CN114456994B - 一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌，所述重组金黄色葡萄球菌的agr系统功能失活，且含有两种或两种以上异种病原体来源的抗原肽段编码基因，所述抗原肽段编码基因分别插入到一金葡菌融合靶分子的编码基因中获得融合蛋白编码序列，所述金葡菌融合靶分子选自金黄色葡萄球菌呈现于膜泡上的蛋白质，使产生的膜泡能够呈现有两种或两种以上异种病原体来源的抗原肽段。本发明还提供了其制备方法和应用。本发明提供的安全金葡菌可用于制备细菌膜泡多联疫苗，对于预防外源目标分子对应的病原体感染具有重要的现实意义。

Description

一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种细菌膜泡多联疫苗及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称金葡菌)为一种革兰氏阳性球菌，常成葡萄状排列，在自然界分布广泛。韩国研究者率先证实金葡菌可产生并向外分泌细菌膜泡(Bacterial membrane vesicles,MVs)(Lee et al.,Proteomics,2009；9:5425-36)。
MVs是细菌在生长繁殖过程中自然产生并分泌到菌体外环境的一种膜性结构，其直径为20～400nm；分泌的MVs可携带细菌来源的各种重要抗原，包括工程构建的融合蛋白质成分(Qiao et al.,Front Microbiol,2021；12:729369)。采用基因工程技术可以将具有保护作用的外源抗原基因(如其他病原体或病毒的保护性基因)与金葡菌基因组中特有的具有MV靶向功能的基因进行融合，利用目标分子的靶向功能，将外源抗原分子呈递到MVs中，作为候选疫苗。由于MVs中的装载分子较多，且可因菌株的不同而携带不同的分子，如果将同一种病原体不同血清型的候选抗原与不同的靶向分子进行融合，则可实现多价疫苗的构建(Yuan et al.,Nano Lett,2018；18:725-33)；如果将不同病原的有效保护抗原与不同的靶向分子进行融合，则可实现多联疫苗的构建。
人类第一个多联疫苗，百白破疫苗就是一种三联疫苗，是将百日咳菌苗、白喉类毒素及破伤风类毒素按一定比例混合制备成为一种疫苗，达到接种一种疫苗就可以预防白喉、百日咳和破伤风三种疾病的目的( et al.,Vaccine,2021；S0264-410X(21)00720-9)。后来开发的麻腮风疫苗以及流脑/hib疫苗均是多联疫苗。吸附无细胞百白破-脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌多联疫苗包括无细胞百日咳抗原、白喉抗原、破伤风抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒和b型流感嗜血杆菌抗原，是一种五联疫苗。还有一种由伤寒菌苗、甲型副伤寒菌苗、乙型副伤寒菌苗、霍乱肠毒素组成的四联疫苗(Borghi et al.,Vaccine,2021；39:5442-6)。在申请号为201710792641.9的中国发明专利申请中公开了一种预防A型链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，该疫苗活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己组成，所述成分甲为分选酶或具有所述分选酶的融合蛋白；所述成分乙为SCPA或具有所述SCPA的融合蛋白；所述成分丙为Spy0269或具有所述Spy0269的融合蛋白；所述成分丁为SCPC或具有所述SCPC的融合蛋白；所述成分戊为SLO或具有所述SLO的融合蛋白；所述成分己佐剂CpG或其他粘膜免疫佐剂。在申请号为202010638005.2的中国发明专利申请中公开了一种将牛轮状病毒VP6片段的loop区替换为来源于牛冠状病毒的抗原表位和/或来源于大肠杆菌的抗原表位的片段，使牛轮状病毒融合蛋白不仅含有牛轮状病毒抗原，还含有牛冠状病毒抗原和大肠杆菌的抗原中的至少一种，形成多联疫苗。在申请号为202111068018.1的中国发明专利申请中公开了一种将大肠杆菌耐热肠毒素和不耐热肠毒素基因，以及魏氏梭菌α毒素和β1毒素基因进行串联形成融合蛋白，从而实现多联疫苗保护功能。然而，这些多联疫苗的制备工艺有些是将每种疫苗按标准流程制备好后，再以一定的比例混合；有些是进行单纯串联表达，均存在成本高、制备程序复杂、效果不稳定以及潜在致病性等风险。
发明内容
本发明针对上述现有技术的多联疫苗制备工艺中存在的技术问题，提供了一种利用微生物的生长特性，发展出多联疫苗制备技术，由此制备的多联疫苗遗传稳定、致病风险低。
本发明的主要目的是提供一种全新且安全的重组金黄色葡萄球菌，在细菌基因组中特定分子编码基因上融合了外源的鼠疫耶尔森菌LcrV1，类鼻疽伯克霍尔德菌Hcp1，金葡菌SEB和炭疽杆菌Pa的编码基因，形成融合基因，通过金葡菌MVs的分泌机制，能产生携带上述四种外源目标分子的细菌膜泡，该膜泡可作为四联候选疫苗使用。
本发明首先提供了一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌，所述重组金黄色葡萄球菌的agr系统功能失活，且含有两种或两种以上异种病原体来源的抗原肽段编码基因，所述抗原肽段编码基因分别插入到一金葡菌融合靶分子的编码基因中获得融合蛋白编码序列，所述金葡菌融合靶分子选自金黄色葡萄球菌呈现于膜泡上的蛋白质，使产生的膜泡能够呈现有两种或两种以上异种病原体来源的抗原肽段。
在根据本发明的一个实施方案中，编码异种病原体来源的抗原肽段的核苷酸序列分别插入到一金葡菌融合靶分子的编码基因中获得融合蛋白编码序列，优选地，所述编码异种病原体来源的抗原肽段的核苷酸序列插入到金葡菌融合靶分子的编码基因的终止子前；
所述金葡菌融合靶分子选自金葡菌金属ABC转运体底物结合蛋白(Mntc)、金葡菌烯醇化酶(Eno)、金葡菌丙酮酸脱氢酶α亚单位(PdhA)和金葡菌丙酮酸脱氢酶β亚单位(PdhB)中的一个或多个；
优选地，所述金葡菌金属ABC转运体底物结合蛋白Mntc的编码基因为SEQ ID NO:10所示的mntc基因；
优选地，所述金葡菌烯醇化酶Eno的编码基因为SEQ ID NO:7所示的eno基因；
优选地，所述金葡菌丙酮酸脱氢酶α亚单位PdhA的编码基因为SEQ ID NO:13所示的pdhA基因；
优选地，所述金葡菌丙酮酸脱氢酶β亚单位PdhB的编码基因为SEQ ID NO:16所示的pdhB基因。
在根据本发明的一个实施方案中，所述异种病原体选自鼠疫耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和炭疽杆菌中的任一个或多个。
在根据本发明的一个实施方案中，所述异种病原体来源的抗原肽段选自鼠疫耶尔森菌III型分泌系统毒力因子LcrV，金葡菌肠毒素SEB,类鼻疽伯克霍尔德菌VI型分泌系统通道蛋白Hcp1和炭疽杆菌毒素成分保护性抗原Pa中的一个或多个；
优选地，所述鼠疫耶尔森菌III型分泌系统毒力因子LcrV的编码基因为SEQ IDNO:8所示的lcrV基因；
优选地，所述金葡菌肠毒素SEB的编码基因为SEQ ID NO:11所示的seb基因；
优选地，所述类鼻疽伯克霍尔德菌VI型分泌系统通道蛋白Hcp1的编码基因为SEQID NO:17所示的hcp1基因；
优选地，所述炭疽杆菌毒素成分保护性抗原Pa的编码基因为SEQ ID NO:14所示的pa基因。
在根据本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白编码序列选自Eno-LcrV融合序列的编码氨基酸序列、Mntc-SEB融合序列的编码氨基酸序列、PdhA-Pa融合序列的编码氨基酸序列和PdhB-Hcp1融合序列的编码氨基酸序列中的一个或多种；
优选地，所述Eno-LcrV融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；所述Eno-LcrV融合序列的编码核苷酸序列进一步优选为SEQ ID NO:2；
优选地，所述Mntc-SEB融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；所述Mntc-SEB融合序列的编码核苷酸序列进一步优选为SEQ ID NO:3；
优选地，所述PdhA-Pa融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:15；所述PdhA-Pa融合序列的编码核苷酸序列进一步优选为SEQ ID NO:4；
优选地，所述PdhB-Hcp1融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:18；所述PdhB-Hcp1融合序列的编码核苷酸序列优选为SEQ ID NO:5。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的重组金黄色葡萄球菌选自金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV、金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV/seb、金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa或金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1中的任一种。
本发明进一步提供了上述的重组金黄色葡萄球菌的构建方法，包括：
1)通过基因重组、基因突变或基因编辑使金黄色葡萄球菌的agrA基因失活，获得agr系统功能失活的安全型金黄色葡萄球菌；
2)确定金葡菌融合靶分子及融合靶分子编码基因，并基于所述融合靶分子编码基因构建同源左臂和同源右臂；
3)确定异种病原体及其抗原肽段，并将所述抗原肽段的编码核苷酸序列插入到所述同源左臂和同源右臂之间，获得以同源左臂-抗原肽编码核苷酸序列-同源右臂形式连接形成的同源重组序列；
4)将所述同源重组序列连接到质粒中，获得融合质粒；
5)将所述融合质粒转化到所述安全型金黄色葡萄球菌中，经筛选获得重组金黄色葡萄球菌。
在根据本发明的一个实施方案中，所述安全型金黄色葡萄球菌是通过包括下述步骤的方法构建得到的：
1)以金葡菌靶标分子在基因组中的基因序列获得用于agrA基因打靶的agrA基因同源左臂和agrA基因同源右臂；
2)将agrA基因同源左臂和agrA基因同源右臂序列直接相连，然后克隆到敲除载体上，得到敲除载体；所述敲除载体优选为pBT2-ΔagrA；
3)将敲除载体转化到野生型金黄色葡萄球菌中，经筛选即得到缺失agrA基因的安全型金黄色葡萄球菌；优选地，所述野生型金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌RN4220菌株。
本发明还提供了上述的重组金黄色葡萄球菌在制备细菌膜泡多联疫苗中的应用。
本发明进一步提供了一种基于上述的重组金黄色葡萄球菌制备得到的细菌膜泡多联疫苗；优选地，所述细菌膜泡多联疫苗为用于金葡菌SEB中毒、鼠疫、炭疽和类鼻疽病中的两种或两种以上的预防或治疗的疫苗。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1)本发明所述的安全的金葡菌，能产生富含外源目标重组蛋白的MVs，可用于相应疾病的防控。
2)以金葡菌群体感应系统agrA为靶标，人工设计同源左、右臂，构建敲除载体，构建agrA基因缺失工程菌株，实现MVs减毒，达到安全效果。
3)以金葡菌金属ABC转运体底物结合蛋白Mntc、金葡菌烯醇化酶Eno、金葡菌丙酮酸脱氢酶α亚单位PdhA、金葡菌丙酮酸脱氢酶β亚单位PdhB为融合靶标分子，可承载任一外源目标抗原分子，形成融合分子，并通过金葡菌MV分泌机制呈现到MVs中。
4)以类鼻疽伯克霍尔德菌VI型分泌系统通道蛋白Hcp1、金葡菌肠毒素SEB、鼠疫耶尔森菌III型分泌系统毒力因子LcrV、炭疽杆菌保护性抗原Pa为候选外源目标分子，通过基因工程技术分别将之插入金葡菌融合靶标蛋白编码区内，形成融合分子，利用细菌膜泡分泌机制，产生重组细菌膜泡，并将上述目标抗原呈现在MVs上。
5)本发明所述的重组MVs不会含其他病原体来源的核酸，不能自行生长繁殖，提高了MVs使用的安全性。
6)金葡菌为革兰阳性球菌，不会含有革兰氏阴性菌的细胞壁内毒素成分，简化了MVs的纯化工艺，提高了制备效率。
实验证明，本发明提供的安全金葡菌能成功表达并分泌外源靶标分子与金葡菌融合靶标分子的融合物，共同呈现在MVs中，可用作细菌膜泡多联疫苗，对于预防外源目标分子对应的病原体感染具有重要的现实意义。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌膜泡的毒力试验结果图。制备金葡菌RN4220和工程菌RN4220-ΔagrA膜泡，按50μg/只进行小鼠腹腔注射，观察动物的死亡情况，绘制成死亡曲线，可见野生型金葡菌膜泡接种一天后80％动物死亡，而接种RN4220-ΔagrA膜泡的动物完全存活，表明敲除agrA基因的金葡菌产生的膜泡具有良好的安全性。
图2为工程菌RN4220-ΔagrA/lcrV的构建与鉴定图谱。其中，左图显示的为重组质粒pBT2-lcrV酶切鉴定及RN4220-ΔagrA/lcrV工程菌中目标融合基因的PCR扩增鉴定；右上方图显示的是RN4220-ΔagrA/lcrV中融合基因PCR扩增产物的测序结果，可见靶基因与外源lcrV基因正确融合，工程菌构建成功；右下图为RN4220-ΔagrA和RN4220-ΔagrA/lcrV膜泡中融合蛋白用LcrV抗体进行的Western blot鉴定结果，在RN4220-ΔagrA不存在融合蛋白，而在RN4220-ΔagrA/lcrV膜泡中存在融合蛋白。
图3为工程菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb的构建与鉴定。左图显示的为重组质粒pBT2-seb酶切鉴定、RN4220-ΔagrA/lcrV/seb工程菌中目标融合基因的PCR扩增鉴定以及RN4220-ΔagrA和RN4220-ΔagrA/lcrV/seb工程菌膜泡蛋白SDS-PAGE电泳分析；右上方图显示的是RN4220-ΔagrA/lcrV/seb中融合基因PCR扩增产物的测序结果，可见靶基因mntc与外源seb基因正确融合，工程菌构建成功；右下图为RN4220-ΔagrA和RN4220-ΔagrA/lcrV/seb膜泡中融合蛋白用SEB抗体进行的Western blot鉴定结果，在RN4220-ΔagrA不存在融合蛋白，而在RN4220-ΔagrA/lcrV膜泡中存在融合蛋白。
图4为工程菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1的构建与鉴定。左上图显示的为目标基因hcp1扩增产物电泳分析，左下图显示的为重组质粒pBT2-hcp1酶切鉴定；右上方图显示的是RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1中融合基因pdhB-hcp1的PCR扩增产物的测序结果，可见靶基因pdhB与外源hcp1基因正确融合，工程菌构建成功；右下图为RN4220-ΔagrA和RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1膜泡中融合蛋白用PdhB抗体进行的Westernblot鉴定结果，在RN4220-ΔagrA的菌体及膜泡中存在约40kDa的PdhB蛋白，而在RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1工程菌的菌体及膜泡中存在PdhB-Hcp1融合蛋白，分子量变大，证实工程菌构建成功。
图5为重组Hcp1重组蛋白诱导表达图谱。培养pET28a-hcp1/BL21重组工程菌，SDS-PAGE电泳检测未加IPTG和加入IPTG诱导不同时间(3h、6h、过夜)，在上清和沉淀中蛋白表达量的差别，结果可见只有加入IPTG，上清和沉淀中蛋白才会大量表达，诱导时间选取6h为佳。
图6为各组免疫动物的体重变化示意图。按图示的方案进行细菌膜泡的免疫接种，注射3针，每日称取实验动物体重，绘制体重变化曲线，可见各组实验小鼠在免疫过程中体重无显著差异。
图7为免疫保护及动物死亡曲线图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
如无特殊声明，本发明涉及的菌株、试剂和材料均可通过商业途径获得，具体如下：
金黄色葡萄球菌RN4220(购自TaKaRa公司，中国大连)
大肠杆菌DH5α和菌株BL21(购自TaKaRa公司，中国大连)
普通Taq DNA聚合酶，BamH I、HindIII、SalI等限制性内切酶(购自Fermentas，美国)
质粒pBT2，pUC-lcrV,pUC-pa,PET28a-hcp1(购自华大基因公司，中国深圳)
质粒DNA抽提试剂盒(购自华舜公司，中国上海)
辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠抗体(购自中杉公司，北京)
PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司，中国上海)
PrimeSTAR Max Premix 2X(购自TaKaRa公司，中国大连)
酵母提取物、琼脂粉、胰蛋白胨，LB培养基(购自Oxoid公司，英国)
BHI培养基干粉(购自Oxoid公司，英国)
氯霉素、四环素(购自生工公司，中国上海)
DAB底物溶液(EL-ABTS显色试剂盒，购自上海生工，中国)
PVDF膜(购自Milipore,美国)
SDS-PAGE蛋白电泳仪、PCR仪、荧光定量PCR仪(购自BIO-RAD公司，美国)
酶标仪(购自Sunshine公司，美国)
Gene Pulser Xcell TM型电穿孔仪(购自BIO-RAD公司，美国)
TSB液体培养基的配制：
称取BHI培养基干粉9g，加300ml ddH2O溶解，高压灭菌，4℃保存备用。
BHI固体培养基的配制：
每1000ml液体BHI培养基中加入15g琼脂粉(上海生工产品)，高压蒸气灭菌，铺板备用。
类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组模板及Hcp1抗体由陆军军医大学临床微生物学教研室毛旭虎教授惠赠。
实施例1金黄色葡萄球菌agrA基因敲除与鉴定
金葡菌为第一种被研究证实可产生MVs的革兰氏阳性细菌(Lee et al.,Proteomics,2009；9:5425–36)，但野生型金葡菌产生的MVs具有毒性，影响MVs使用的安全性(Yuan et al.,Nano Lett,2018；18:725-33)，本申请对金葡菌RN4220中群体感应系统agrA基因进行敲除，构建安全的金葡菌菌株；
1.敲除载体的构建
分析金葡菌RN4220菌株基因组上agrA基因序列SEQ ID NO:6，AgrA蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。在敲除序列位点上下游900bp左右设计引物，左同源臂扩增引物见序列表SEQ ID NO：19(引物P1)和20(引物P2)，右同源臂扩增引物见序列表SEQ ID NO：21(引物P3)和22(引物P4)，以RN4220基因组为模板，PCR分别扩增agrA基因的左、右同源臂；将扩增产物纯化后，取等量同源臂为模板，利用左右同源臂之间的同源序列，用SEQ ID NO：19(引物P1)和SEQ ID NO：22(引物P4)引物进行扩增，获得左右同源臂直接相连的敲除序列；再利用酶切(BamHI和HindIII)连接的方法将敲除序列连接至大肠埃希菌-金葡菌穿梭质粒pBT2上，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性重组子进行测序鉴定，序列正确的质粒即为敲除质粒pBT2-ΔagrA。
左右同源臂PCR的反应体系如下:
PCR的反应条件：98℃30秒，58℃30秒,72℃70秒，循环30次；所得PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物回收、纯化，即获得左、右同源臂片段。
敲除序列的PCR反应体系如下:
PCR的反应条件：98℃30秒，58℃30秒,72℃120秒，循环30次；所得PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物回收、纯化，即获得敲除序列DNA片段。
敲除序列酶切：
利用P1、P4引物上设计的酶切位点，采用限制酶对PCR扩增的敲除序列进行酶切，酶切体系如下：
上述混合物置于37℃作用3h，所得酶切产物经0.8％琼脂糖电泳回收，插入到pBT2质粒的相应酶切位点，并转化大肠埃希菌DH5α感受态，经AMP(100μg/ml)平板37℃24h培养后，挑取AMP抗性菌落，提取质粒进行酶切鉴定，能切出目标片段者为成功构建的敲除质粒pBT2-ΔagrA。
2.感受态的制备与质粒电转化
挑取金葡菌RN4220株单菌落至2ml BHI液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，次日按1:100比例转种于含100ml新鲜BHI液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养，至OD600约1.0(约培养2h)；用无菌离心管分装，冰浴30min后4℃离心4,500×g，10min后，小心弃去上清。每管加入约40ml预冷的0.5M蔗糖溶液，涡悬混匀，冰浴静置5min后4℃离心4,500g，10min后，小心弃去上清，重复三次；用1ml冰浴冷的0.5M蔗糖溶液重悬，100μl分装，-80℃保存；
取敲除质粒pBT2-ΔagrA约0.5μg与100μl的金葡菌RN4220电转感受态混匀，冰浴20min后，转入预冷的0.2cm的电转杯中，静置10min进行电转化；电转仪参数设定为电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω；电转完毕之后，迅速加入1ml BHI液体培养基，30℃，150rpm复苏培养1h，转化菌涂于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的BHI固体平板上，30℃孵育培养24h，从转化固体培养基中挑取RN4220转化菌，提取质粒进行酶切鉴定。
3.敲除菌株的筛选与鉴定
利用pBT2质粒温度敏感的特性，30℃时该质粒可以在细菌中稳定存在，当温度大于42℃时质粒不能复制，容易与细菌染色体发生整合，再经过25℃诱导，使整合的质粒片段从基因组上环化切离，从而敲除目的基因；在敲除质粒pBT2-ΔagrA转化的RN4220菌株中用氯霉素(10μg/ml)进行抗性负向筛选，负向筛选得到在氯霉素平板上不生长，无抗生素平板上能生长的细菌克隆并提取基因组；利用验证引物(SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22)对敲除株agrA基因上下游进行PCR扩增验证，筛选可能的RN4220-ΔagrA敲除株；最后扩增基因组片段进行DNA测序鉴定，获得构建成功的RN4220-ΔagrA敲除株。
实施例2金葡菌RN4220-ΔagrA敲除株膜泡的毒力检测
群体感应系统Agr是金葡菌重要的毒力调控系统，控制着上百个毒力因子的表达，该系统功能缺失将导致菌株的毒力显著下降(Reye et al.,JBacteriol,2011；193:6020-31)；为观察agrA敲除后细菌膜泡的安全性能，本申请制备了RN4220-ΔagrA敲除株及其野生株的膜泡，并采用Balb/c小鼠动物实验检测膜泡的毒力，验证RN4220-ΔagrA敲除株膜泡的安全性。
1.金葡菌RN4220和RN4220-ΔagrA的培养
从BHI固体平板上挑取单个菌落，接种于3ml的BHI液体培养基中，37℃振荡培养18h，次日按1:1,000接种于300ml新鲜BHI培养基，37℃振荡培养，于培养后24h收集培养上清。
2.细菌膜泡的制备
(1)将收集的细菌培养上清用50,000×g于4℃离心30min(日立CP70ME型超速离心机,日本)，离心上清用0.45μm的滤器过滤，滤液再用100kDa的超滤柱(Millipore,美国)超滤。
(2)将滤液用200,000×g于4℃离心3h，收集沉淀。
(3)用PBS缓冲液悬浮沉淀，用Optiprep梯度液(50％，40％，10％)200,000×g4℃离心3h(Lee et al.,Proteomics,2009；9:5425-36)，小心收集10％-40％梯度界面的悬浮带，4℃保存备用。
3.动物实验
参见文献方法(Riveraet al.,Proc Natl Acad Sci USA,2010；107:19002-7)进行；取野生株RN4220膜泡和RN4220-ΔagrA细菌膜泡(浓度为1mg/ml)各50μl分别采用腹腔注射的方法，攻击6-8周龄Balb/c小鼠，每组10只，实时观察每只小鼠的情况，记录死亡时间,结果如附图1所示，野生株RN4220的膜泡攻击小鼠24h后，只有2只小鼠存活，而agrA敲除株膜泡攻击的小鼠则全部存活，观察至7天实验结束后，未发现有任何发病症状。经统计学分析，agrA敲除株与野生株感染组的存活率有明显差异(P<0.01),表明金黄色葡萄球菌agrA缺失会导致细菌膜泡的毒力显著下降，安全性大大提高。
实施例3金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV工程菌构建
有研究报道金葡菌Eno可呈现在膜泡中(Yuan et al.,Nano Lett,2018；18:725-33)，本申请利用烯醇化酶Eno(48kDa)作为金葡菌中融合靶标分子，通过基因工程技术将鼠疫耶尔森菌保护性抗原LcrV与Eno构建成融合蛋白，利用Eno的膜泡定位功能将融合蛋白呈现在MVs中。
1.LcrV分子的选择
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是耶尔森氏菌属中的一种杆菌，为腺鼠疫、肺鼠疫和败血型鼠疫的病原体，鼠疫是一种自然疫源性烈性传染病，也叫做黑死病；临床主要表现为高热、淋巴结肿痛、出血倾向、肺部特殊炎症等；远在2000多年前即有记载，在世界上曾发生三次大流行，严重危害人类健康；该病原菌可经多途径传播，靠荚膜、多种毒性抗原、内毒素及毒性酶、透明质酸酶、纤维蛋白酶等致病；其中III型分泌系统是鼠疫耶尔森菌重要的毒力系统，该III型分泌系统毒力因子LcrV为重要的致病因子和免疫原(Mitchell etal.,mBio,2017；8:e00646-17)，本申请里先选择鼠疫耶尔森菌LcrV(序列表SEQ ID NO：8)作为外源分子进行金葡菌膜泡疫苗构建。
2.重组载体的构建
(1)引物设计
①展示靶序列根据pUC-lcrV重组质粒中克隆的依据金黄色葡萄球菌基因组密码子使用偏嗜性设计并人工合成的鼠疫耶尔森菌LcrV(序列表SEQ ID NO：8)设计PCR扩增引物(序列表SEQ ID NO：23和24)，扩增lcrV基因片段；
②根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中eno基因(序列表SEQ ID NO：7)所在的DNA序列设计基因打靶左、右同源臂PCR引物，碱基序列如下：同源左臂PCR引物(P13、P14)，预计扩增片段998bp(SEQ ID NO:35)：P13(SEQ ID NO:31):5’-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTATCTATCGC AGTAGCACGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)，P14(SEQ ID NO:32):5’-TTGTTCGTAGGCTCTAATCATTTTATCTAAGTTATAGAATGATTTG-3’(下划线为21bp与序列表SEQ ID NO：23引物反向互补的序列)。
同源右臂PCR引物(P15、P16)，预计扩增片段988bp(SEQ ID NO:36)
P15(SEQ ID NO:33):5’-ATGACACGTCTGGTAAATGATTTTCTTTATAATCAAATGCTGA-3’(下划线为20bp与SEQ ID NO：24引物反向互补的序列)；P16(SEQ ID NO:34):5’-CTTGCATGCCTGCAGGTCGACCTGCTTTT ACCTTCTTGGAG-3’(下划线为SalI酶切位点)；
(2)PCR扩增左、右同源臂片段，参照实施例1进行；
(3)lcrV基因的PCR扩增根据pUC-lcrV质粒上lcrV的基因序列设计引物，引物序列见序列表SEQ ID NO：23(引物P5)和24(引物P6)，用该引物对，以pUC-lcrV质粒为模板进行PCR扩增，具体参照实施例1进行，获得lcrV基因片段；
(4)融合片段获得取等量的左、右同源臂及lcrV基因片段，参照实施例1中敲除序列获得的方法，以P13,P16引物进行扩增，获得左同源臂-lcrV基因-右同源臂的融合片段；
(5)载体构建将融合片段回收后用HindII、SalI进行双酶切，再插入到pBT2质粒的相应酶切位点，并转化大肠埃希菌DH5α感受态，经AMP(100μg/ml)平板37℃24h培养后，挑取AMP抗性菌落，提取质粒进行酶切鉴定，能切出目标片段者为成功构建的打靶质粒pBT2-lcrV。
2.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV工程菌筛选与鉴定
制备金葡菌RN4220-ΔagrA感受态细胞，将打靶质粒pBT2-lcrV转化人感受态细胞中，具体方法参照实施例1进行；
利用pBT2质粒温度敏感的特性，30℃时该质粒可以在细菌中稳定存在，当温度大于42℃时质粒不能复制，容易与细菌染色体发生整合，再经过25℃诱导，使整合的质粒片段从基因组上环化切离，从而敲入目的基因；在打靶质粒pBT2-lcrV转化的RN4220-ΔagrA菌株中用氯霉素(10μg/ml)进行抗性负向筛选，负向筛选得到在氯霉素平板上不生长，无抗生素平板上能生长的细菌克隆并提取基因组；利用验证引物(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)对目标菌株中lcrV基因进行PCR扩增验证，筛选可能的RN4220-ΔagrA/lcrV工程菌株；最后扩增基因组片段进行DNA测序鉴定，获得构建成功的RN4220-ΔagrA/lcrV工程菌株。
实施例4：金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV膜泡中融合蛋白的鉴定
在菌株RN4220-ΔagrA/lcrV中，利用金葡菌的融合靶分子Eno融合了鼠疫耶尔森菌的LcrV分子，在本实施例中，进一步用免疫印迹(Western blot)方法对工程菌膜泡中的融合靶分子蛋白质进行鉴定。
1.膜泡制备
制备RN4220-ΔagrA和RN4220-ΔagrA/lcrV工程菌膜泡，具体参照实施例2的方法进行。
2.SDS-PAGE电泳分析
取30μl膜泡，加入等量2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴10min，上样至SDS-PAGE电泳胶(10％)，80V电泳至指示剂至电泳板底部。
3.Western blot鉴定
SDS-PAGE电泳过程中，待指示剂电泳至电泳板底部，揭下凝胶，将蛋白质电转移到PVDF膜上。用小鼠抗LcrV抗血清作一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG(北京中杉公司)作二抗进行Western blot鉴定；结果如附图2所示，正常对照RN4220-ΔagrA菌株膜泡没有印迹条带，RN4220-ΔagrA/lcrV膜泡中可检出融合蛋白存在，表明LcrV已与Eno融合，并利用Eno的定向分泌能力将融合蛋白呈现在MVs中。
实施例5：金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb工程菌构建及膜泡呈现
1.SEB分子的选择
金葡菌为一种常见的食源性致病微生物，可产生多种肠毒素致病；SEB是一种常见的肠毒素，也是一种重要的生物战剂，该毒素为一种单链小分子蛋白质，分子量约30kDa，相对分子质量较低，具有热稳定性，对人体肠道产生破坏，导致呕吐腹泻等症状(Zhang etal.,Microbiol Res,2017；205:19-24)；本申请选择金葡菌SEB为外源抗原靶标，从工程金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/出发，构建Mntc-seb融合基因，并将目标融合蛋白呈现在MVs上。
2.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb工程菌构建
根据金葡菌基因组中肠毒素SEB基因序列(序列表SEQ ID NO：11)，设计并人工合成SEB的PCR扩增引物(序列表SEQ ID NO：25和26)，扩增seb基因片段；
根据金葡菌基因组中mntc基因序列设计基因打靶左、右同源臂PCR引物，左同源臂扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：37和38，右同源臂扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：39和40；
以金葡菌RN4220基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，获得seb基因片段，同源左臂片段(SEQ ID NO：41)和同源右臂片段(SEQ ID NO：42)；再参照实施例3的方法构建融合基因和打靶质粒pBT2-seb，构建金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb工程菌；
3.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb膜泡中融合蛋白的鉴定
制备目标工程菌膜泡，参照实施例4的方法，用SEB抗体做一抗，进行Western blot鉴定，结果如附图3所示，正常对照RN4220-ΔagrA菌株膜泡没有印迹条带，RN4220-ΔagrA/lcrV/seb膜泡中可检出融合蛋白存在，且大小与融合蛋白的大小相符，表明SEB已与Mntc融合，并利用Mntc的定向分泌能力将融合蛋白呈现在MVs中。
实施例6：金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa工程菌构建及膜泡呈现
1.Pa分子的选择
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)为需氧芽胞杆菌属成员，能引起羊、牛、马等动物以及人类的炭疽病；重要的是该菌可作为生物武器开展袭击，以气溶胶方式散布的炭疽芽胞能大面积污染空气、水源、食物，感染人和动物引起皮肤型炭疽、肠型炭疽和肺型炭疽等，致病能力强(李伟等,中国国境卫生检疫杂志，2004；6：329-31)；炭疽杆菌产生的毒素由保护性抗原Pa、水肿毒素Lef、致死毒素Cya三种成分组成，其毒性作用主要是直接损伤微血管的内皮细胞，增强微血管的通透性，改变血流循环动力学，损害肾脏功能，干扰糖代谢，血液呈高凝状态，易形成感染性休克和弥散性血管内凝血，最后导致机体死亡(Michelman-Ribeiro et al.,Toxins(Basel),2021；13:888)；本申请选择金葡菌Pa为外源抗原靶标，从工程金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb出发，构建PdhA-Pa融合基因，并将目标融合蛋白呈现在金葡菌MVs上。
2.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa工程菌构建
根据pUC-pa重组质粒中pa基因序列(序列表SEQ ID NO：14)，设计并人工合成pa的PCR扩增引物(序列表SEQ ID NO：27和28)，扩增pa基因片段；
根据金葡菌基因组中pdhA基因序列设计基因打靶左、右同源臂PCR引物，左同源臂扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：43和44，右同源臂扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：45和46；
以金葡菌RN4220基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，先获得同源左臂片段(SEQ ID NO：47)和同源右臂片段(SEQ ID NO：48)，以pUC-pa重组质粒DNA为模板，通过PCR扩增获得pa基因片段；再参照实施例3的方法构建融合基因和打靶质粒pBT2-pa，构建并鉴定金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa工程菌。
3.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa膜泡中融合蛋白的鉴定
制备目标工程菌膜泡，参照实施例4的方法，用Pa抗体做一抗，进行Western blot鉴定，可见正常对照RN4220-ΔagrA菌株膜泡没有印迹条带，RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa膜泡中可检出融合蛋白存在，且大小与融合蛋白的大小相符，表明Pa已与PdhA分子融合，并利用PdhA的定向分泌能力将融合蛋白呈现在工程化金葡菌的MVs中。
实施例7：金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1工程菌构建及膜泡呈现
1.Hcp1分子的选择
类鼻疽是一种人类和动物感染的致命热带传染病，由革兰氏阴性细菌类鼻疽伯克霍德氏杆菌(Burkholderia pseudomallei)引起，由于类鼻疽伯克霍尔德菌属兼性胞内感染病原菌，且目前关于其逃逸宿主免疫的机制还不十分清楚，因此迄今为止，类鼻疽的疫苗研究仍处于探索阶段；溶血素共调节蛋白1(hemolysin-coregulated protein 1,Hcp1)是类鼻疽菌对靶细胞产生生物学效应的重要效应蛋白，也是形成VI型分泌系统(T6SS)分泌装置的通道蛋白，被认为是T6SS的分子标志，可作为BP临床血清学诊断的依据(Chieng etal.,Microb Pathog,2015；79:47-56)，或在菌株检测中作为判断T6SS是否存在的标志物之一(Zhou et al.,Infect Immun,2012；80:1243-51)。已有研究证明Hcp1蛋白具有免疫原性并可在体内产生保护作用(Kim et al.，Semin Cell Dev Biol，2015；40:97-104)；本申请选择类鼻疽菌Hcp1为外源抗原靶标，从工程金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa出发，构建PdhB-Hcp1融合基因，并将目标融合蛋白呈现在金葡菌MVs上。
2.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1工程菌构建
根据类鼻疽菌基因组中hcp1基因序列(序列表SEQ ID NO：17)，设计并人工合成的hcp1的PCR扩增引物(序列表SEQ ID NO：29和30)，扩增hcp1基因片段；
根据金葡菌基因组中pdhB基因序列设计基因打靶左、右同源臂PCR引物，左同源臂扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：49和50，右同源臂扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：51和52；
以金葡菌RN4220基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，先获得同源左臂片段(SEQ ID NO：53)和同源右臂片段(SEQ ID NO：54)，以类鼻疽菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得hcp1基因片段；再参照实施例3的方法构建融合基因和打靶质粒pBT2-hcp1，构建并鉴定金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1工程菌。
3.金葡菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/hcp1膜泡中融合蛋白的鉴定
制备目标工程菌膜泡，参见实施例4的方法，用Hcp1抗体做一抗，进行Westernblot鉴定，结果如附图4所示，正常对照RN4220-ΔagrA菌株膜泡没有印迹条带，RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1膜泡中可检出融合蛋白存在，且大小与融合蛋白的大小相符，表明Hcp1已与PdhB分子融合，并利用PdhB的定向分泌能力将融合蛋白呈现在工程化金葡菌的MVs中。
实施例8类鼻疽菌Hcp1重组蛋白的制备
1.pET28a-hcp1/BL21重组菌的构建
提取pET28a-hcp1质粒化转到大肠埃希菌BL21感受态细胞中，过夜摇菌提取质粒，再以质粒为模板，用PCR引物(序列表SEQ ID NO：29和30)进行扩增，片段大小(771bp)与预期目的条带大小相符，证实pET28a-hcp1/BL21重组菌构建成功。
1.Hcp1蛋白诱导表达
SDS-PAGE电泳检测未加IPTG和加入IPTG诱导不同时间(3h、6h、过夜)，在上清和沉淀中蛋白表达量的差别，结果如附图5所示，只有加入IPTG，上清和沉淀中蛋白才会大量表达，诱导时间选取6h。
2.重组蛋白纯化
由于pET28a载体多克隆位点的上游带有6×His序列，可使表达的Hcp1蛋白N-端带有组氨酸标签；利用咪唑与His重组蛋白竞争结合镍离子的特性进行蛋白纯化，使用50-500mmol/L浓度梯度的咪唑对重组蛋白进行洗脱，收集UV>0.05的峰，并进行SDS-PAGE电泳检测，结果可见，在200及300mmol/L咪唑洗脱峰中含有与理论目的蛋白分子量(约20kDa)相一致的蛋白质，表明已成功纯化出Hcp1蛋白。
3.BCA测定Hcp1蛋白浓度
选取250mm咪唑洗脱峰时洗脱下来的蛋白透析，先在加了甘油的1L PBS中透析2h，接着换液透析过夜，全程在4℃冰箱中操作，透析完成，采用BCA法按试剂盒说明书测定蛋白浓度，结果浓度为0.752mg/ml；用灰度值比对得出重组工程菌膜泡50μg中包含0.173μgHcp1蛋白。
实施例9重组膜泡疫苗对类鼻疽菌感染BALB/C小鼠的保护作用
1.小鼠免疫
实验BALB/C小鼠随机分成5组,每组10只；A组为PBS对照组，B组为金葡菌RN4220-ΔagrA膜泡(WT)免疫组，C为工程菌RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1膜泡(PH)免疫保护组，D组为PH+弗氏完全佐剂免疫组，E组为Hcp1纯蛋白免疫组；
免疫剂量：取对照组RN4220-Δagr及RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa/hcp1菌株的膜泡蛋白各50μg，Hcp1蛋白0.173μg进行免疫(按照重组膜泡中包含的HCP1蛋白比例，见实施例8)；注射小鼠四肢皮下淋巴结及腹腔，共100微升；第1次免疫后10天进行第2次免疫，21天进行第三次免疫，第28天用类鼻疽杆菌进行腹腔注射感染(攻毒)，具体方案如表1所示：
表1各实验组动物的免疫接种及攻毒方案
2.小鼠体重变化
每日称取实验动物体重，绘制体重变化曲线，体重变化曲线如附图6所示，可见各实验小鼠在免疫过程中体重无显著差异。
3.免疫保护感染模型的建立及动物死亡曲线
(1)攻毒剂量与模型建立
将类鼻疽BPC006菌株接种于LB液体培养基中培养18h，第二天将过夜菌以1:100比例接种于新鲜的LB液体培养基中，5h后取10微升菌液作适当稀释后滴平板，培养24h后进行菌落计数，获得BPC006菌株在此培养条件下的浓度为3×108CFU/ml；收集菌液，5,000×g离心10min,菌体用PBS分别稀释成3×105，6×105，1×106，3×106，6×106CFU/ml浓度，各取100μl腹腔接种Balb/c小鼠，观察动物死亡情况，感染7天内造成约100％死亡的剂量为目标剂量，结果测得该剂量为3×106CFU/ml。
(2)免疫保护及动物死亡曲线
按本实施例1中的小鼠免疫接种和攻毒方案进行，记录攻毒后21天小鼠的生存情况，结果如附图7所示，PBS对照组小鼠于攻毒后第6天全部死亡，对照菌株膜泡免疫组小鼠第18天全部死亡，纯蛋白Hcp1组小鼠第19天全部死亡，重组膜泡疫苗免疫组小鼠第21天仍有60％存活，该重组膜泡加佐剂组小鼠第21天仍有70存活，表明重组膜泡疫苗具有明显的保护实验动物遭受致死剂量的类鼻疽菌攻击，有否佐剂对重组膜泡疫苗的保护效率无明显影响。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌及其制备方法和应用
<141> 2022-01-19
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 1
Met Lys Ile Phe Ile Cys Glu Asp Asp Pro Lys Gln Arg Glu Asn Met
1 5 10 15
Val Thr Ile Ile Lys Asn Tyr Ile Met Ile Glu Glu Lys Pro Met Glu
20 25 30
Ile Ala Leu Ala Thr Asp Asn Pro Tyr Glu Val Leu Glu Gln Ala Lys
35 40 45
Asn Met Asn Asp Ile Gly Cys Tyr Phe Leu Asp Ile Gln Leu Ser Thr
50 55 60
Asp Ile Asn Gly Ile Lys Leu Gly Ser Glu Ile Arg Lys His Asp Pro
65 70 75 80
Val Gly Asn Ile Ile Phe Val Thr Ser His Ser Glu Leu Thr Tyr Leu
85 90 95
Thr Phe Val Tyr Lys Val Ala Ala Met Asp Phe Ile Phe Lys Asp Asp
100 105 110
Pro Ala Glu Leu Arg Thr Arg Ile Ile Asp Cys Leu Glu Thr Ala His
115 120 125
Thr Arg Leu Gln Leu Leu Ser Lys Asp Asn Ser Val Glu Thr Ile Glu
130 135 140
Leu Lys Arg Gly Ser Asn Ser Val Tyr Val Gln Tyr Asp Asp Ile Met
145 150 155 160
Phe Phe Glu Ser Ser Thr Lys Ser His Arg Leu Ile Ala His Leu Asp
165 170 175
Asn Arg Gln Ile Glu Phe Tyr Gly Asn Leu Lys Glu Leu Ser Gln Leu
180 185 190
Asp Asp Arg Phe Phe Arg Cys His Asn Ser Phe Val Val Asn Arg His
195 200 205
Asn Ile Glu Ser Ile Asp Ser Lys Glu Arg Ile Val Tyr Phe Lys Asn
210 215 220
Lys Glu His Cys Tyr Ala Ser Val Arg Asn Val Lys Lys Ile
225 230 235
<210> 2
<211> 2283
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgccaatta ttacagatgt ttacgctcgc gaagtcttag actctcgtgg taacccaact 60
gttgaagtag aagtattaac tgaaagtggc gcatttggtc gtgcattagt accatcaggt 120
gcttcaactg gtgaacacga agctgttgaa ttacgtgatg gagacaaatc acgttattta 180
ggtaaaggtg ttactaaagc agttgaaaac gttaatgaaa tcatcgcacc agaaattatt 240
gaaggtgaat tttcagtatt agatcaagta tctattgata aaatgatgat cgcattagac 300
ggtactccaa acaaaggtaa attaggtgca aatgctattt taggtgtatc tatcgcagta 360
gcacgtgcag cagctgactt attaggtcaa ccactttaca aatatttagg tggatttaat 420
ggtaagcagt taccagtacc aatgatgaac atcgttaatg gtggttctca ctcagatgct 480
ccaattgcat tccaagaatt catgatttta cctgtaggtg ctacaacgtt caaagaatca 540
ttacgttggg gtactgaaat tttccacaac ttaaaatcaa ttttaagcaa acgtggttta 600
gaaactgcag taggtgacga aggtggtttc gctcctaaat ttgaaggtac tgaagatgct 660
gttgaaacaa ttatccaagc aatcgaagca gctggttaca aaccaggtga agaagtattc 720
ttaggatttg actgtgcatc atcagaattc tatgaaaatg gtgtatatga ctacagtaag 780
ttcgaaggcg aacacggtgc aaaacgtaca gctgcagaac aagttgacta cttagaacaa 840
ttagtagaca aatatcctat cattacaatt gaagacggta tggacgaaaa cgactgggat 900
ggttggaaac aacttacaga acgtatcggt gaccgtgtac aattagtagg tgacgattta 960
ttcgtaacaa acactgaaat tttagcaaaa ggtattgaaa acggaattgg taactcaatc 1020
ttaattaaag ttaaccaaat cggtacatta actgaaacat ttgatgcaat cgaaatggct 1080
caaaaagctg gttacacagc agtagtttct caccgttcag gtgaaacaga agatacaaca 1140
attgctgata ttgctgttgc tacaaacgct ggtcaaatta aaactggttc attatcacgt 1200
actgaccgta ttgctaaata caatcaatta ttacgtatcg aagatgaatt atttgaaact 1260
gctaaatatg acggtatcaa atcattctat aacttagata aaatgattag agcctacgaa 1320
caaaacccac aacattttat tgaggatcta gaaaaagtta gggtggaaca acttactggt 1380
catggttctt cagttttaga agaattggtt cagttagtca aagataaaaa tatagatatt 1440
tccattaaat atgatcccag aaaagattcg gaggtttttg ccaatagagt aattactgat 1500
gatatcgaat tgctcaagaa aatcctagct tattttctac ccgaggatgc cattcttaaa 1560
ggcggtcatt atgacaacca actgcaaaat ggcatcaagc gagtaaaaga gttccttgaa 1620
tcatcgccga atacacaatg ggaattgcgg gcgttcatgg cagtaatgca tttctcttta 1680
accgccgatc gtatcgatga tgatattttg aaagtgattg ttgattcaat gaatcatcat 1740
ggtgatgccc gtagcaagtt gcgtgaagaa ttagctgagc ttaccgccga attaaagatt 1800
tattcagtta ttcaagccga aattaataag catctgtcta gtagtggcac cataaatatc 1860
catgataaat ccattaatct catggataaa aatttatatg gttatacaga tgaagagatt 1920
tttaaagcca gcgcagagta caaaattctc gagaaaatgc ctcaaaccac cattcaggtg 1980
gatgggagcg agaaaaaaat agtctcgata aaggactttc ttggaagtga gaataaaaga 2040
accggggcgt tgggtaatct gaaaaactca tactcttata ataaagataa taatgaatta 2100
tctcactttg ccaccacctg ctcggataag tccaggccgc tcaacgactt ggttagccaa 2160
aaaacaactc agctgtctga tattacatca cgttttaatt cagctattga agcactgaac 2220
cgtttcattc agaaatatga ttcagtgatg caacgtctgc tagatgacac gtctggtaaa 2280
tga 2283
<210> 3
<211> 1737
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60
ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120
attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180
cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240
gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300
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gaacaacgtg ccatgattac aagtgaaggt gccttcaagt acttctcaaa acaatacggt 660
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gttgataaga aagcaatgga aagtttatct gaagaaacga agaaagatat ctttggtgaa 840
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aaatcaaata ttgaaactgt acacggaagc atgaaaatgt ataagagatt atttatttca 960
catgtaattt tgatattcgt actgatatta gttatttcta cacccaacgt tttagcagag 1020
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aatggaaacc aattagataa atatagaagt attactgtta gggtatttga agatggtaaa 1440
aatttattat cttttgacgt acaaactaat aagaaaaaag tgactgctca agaattagat 1500
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cctgcaccag gagataaatt tgaccaatct aaatatttaa tgatgtacaa tgataataaa 1680
ttggttgatt ctaaagatgt gaagattgaa gtttatctta cgacaaagaa aaagtga 1737
<210> 4
<211> 3405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctccta agttacaagc ccaattcgat gcagtaaaag ttttaaatga tactcaatcg 60
aaatttgaaa tggttcaaat tttggatgag aatggtaacg tcgtaaatga agacttagta 120
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ttagctgtat atcaagcaac taaagaagca cgtgaccgcg cagttgcagg tgaaggtcca 780
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ttccgtaaat tccttgaaaa caaaggttta tggaatgaag acaaagaaaa tgaagttatt 960
gaacgtgcaa aagctgatat taaagcagca attaaagagg ctgataacac tgaaaaacaa 1020
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aaaaaagaag tgatttctag tgataactta caattgccag aattaaaaca aaaatcttcg 1680
aactcaagaa aaaagcgaag tacaagtgct ggacctacgg ttccagaccg tgacaatgat 1740
ggaatccctg attcattaga ggtagaagga tatacggttg atgtcaaaaa taaaagaact 1800
tttctttcac catggatttc taatattcat gaaaagaaag gattaaccaa atataaatca 1860
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cggattgata agaatgtatc accagaggca agacaccccc ttgtggcagc ttatccgatt 1980
gtacatgtag atatggagaa tattattctc tcaaaaaatg aggatcaatc cacacagaat 2040
actgatagtc aaacgagaac aataagtaaa aatacttcta caagtaggac acatactagt 2100
gaagtacatg gaaatgcaga agtgcatgcg tcgttctttg atattggtgg gagtgtatct 2160
gcaggattta gtaattcgaa ttcaagtacg gtcgcaattg atcattcact atctctagca 2220
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gccaatatta gatatgtaaa tactgggacg gctccaatct acaacgtgtt accaacgact 2340
tcgttagtgt taggaaaaaa tcaaacactc gcgacaatta aagctaagga aaaccaatta 2400
agtcaaatac ttgcacctaa taattattat ccttctaaaa acttggcgcc aatcgcatta 2460
aatgcacaag acgatttcag ttctactcca attacaatga attacaatca atttcttgag 2520
ttagaaaaaa cgaaacaatt aagattagat acggatcaag tatatgggaa tatagcaaca 2580
tacaattttg aaaatggaag agtgagggtg gatacaggct cgaactggag tgaagtgtta 2640
ccgcaaattc aagaaacaac tgcacgtatc atttttaatg gaaaagattt aaatctggta 2700
gaaaggcgga tagcggcggt taatcctagt gatccattag aaacgactaa accggatatg 2760
acattaaaag aagcccttaa aatagcattt ggatttaacg aaccgaatgg aaacttacaa 2820
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aaattaaatg caaaaatgaa tattttaata agagataaac gttttcatta tgatagaaat 3000
aacatagcag ttggggcgga tgagtcagta gttaaggagg ctcatagaga agtaattaat 3060
tcgtcaacag agggattatt gttaaatatt gataaggata taagaaaaat attatcaggt 3120
tatattgtag aaattgaaga tactgaaggg cttaaagaag ttataaatga cagatatgat 3180
atgttgaata tttctagttt acggcaagat ggaaaaacat ttatagattt taaaaaatat 3240
aatgataaat taccgttata tataagtaat cccaattata aggtaaatgt atatgctgtt 3300
actaaagaaa acactattat taatcctagt gagaatgggg atactagtac caacgggatc 3360
aagaaaattt taatcttttc taaaaaaggc tatgagatag gataa 3405
<210> 5
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcacaaa tgacaatggt tcaagcgatt aatgatgcgc ttaaaactga acttaaaaat 60
gaccaagatg ttttaatttt tggtgaagac gttggtgtta acggcggtgt tttccgtgtt 120
actgaaggac tacaaaaaga atttggtgaa gatagagtat tcgatacacc tttagctgaa 180
tcaggtattg gtggtttagc gatgggtctt gcagttgaag gattccgtcc ggttatggaa 240
gtacaattct taggtttcgt attcgaagta tttgatgcga ttgctggaca aattgcacgt 300
actcgtttcc gttcaggcgg tactaaaact gcacctgtaa caattcgtag cccatttggt 360
ggtggcgtac acacaccaga attacacgca gataacttag aaggtatttt agctcaatct 420
ccaggtctaa aggttgttat tccttcaggc ccatacgatg cgaaaggttt attaatttct 480
tctattagaa gtaatgaccc agtcgtatac ttagagcata tgaaattgta tcgttcattc 540
cgtgaagaag tacctgaaga agaatataca attgacattg gtaaggctaa tgtgaaaaaa 600
gaaggtaatg acatttcaat catcacatac ggtgcaatgg ttcaagaatc aatgaaagct 660
gcagaagaac ttgaaaaaga tggttattct gttgaagtaa ttgacttacg tactgttcaa 720
ccaatcgatg ttgacacaat tgtagcttca gttgaaaaaa ctggtcgtgc agttgtagtt 780
caagaagcac aacgtcaagc tggtgttggt gcagcagttg tagctgaatt aagtgaacgt 840
gcaatccttt cattagaagc acctattgga agagttgcag cagcagatac aatttatcca 900
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gaaactttag aatttatgct ggccggaata tatctcaagg tcaaaggaaa aacccagggg 1020
gaaatcaaag gctccgtcgt tcaggaaggt catgacggga aaatccacat cctcgccttc 1080
aagaacgact acgacatgcc tgccaggctc caggaaggcc tgacgcccgc cgccgccgct 1140
cgcggcacga tcacgttgac gaaggaaatg gacagatcgt cgccgcaatt cctgcaggcg 1200
ctcggcaagc gcgagatgat ggaagagttc gagatcacga tccaccgtcc gaagacggat 1260
acaacaggtg gggacctgac cgaactcctg ttcacgtaca agttcgaaaa agtgctgatc 1320
acccacatgg accaatactc gcccacgccg cacaaagacg atagcaacgg catcaaggaa 1380
ggcttgctcg gctatatcga ggagatcaag ttcacgtatt cgggatactc gttggaacac 1440
gcggaatcgg gcatcgcggg cgccgcaaac tggacgaatg gctga 1485
<210> 6
<211> 717
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 6
atgaaaattt tcatttgcga agacgatcca aaacaaagag aaaacatggt taccattatt 60
aaaaattata taatgataga agaaaagcct atggaaattg ccctcgcaac tgataatcct 120
tatgaggtgc ttgagcaagc taaaaatatg aatgacatag gctgttactt tttagatatt 180
caactttcaa ctgatattaa tggtatcaaa ttaggcagtg aaattcgtaa gcatgaccca 240
gttggtaaca ttattttcgt tacgagtcac agtgaactta cctatttaac atttgtctac 300
aaagttgcag cgatggattt tatttttaaa gatgatccag cagaattaag aactcgaatt 360
atagattgtt tagaaactgc acatacacgc ttacaattgt tgtctaaaga taatagcgtt 420
gaaacgattg aattaaaacg tggcagtaat tcagtgtatg ttcaatatga tgatattatg 480
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gaattttatg gtaatttaaa agaactgagt caattagatg atcgtttctt tagatgtcat 600
aatagctttg tcgtcaatcg ccataatatt gaatctatag attcgaaaga gcgaattgtc 660
tattttaaaa ataaagaaca ctgctatgca tcggtgagaa acgttaaaaa aatataa 717
<210> 7
<211> 1305
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 7
atgccaatta ttacagatgt ttacgctcgc gaagtcttag actctcgtgg taacccaact 60
gttgaagtag aagtattaac tgaaagtggc gcatttggtc gtgcattagt accatcaggt 120
gcttcaactg gtgaacacga agctgttgaa ttacgtgatg gagacaaatc acgttattta 180
ggtaaaggtg ttactaaagc agttgaaaac gttaatgaaa tcatcgcacc agaaattatt 240
gaaggtgaat tttcagtatt agatcaagta tctattgata aaatgatgat cgcattagac 300
ggtactccaa acaaaggtaa attaggtgca aatgctattt taggtgtatc tatcgcagta 360
gcacgtgcag cagctgactt attaggtcaa ccactttaca aatatttagg tggatttaat 420
ggtaagcagt taccagtacc aatgatgaac atcgttaatg gtggttctca ctcagatgct 480
ccaattgcat tccaagaatt catgatttta cctgtaggtg ctacaacgtt caaagaatca 540
ttacgttggg gtactgaaat tttccacaac ttaaaatcaa ttttaagcaa acgtggttta 600
gaaactgcag taggtgacga aggtggtttc gctcctaaat ttgaaggtac tgaagatgct 660
gttgaaacaa ttatccaagc aatcgaagca gctggttaca aaccaggtga agaagtattc 720
ttaggatttg actgtgcatc atcagaattc tatgaaaatg gtgtatatga ctacagtaag 780
ttcgaaggcg aacacggtgc aaaacgtaca gctgcagaac aagttgacta cttagaacaa 840
ttagtagaca aatatcctat cattacaatt gaagacggta tggacgaaaa cgactgggat 900
ggttggaaac aacttacaga acgtatcggt gaccgtgtac aattagtagg tgacgattta 960
ttcgtaacaa acactgaaat tttagcaaaa ggtattgaaa acggaattgg taactcaatc 1020
ttaattaaag ttaaccaaat cggtacatta actgaaacat ttgatgcaat cgaaatggct 1080
caaaaagctg gttacacagc agtagtttct caccgttcag gtgaaacaga agatacaaca 1140
attgctgata ttgctgttgc tacaaacgct ggtcaaatta aaactggttc attatcacgt 1200
actgaccgta ttgctaaata caatcaatta ttacgtatcg aagatgaatt atttgaaact 1260
gctaaatatg acggtatcaa atcattctat aacttagata aataa 1305
<210> 8
<211> 981
<212> DNA
<213> 鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)
<400> 8
atgattagag cctacgaaca aaacccacaa cattttattg aggatctaga aaaagttagg 60
gtggaacaac ttactggtca tggttcttca gttttagaag aattggttca gttagtcaaa 120
gataaaaata tagatatttc cattaaatat gatcccagaa aagattcgga ggtttttgcc 180
aatagagtaa ttactgatga tatcgaattg ctcaagaaaa tcctagctta ttttctaccc 240
gaggatgcca ttcttaaagg cggtcattat gacaaccaac tgcaaaatgg catcaagcga 300
gtaaaagagt tccttgaatc atcgccgaat acacaatggg aattgcgggc gttcatggca 360
gtaatgcatt tctctttaac cgccgatcgt atcgatgatg atattttgaa agtgattgtt 420
gattcaatga atcatcatgg tgatgcccgt agcaagttgc gtgaagaatt agctgagctt 480
accgccgaat taaagattta ttcagttatt caagccgaaa ttaataagca tctgtctagt 540
agtggcacca taaatatcca tgataaatcc attaatctca tggataaaaa tttatatggt 600
tatacagatg aagagatttt taaagccagc gcagagtaca aaattctcga gaaaatgcct 660
caaaccacca ttcaggtgga tgggagcgag aaaaaaatag tctcgataaa ggactttctt 720
ggaagtgaga ataaaagaac cggggcgttg ggtaatctga aaaactcata ctcttataat 780
aaagataata atgaattatc tcactttgcc accacctgct cggataagtc caggccgctc 840
aacgacttgg ttagccaaaa aacaactcag ctgtctgata ttacatcacg ttttaattca 900
gctattgaag cactgaaccg tttcattcag aaatatgatt cagtgatgca acgtctgcta 960
gatgacacgt ctggtaaatg a 981
<210> 9
<211> 760
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Pro Ile Ile Thr Asp Val Tyr Ala Arg Glu Val Leu Asp Ser Arg
1 5 10 15
Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Glu Val Leu Thr Glu Ser Gly Ala Phe
20 25 30
Gly Arg Ala Leu Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Glu His Glu Ala
35 40 45
Val Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val
50 55 60
Thr Lys Ala Val Glu Asn Val Asn Glu Ile Ile Ala Pro Glu Ile Ile
65 70 75 80
Glu Gly Glu Phe Ser Val Leu Asp Gln Val Ser Ile Asp Lys Met Met
85 90 95
Ile Ala Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly Lys Leu Gly Ala Asn Ala
100 105 110
Ile Leu Gly Val Ser Ile Ala Val Ala Arg Ala Ala Ala Asp Leu Leu
115 120 125
Gly Gln Pro Leu Tyr Lys Tyr Leu Gly Gly Phe Asn Gly Lys Gln Leu
130 135 140
Pro Val Pro Met Met Asn Ile Val Asn Gly Gly Ser His Ser Asp Ala
145 150 155 160
Pro Ile Ala Phe Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Thr Thr
165 170 175
Phe Lys Glu Ser Leu Arg Trp Gly Thr Glu Ile Phe His Asn Leu Lys
180 185 190
Ser Ile Leu Ser Lys Arg Gly Leu Glu Thr Ala Val Gly Asp Glu Gly
195 200 205
Gly Phe Ala Pro Lys Phe Glu Gly Thr Glu Asp Ala Val Glu Thr Ile
210 215 220
Ile Gln Ala Ile Glu Ala Ala Gly Tyr Lys Pro Gly Glu Glu Val Phe
225 230 235 240
Leu Gly Phe Asp Cys Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Gly Val Tyr
245 250 255
Asp Tyr Ser Lys Phe Glu Gly Glu His Gly Ala Lys Arg Thr Ala Ala
260 265 270
Glu Gln Val Asp Tyr Leu Glu Gln Leu Val Asp Lys Tyr Pro Ile Ile
275 280 285
Thr Ile Glu Asp Gly Met Asp Glu Asn Asp Trp Asp Gly Trp Lys Gln
290 295 300
Leu Thr Glu Arg Ile Gly Asp Arg Val Gln Leu Val Gly Asp Asp Leu
305 310 315 320
Phe Val Thr Asn Thr Glu Ile Leu Ala Lys Gly Ile Glu Asn Gly Ile
325 330 335
Gly Asn Ser Ile Leu Ile Lys Val Asn Gln Ile Gly Thr Leu Thr Glu
340 345 350
Thr Phe Asp Ala Ile Glu Met Ala Gln Lys Ala Gly Tyr Thr Ala Val
355 360 365
Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Thr Ile Ala Asp Ile
370 375 380
Ala Val Ala Thr Asn Ala Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ser Leu Ser Arg
385 390 395 400
Thr Asp Arg Ile Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Asp Glu
405 410 415
Leu Phe Glu Thr Ala Lys Tyr Asp Gly Ile Lys Ser Phe Tyr Asn Leu
420 425 430
Asp Lys Met Ile Arg Ala Tyr Glu Gln Asn Pro Gln His Phe Ile Glu
435 440 445
Asp Leu Glu Lys Val Arg Val Glu Gln Leu Thr Gly His Gly Ser Ser
450 455 460
Val Leu Glu Glu Leu Val Gln Leu Val Lys Asp Lys Asn Ile Asp Ile
465 470 475 480
Ser Ile Lys Tyr Asp Pro Arg Lys Asp Ser Glu Val Phe Ala Asn Arg
485 490 495
Val Ile Thr Asp Asp Ile Glu Leu Leu Lys Lys Ile Leu Ala Tyr Phe
500 505 510
Leu Pro Glu Asp Ala Ile Leu Lys Gly Gly His Tyr Asp Asn Gln Leu
515 520 525
Gln Asn Gly Ile Lys Arg Val Lys Glu Phe Leu Glu Ser Ser Pro Asn
530 535 540
Thr Gln Trp Glu Leu Arg Ala Phe Met Ala Val Met His Phe Ser Leu
545 550 555 560
Thr Ala Asp Arg Ile Asp Asp Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser
565 570 575
Met Asn His His Gly Asp Ala Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala
580 585 590
Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile
595 600 605
Asn Lys His Leu Ser Ser Ser Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser
610 615 620
Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile
625 630 635 640
Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr
645 650 655
Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp
660 665 670
Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys
675 680 685
Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala
690 695 700
Thr Thr Cys Ser Asp Lys Ser Arg Pro Leu Asn Asp Leu Val Ser Gln
705 710 715 720
Lys Thr Thr Gln Leu Ser Asp Ile Thr Ser Arg Phe Asn Ser Ala Ile
725 730 735
Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val Met Gln Arg
740 745 750
Leu Leu Asp Asp Thr Ser Gly Lys
755 760
<210> 10
<211> 939
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 10
atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60
ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120
attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180
cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240
gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300
aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360
gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420
gcatggttaa gtttagataa cggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480
gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540
ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac agtaaagaca aatttaatga cattccaaaa 600
gaacaacgtg ccatgattac aagtgaaggt gccttcaagt acttctcaaa acaatacggt 660
attacaccag gttatatttg ggaaattaac actgaaaaac aaggtacacc tgaacaaatg 720
agacaagcta ttgagtttgt taaaaagcac aaattaaaac acttattagt agaaacaagt 780
gttgataaga aagcaatgga aagtttatct gaagaaacga agaaagatat ctttggtgaa 840
gtgtacacag attcaatcgg taaagaaggc actaaaggtg actcttacta caaaatgatg 900
aaatcaaata ttgaaactgt acacggaagc atgaaataa 939
<210> 11
<211> 801
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 11
atgtataaga gattatttat ttcacatgta attttgatat tcgtactgat attagttatt 60
tctacaccca acgttttagc agagagtcaa ccagatccta aaccagatga gttgcacaaa 120
gcgagtaaat tcactggttt gatggaaaat atgaaagttt tgtatgatga taatcatgta 180
tcagcaataa acgttaaatc tatagatcaa tttctatact ttgacttaat atattctatt 240
aaggacacta agttagggaa ttatgataat gttcgagtcg aatttaaaaa caaagattta 300
gctgataaat acaaagataa atacgtagat gtgtttggag ctaattatta ctatcaatgt 360
tatttttcta aaaaaacgaa tgatattaat tcacatcaaa ctgacaaacg aaaaacttgt 420
atgtatggtg gtgtaactga gcataatgga aaccaattag ataaatatag aagtattact 480
gttagggtat ttgaagatgg taaaaattta ttatcttttg acgtacaaac taataagaaa 540
aaagtgactg ctcaagaatt agattaccta actcgtcact atttggtgaa aaataaaaaa 600
ctctatgaat ttaacaactc gccttatgaa acgggatata ttaaatttat agaaagtgag 660
aatagctttt ggtatgacat gatgcctgca ccaggagata aatttgacca atctaaatat 720
ttaatgatgt acaatgataa taaattggtt gattctaaag atgtgaagat tgaagtttat 780
cttacgacaa agaaaaagtg a 801
<210> 12
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Lys Lys Leu Val Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Cys Gly Thr Gly Gly Lys Gln Ser Ser Asp Lys Ser Asn Gly Lys
20 25 30
Leu Lys Val Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Ala Lys Asn
35 40 45
Val Gly Gly Asp Asn Val Asp Ile His Ser Ile Val Pro Val Gly Gln
50 55 60
Asp Pro His Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Lys Leu Thr
65 70 75 80
Asp Ala Asp Val Ile Leu Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn
85 90 95
Gly Trp Phe Glu Lys Ala Leu Glu Gln Ala Gly Lys Ser Leu Lys Asp
100 105 110
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115 120 125
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Asp Asn Asp Lys Lys His Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Lys
165 170 175
Tyr Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Lys Phe Asn Asp Ile Pro Lys Glu Gln Arg Ala Met Ile Thr Ser
195 200 205
Glu Gly Ala Phe Lys Tyr Phe Ser Lys Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Gly
210 215 220
Tyr Ile Trp Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Glu Gln Met
225 230 235 240
Arg Gln Ala Ile Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu
245 250 255
Val Glu Thr Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu
260 265 270
Thr Lys Lys Asp Ile Phe Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys
275 280 285
Glu Gly Thr Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile
290 295 300
Glu Thr Val His Gly Ser Met Lys Met Tyr Lys Arg Leu Phe Ile Ser
305 310 315 320
His Val Ile Leu Ile Phe Val Leu Ile Leu Val Ile Ser Thr Pro Asn
325 330 335
Val Leu Ala Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys
340 345 350
Ala Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp
355 360 365
Asp Asn His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu
370 375 380
Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr
385 390 395 400
Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr
405 410 415
Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys
420 425 430
Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys
435 440 445
Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln
450 455 460
Leu Asp Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys
465 470 475 480
Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala
485 490 495
Gln Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys
500 505 510
Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe
515 520 525
Ile Glu Ser Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly
530 535 540
Asp Lys Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys
545 550 555 560
Leu Val Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys
565 570 575
Lys Lys
<210> 13
<211> 1113
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 13
atggctccta agttacaagc ccaattcgat gcagtaaaag ttttaaatga tactcaatcg 60
aaatttgaaa tggttcaaat tttggatgag aatggtaacg tcgtaaatga agacttagta 120
cctgatctta cggatgaaca attagtggaa ttaatggaaa gaatggtatg gactcgtatc 180
cttgatcaac gttctatctc attaaacaga caaggacgtt taggtttcta tgcaccaact 240
gctggtcaag aagcatcaca attagcgtca caatacgctt tagaaaaaga agattacatt 300
ttaccgggat acagagatgt tcctcaaatt atttggcatg gtttaccatt aactgaagct 360
ttcttattct caagaggtca cttcaaagga aatcaattcc ctgaaggcgt taatgcatta 420
agcccacaaa ttattatcgg tgcacaatac attcaagctg ctggtgttgc atttgcactt 480
aaaaaacgtg gtaaaaatgc agttgcaatc acttacactg gtgacggtgg ttcttcacaa 540
ggtgatttct acgaaggtat taactttgca gcagcttata aagcacctgc aattttcgtt 600
attcaaaaca ataactatgc aatttcaaca ccaagaagca agcaaactgc tgctgaaaca 660
ttagctcaaa aagcaattgc tgtaggtatt cctggtatcc aagttgatgg tatggatgcg 720
ttagctgtat atcaagcaac taaagaagca cgtgaccgcg cagttgcagg tgaaggtcca 780
acattaattg aaactatgac atatcgttat ggtcctcata caatggctgg tgacgatcca 840
actcgttaca gaacttcaga cgaagatgct gaatgggaga aaaaagaccc attagtacgt 900
ttccgtaaat tccttgaaaa caaaggttta tggaatgaag acaaagaaaa tgaagttatt 960
gaacgtgcaa aagctgatat taaagcagca attaaagagg ctgataacac tgaaaaacaa 1020
actgttactt ctctaatgga aattatgtat gaagatatgc ctcaaaactt agcagaacaa 1080
tatgaaattt acaaagagaa ggagtcgaag taa 1113
<210> 14
<211> 2295
<212> DNA
<213> 炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)
<400> 14
atgaaaaaac gaaaagtgtt aataccatta atggcattgt ctacgatatt agtttcaagc 60
acaggtaatt tagaggtgat tcaggcagaa gttaaacagg agaaccggtt attaaatgaa 120
tcagaatcaa gttcccaggg gttactagga tactatttta gtgatttgaa ttttcaagca 180
cccatggtgg ttacttcttc tactacaggg gatttatcta ttcctagttc tgagttagaa 240
aatattccat cggaaaacca atattttcaa tctgctattt ggtcaggatt tatcaaagtt 300
aagaagagtg atgaatatac atttgctact tccgctgata atcatgtaac aatgtgggta 360
gatgaccaag aagtgattaa taaagcttct aattctaaca aaatcagatt agaaaaagga 420
agattatatc aaataaaaat tcaatatcaa cgagaaaatc ctactgaaaa aggattggat 480
ttcaagttgt actggaccga ttctcaaaat aaaaaagaag tgatttctag tgataactta 540
caattgccag aattaaaaca aaaatcttcg aactcaagaa aaaagcgaag tacaagtgct 600
ggacctacgg ttccagaccg tgacaatgat ggaatccctg attcattaga ggtagaagga 660
tatacggttg atgtcaaaaa taaaagaact tttctttcac catggatttc taatattcat 720
gaaaagaaag gattaaccaa atataaatca tctcctgaaa aatggagcac ggcttctgat 780
ccgtacagtg atttcgaaaa ggttacagga cggattgata agaatgtatc accagaggca 840
agacaccccc ttgtggcagc ttatccgatt gtacatgtag atatggagaa tattattctc 900
tcaaaaaatg aggatcaatc cacacagaat actgatagtc aaacgagaac aataagtaaa 960
aatacttcta caagtaggac acatactagt gaagtacatg gaaatgcaga agtgcatgcg 1020
tcgttctttg atattggtgg gagtgtatct gcaggattta gtaattcgaa ttcaagtacg 1080
gtcgcaattg atcattcact atctctagca ggggaaagaa cttgggctga aacaatgggt 1140
ttaaataccg ctgatacagc aagattaaat gccaatatta gatatgtaaa tactgggacg 1200
gctccaatct acaacgtgtt accaacgact tcgttagtgt taggaaaaaa tcaaacactc 1260
gcgacaatta aagctaagga aaaccaatta agtcaaatac ttgcacctaa taattattat 1320
ccttctaaaa acttggcgcc aatcgcatta aatgcacaag acgatttcag ttctactcca 1380
attacaatga attacaatca atttcttgag ttagaaaaaa cgaaacaatt aagattagat 1440
acggatcaag tatatgggaa tatagcaaca tacaattttg aaaatggaag agtgagggtg 1500
gatacaggct cgaactggag tgaagtgtta ccgcaaattc aagaaacaac tgcacgtatc 1560
atttttaatg gaaaagattt aaatctggta gaaaggcgga tagcggcggt taatcctagt 1620
gatccattag aaacgactaa accggatatg acattaaaag aagcccttaa aatagcattt 1680
ggatttaacg aaccgaatgg aaacttacaa tatcaaggga aagacataac cgaatttgat 1740
tttaatttcg atcaacaaac atctcaaaat atcaagaatc agttagcgga attaaacgta 1800
actaacatat atactgtatt agataaaatc aaattaaatg caaaaatgaa tattttaata 1860
agagataaac gttttcatta tgatagaaat aacatagcag ttggggcgga tgagtcagta 1920
gttaaggagg ctcatagaga agtaattaat tcgtcaacag agggattatt gttaaatatt 1980
gataaggata taagaaaaat attatcaggt tatattgtag aaattgaaga tactgaaggg 2040
cttaaagaag ttataaatga cagatatgat atgttgaata tttctagttt acggcaagat 2100
ggaaaaacat ttatagattt taaaaaatat aatgataaat taccgttata tataagtaat 2160
cccaattata aggtaaatgt atatgctgtt actaaagaaa acactattat taatcctagt 2220
gagaatgggg atactagtac caacgggatc aagaaaattt taatcttttc taaaaaaggc 2280
tatgagatag gataa 2295
<210> 15
<211> 1134
<212> PRT
<213> 炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)
<400> 15
Met Ala Pro Lys Leu Gln Ala Gln Phe Asp Ala Val Lys Val Leu Asn
1 5 10 15
Asp Thr Gln Ser Lys Phe Glu Met Val Gln Ile Leu Asp Glu Asn Gly
20 25 30
Asn Val Val Asn Glu Asp Leu Val Pro Asp Leu Thr Asp Glu Gln Leu
35 40 45
Val Glu Leu Met Glu Arg Met Val Trp Thr Arg Ile Leu Asp Gln Arg
50 55 60
Ser Ile Ser Leu Asn Arg Gln Gly Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Pro Thr
65 70 75 80
Ala Gly Gln Glu Ala Ser Gln Leu Ala Ser Gln Tyr Ala Leu Glu Lys
85 90 95
Glu Asp Tyr Ile Leu Pro Gly Tyr Arg Asp Val Pro Gln Ile Ile Trp
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu Thr Glu Ala Phe Leu Phe Ser Arg Gly His Phe
115 120 125
Lys Gly Asn Gln Phe Pro Glu Gly Val Asn Ala Leu Ser Pro Gln Ile
130 135 140
Ile Ile Gly Ala Gln Tyr Ile Gln Ala Ala Gly Val Ala Phe Ala Leu
145 150 155 160
Lys Lys Arg Gly Lys Asn Ala Val Ala Ile Thr Tyr Thr Gly Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Ser Gln Gly Asp Phe Tyr Glu Gly Ile Asn Phe Ala Ala Ala
180 185 190
Tyr Lys Ala Pro Ala Ile Phe Val Ile Gln Asn Asn Asn Tyr Ala Ile
195 200 205
Ser Thr Pro Arg Ser Lys Gln Thr Ala Ala Glu Thr Leu Ala Gln Lys
210 215 220
Ala Ile Ala Val Gly Ile Pro Gly Ile Gln Val Asp Gly Met Asp Ala
225 230 235 240
Leu Ala Val Tyr Gln Ala Thr Lys Glu Ala Arg Asp Arg Ala Val Ala
245 250 255
Gly Glu Gly Pro Thr Leu Ile Glu Thr Met Thr Tyr Arg Tyr Gly Pro
260 265 270
His Thr Met Ala Gly Asp Asp Pro Thr Arg Tyr Arg Thr Ser Asp Glu
275 280 285
Asp Ala Glu Trp Glu Lys Lys Asp Pro Leu Val Arg Phe Arg Lys Phe
290 295 300
Leu Glu Asn Lys Gly Leu Trp Asn Glu Asp Lys Glu Asn Glu Val Ile
305 310 315 320
Glu Arg Ala Lys Ala Asp Ile Lys Ala Ala Ile Lys Glu Ala Asp Asn
325 330 335
Thr Glu Lys Gln Thr Val Thr Ser Leu Met Glu Ile Met Tyr Glu Asp
340 345 350
Met Pro Gln Asn Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Glu
355 360 365
Ser Lys Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser
370 375 380
Thr Ile Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala Glu
385 390 395 400
Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser Gln
405 410 415
Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro Met
420 425 430
Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu
435 440 445
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Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr
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Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val Ile
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Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu Val
530 535 540
Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser Ser
545 550 555 560
Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp
565 570 575
Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr
580 585 590
Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn
595 600 605
Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys
610 615 620
Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly
625 630 635 640
Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala
645 650 655
Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys
660 665 670
Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile
675 680 685
Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly
690 695 700
Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser
705 710 715 720
Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser
725 730 735
Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn
740 745 750
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Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn
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Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Val Thr Asn Ile Tyr Thr Val
965 970 975
Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp
980 985 990
Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu
995 1000 1005
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1090 1095 1100
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Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
1125 1130
<210> 16
<211> 978
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 16
atggcacaaa tgacaatggt tcaagcgatt aatgatgcgc ttaaaactga acttaaaaat 60
gaccaagatg ttttaatttt tggtgaagac gttggtgtta acggcggtgt tttccgtgtt 120
actgaaggac tacaaaaaga atttggtgaa gatagagtat tcgatacacc tttagctgaa 180
tcaggtattg gtggtttagc gatgggtctt gcagttgaag gattccgtcc ggttatggaa 240
gtacaattct taggtttcgt attcgaagta tttgatgcga ttgctggaca aattgcacgt 300
actcgtttcc gttcaggcgg tactaaaact gcacctgtaa caattcgtag cccatttggt 360
ggtggcgtac acacaccaga attacacgca gataacttag aaggtatttt agctcaatct 420
ccaggtctaa aggttgttat tccttcaggc ccatacgatg cgaaaggttt attaatttct 480
tctattagaa gtaatgaccc agtcgtatac ttagagcata tgaaattgta tcgttcattc 540
cgtgaagaag tacctgaaga agaatataca attgacattg gtaaggctaa tgtgaaaaaa 600
gaaggtaatg acatttcaat catcacatac ggtgcaatgg ttcaagaatc aatgaaagct 660
gcagaagaac ttgaaaaaga tggttattct gttgaagtaa ttgacttacg tactgttcaa 720
ccaatcgatg ttgacacaat tgtagcttca gttgaaaaaa ctggtcgtgc agttgtagtt 780
caagaagcac aacgtcaagc tggtgttggt gcagcagttg tagctgaatt aagtgaacgt 840
gcaatccttt cattagaagc acctattgga agagttgcag cagcagatac aatttatcca 900
ttcactcaag ctgaaaatgt ttggttacca aacaaaaatg acatcatcga aaaagcaaaa 960
gaaactttag aattttaa 978
<210> 17
<211> 510
<212> DNA
<213> 类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)
<400> 17
atgctggccg gaatatatct caaggtcaaa ggaaaaaccc agggggaaat caaaggctcc 60
gtcgttcagg aaggtcatga cgggaaaatc cacatcctcg ccttcaagaa cgactacgac 120
atgcctgcca ggctccagga aggcctgacg cccgccgccg ccgctcgcgg cacgatcacg 180
ttgacgaagg aaatggacag atcgtcgccg caattcctgc aggcgctcgg caagcgcgag 240
atgatggaag agttcgagat cacgatccac cgtccgaaga cggatacaac aggtggggac 300
ctgaccgaac tcctgttcac gtacaagttc gaaaaagtgc tgatcaccca catggaccaa 360
tactcgccca cgccgcacaa agacgatagc aacggcatca aggaaggctt gctcggctat 420
atcgaggaga tcaagttcac gtattcggga tactcgttgg aacacgcgga atcgggcatc 480
gcgggcgccg caaactggac gaatggctga 510
<210> 18
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Ala Gln Met Thr Met Val Gln Ala Ile Asn Asp Ala Leu Lys Thr
1 5 10 15
Glu Leu Lys Asn Asp Gln Asp Val Leu Ile Phe Gly Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Asn Gly Gly Val Phe Arg Val Thr Glu Gly Leu Gln Lys Glu Phe
35 40 45
Gly Glu Asp Arg Val Phe Asp Thr Pro Leu Ala Glu Ser Gly Ile Gly
50 55 60
Gly Leu Ala Met Gly Leu Ala Val Glu Gly Phe Arg Pro Val Met Glu
65 70 75 80
Val Gln Phe Leu Gly Phe Val Phe Glu Val Phe Asp Ala Ile Ala Gly
85 90 95
Gln Ile Ala Arg Thr Arg Phe Arg Ser Gly Gly Thr Lys Thr Ala Pro
100 105 110
Val Thr Ile Arg Ser Pro Phe Gly Gly Gly Val His Thr Pro Glu Leu
115 120 125
His Ala Asp Asn Leu Glu Gly Ile Leu Ala Gln Ser Pro Gly Leu Lys
130 135 140
Val Val Ile Pro Ser Gly Pro Tyr Asp Ala Lys Gly Leu Leu Ile Ser
145 150 155 160
Ser Ile Arg Ser Asn Asp Pro Val Val Tyr Leu Glu His Met Lys Leu
165 170 175
Tyr Arg Ser Phe Arg Glu Glu Val Pro Glu Glu Glu Tyr Thr Ile Asp
180 185 190
Ile Gly Lys Ala Asn Val Lys Lys Glu Gly Asn Asp Ile Ser Ile Ile
195 200 205
Thr Tyr Gly Ala Met Val Gln Glu Ser Met Lys Ala Ala Glu Glu Leu
210 215 220
Glu Lys Asp Gly Tyr Ser Val Glu Val Ile Asp Leu Arg Thr Val Gln
225 230 235 240
Pro Ile Asp Val Asp Thr Ile Val Ala Ser Val Glu Lys Thr Gly Arg
245 250 255
Ala Val Val Val Gln Glu Ala Gln Arg Gln Ala Gly Val Gly Ala Ala
260 265 270
Val Val Ala Glu Leu Ser Glu Arg Ala Ile Leu Ser Leu Glu Ala Pro
275 280 285
Ile Gly Arg Val Ala Ala Ala Asp Thr Ile Tyr Pro Phe Thr Gln Ala
290 295 300
Glu Asn Val Trp Leu Pro Asn Lys Asn Asp Ile Ile Glu Lys Ala Lys
305 310 315 320
Glu Thr Leu Glu Phe Met Leu Ala Gly Ile Tyr Leu Lys Val Lys Gly
325 330 335
Lys Thr Gln Gly Glu Ile Lys Gly Ser Val Val Gln Glu Gly His Asp
340 345 350
Gly Lys Ile His Ile Leu Ala Phe Lys Asn Asp Tyr Asp Met Pro Ala
355 360 365
Arg Leu Gln Glu Gly Leu Thr Pro Ala Ala Ala Ala Arg Gly Thr Ile
370 375 380
Thr Leu Thr Lys Glu Met Asp Arg Ser Ser Pro Gln Phe Leu Gln Ala
385 390 395 400
Leu Gly Lys Arg Glu Met Met Glu Glu Phe Glu Ile Thr Ile His Arg
405 410 415
Pro Lys Thr Asp Thr Thr Gly Gly Asp Leu Thr Glu Leu Leu Phe Thr
420 425 430
Tyr Lys Phe Glu Lys Val Leu Ile Thr His Met Asp Gln Tyr Ser Pro
435 440 445
Thr Pro His Lys Asp Asp Ser Asn Gly Ile Lys Glu Gly Leu Leu Gly
450 455 460
Tyr Ile Glu Glu Ile Lys Phe Thr Tyr Ser Gly Tyr Ser Leu Glu His
465 470 475 480
Ala Glu Ser Gly Ile Ala Gly Ala Ala Asn Trp Thr Asn Gly
485 490
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcggatccc tacaaataca agttcaaac 29
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gatttacaat tgaatacgcc gacattcaca tccttatggc tag 43
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctagccataa ggatgtgaat gtcggcgtat tcaattgtaa atc 43
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gggaagcttt atgggataac gctgaagat 29
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caaatcattc tataacttag ataaaatgat tagagcctac gaacaa 46
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcagcatttg attataaaga aaatcattta ccagacgtgt cat 43
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cacggaagca tgaaaatgta taagagatta 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttaaaacaca gcgtgtcact ttttctttgt 30
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tttacaaaga gaaggagtcg aagatgaaaa aacgaaaagt gtta 44
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cattgtcatt tgtgccatgg cttatcctat ctcatagcct tttt 44
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caaaagaaac tttagaattt atgctggccg gaatatatct 40
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcgttaactt ttaaaatgta tcagccattc gtccagttt 39
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagctcggta cccggggatc ctatctatcg cagtagcacg t 41
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttgttcgtag gctctaatca ttttatctaa gttatagaat gatttg 46
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atgacacgtc tggtaaatga ttttctttat aatcaaatgc tga 43
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cttgcatgcc tgcaggtcga cctgctttta ccttcttgga g 41
<210> 35
<211> 998
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gagctcggta cccggggatc ctatctatcg cagtagcacg tgcagcagct gacttattag 60
gtcaaccact ttacaaatat ttaggtggat ttaatggtaa gcagttacca gtaccaatga 120
tgaacatcgt taatggtggt tctcactcag atgctccaat tgcattccaa gaattcatga 180
ttttacctgt aggtgctaca acgttcaaag aatcattacg ttggggtact gaaattttcc 240
acaacttaaa atcaatttta agcaaacgtg gtttagaaac tgcagtaggt gacgaaggtg 300
gtttcgctcc taaatttgaa ggtactgaag atgctgttga aacaattatc caagcaatcg 360
aagcagctgg ttacaaacca ggtgaagaag tattcttagg atttgactgt gcatcatcag 420
aattctatga aaatggtgta tatgactaca gtaagttcga aggcgaacac ggtgcaaaac 480
gtacagctgc agaacaagtt gactacttag aacaattagt agacaaatat cctatcatta 540
caattgaaga cggtatggac gaaaacgact gggatggttg gaaacaactt acagaacgta 600
tcggtgaccg tgtacaatta gtaggtgacg atttattcgt aacaaacact gaaattttag 660
caaaaggtat tgaaaacgga attggtaact caatcttaat taaagttaac caaatcggta 720
cattaactga aacatttgat gcaatcgaaa tggctcaaaa agctggttac acagcagtag 780
tttctcaccg ttcaggtgaa acagaagata caacaattgc tgatattgct gttgctacaa 840
acgctggtca aattaaaact ggttcattat cacgtactga ccgtattgct aaatacaatc 900
aattattacg tatcgaagat gaattatttg aaactgctaa atatgacggt atcaaatcat 960
tctataactt agataaaatg attagagcct acgaacaa 998
<210> 36
<211> 988
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atgacacgtc tggtaaatga ttttctttat aatcaaatgc tgacataatt ttagttgagg 60
attattatga cggtataaat taaataaaga ttttgagttc acgcttaaat aagttcacgc 120
ttaaatttat agcctgccac agagttgaga ctgtggtagg ttttttattt tgaagtatta 180
atcataacag actaataatc atgaggtaac taataacaca tatttaactt gtattcttaa 240
actggtataa taaatttatg ttgaaatgaa tattgtatga cagggtattc acttttatta 300
aaaggtaaaa ttaaataaag gttttataga acgtatttaa atatatgagg agtaaacaaa 360
tggctgatag aacgaataaa gaaattaaaa caggacgctt tattgcaact gcatcaatcg 420
tattctcaat attattgatt attcattact ttgtttcgtt ggataatgcg actgccaaag 480
cattacttaa tttaacgaat caaaacactt cagataaagc gattgattac attttaaaca 540
gctttagatt cactggtatt atgtatattt tggcttatct agcaggcttc atcacttttt 600
ggaatcgaca tacttatgtg tggtggttta tgtttgcagt ttatgtatca aatagtttgt 660
ttacgttgat taatttatca atcacaattc aagcaataaa agctgcacac ggtgcgtact 720
taacattgcc aattttaatt gttattatag gttcggttgc attagcgatt tatatgcttg 780
ttgtttctat caaacgtaaa agtacattta atcgctagaa aattgatttt aacaataaaa 840
atatgatata ctacttgtcg tatataagga acggaggaca atttatgcat acatttttaa 900
tcgtattatt aatcattgat tgtattgcat taataactgt tgtactactc caagaaggta 960
aaagcaggtc gacctgcagg catgcaag 988
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagctcggta cccggggatc caaagtagta acgacgaatt c 41
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
taatctctta tacattttca tgcttccgtg 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acaaagaaaa agtgacacgc tgtgttttaa 30
<210> 40
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cttgcatgcc tgcaggtcga cgagaacagt tgtccaatca c 41
<210> 41
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gagctcggta cccggggatc caaagtagta acgacgaatt caattttata tgatatggct 60
aaaaatgttg gtggagacaa cgtcgatatt catagtattg tacctgttgg tcaagatcct 120
catgaatatg aagttaaacc taaagatatt aaaaagttaa ctgacgctga cgttatttta 180
tacaacggat taaatttaga gactggtaac ggttggtttg aaaaagcctt agaacaggct 240
ggtaaatcat taaaagataa aaaagttatc gcagtatcaa aagatgttaa acctatctat 300
ttaaacggtg aagaaggcaa caaagataaa caagatccac acgcatggtt aagtttagat 360
aacggtatta aatacgtaaa aacaattcaa caaacattta tcgataacga caaaaaacat 420
aaagcagatt atgaaaagca aggtaacaaa tacattgctc aattggaaaa attaaataat 480
gacagtaaag acagtaaaga caaatttaat gacattccaa aagaacaacg tgccatgatt 540
acaagtgaag gtgccttcaa gtacttctca aaacaatacg gtattacacc aggttatatt 600
tgggaaatta acactgaaaa acaaggtaca cctgaacaaa tgagacaagc tattgagttt 660
gttaaaaagc acaaattaaa acacttatta gtagaaacaa gtgttgataa gaaagcaatg 720
gaaagtttat ctgaagaaac gaagaaagat atctttggtg aagtgtacac agattcaatc 780
ggtaaagaag gcactaaagg tgactcttac tacaaaatga tgaaatcaaa tattgaaact 840
gtacacggaa gcatgaaaat gtataagaga tta 873
<210> 42
<211> 1013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acaaagaaaa agtgacacgc tgtgttttaa tgaagtaaga tgaattgatg ttgatgcaac 60
ctaaaatatt ggtatctcca atattttagg ccacacatca acataacaaa gtcgaaggct 120
aatagtccca tatcgtgcgt taaatatata ttaccctcct attaatatat ataccgttcc 180
cgatcgcacg atatggtggt attagaactt ctctttgaac gaaagagaaa agctagaagt 240
tcttatgcag ttttaattaa actgtaaaca tttgtcactc tttaaatcaa agagtaaagt 300
taaaagcttt atgtggtttt gattaaactg cgaacagctg cttctctttg aacgaaagag 360
aaaagctaga agttcttatg cagttttaat taaactgtaa acatttatca ctctttaaat 420
caaagagtaa agttaaaagc tttatgtggt tttgattaaa ctgcgaacag ctgcttctct 480
ttgaacgaaa gagaaaagct agaagttctt atgcagtttt aattaaactg taaacattta 540
tcactcttta aatcaaagag taaagttaaa agctttatgt ggttttgatt aaactgcgaa 600
cagctgcttc tctttgaacg aaagagaaaa gctagaagtt cttatgcagt tttaattaaa 660
ctgtaaacat ttatcactct ttaaatcaaa gagtaaagtt aaaagcttta tgtggttttg 720
attaaactgc gaacagctgc ttctctttga acgagagaga aaagctagaa gttcttatgc 780
agttttaatt aaactgtcgt tcccttcatc tcttttaacc acagagatgc gttagaagtt 840
cttctaatac aatttataca acgccattcc ctacacactc ttataaaaga gattcacgcg 900
cgtcaataaa ttgtattaca tactaactaa aaagcttttc ttaatcgtac taacgaagtt 960
agaggttctt atgtgattgg acaactgttc tcgtcgacct gcaggcatgc aag 1013
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gagctcggta cccggggatc cttatgggaa aggtatggtg a 41
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
taacactttt cgttttttca tcttcgactc cttctctttg taaa 44
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aaaaaggcta tgagatagga taagccatgg cacaaatgac aatg 44
<210> 46
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cttgcatgcc tgcaggtcga ctttttgccc tcctaagatt tcg 43
<210> 47
<211> 1177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gagctcggta cccggggatc cttatgggaa aggtatggtg aattgaatgg ctcctaagtt 60
acaagcccaa ttcgatgcag taaaagtttt aaatgatact caatcgaaat ttgaaatggt 120
tcaaattttg gatgagaatg gtaacgtcgt aaatgaagac ttagtacctg atcttacgga 180
tgaacaatta gtggaattaa tggaaagaat ggtatggact cgtatccttg atcaacgttc 240
tatctcatta aacagacaag gacgtttagg tttctatgca ccaactgctg gtcaagaagc 300
atcacaatta gcgtcacaat acgctttaga aaaagaagat tacattttac cgggatacag 360
agatgttcct caaattattt ggcatggttt accattaact gaagctttct tattctcaag 420
aggtcacttc aaaggaaatc aattccctga aggcgttaat gcattaagcc cacaaattat 480
tatcggtgca caatacattc aagctgctgg tgttgcattt gcacttaaaa aacgtggtaa 540
aaatgcagtt gcaatcactt acactggtga cggtggttct tcacaaggtg atttctacga 600
aggtattaac tttgcagcag cttataaagc acctgcaatt ttcgttattc aaaacaataa 660
ctatgcaatt tcaacaccaa gaagcaagca aactgctgct gaaacattag ctcaaaaagc 720
aattgctgta ggtattcctg gtatccaagt tgatggtatg gatgcgttag ctgtatatca 780
agcaactaaa gaagcacgtg accgcgcagt tgcaggtgaa ggtccaacat taattgaaac 840
tatgacatat cgttatggtc ctcatacaat ggctggtgac gatccaactc gttacagaac 900
ttcagacgaa gatgctgaat gggagaaaaa agacccatta gtacgtttcc gtaaattcct 960
tgaaaacaaa ggtttatgga atgaagacaa agaaaatgaa gttattgaac gtgcaaaagc 1020
tgatattaaa gcagcaatta aagaggctga taacactgaa aaacaaactg ttacttctct 1080
aatggaaatt atgtatgaag atatgcctca aaacttagca gaacaatatg aaatttacaa 1140
agagaaggag tcgaagatga aaaaacgaaa agtgtta 1177
<210> 48
<211> 1114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aaaaaggcta tgagatagga taagccatgg cacaaatgac aatggttcaa gcgattaatg 60
atgcgcttaa aactgaactt aaaaatgacc aagatgtttt aatttttggt gaagacgttg 120
gtgttaacgg cggtgttttc cgtgttactg aaggactaca aaaagaattt ggtgaagata 180
gagtattcga tacaccttta gctgaatcag gtattggtgg tttagcgatg ggtcttgcag 240
ttgaaggatt ccgtccggtt atggaagtac aattcttagg tttcgtattc gaagtatttg 300
atgcgattgc tggacaaatt gcacgtactc gtttccgttc aggcggtact aaaactgcac 360
ctgtaacaat tcgtagccca tttggtggtg gcgtacacac accagaatta cacgcagata 420
acttagaagg tattttagct caatctccag gtctaaaggt tgttattcct tcaggcccat 480
acgatgcgaa aggtttatta atttcttcta ttagaagtaa tgacccagtc gtatacttag 540
agcatatgaa attgtatcgt tcattccgtg aagaagtacc tgaagaagaa tatacaattg 600
acattggtaa ggctaatgtg aaaaaagaag gtaatgacat ttcaatcatc acatacggtg 660
caatggttca agaatcaatg aaagctgcag aagaacttga aaaagatggt tattctgttg 720
aagtaattga cttacgtact gttcaaccaa tcgatgttga cacaattgta gcttcagttg 780
aaaaaactgg tcgtgcagtt gtagttcaag aagcacaacg tcaagctggt gttggtgcag 840
cagttgtagc tgaattaagt gaacgtgcaa tcctttcatt agaagcacct attggaagag 900
ttgcagcagc agatacaatt tatccattca ctcaagctga aaatgtttgg ttaccaaaca 960
aaaatgacat catcgaaaaa gcaaaagaaa ctttagaatt ttaatacatt ttaaaagtta 1020
acgaagttag cgtattttag tctcattgat taaaatgaaa tgtttaattt acgaaatctt 1080
aggagggcaa aaagtcgacc tgcaggcatg caag 1114
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gagctcggta cccggggatc caactgaact taaaaatgac caag 44
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agatatattc cggccagcat aaattctaaa gtttcttttg 40
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaactggacg aatggctgat acattttaaa agttaacga 39
<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cttgcatgcc tgcaggtcga ctccagtaat gtttatgaac gatt 44
<210> 53
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gagctcggta cccggggatc caactgaact taaaaatgac caagatgttt taatttttgg 60
tgaagacgtt ggtgttaacg gcggtgtttt ccgtgttact gaaggactac aaaaagaatt 120
tggtgaagat agagtattcg atacaccttt agctgaatca ggtattggtg gtttagcgat 180
gggtcttgca gttgaaggat tccgtccggt tatggaagta caattcttag gtttcgtatt 240
cgaagtattt gatgcgattg ctggacaaat tgcacgtact cgtttccgtt caggcggtac 300
taaaactgca cctgtaacaa ttcgtagccc atttggtggt ggcgtacaca caccagaatt 360
acacgcagat aacttagaag gtattttagc tcaatctcca ggtctaaagg ttgttattcc 420
ttcaggccca tacgatgcga aaggtttatt aatttcttct attagaagta atgacccagt 480
cgtatactta gagcatatga aattgtatcg ttcattccgt gaagaagtac ctgaagaaga 540
atatacaatt gacattggta aggctaatgt gaaaaaagaa ggtaatgaca tttcaatcat 600
cacatacggt gcaatggttc aagaatcaat gaaagctgca gaagaacttg aaaaagatgg 660
ttattctgtt gaagtaattg acttacgtac tgttcaacca atcgatgttg acacaattgt 720
agcttcagtt gaaaaaactg gtcgtgcagt tgtagttcaa gaagcacaac gtcaagctgg 780
tgttggtgca gcagttgtag ctgaattaag tgaacgtgca atcctttcat tagaagcacc 840
tattggaaga gttgcagcag cagatacaat ttatccattc actcaagctg aaaatgtttg 900
gttaccaaac aaaaatgaca tcatcgaaaa agcaaaagaa actttagaat ttatgctggc 960
cggaatatat ct 972
<210> 54
<211> 1007
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aaactggacg aatggctgat acattttaaa agttaacgaa gttagcgtat tttagtctca 60
ttgattaaaa tgaaatgttt aatttacgaa atcttaggag ggcaaaaacg tggcatttga 120
atttagatta cccgatatcg gggaaggtat ccacgaaggt gaaattgtaa aatggtttgt 180
taaagctgga gatactattg aagaagacga tgttttagct gaggtacaaa acgataaatc 240
agtagtagaa atcccatcac cagcatctgg tactgtagaa gaagttatgg tagaagaagg 300
tacagtagct gtagttggtg acgttattgt taaaatcgat gcacctgatg cagaagatat 360
gcaatttaaa ggtcatgatg atgattcatc atctaaagaa gaacctgcga aagaggaagc 420
gccagcagag caagcacctg tagctactca aactgaagaa gtagatgaaa acagaactgt 480
taaagcaatg ccttcagtac gtaaatacgc acgtgaaaaa ggtgttaaca ttaaagcagt 540
ttctggatct ggtaaaaatg gtcgtattac aaaagaagat gtagatgcat acttaaatgg 600
tggtgcacca acagcttcaa atgaatcagc tgcttcagct acaagtgaag aagttgctga 660
aactcctgca gcacctgcag cagtaacatt agaaggcgac ttcccagaaa caactgaaaa 720
aatccctgct atgcgtagag caattgcgaa agcaatggtt aactctaagc atactgcacc 780
tcatgtaaca ttaatggatg aaattgatgt tcaagcatta tgggatcacc gtaagaaatt 840
taaagaaatc gcagctgaac aaggtactaa gttaacattc ttaccttatg ttgttaaagc 900
acttgtttct gcattgaaaa aatacccagc acttaacact tcattcaatg aagaagctgg 960
tgaaatcgtt cataaacatt actggagtcg acctgcaggc atgcaag 1007

Claims (20)

1.一种用于制备细菌膜泡多联疫苗的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述重组金黄色葡萄球菌是安全型的金黄色葡萄球菌，且含有两种或两种以上异种病原体来源的抗原肽段编码基因，所述抗原肽段编码基因分别插入到一金葡菌融合靶分子的编码基因中获得融合蛋白编码序列，所述金葡菌融合靶分子选自金黄色葡萄球菌融合蛋白编码序列能表达含异种病原体抗原肽的融合蛋白，并能呈现于金黄色葡萄球菌的膜泡上；通过基因重组、基因突变或基因编辑使金黄色葡萄球菌的agrA基因失活，获得agr系统功能失活的安全型金黄色葡萄球菌；
所述金葡菌融合靶分子选自金葡菌金属ABC转运体底物结合蛋白（Mntc）、金葡菌烯醇化酶（Eno）、金葡菌丙酮酸脱氢酶α亚单位（PdhA）和金葡菌丙酮酸脱氢酶β亚单位（PdhB）；
所述异种病原体来源的抗原肽段选自鼠疫耶尔森菌III型分泌系统毒力因子LcrV，金葡菌肠毒素SEB, 类鼻疽伯克霍尔德菌VI型分泌系统通道蛋白Hcp1和炭疽杆菌毒素成分保护性抗原Pa；
所述融合蛋白编码序列选自Eno-LcrV融合序列的编码核苷酸序列、Mntc-SEB融合序列的编码核苷酸序列、PdhA-Pa融合序列的编码核苷酸序列和PdhB-Hcp1融合序列的编码核苷酸序列；所述Eno-LcrV融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；所述Mntc-SEB融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；所述PdhA-Pa融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:15；所述PdhB-Hcp1融合序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
2.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述异种病原体来源的抗原肽段编码基因的核苷酸序列插入到金葡菌融合靶分子的编码基因的终止子前。
3.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述金葡菌金属ABC转运体底物结合蛋白Mntc的编码基因为SEQ ID NO:10所示的mntc基因。
4.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述金葡菌烯醇化酶Eno的编码基因为SEQ ID NO:7所示的eno基因。
5.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述金葡菌丙酮酸脱氢酶α亚单位PdhA的编码基因为SEQ ID NO:13所示的pdhA基因。
6.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述金葡菌丙酮酸脱氢酶β亚单位PdhB的编码基因为SEQ ID NO:16所示的pdhB基因。
7.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述鼠疫耶尔森菌III型分泌系统毒力因子LcrV的编码基因为SEQ ID NO:8所示的lcrV基因。
8.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述金葡菌肠毒素SEB的编码基因为SEQ ID NO:11所示的seb基因。
9.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述类鼻疽伯克霍尔德菌VI型分泌系统通道蛋白Hcp1的编码基因为SEQ ID NO:17所示的hcp1基因。
10.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述炭疽杆菌毒素成分保护性抗原Pa的编码基因为SEQ ID NO:14所示的pa基因。
11.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述Eno-LcrV融合序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
12.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述Mntc-SEB融合序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
13.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述PdhA-Pa融合序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
14.如权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述PdhB-Hcp1融合序列的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
15.如权利要求1-14中任一项所述的重组金黄色葡萄球菌，其特征在于，所述重组金黄色葡萄球菌为金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV/seb、金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/pa或金葡菌菌株RN4220-ΔagrA/lcrV/seb/ pa/hcp1。
16.如权利要求1-15中任一项所述的重组金黄色葡萄球菌的构建方法，其特征在于，包括：
1）通过基因重组、基因突变或基因编辑使金黄色葡萄球菌的agrA基因失活，获得agr系统功能失活的安全型金黄色葡萄球菌；
2）确定金葡菌融合靶分子及融合靶分子编码基因，并基于所述融合靶分子编码基因构建同源左臂和同源右臂；
3）确定异种病原体及其抗原肽段，并将所述抗原肽段的编码核苷酸序列插入到所述同源左臂和同源右臂之间，获得以同源左臂-抗原肽编码核苷酸序列-同源右臂形式连接形成的同源重组序列；
4）将所述同源重组序列连接到质粒中，获得融合质粒；
5）将所述融合质粒转化到所述安全型金黄色葡萄球菌中，经筛选获得重组金黄色葡萄球菌。
17.如权利要求16所述的构建方法，其特征在于，所述安全型金黄色葡萄球菌是通过包括下述步骤的方法构建得到的：
1）以金葡菌靶标分子在基因组中的基因序列获得用于agrA基因打靶的agrA基因同源左臂和agrA基因同源右臂；
2）将agrA基因同源左臂和agrA基因同源右臂序列直接相连，然后克隆到敲除载体上，得到敲除载体；所述敲除载体为pBT2-ΔagrA；
3）将敲除载体转化到野生型金黄色葡萄球菌中，经筛选即得到缺失agrA基因的安全型金黄色葡萄球菌；所述野生型金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌RN4220菌株。
18.如权利要求1-15中任一项所述的重组金黄色葡萄球菌在制备细菌膜泡多联疫苗中的应用。
19.一种细菌膜泡多联疫苗，其特征在于，所述的细菌膜泡多联疫苗是基于权利要求1-15中任一项所述的重组金黄色葡萄球菌制备得到的。
20.如权利要求19所述的多联疫苗，其特征在于，所述细菌膜泡多联疫苗为用于金葡菌SEB中毒、鼠疫、炭疽和类鼻疽病中的两种或两种以上的预防的疫苗。
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