaagttaga aactatttac ttaagcataa aaatttatat 840

gaatttaata gttcgcctta tgagactggc tatataaagt ttatcgaagg aaatggtcat 900

tctttttggt atgatatgat gcctgaatct ggtgaaaaat tttatccgac taaatattta 960

ctaatttata atgataataa gacagttgag agtaaatcta ttaatgtaga agttcattta 1020

accaaaaaag gtggaggcgg ttcaccaaca aatgaaaaaa tgactgattt acaagataca 1080

aaatatgttg tttatgaaag tgttgagaat aacgaatcta tgatggatac ttttgttaaa 1140

caccctatta aaacaggtat gcttaacggc aaaaaatata tggtcatgga aactactaat 1200

gacgattact ggaaagattt catggttgaa ggtcaacgtg ttagaactat aagcaaagat 1260

gctaaaaata atactagaac aattattttc ccatatgttg aaggtaaaac tctatatgat 1320

gctatcgtta aagttcacgt aaaaacgatt gattatgatg gacaatacca tgtcagaatc 1380

gttgataaag aagcatttac aaaagccaat accgataaat cttaa 1425

<210>8

<211>474

<212>PRT

<213>信息耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA、IsdB的活性功能片段与肠毒素C融合后CSI的氨基酸序列

<400>8

Met Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val Asn Gly His Ile Asp Pro Asn

1 5 10 15

Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser

20 25 30

Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp Asn Glu Val Ala Phe Asn

35 40 45

Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Val Val Pro Glu

50 55 60

Gln Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Met Lys Leu Phe Ala Phe Ile Phe Ile Cys Val Lys Ser Cys

85 90 95

Ser Leu Leu Phe Met Leu Asn Gly Ala Pro Lys Pro Glu Gln Leu Asn

100 105 110

Lys Ala Ser Glu Phe Thr Gly Leu Met Asp Asn Met Arg Tyr Leu Tyr

115 120 125

Asp Asp Lys His Val Ser Glu Ile Asn Ile Lys Ala Gln Glu Lys Phe

130 135 140

Leu Gln His Asp Leu Leu Phe Lys Ile Asn Gly Ser Lys Ile Asp Gly

145 150 155 160

Ser Lys Ile Leu Lys Thr Glu Phe Asn Asn Asn Ser Leu Ser Asp Lys

165 170 175

Tyr Lys Asn Lys Asn Ile Asp Leu Phe Gly Thr Asn Tyr Tyr Tyr Gln

180 185 190

Cys Tyr Phe Ser Ala Asp Asn Met Glu Leu Asn Asp Gly Arg Leu Ile

195 200 205

Glu Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly Asn Gln

210 215 220

Ile Asp Lys Asn Asn Ser Thr Asp Asn Ser HisAsn Ile Leu Ile Lys

225 230 235 240

Val Phe Glu Asn Glu Arg Asn Ser Leu Ser Phe Asp Ile Pro Thr Asn

245 250 255

Lys Lys Asn Ile Thr Ala Gln Glu Ile Asp Tyr Lys Val Arg Asn Tyr

260 265 270

Leu Leu Lys His Lys Asn Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu

275 280 285

Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Gly Asn Gly His Ser Phe Trp Tyr

290 295 300

Asp Met Met Pro Glu Ser Gly Glu Lys Phe Tyr Pro Thr Lys Tyr Leu

305 310 315 320

Leu Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Glu Ser Lys Ser Ile Asn Val

325 330 335

Glu Val His Leu Thr Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Thr Asn Glu

340 345 350

Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val

355 360 365

Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys

370 375 380

Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn

385 390 395 400

Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr

405 410 415

Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr

420 425 430

Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys

435 440 445

Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu

450 455 460

Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser

465 470

<210>9

<211>1425

<212>DNA

<213>耐甲氧西林金黄色葡葡球菌ClfA、IsdB的活性功能片段与肠毒素C融合后的ISC编码基因序列

<400>9

atgccaacaa atgaaaaaat gactgattta caagatacaa aatatgttgt ttatgaaagt 60

gttgagaata acgaatctat gatggatact tttgttaaac accctattaa aacaggtatg 120

cttaacggca aaaaatatat ggtcatggaa actactaatg acgattactg gaaagatttc 180

atggttgaag gtcaacgtgt tagaactata agcaaagatg ctaaaaataa tactagaaca 240

attattttcc catatgttga aggtaaaact ctatatgatg ctatcgttaa agttcacgta 300

aaaacgattg attatgatgg acaataccat gtcagaatcg ttgataaaga agcatttaca 360

aaagccaata ccgataaatc tggtggaggc ggttcaatga agttatttgc ttttatcttc 420

atatgtgtta agtcttgcag cttactattt atgttaaatg gcgctcctaa accagaacaa 480

ttgaataaag cgagtgaatt cactggtcta atggataata tgaggtattt gtatgatgat 540

aaacacgtat cagaaataaa cattaaagcc caagagaagt ttttacaaca tgatttatta 600

tttaaaataa atggctctaa aattgatggt tctaaaattt taaaaacaga atttaataat 660

aatagccttt cggataaata caaaaataaa aacatagatt tgtttgggac aaactattat 720

tatcaatgct atttttcagc ggataatatg gaattaaatg atggtagact aattgaaaaa 780

acgtgtatgt atggcggtgt gaccgagcat gatggaaatc aaatagataa aaataattca 840

actgataact ctcataatat cttaattaaa gtttttgaaa acgagagaaa ttcattatct 900

tttgatatac ctactaataa gaaaaacata acagcacaag aaatagatta taaagttaga 960

aactatttac ttaagcataa aaatttatat gaatttaata gttcgcctta tgagactggc 1020

tatataaagt ttatcgaagg aaatggtcat tctttttggt atgatatgat gcctgaatct 1080

ggtgaaaaat tttatccgac taaatattta ctaatttata atgataataa gacagttgag 1140

agtaaatcta ttaatgtaga agttcattta accaaaaaag gtggaggcgg ttcaacaaca 1200

ccatatattg tagttgttaa tgggcatatt gatcctaata gtaaaggtga tttagcttta 1260

cgttcaactt tatatggata taattcgaat ataatttggc gatcaatgtc atgggataat 1320

gaagtagcat ttaataacgg atcaggttct ggtgacggta tcgataaacc tgttgttcct 1380

gaacaacctg atgagccggg tgaaattgaa ccaattccag agtaa 1425

<210>10

<211>474

<212>PRT

<213>信息耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA、IsdB的活性功能片段与肠毒素C融合后的ISC的氨基酸序

列

<400>10

Met Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val

1 5 10 15

Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val

2 025 30

Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val

35 40 45

Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly

50 55 60

Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr

65 70 75 80

Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val

85 90 95

Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg

100 105 110

Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Met Lys Leu Phe Ala Phe Ile Phe Ile Cys Val Lys

130 135 140

Ser Cys Ser Leu Leu Phe Met Leu Asn Gly Ala Pro Lys Pro Glu Gln

145 150 155 160

Leu Asn Lys Ala Ser Glu Phe Thr Gly Leu Met Asp Asn Met Arg Tyr

165 170 175

Leu Tyr Asp Asp Lys His Val Ser Glu Ile Asn Ile Lys Ala Gln Glu

180 185 190

Lys Phe Leu Gln His Asp Leu Leu Phe Lys Ile Asn Gly Ser Lys Ile

195 200 205

Asp Gly Ser Lys Ile Leu Lys Thr Glu Phe Asn Asn Asn Ser Leu Ser

210 215 220

Asp Lys Tyr Lys Asn Lys Asn Ile Asp Leu Phe Gly Thr Asn Tyr Tyr

225 230 235 240

Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Ala Asp Asn Met Glu Leu Asn Asp Gly Arg

245 250 255

Leu Ile Glu Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asp Gly

260 265 270

Asn Gln Ile Asp Lys Asn Asn Ser Thr Asp Asn Ser His Asn Ile Leu

275 280 285

Ile Lys Val Phe Glu Asn Glu Arg Asn Ser Leu Ser Phe Asp Ile Pro

290 295 300

Thr Asn Lys Lys Asn Ile Thr Ala Gln Glu Ile Asp Tyr Lys Val Arg

305 310 315 320

Asn Tyr Leu Leu Lys His Lys Asn Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro

325 330 335

Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Gly Asn Gly His Ser Phe

340 345 350

Trp Tyr Asp Met Met Pro Glu Ser Gly Glu Lys Phe Tyr Pro Thr Lys

355 360 365

Tyr Leu Leu Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Glu Ser Lys Ser Ile

370 375 380

Asn Val Glu Val His Leu Thr Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr

385 390 395 400

Pro Tyr Ile Val Val Val Asn Gly His Ile Asp Pro Asn Ser Lys Gly

405 410 415

Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile

420 425 430

Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp Asn Glu Val Ala Phe Asn Asn Gly Ser

435 440 445

Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Val Val Pro Glu Gln Pro Asp

450 455 460

Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu

465 470

Claims

1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗，其特征在于：该疫苗的活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活性功能片段通过接头序列与肠毒素C突变体mSEC连接在一起后，再通过接头序列与IsdB活性功能片段连接在一起而得到融合蛋白质CSI，融合蛋白质CSI的氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示；或者活性成分是先将MRSA抗原组分IsdB活性功能片段首先与肠毒素C突变体mSEC的融合基因连接后，再与ClfA活性功能片段在基因水平上通过接头序列融合在一起形成的多亚单位基因工程重组融合蛋白质ISC，融合蛋白质ISC的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示。

2.采用MRSA ClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体基因制备的疫苗制剂，其特征在于：所述疫苗由权利要求1所述的基因工程疫苗活性成分与Al(OH)₃佐剂、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂按常规方法组成。

3.制备权利要求1-2任一所述的基因工程疫苗的方法，主要包括以下步骤：

（1）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA和IsdB亚单位保护性抗原以及MRSA肠毒素C突变体目的基因的PCR扩增、基因克隆与序列分析，得到基因片段ClfA_484-559、IsdB_337-462和mSEC，其基因序列依次为SEQ ID NO:1的第484-559位、SEQ ID NO:5的第337-462位和SEQ ID NO:3；

（2）将步骤（1）所述的ClfA_484-559基因片段通过重叠延伸PCR方法与mSEC连接后，再与IsdB_337-462基因片段通过重叠延伸PCR方法连接起来；或者先将IsdB_337-462基因片段与mSEC基因片段水平连接后，再与基因片段ClfA_484-559水平连接，构建表达基因工程重组多价融合蛋白疫苗，得到ClfA和IsdB活性功能片段与肠毒素C突变体的融合基因，连接到原核表达质粒中，得到重组表达质粒pET28a-CSI或pET28a-ISC；

（3）用步骤（2）的得到的重组表达质粒转化的宿主细菌细胞，得到基因工程重组菌株pET28a-CSI/BL21或pET28a-ISC/BL21；

（4）在适于表达所需蛋白质的条件下，大规模发酵培养步骤（3）的基因工程重组菌株pET28a-CSI/BL21或pET28a-ISC/BL21；

（5）分离并纯化步骤（4）产生的重组蛋白质，即得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗的活性成分。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是在步骤1中，克隆ClfA、IsdB、mSEC亚单位基因使用的引物如下：

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤2中构建融合基因使用的合成引物如下：

ClfA_484-559与mSEC融合基因CS

CS与IsdB_337–462融合基因CSI

IsdB_337–462与mSEC融合基因IS

ClfA_484–559与IS基因融合获得ISC

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为使用镍离子亲和纯化、阴离子纯化、凝胶过滤层析柱纯化重组蛋白质，其中阴离子纯化填料选自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF或QSepharose XL；镍离子亲和纯化填料选自Chelating Sepharose HP或Chelating Sepharose FF；凝胶过滤层析柱选自Superdex 75、Superdex200或Superdex HR 10/30。