CN103333849A - 金黄色葡萄球菌突变株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明总体上提供一种金黄色葡萄球菌突变株及其制备方法和应用。该突变株的保藏号为CGMCC No.7583。其制备方法为：利用同源重组技术将金黄色葡萄球菌RN4220菌株染色体上编码全局性调控因子(Agr)的agr基因进行基因敲除；再利用同源重组技术将编码登革病毒包膜E蛋白EDIII区的简并序列敲入到RN4220编码丙酮酸脱氢酶β亚单位基因pdhB的3′端，并在EDIII后插入氯霉素抗性编码基因，经核苷酸测序鉴定。用本发明所述突变株为工程菌，经发酵，从发酵上清中纯化含有登革病毒EDIII重组蛋白的细菌膜泡。用这种细菌产生的登革热膜泡作为疫苗，可以用于登革病毒感染性疾病的预防。

Description

金黄色葡萄球菌突变株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说，本发明涉及DNA重组技术构建含登革病毒保护性抗原基因的重组金黄色葡萄球菌，以及利用该重组菌制备登革热膜泡的方法和应用。

背景技术

登革病毒（Dengue virus,DV）为黄病毒科的单股正链RNA病毒，以蚊虫为媒介进行传播。DV有4种血清型，分别称为DV-1,DV-2,DV-3,DV-4。人感染其中的任何一种血清型后均可产生对此种血清型病毒的保护性免疫，但不同型之间的交叉保护性免疫较为短暂，并且病毒感染产生的非中和抗体还可介导抗体依赖的感染增强现象(Antibody-dependent enhancement,ADE)，导致严重的登革出血热和登革休克综合症(Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome,DHF/DSS)的发生（Morens DM,et al.Microb Pathog.1987;3(4):231-7）。DV所致的登革热（Dengue fever,DF）、DHF和DSS广泛流行于热带和亚热带地区，全球有25～30亿人生活在流行区内，每年约有1亿人遭受感染，其中约100万人发展成严重的DHF/DSS，死亡率5～20％（Chaturvedi UC.J Biosci.2008;33(4):429-41）。我国也是登革热的高发区，海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区为重点流行区域，多次发生DF、DHF/DSS的爆发流行，给流行区人们的健康带来严重影响。

目前，对DV感染性疾病仍无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。然而，登革热疫苗的研究一直备受关注，现有技术中的登革热疫苗包括以下几种：

基因工程亚单位疫苗：印度（Etemad B,et al.Am J Trop Med Hyg.2008Sep;79(3):353-63）和中国学者（Chen S,et al.DNA Cell Biol.2007;26(6):361-7）将4种血清型登革病毒E蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1:47-1:588，对各型DV的保护力差异较大，相比较而言，亚单位疫苗的保护效果不如颗粒性疫苗。

假病毒疫苗：假病毒（pseudovirus）为不含核酸的病毒空壳结构,但保留了天然病毒颗粒的空间构象，不仅可用于模拟天然病毒对宿主的感染，探索病毒侵入敏感细胞的机制，同时VLPs由病毒主要结构蛋白组成，含病毒特异的抗原表位,能够刺激机体免疫系统产生很强的免疫应答，是很有发展前景的、安全的候选疫苗。Merck公司研制的HPV6、11、16、18四价VLP Gardasil疫苗（预防宫颈癌）已于2006年6月获得美国FDA许可，成为第一个投放市场应用的VLPs疫苗，也标示着未来疫苗的发展方向。但假病毒疫苗的制备多采用哺乳动物细胞进行，产量低，成本高。

美国Schein CH等（BMC Bioinformatics.2012;13Suppl13:S9）公开了一种利用计算机针对671株DV包膜E蛋白III区（EDIII）蛋白序列设计的物理、化学性质一致的EDIII蛋白的制备方法，该蛋白免疫产生的抗体虽然保护范围广，但特异性较差，可能对特异流行株感染的保护效果不佳，不利于推广。

法国Sabchareon A等（Lancet.2012;380(9853):1559-67）报道的首个登革热疫苗—CYD-TDV重组减毒四价登革病毒疫苗能够对1、3和4型登革热病毒株具有免疫作用，但其整体效果并不理想，它对于在泰国最常见的2型登革热病毒株所起的防护作用弱。

新加坡Sim AC等（Vaccine.2008;26(9):1145-54）报道了一种表达登革病毒EDIII的重组乳链球菌制剂，但对同种或不同种小鼠的保护能力差异很大，其中的作用效果和免疫途径都有待深入进行评估。

综上所述，在登革热防治中急切需求安全性好，免疫效价高的优质疫苗。

细菌膜泡（Bacterial membrane vesicles,MVs）是细菌在生长过程中产生的纳米级膜性结构，是细菌的一种重要外分泌系统，可将细菌合成的重要抗原、膜蛋白、脂多糖、DNA等以小囊泡的方式输送至胞外（Kulp A and Kuehn MJ.Annu Rev Microbiol,2010;64:163–84）。因MVs中可包裹或镶嵌细菌或重组的抗原组分，形成“病毒体样”结构，有良好的免疫原性，故细菌膜泡疫苗近年来受到高度重视。除包裹和镶嵌特定抗原外，细菌膜泡还具有佐剂活性，也是极为理想的新一代疫苗递送系统（Lee DH,et al.Vaccine,2011;29:8293-301）。采用分子生物学技术将外源基因（如病毒保护性抗原基因）重组到细菌染色体中特定的抗原靶位点，利用细菌的膜泡形成机制，不仅能将设计的抗原呈现在膜泡表面，模拟天然病毒颗粒样结构诱发机体的保护性免疫，同时膜泡为细菌在生长过程中自然分泌，具有稳定，高效等优势，是理想的新型疫苗构建策略。Findlow等（Clin Infect Dis,2010;51:1127-37）公开的重组NadA、fHBP、NHBA三种抗原的脑膜炎奈瑟菌膜泡疫苗已在英国进入II期临床试验，该疫苗的实质是将脑膜炎奈瑟菌三种重组表达抗原（NadA,fHBP，NHBA）纯化后与细菌的膜泡进行混合而成。因革兰阴性菌细胞臂含有内毒素（LPS），该组分也能经膜泡分泌，故在构建革兰阴性菌膜泡疫苗时，所用菌株须经LPS合成基因（如lpxL2和synX）的敲除处理(Zollinger WD,et al.Vaccine,2010;28:5057-67)。2009年，韩国的Lee等(Proteomics,2009;9:5425-36)发现金黄色葡萄球菌（革兰阳性）也能分泌细菌膜泡，故利用革兰阳性菌制备病毒的膜泡疫苗成为新的发展方向，一方面具有细菌膜泡疫苗的稳定性，可将有效病毒抗原表位插入膜泡表面，形成类似天然病毒样结构,有效刺激机体的免疫应答，同时细菌膜泡不含病毒特性核酸，不能复制，保障了膜泡疫苗的安全性；另一方面可避免革兰阴性菌LPS的影响，进一步提高了疫苗安全性，简化了膜泡疫苗的纯化工艺，是理想的疫苗制备策略。

发明内容

本发明利用DNA重组技术构建一种含登革病毒保护性抗原基因的重组金黄色葡萄球菌，并利用该重组菌制备登革热膜泡。

具体地，本发明提供的含登革病毒保护性抗原基因的重组金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株，其保藏号为CGMCC No.7583。

本发明还提供上述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株的方法，对一株金黄色葡萄球菌RN4220（中国科学技术大学孙宝林教授提供，Shang F,etal.Infect Immun,2009;77:2849-56）进行基因工程技术改造，其主要包含步骤：

1）根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中agr基因的上下游DNA序列，设计线性基因敲除左、右臂PCR引物；通过PCR扩增、酶切、连接、转化操作构建agr基因pYT3打靶载体；

2）将步骤1）制备的pYT3打靶载体电转化到金黄色葡萄球菌RN4220的感受态细胞，并诱导其发生同源重组，经四环素负性筛选，DNA测序鉴定，得到金黄色葡萄球菌RN4220Δagr；

3）提取所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr细菌膜泡，经SDS-PAGE和质谱分析，鉴定RN4220Δagr细菌膜泡携带的主要抗原；其中至少有一种是金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位，其编码基因为pdhB；

4）根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中所述pdhB基因的上下游DNA序列，设计线性基因敲入左、右臂，在同源敲入左臂，即pdhB基因终止密码子前插入登革病毒包膜E蛋白III区简并序列（简并EDIII），在同源敲入右臂前插入氯霉素抗性编码序列，构建“同源敲入左臂-简并EDIII-氯霉素抗性序列-同源敲入右臂”线性基因敲入片段，构建pYT3敲入载体；

5）将步骤4）构建的pYT3敲入载体电转化到金黄色葡萄球菌RN4220Δagr的感受态细胞，并诱导其发生同源重组，经四环素负性、氯霉素正性筛选，DNA测序鉴定，即得到所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株。

优选地，步骤1）中，所述agr基因的序列如SEQ ID NO：1所示，线性基因敲除左、右臂的序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。

优选地，步骤3）中，金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位的编码基因pdhB的序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，步骤4）中，所述线性基因敲入左、右臂的序列分别如SEQ ID NO：8和9所示；登革病毒包膜E蛋白III区简并序列如SEQ ID NO：2所示；氯霉素抗性编码序列的序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供一种含登革病毒包膜E蛋白III区简并序列重组蛋白的细菌膜泡，其以该金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株为工程菌，经发酵而产生。

本发明还提供一种制备上述的细菌膜泡的方法，其主要包含步骤：

1）菌种准备：将上述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株接种于含氯霉素的TSB平板，经培养，挑取单个菌落扩大培养后作为种子菌；

2）发酵：将所述种子菌转种于相应的发酵瓶或发酵罐中，发酵后收集发酵上清；

3）过滤：过滤所述上清，收集过滤液再用100kDa超滤器过滤处理，收集滤过液；

4）离心：离心所述滤过液，收集沉淀；

5）梯度离心：用PBS缓冲液悬浮所述沉淀，离心后，收集10%-40%梯度界面的悬浮带，即为细菌膜泡。

本发明所述的细菌膜泡可用于制备预防或治疗登革病毒感染性疾病制剂中的应用。优选地，所述制剂为疫苗。

本发明还提供一种登革热膜泡疫苗，其由上述的细菌膜泡免疫小鼠制备而成。

所述登革热膜泡疫苗的制备方法主要包括以下步骤：

1.构建agr线性基因打靶载体，金黄色葡萄球菌RN4220Δagr突变株的筛选与鉴定；

2.构建登革病毒简并EDIII基因线性敲入载体，金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株的筛选与鉴定；

3.登革热膜泡疫苗的制备。

本发明所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株的菌种保藏号是：CGMCC No.7583；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌种的拉丁学名是：Staphylococcus aureus，参据的微生物（株）：RN4220Δagr/EDⅢ(+)，保藏日期为2013年5月13日。

本发明金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株具有以下特征：所述突变株属于葡萄球菌属，为革兰阳性球菌；兼性厌氧，在液体培养基中呈浑浊生长，营养要求不高，在普通琼脂平板上37℃培养24h后，形成直径2～3mm圆形、突起、湿润的金黄色S型菌落；能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸不产气。

本发明的突出优点：

1.本发明所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株，能产生富含登革病毒简并EDIII重组蛋白的细菌膜泡，可用于登革病毒感染性疾病的防控。

2.本发明所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株生物学性状稳定，其全局性调控因子Agr被敲除，使产生的细菌膜泡的毒力大大减低。

3.在分析金黄色葡萄球菌膜泡携带主要抗原组分的基础上，将有效的登革病毒简并抗原表位插入膜泡携带主要抗原中，利用细菌膜泡分泌机制，形成类似天然病毒样结构,能有效刺激机体的免疫应答，且细菌膜泡不含病毒特性核酸，不能复制，保障了膜泡疫苗的安全性。

4.金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，不含细菌内毒素（LPS）成分，简化了膜泡疫苗的纯化工艺，提高了疫苗安全性，是理想的登革热疫苗制备方案。

下面结合具体实施实例，进一步阐明本发明。应当指出的是，这些实施实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如黄培堂等译《分子克隆实验指南》（第三版，科学出版社，2002）中所述的条件，或按试剂制造产家所建议的条件进行。

附图说明

图1是登革热膜泡疫苗制备示意图。图1中，左边为agr基因在金黄色葡萄球菌RN4220基因组上的结构，据此设计基因打靶序列，先分别用P1/P2,P3/P4两对引物从基因组中扩增出左、右臂，再利用序列间的重叠区域，用P1/P4引物扩增出打靶序列片段，经BamHI/SalI双酶切后连接到pYT3穿梭载体上，转化大肠埃希菌DH5α，筛选AMP抗性菌落，提取质粒测序，将构建正确的质粒转化金黄色葡萄球菌RN4220感受态，筛选四环素敏感菌株，提取基因组用P1/P4引物扩增，原始RN4220菌株对照为5300bp,而敲除株的产物约2000bp,即缺失了约3300bp的agr基因，此即为RN4220Δagr；图中右边，在确认pdhB为RN4220膜泡主要携带抗原后，以pdhB基因最后一个编码子与终止密码子间为插入位点，设计敲入片段（左臂-EDIII-氯霉素抗性基因-右臂），构建pYT3敲入载体，转化RN4220Δagr感受态，筛选氯霉素抗性菌，提起基因组进行PCR扩增鉴定，最后经核苷酸测序证实，含有EDIII敲入的菌株即为RN4220Δagr/EDIII(+)，以突变菌株为工程菌，发酵制备上清，经超滤，梯度离心等操作，制备登革热膜泡疫苗。

图2是金黄色葡萄球菌RN4220产生膜泡的SDS-PAGE电泳图。提取细菌膜泡，进行SDS-PAGE电泳，泳道1为蛋白质分子量标准（大小标记见左边），泳道2为培养6h后提取的细菌膜泡，泳道3、4、5均为培养24h后提取的细菌膜泡。将膜泡携带的主蛋白条带（5条的大约分子量标记见右边）切下，送质谱分析。

图3是RN4220Δagr/EDIII(+)突变菌株的PCR鉴定。泳道1、2为金黄色葡萄球菌特异femB基因，泳道3、4为用引物P7/P8扩增结果，泳道5、6为引物P7/P9扩增，泳道7、8为P10/P12扩增，泳道9、10为P11/P12扩增，泳道11、12为P5/P6扩增。其中泳道1、3、5、7、9、11中所使用的模板为RN4220野生菌基因组DNA；泳道2、4、6、8、10中所使用的模板为RN4220Δagr/EDIII(+)突变菌株基因组DNA。

图4是登革热膜泡疫苗免疫鼠血清与正常鼠血清对DV-2空斑形成的抑制率。

具体实施方式

材料：

1.普通Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司产品，中国大连）；

2.

HS DNA聚合酶（TaKaRa公司产品，中国大连）；

3.EcoR I、BamH I、Hind III、SalI、SphI等限制性内切酶（TaKaRa公司产品，中国大连）；

4.质粒pYT3(Hanaki H,et al.J Antimicrob Chemother.1998Aug;42(2):199-209)；

质粒pSET1(Takamatsu D,et al.Plasmid.2001Mar;45(2):101-13)；

质粒pET22b-DVIII（Yangjie,et al.Can J Microbiol.2012Apr;58(4):369-80）；

5.质粒DNA抽提试剂盒（华舜公司产品，中国上海）；

6.DNA胶回收试剂盒（华舜公司产品，中国上海）；

7.PCR产物纯化试剂盒（华舜公司产品，中国上海）；

8.大肠杆菌DH5α（天根公司产品，中国北京）

9.酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司产品，英国）

10.Tryptone Soya Broth(TSB)培养基干粉（Oxoid公司产品，英国）

11.TSB液体培养基：称取TSB培养基干粉9g，加300ml ddH₂O溶解，高压灭菌，4℃保存备用。

12.TSB固体培养基：每1000ml液体TSB培养基中加入15g琼脂粉，高压蒸气灭菌，铺板备用。

13.氯霉素（上海生工产品，中国）；

14.氨苄青霉素（北京鼎国产品，中国）；

15.四环素（上海生工产品，中国）；

16.凝胶成像仪（BIO-RAD公司产品，美国）；

17.Gene Pulser Xcell TM型电穿孔仪（BIO-RAD公司产品，美国）；

18.梯度离心液Optiprep(AXIS-SHIELD,挪威)；

19.非洲绿猴肾细胞（vero细胞ATCC CCL-81）（购自上海复祥生物科技公司）；

20.登革病毒DV-21751株（Trent,et al.1983）。

实施例1金黄色葡萄球菌RN4220Δagr的构建

金黄色葡萄球菌的毒力表达受到严格调控，其中全局性调控因子（accessorygene regulator，agr)对金葡菌的毒力有重要调控作用，agr的突变或缺失会导致毒力下降（Rudkin JK，et al.J Infect Dis,2012;205:798–806)。为提高疫苗制备工程菌的安全性，发明人对金黄色葡萄球菌RN4220的agr基因进行敲除，其步骤如下：

1.线性基因打靶片段的构建

（1）引物设计：根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组序列（下载地址：http://jb.asm.org/content/193/9/2332/suppl/DC1[Supplemental file1])中agr所在的DNA序列（其序列如SEQ ID NO：1所示）设计基因打靶左、右臂PCR引物，碱基序列如下：

线性基因打靶PCR引物（P1、P2、P3、P4）：分别为SEQ ID NO：11、12、13、14所示。

P1:5'-GGAGGATCCTAGTTCTAAAAATGAAACTCAAA-3'(下划线为BamHI酶切位点)

P2:5'-TAACTGACTTTATTATCTTAGTAATGAAGAAGGGA-3'

P3:5'-ACTCATCCCTTCTTCATTACTAAGATAATAAAGTC-3'(下划线为30bp与P2引物的反向互补序列)

P4:5'-GAAGTCGACATGTGAATGAAAATGATGTAGTA-3'(下划线为SalI酶切位点)

上述引物的对应位置见图1所示。

（2）PCR扩增：以金黄色葡萄球菌RN4220的基因组DNA为模板，分别用引物P1/P2，P3/P4进行PCR，扩增线性基因打靶片段的左、右臂（其序列分别如SEQ ID NO：5和6所示）。

PCR的反应体系为：

PCR的反应条件：98℃30秒，58℃30秒,72℃70秒（1min/kb），循环30次；所得PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，可分别见约1000bp(P1/P2引物扩增)和950bp(P3/P4引物扩增)大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化，稀释200倍后，各取1μl作为模版，如前步骤再一次用P1/P4引物进行PCR扩增，利用产物间的重叠区，这样可扩增出含线性基因打靶片段的左臂+右臂的线性片段。将第二次PCR后的产物回收、纯化，冻存备用。

2.pYT3基因打靶载体的构建

利用P1、P4引物上设计的酶切位点，将第二次PCR产物进行BamHI、SalI双酶切，酶切体系如下：

上述混合物置37℃作用3h，所得酶切产物经0.8%琼脂糖电泳回收，插入到pYT3质粒的相应酶切位点，转化大肠埃希菌DH5α感受态，经AMP（100μg/ml）平板37℃24h培养后，挑取AMP抗性菌落，提取质粒进行酶切鉴定，能切出目标片段者为成功构建的pYT3基因打靶载体。

3.金黄色葡萄球菌RN4220Δagr的筛选与鉴定

（1）电转化法金黄色葡萄球菌RN4220感受态细胞的制备

受体菌（RN4220）接种于TSB培养基，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.3左右（约3h）；将菌液迅速置于冰上冷却10min，4℃下3000g冷冻离心10min；弃上清，加入15ml冰冷的0.5M蔗糖，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮，4℃下3000g冷冻离心10min；弃上清，加入10ml冰冷的0.5M蔗糖，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮，4℃下3000g冷冻离心10min；加入5ml冰冷的0.5M蔗糖，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，4℃下3000g冷冻离心10min；弃上清，加入500μl冰冷的0.5M蔗糖，迅速置于-70°C超低温保存。

（2）电转化

将pYT3基因打靶载体电转化至RN4220感受态（电转化参数：电压2.5kV；电容50μF；电阻200ohms）。电击之后，立即加入900μl TSB，于30℃，200rpm振荡培养1h，涂布含四环素（5μg/ml）的TSB平板，30℃培养箱静置培养2天，挑取抗性菌落，提取质粒，用BamHI,SalI进行酶切鉴定，正确者为成功转化了打靶载体的RN4220。

（3）筛选与鉴定

①因pYT3为一温敏质粒，在30℃时能复制，在42℃培养时会丢失。故将转化了打靶载体的RN4220过夜培养产物1:100接种至5ml不含四环素的TSB培养基中，42℃，200rpm振荡培养过夜。

②过夜培养产物1:100接种至5ml不含四环素的TSB培养基中，25℃，200rpm振荡培养过夜。

③重复上述①②步骤

④将培养产物三线法划线至不含抗生素的固体TSB培养基中，置37℃恒温培养箱培养过夜。

⑤挑取单菌落，分别接种无抗性固体TSB平板以及含5μg/ml四环素抗性固体TSB平板中，置37℃恒温培养箱培养过夜。

⑥挑取在无抗性固体TSB平板中生长，而在四环素抗性固体TSB平板中不生长的单菌落，作为候选agr敲除株，接种至2ml无抗生素液体TSB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

⑦提取候选敲除株基因组DNA。

⑧鉴定

对提取的基因组DNA1：50稀释后，取1μl作为模板，用位于agr基因两侧的一对引物PL和PR进行扩增，引物序列为（分别如SEQ ID NO：15、16所示）：

PL:5'-AAAGGATCCTTATGTCTTGTGCTCGTTTTTTG-3'

PR:5'-AAAGTCGACTGCGTTAGCTTTTGTGAGTTTGA-3'

扩增条件如下：

98℃10秒，58℃15秒,72℃6分钟（1min/kb），循环30次；所得PCR产物经0.8%琼脂糖电泳检测,如果敲除株扩增产物比正常RN4220对照株短3500bp，则agr基因被成功敲除，再将敲除株的PCR产物进行DNA序列测定(其序列如SEQ ID NO：7所示)，表明agr基因确已被敲除，所得菌株命名RN4220Δagr。

实施例2金黄色葡萄球菌RN4220Δagr膜泡携带主要抗原鉴定

细菌分泌的膜泡可以携带细菌的多种成分，包括主要抗原、LPS、DNA等，且不同的细菌携带的成分有明显差异，为寻找登革病毒抗原的有效重组目标，发明人对金黄色葡萄球菌RN4220Δagr膜泡进行了制备，并对其膜泡携带的蛋白抗原进行了分析和鉴定；

1.金黄色葡萄球菌RN4220Δagr的培养

从TSB固体平板上挑取单个菌落，接种于2ml的TSB培养基中，37℃振荡培养20h，次日按1:1000接种300ml新鲜TSB培养基，37℃振荡培养，分别于培养后6h和24h收集培养上清。

2.膜泡的制备

（1）将收集的细菌培养上清用0.45μm的滤器过滤，所得滤液再用100kDa的超滤柱（Millipore,美国）过滤。

（2）将滤液用200000g于4℃离心3h(日立CP70ME型超速离心机，日本)，收集沉淀。

（3）用PBS缓冲液悬浮沉淀，用Optiprep梯度液（50%，40%，10%）200000g4℃离心3h（Lee EY,et al.Proteomics2009;9:5425-36），小心收集10%-40%梯度界面的悬浮带，4℃保存备用。

（4）SDS-PAGE电泳取30μl膜泡，加入等量2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴10min，参见分子克隆实验指南的方法，上样至SDS-PAGE电泳胶，80V电泳至指示剂至电泳板底部，揭下凝胶，用考马斯蓝R250染色，结果如图2所示。

3.质谱鉴定

从图2中可见，RN4220Δagr可携带20种以上的抗原，选取其中的5条主要的抗原带（大约分子量如图2右边所示），用刀片切下，送中心实验室进行质谱分析，结果表明其中48kDa的蛋白为金黄色葡萄球菌磷酸丙酮酸水合酶（enolase），理论分子量47117.2Da，编码基因eno；37kDa蛋白为金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位（Pyruvate dehydrogenase E1component beta subunit），理论分子量为35260.7Da，编码基因为pdhB(其序列如SEQ ID NO：3所示)，其余3个条带的质谱鉴定效果不佳。

实施例3金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDIII(+)突变株的构建、筛选与鉴定

在用质谱鉴定出的2条金黄色葡萄球菌RN4220Δagr膜泡携带主要抗原中，由pdhB基因编码的丙酮酸脱氢酶β亚单位（37kDa）在Lee EY等（Proteomics2009;9:5425-36）采用蛋白质组学技术鉴定的金黄色葡萄球菌ATCC14458产生的膜泡中也含有，故选择pdhB基因作为外源基因敲入的靶基因。

1.线性敲入片段的构建

（1）引物设计，各引物的对应位置见图1所示：

①根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中pdhB（其序列如SEQ ID NO：3所示）所在的DNA序列设计基因打靶左、右臂PCR引物，碱基序列如下：分别如SEQ ID NO：17、18、19、20所示

同源左臂PCR引物（P7、P13），预计扩增片段931bp：

P7:5'-GGAGGATCCAACTGAACTTAAAAATGACCAAG-3'(下划线为BamHI酶切位点)

P13:5'-CATGCTGTAGGACATAAATTCTAAAGTTTCTTTTG-3'(下划线为30bp与P10引物的反向互补序列)

同源右臂PCR引物（P14、P12），预计扩增片段973bp

P14:5'-GGCGCATGCTACATTTTAAAAGTTAACGA-3'(下划线SphⅠ酶切位点)

P12:5'-GGAGTCGACTCCAGTAATGTTTATGAACGATT-3'(下划线为SalI酶切位点)

②根据pET22b-DVIII重组质粒中克隆的自行设计并人工合成登革病毒简并EDIII序列（如SEQ ID NO：2所示）设计EDIII PCR扩增引物（P10，P8），预计扩增片段300bp，具体序列如下：分别如SEQ ID NO：21、22所示

P10:5'-GAAACTTTAGAATTTATGTCCTACAGCATGTGTAC-3'(下划线为30bp与P13引物的反向互补序列)

P8:5'-AAGCTCTAGTTCTTAGCCTTTCTTGAACCAATTCA-3'(下划线为30bp与P11引物的反向互补序列，黑体为终止密码)

③根据pSET1质粒中氯霉素抗性编码基因的序列（如SEQ ID NO：4所示）设计PCR引物（P11，P9），预计扩增片段1052bp：分别如SEQ ID NO：23、24所示

P11:5'-TGGTTCAAGAAAGGCTAAGAACTAGAGCTTGATGA-3'(下划线为30bp与P8引物的反向互补序列，黑体为终止密码)如SEQ ID NO：23所示

P9:5'-AAAGCATGCTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3'(下划线为SphⅠ酶切位点)如SEQ ID NO：24所示

④根据敲入序列插入的位置，设计一对PCR验证引物(P5,P6)，预计扩增片段3323bp:

P5:5'-AAAGGATCCATGGCACAAATGACAATGGTTCAA-3'(位于左同源臂的上游，见图1)如SEQ ID NO：25所示

P6:5'-AAAGTCGACACTAATAATCCTCTATCAGTGTCTG-3'(位于右同源臂的下游，见图1)如SEQ ID NO：26所示

（2）PCR扩增

①以金黄色葡萄球菌RN4220的基因组DNA为模板，分别用引物P7/P13，P14/P12引物对进行PCR，扩增线性敲入片段的左、右臂（序列表SEQ ID NO：8和9）：

PCR的反应体系为：

PCR的反应条件：98℃10秒，60℃15秒,72℃70秒（1min/kb），循环30次；所得PCR产物经0.8%琼脂糖电泳检测可分别见约900bp(P7/P13引物扩增)和1000bp(P14/P12引物扩增)大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化备用。

②以pET22b-DVIII质粒为模板，用引物P10，P8扩增出登革病毒简并EDIII片段：

PCR的反应体系为：

PCR的反应条件：98℃10秒，56℃15秒,72℃30秒（1min/kb），循环30次；所得PCR产物经1.2%琼脂糖电泳检测可见约300bp大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化备用。

③以pSET1质粒为模板，用引物P11，P9扩增出登革病毒简并EDIII片段：

PCR的反应体系为：

PCR的反应条件：98℃10秒，58℃15秒,72℃90秒（1min/kb），循环30次；所得PCR产物经1.2%琼脂糖电泳检测可见约1100bp大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化备用。

④线性敲入片段的获得

将上述敲入片段左臂、EDIII扩增产物稀释200倍后，各取1μl作为模版，利用产物间30bp的重叠区，再一次用P7/P8引物进行PCR扩增，这样可扩增出含左臂-EDIII的线性基因片段；将氯霉素抗性基因扩增产物和右臂分别经过SphⅠ酶切后，各取5ul混匀，T4连接酶（Takara中国大连）连接过夜，取连接产物1ul稀释50倍后，用P11/P12引物进行PCR扩增，得到氯霉素-右臂基因片段。将这两种大片段分别回收，稀释200倍后，各取1μl作为模版，用P7、P12引物进行PCR扩增，即可得左臂-EDIII-氯霉素-右臂大片段，将产物回收、纯化，冻存备用。

2.pYT3敲入载体的构建

利用P7、P12引物上设计的酶切位点，将左臂-EDIII-氯霉素-右臂大片段进行BamHI、SalI双酶切，酶切体系如下：

37℃水浴酶切3h,酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳回收，纯化，插入到pYT3质粒的相应酶切位点，转化大肠埃希菌DH5α感受态，经AMP（100μg/ml）平板37℃24h培养后，挑取AMP抗性菌落，提取质粒进行酶切鉴定，能切除目标片段者为构建成功的pYT3敲入载体。

3.金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDIII(+)突变株的筛选与鉴定

（1）电转化法金黄色葡萄球菌RN4220Δagr感受态细胞的制备见实施例1所述。将pYT3敲入载体电转化至RN4220Δagr感受态（电转化参数：电压2.5kV；电容50μF；电阻200ohms）。电击之后，立即加入900μl TSB，于30℃，200rpm振荡培养2h，涂布含四环素（5μg/ml）和氯霉素（10μg/ml）的TSB平板，30℃培养箱静置培养2天，挑取抗性菌落，提取质粒，用BamHI,SalI进行酶切鉴定，正确者为成功转化了敲入载体的RN4220Δagr。

（2）筛选与鉴定

①根据pYT3为温敏质粒特性，将转化了敲入载体的RN4220Δagr过夜培养产物1:100接种至5ml不含四环素和氯霉素的TSB培养基中，42℃，200rpm振荡培养过夜。

②过夜培养产物1:100接种至5ml不含四环素，但含氯霉素的TSB培养基中，25℃，200rpm振荡培养过夜。

③重复上述①②步骤

④将培养产物三线法划线接种至只含氯霉素的固体TSB培养基中，置37℃恒温培养箱培养过夜。

⑤挑取单菌落，分别接种至10μg/ml氯霉素抗性固体TSB平板以及5μg/ml四环素抗性固体TSB平板中，置37℃恒温培养箱培养过夜。

⑥挑取在氯霉素抗性固体TSB平板中生长，而在四环素抗性固体TSB平板中不生长的单菌落，作为候选EDIII敲入突变株，接种至2ml无抗生素液体TSB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。

⑦提取突变株株基因组。

⑧鉴定提取的基因组1：50稀释后，取1μl作为模板，用位于敲入序列两侧的一对PCR引物P5/P6,以及各片段的PCR引物进行混合配对PCR扩增，扩增条件见实施例1所述。所得PCR产物经0.8%琼脂糖电泳检测,如图3所示，引物P5/P6能扩增出预期的约3300bp大小的片段，其余的引物对扩增结果也符合预期大小，表明敲入序列已成功插入预定位点，最后将敲入序列扩增后送英俊公司（上海）进行DNA测序（其序列如SEQ ID NO：10所示），证实各片段连接正确，将所得菌株命名金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDIII(+)，菌株保藏号为CGMCC No.7583。

实施例4登革膜泡的制备与鉴定

1.登革膜泡的制备

（1）菌种准备将金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDIII(+)工程菌接种于含10μg/ml氯霉素的TSB平板，37℃培养24h，挑取单个菌落转种于5ml TSB培养基，次日按1:1000比例接种于200ml TSB液体培养基，37℃振荡培养18h即为种子菌。

（2）发酵将种子菌转种于1.8L TSB培养基(3.7L KLF2000型发酵罐，瑞士)，37℃发酵24h，补液为5×TSB培养基，下罐后，发酵物经5000g离心10min（日立21G离心机，日本），收集上清。

（3）过滤将上清用0.45μm的滤器（Millipore公司，美国）过滤，收集过滤液再用100kDa超滤器（Millipore公司，美国）过滤，收集滤过液。

（4）离心将滤过液200000g于4℃离心3h(日立CP70ME型超速离心机,日本)，收集沉淀。

（5）梯度离心用PBS缓冲液悬浮沉淀，用Optiprep梯度液（50%，40%，10%）200000g4℃离心3h，小心收集10%-40%梯度界面的悬浮带，-80℃保存备用。

2.登革膜泡的鉴定

（1）SDS-PAGE电泳取20μl膜泡，加入等量2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴10min，参见分子克隆实验指南的方法进行SDS-PAGE电泳。

（2）Western blot鉴定待指示剂电泳至电泳板底部，揭下凝胶，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗登革病毒EDIII抗血清（Yang J.et al.Can J Microbiol,2012;58:369-80）作一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠（北京中杉公司）作二抗进行免疫印迹（Western blot）鉴定。结果登革热膜泡中有一约43kDa蛋白能与登革病毒EDIII抗体进行印迹反应，表明金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDIII(+)产生的细菌膜泡中含有登革病毒特异性抗原。

实施例5登革热膜泡疫苗的动物免疫

1.动物免疫

为证实登革热膜泡疫苗的免疫效能，发明人检测了登革热膜泡疫苗对BALB/c小鼠免疫后产生抗体的效价。

登革病热膜泡疫苗的免疫方案：10只4周龄BALB/c小鼠，分对照组和免疫组进行实验，免疫剂量和时间见表1。

表1.登革病热膜泡疫苗的免疫剂量与时间

采集小鼠血液，分离血清，加1倍体积100%无菌甘油保存于-20°C备用。

2.ELISA检测血清的免疫效价

（1）抗原包被参照分子克隆实验指南的方法包被重庆登革病毒DVIII抗原（Yang J.et al.Can J Microbiol,2012;58:369-80）。

（2）封闭各包被抗原孔用含5%脱脂奶粉（上海生工）的PBS进行封闭，37°C孵育1h,洗涤（PBS-T,配方参见分子克隆实验指南）。

（3）将免疫获得的小鼠血清用PBS缓冲液作倍比稀释，依次加入每个抗原包被孔中，37°C孵育1h,PBS-T洗涤5次。

（4）加入PBS-T稀释的HRP标记的兔抗鼠抗体（北京中杉公司），37°C孵育1h,PBS-T洗涤5次。

（5）加入DAB底物溶液（EL-ABTS显色试剂盒，上海生工）显色，37°C孵育20分钟，酶标仪（Sunshine）测定OD405的吸光度值。

（6）效价判定经对照组血清吸光度为对照，免疫组血清孔OD405高出2.1倍者判为阳性，结果用登革热膜泡疫苗免疫小鼠血清的效价为1:12800。

实施例6登革热膜泡疫苗免疫血清的中和作用

为检测登革热膜泡疫苗在登革病毒感染性疾病防治中的应用，发明人利用实施例5中制备的小鼠抗血清，在细胞水平观察不同稀释度血清对登革病毒II型感染vero细胞的阻断作用，间接反应疫苗的保护效能。

1.Vero细胞培养复苏Vero细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基（成都哈里公司）参见分子克隆实验指南的方法进行细胞培养与传代。

2.将重组登革热膜泡免疫血清和正常对照鼠血清分别按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320与DV-2登革病毒液（5×10⁴pfu/ml）混合，37°C孵育60min。

3.将Vero细胞悬液1×10⁵/孔接种24孔板，37°C，5%CO₂孵箱中培养至细胞长成单层(约16h)，吸弃培养液，用稀释液洗涤后加入上述病毒—血清混合液，37°C孵育60min后，吸出孔板中的液体，加入含1%甲基纤维素的DMEM培养基，37°C，5%CO₂孵箱中培养，同时设置病毒对照和空白对照。倒置显微镜下观察，出现明显的空（噬）斑后(感染后培养约8天)，吸除孔板中的液体，加入结晶紫染色20min，洗净后计数空斑，记录不同稀释度的抗血清对病毒的中和情况，观察病毒空斑形成情况。

4.计数各实验孔的病毒空斑数，按下列公式计算空斑形成抑制率

结果1:80稀释的免疫血清对DV-2的空斑形成抑制率为85.2%；1:320稀释的免疫血清对DV-2的空斑形成抑制率为69.1%（见图4）。表明所制备的登革热膜泡免疫血清能有效阻止登革病毒的感染。

实施例7登革热膜泡疫苗的毒力实验

疫苗的安全性评价是疫苗研究的重要内容，本发明为降低金黄色葡萄球菌产生膜泡的毒力，对RN4220菌株中调控细菌毒力表达的全局性调控因子Agr的编码基因实施了敲除，在agr敲除菌的基础上重组登革病毒简并性EDIII抗原表位，用于登革热膜泡疫苗的制备。发明人也检测了agr敲除前后，金黄色葡萄球菌产生膜泡对小鼠的致死毒力。

1.金黄色葡萄球菌RN4220细菌膜泡的制备，参见实施例2进行。

2.金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDIII(+)细菌膜泡的制备，参见实施例2进行。

3.动物接种各取6-8周龄BALB/c小鼠10只，分别腹腔接种RN4220细菌膜泡和RN4220Δagr/EDIII(+)细菌膜泡，50μg/只，观察动物的死亡率。

4.记录动物的死亡情况，结果agr敲除前的细菌膜泡注射小鼠后2天，80%的动物死亡，表明金黄色葡萄球菌膜泡携带了大量的毒力因子，而agr敲除后，影响了细菌毒力的表达，其膜泡携带的毒力因子也大大下降，接种膜泡10天，仍有90%实验动物存活，可见，agr敲除金黄色葡萄球菌产生的膜泡安全性更佳。实验证明，本发明制备的登革热膜泡疫苗免疫机体，可以激发机体产生免疫应答，对登革病毒强毒株感染的细胞有较高的保护效果。本发明对于预防人类登革病毒的感染具有重要意义。

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株，其保藏号为CGMCCNo.7583。

2.一种制备权利要求1所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株的方法，其特征在于，包含步骤：

1）根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中agr基因的上下游DNA序列，设计线性基因敲除左、右臂PCR引物；通过PCR扩增、酶切、连接、转化操作构建agr基因pYT3打靶载体；

2）将步骤1）制备的pYT3打靶载体电转化到金黄色葡萄球菌RN4220的感受态细胞，并诱导其发生同源重组，经四环素负性筛选，DNA测序鉴定，得到金黄色葡萄球菌RN4220Δagr；

3）提取所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr细菌膜泡，经SDS-PAGE和质谱分析，鉴定RN4220Δagr细菌膜泡携带的主要抗原；其中至少有一种是金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位，其编码基因为pdhB；

4）根据金黄色葡萄球菌RN4220基因组中所述pdhB基因的上下游DNA序列，设计线性基因敲入左、右臂，在同源敲入左臂，即pdhB基因终止密码子前插入登革病毒包膜E蛋白III区简并序列，在同源敲入右臂前插入氯霉素抗性编码序列，构建“同源敲入左臂-简并EDIII-氯霉素抗性序列-同源敲入右臂”线性基因敲入片段，构建pYT3敲入载体；

5）将步骤4）构建的pYT3敲入载体电转化到金黄色葡萄球菌RN4220Δagr的感受态细胞，并诱导其发生同源重组，经四环素负性、氯霉素正性筛选，DNA测序鉴定，即得到所述金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述agr基因的序列如SEQ ID NO：1所示，线性基因敲除左、右臂的序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）中，金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位的编码基因pdhB的序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）中，所述线性基因敲入左、右臂的序列分别如SEQ ID NO：8和9所示；登革病毒包膜E蛋白III区简并序列如SEQ ID NO：2所示；氯霉素抗性编码序列的序列如SEQ ID NO：4所示。

6.一种含登革病毒包膜E蛋白III区简并序列重组蛋白的细菌膜泡，其由权利要求1所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株发酵产生。

7.一种制备权利要求6所述的细菌膜泡的方法，其特征在于，包含步骤：

1）菌种准备：将权利要求1所述的金黄色葡萄球菌RN4220Δagr/EDⅢ(+)突变株接种于含氯霉素的TSB平板，经培养，挑取单个菌落扩大培养后作为种子菌；

2）发酵：将所述种子菌转种于相应的发酵瓶或发酵罐中，发酵后收集发酵上清；

3）过滤：过滤所述上清，收集过滤液再用100kDa超滤器过滤处理，收集滤过液；

4）离心：离心所述滤过液，收集沉淀；

5）梯度离心：用PBS缓冲液悬浮所述沉淀，离心后，收集10%-40%梯度界面的悬浮带，即为细菌膜泡。

8.权利要求6所述的细菌膜泡在制备预防或治疗登革病毒感染性疾病制剂中的应用。

9.根据权利要求8中的应用，其特征在于，所述制剂为疫苗。

10.一种登革热膜泡疫苗，其由权利要求6所述的细菌膜泡免疫小鼠制备而成。

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