CN103059139B

CN103059139B - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)疫苗重组蛋白抗原i12c及制备方法和应用

Info

Publication number: CN103059139B
Application number: CN201210375013.8A
Authority: CN
Inventors: 曾浩; 邹全明; 冯强; 樊绍文; 卢陆; 蔡昌芝; 吴翼; 顾江; 章金勇
Original assignee: CHONGQING YUANLUN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd; Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN103059139A

Abstract

本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白I₁₂C的制备方法和应用，该融合蛋白由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段与ClfA抗原分子的一个活性片段组成，各片段通过连接肽融合。该融合蛋白纯度高，表达量高，便于分离纯化，高效安全，其制备方法简捷、容易放大、重复性好，所述融合蛋白辅以铝佐剂后，可制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，通过动物试验验证，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好抗MRSA感染的免疫保护作用。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原I12C及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，特别涉及一种用于人的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原I₁₂C及制备方法和应用。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌指的是对恶唑类青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，是一种存在人和动物的体表、鼻咽、会阴部及肠道的革兰阳性菌,通常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。自1961年被英国学者Jevons首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，变异性大，且呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”，这一特点使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。

在国外，2005年美国的MRSA感染监控资料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。在国内，2010年中国CHINET细菌耐药性检测网结果显示，国内主要地区14所教学医院，MRSA平均检出率为51.7%，最高为77.6%；2008年中国CHINET细菌耐药性监结果显示，国内主要地区12所教学医院MRSA平均检出率为55.9%，最高为77.5%，属于MRSA感染的严重国家之一。以上海为例，2004年该地区14所医院金黄色葡萄球菌中MRSA的平均检出率为63.9%，最高为86.5%，而2006年MRSA的平均检出率为64.6%，最高达92.5%。由此可见，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。

目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美国研发的MRSA疫苗已进入Ⅲ期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。

由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA、IsdB、肠毒素、TSST-1、α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA一个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。ClfA是一种调节金葡菌与纤维蛋白素的结合，促进金葡菌同生物材料表面﹑血块﹑血小板﹑内皮表面结合的黏附素。在金葡菌与血小板的结合中ClfA也起着重要的作用，在导管诱导所致金葡菌心内膜炎的动物模型中，其相互作用也很关键。

ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。本研究利用生物信息技术筛选出ClfA和IsdB的活性功能片段，并将活性功能片段组合起来，目前尚未见使用ClfA、IsdB选择两个亚单位的活性功能片段的融合蛋白作为免疫原性材料，制备MRSA双价疫苗的报道。

发明内容

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性的问题，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组融合蛋白I₁₂C，该融合蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全。

本发明所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组融合蛋白I₁₂C，由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段与ClfA抗原分子的一个活性片段组成，各片段通过连接肽融合。

所述重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述连接肽为Linker，该连接肽的氨基酸序列结构-(GGGGS)n，其中较好的技术方案是n为1。

活性片段IsdB1的氨基酸如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；活性片段IsdB2的氨基酸如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述的Clfa,的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

上述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

1）构建融合基因（并加入Linker）使用的引物如下：

2）使用步骤1）设计的引物P1及P2，通过PCR扩增出编码I₁₂-Linker-的基因片段；使用P3及P4，扩增出编码-Linker-ClfA_97-639的基因片段；再以扩增出的基因片段为模板，用引物P1及P4扩增出编码I₁₂C的基因片段；

3）将步骤2）所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；

4）诱导转化后的宿主菌表达I₁₂C重组蛋白。

表达重组蛋白I₁₂C的表达载体，其包含编码权利要求1所述重组蛋白的核酸序列。

所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体及pQE系列载体，优选为pGex-6P-2。

表达上述表达载体的宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XL1-blue。

鉴于IsdB蛋白为跨膜蛋白，其胞外区对应151~277氨基酸序列和338~466氨基酸序列两个结构功能域在捕获血红蛋白发挥主要作用，同时选取ClfA跨膜蛋白的一个活性功能片段，其胞外区对应33~213氨基酸序列。本发明设计将IsdB的第151~277氨基酸对应的核酸序列IsdB_451–831和第338~466氨基酸对应的核酸序列IsdB_1042–1398中间加上Linker并进行全基因合成，以及ClfA的第33~213氨基酸对应的核酸序列ClfA_97–639分别PCR扩增出来，并用Linker连接组成以表达融合蛋白I₁₂C（IsdB_451-831IsdB_1042-1398ClfA_97-639）。

本发明优选采用pGEX-6p-2载体来构建重组表达载体，表达I₁₂C重组蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

本发明还提供一种重组蛋白I₁₂C在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

本发明还提供一种重组蛋白I₁₂C在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段与ClfA的一个活性片段重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的双价亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。

本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分I₁₂C蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。I₁₂C重组蛋白可以直接与佐剂（如Al(OH)₃佐剂、MF59、AlS0₃、AlS0₄、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等）配合使用，适用于注射免疫接种。

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点：

1）I₁₂C重组蛋白表达质粒在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达；

2）选择pGEX载体系列时，I₁₂C重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；表达率约为30%，纯化出来的I₁₂C重组蛋白纯度大于95%；

3）I₁₂C重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。

利用本发明I₁₂C重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

图1基因片段的PCR扩增结果，其中

泳道M：核酸(DNA)分子量标准（Marker）；

泳道1：ClfA_97-639基因片段(543bp)PCR产物。

泳道3：全基因合成片段I₁₂（758bp）产物。

泳道2：目的基因片段I₁₂C(IsdB_451-831 Linker IsdB_1042-1398 Linker ClfA_97-639) （1311bp）

图2为表达载体pGEX-6p-2-I₁₂C的酶切鉴定结果：

泳道M：核酸(DNA)分子量标准（Marker）；

泳道1-3：重组表达质粒pGEX-6p-2-I₁₂C经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段4000bp和1311bp；

图3表示重组表达载体在16℃过夜诱导表达后，获得含GST标签的融合蛋白及GST标签的融合蛋白酶切结果，其中

泳道M：蛋白分子量标准（Marker）；

泳道1：酶切前，含有GST标签的融合蛋白；

泳道2：酶切后，在上清获取的目的蛋白；

泳道3：酶切后，第一次洗涤用于结合表达蛋白的Glutathione Sepharose4B凝胶柱（beads）获取的目的蛋白；

泳道4：酶切后，第二次洗涤beads获取的目的蛋白；

泳道5：酶切后，非特异性结合在beads的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。

图4是重组表达载体测序后与I₁₂C的核酸序列对比结果。

具体实施方式

本发明所使用的菌株与各种试剂如下：

1.菌株、质粒

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；

菌株XL-1blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品；

质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品;

质粒pET-22b为美国merck公司产品；

2.试剂

primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和 Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；

T4DNA Ligase为Fermentas公司产品;

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose4B为美国GE Healthcare公司产品。

3.实验动物

SPF级4~6周龄，雌性BALB/C小鼠，购自北京华阜康公司。

实施例1：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB两个活性片段与ClfA一个活性片段融合表达载体的克隆

1.-80℃冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。

2.采用PCR方法自合成模板I₁₂扩增I₁₂-Linker-基因片段，扩增步骤如下：

1）设计PCR引物P1及P2。

2）用合成模板I₁₂PCR扩增ClfA_97-639基因片段。

3）PCR体系：

模板(50ng/μl)	2.5μl
		P1(50μM)	1μl
P2(50μM)	1μl

Taq酶	2.5μl
		dNTP	2μl
Buffer	15μl
		灭菌双蒸水	26μl
总体积	50μl

PCR扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性20s，68℃退火40s，72℃延伸2.5min，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。

4）使用凝胶回收试剂盒回收I₁₂-Linker-PCR产物。

3.采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增-Linker-ClfA_97–639基因片段，扩增步骤如下：

1）设计PCR引物P3及P4。

2）以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增ClfA_97–639基因片段。

3）PCR体系：

模板(100ng/μl)	2.5μl
		P3(50μM)	1μl
P4(50μM)	1μl
		Taq酶	2.5μl
dNTP	2μl
		Buffer	15μl
灭菌双蒸水	26μl

总体积

50μl

4）使用凝胶回收试剂盒回收-Linker-ClfA_97-639PCR产物。

4.采用重叠延生PCR方法，以I₁₂-Linker-及-Linker-ClfA_97-639为模板，重叠延生PCR方法扩增出I₁₂C基因片段。

1）PCR体系：

模板1I₁₂-Linker-（50ng/μl）	1μl
		模板2)-Linker-ClfA_97-639（50ng/μl）	1μl
P1(50μM)	1μl
		P4(50μM)	1μl
Taq酶	2.5μl
		dNTP	2μl
Buffer	15μl
		灭菌双蒸水	26μl
总体积	50μl

2)PCR扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性20s，65℃退火40s，72℃延伸1min40s，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增I₁₂C结果示于图1中。

3)使用凝胶回收试剂盒回收I₁₂C基因PCR产物。

5.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：

1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和I₁₂C PCR产物

酶切反应体系：

BamH I

3μl

Not I	3μl
		10×K Buffer	3μl
0.1%BSA	6μl
		Product	45μl
总体积	60μl

37℃酶切4h。

2）使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。

3）连接和转化

通过紫外分光光度计测定I₁₂C酶切回收产物核酸浓度：34ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2~10，设计以下连接反应体系。

连接反应体系：

T4 DNA Ligase	0.5μl
		T4DNA Ligase Buffer	1μl
I₁₂C酶切回收产物	8.2μl
		PGEX-6P-2酶切回收产物	0.3μl
总体积	10μl

混匀，16℃连接1.5h。

4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取150μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

5）pGEX-6p-2/I₁₂C阳性重组质粒的筛选、鉴定

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；

双酶切反应体系：

BamH I	0.5μl
		Not I	0.5μl
10×K Buffer	0.5μl
		0.1%BSA	1μl
重组质粒	8μl
		总体积	12.5μl

37℃酶切2h；

④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道4样品为构建成功的pGEX-6p-2/I₁₂C重组质粒；

⑤pGEX-6p-2/I₁₂C重组质粒送往上海英俊公司测序，测序结果比对结果示于图3，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。

实施例2：I₁₂C多亚单位在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

1.目的蛋白诱导表达

1）取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-I₁₂C/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp抗性的TB培养基中，80rpm37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp抗性的TB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），37℃培养2~3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.6~0.8时，加入IPTG40μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达16℃过夜诱导表达。

2)将诱导表达后的菌液取出，以6000rpm离心15min，弃去上清，加入1mL lysis buffer混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃ 14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。

2.处理上清

取Glutathione Sepharose 4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose4B中，4℃旋转过夜结合（或室温结合1h）。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20ul5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心30s。

3.处理沉淀

在沉淀中加入500μL lysis buffer重悬菌体，取80uL重悬菌液加入20μL 5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心30s。

4.SDS-PAGE电泳，将5%浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入12%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。

5.将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1~2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图3，PGEX-6P-2-I₁₂C/XL-1blue在16℃条件下才能表达出分子量大小约为kDa的含有GST标签的I₁₂C，且重组蛋白均在超声裂解的上清中，因此所述重组蛋白为可溶性蛋白，且16℃下目的蛋白的表达量最高，其纯度达到95%以上。

实施例3：I₁₂C抗原的制备

1.放大培养获取蛋白

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-I₁₂C/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化，200rpm37℃培养5~6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的TB培养基中进行二次活化，37℃培养3~4h至OD600为0.8时，加入80Μl IPTG（终浓度为200uM）置于16℃摇床中过夜诱导后，6000rpm离心15min收集菌体,再加20mL lysis buffer 重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B凝胶珠（beads）结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果示于图4，可见在实施例中目的蛋白获得大量的表达。

2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取I₁₂C目的蛋白

向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入800μL PBS和120μL PreScission protease（PP酶），室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳（方法同上），在呈相系统下观察结果，酶切前GST融合蛋白分子量在90kDa左右，酶切下来的I₁₂C蛋白分子量在55kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图4，其中泳道1表示酶切前，含有GST标签的融合蛋白；泳道2表示酶切后，由于目的蛋白与结合与凝胶珠的GST标签分离，因此在上清获取的目的蛋白；泳道3表示酶切后，第一次洗涤Glutathione Sepharose4B凝胶珠（beads）获取的非特异性结合在beads上的目的蛋白；泳道4表示酶切后，第二次洗涤beads获取的非特异性结合在beads上的目的蛋白；泳道5表示酶切后，非特异性结合在beads上的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。

实施例4：感染用金黄色葡萄球菌菌株（国际标准株MRSA-252）标准定量曲线的建立

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度（OD600），并取各个稀释度的菌液100ul涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。

结果：标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051（10⁹CFU/ml），相关系数为0.9999。

实施例5：脓毒血症动物模型的构建

SPF级BALB/C4~6周龄雌性小鼠120只，分成阳性对照组、实验组、阴性对照组、空白对照组，购于北京华阜康公司。

1．将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释（或浓缩）为2.0×10¹⁰CFU/mL、1.5×10¹⁰CFU/mL、1.25×10¹⁰CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6~8周龄、体重为18~20g的BALB/C小鼠（100μl/只）进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；

2、感染后计时每隔24小时（至感染后7天）采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5~1mL，取20μL血样用180μL肝素稀释10倍后用于细菌计数，取50μL涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取1mL均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。

结果显示于表1：

表1MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定

2.0×10⁹CFU剂量组12小时（h）内小鼠死亡率为100%；1.5×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90%，72h内死亡率为100%；1.25×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为80%，96h内死亡率为小鼠死亡率为90%,120h内死亡率为小鼠死亡率为100%；1.0×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为10%，72h内死亡率为小鼠死亡率为20%,7天（d）内死亡率为小鼠死亡率为70%；由此可见MRSA-252最小致死剂量约为1.25×10⁹CFU，亚致死剂量为1.0~1.25×10⁹CFU。

3．MRSA-252感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：

感染后血液中细菌的在48h时达到峰值，最大定植量达到8.0×10⁹CFU/ml，在72h时血液中细菌量开始减少，到96h时血液中未检测出细菌；感染后脾、肾、肝脏中定植的细菌均在72时达到峰值，最大定植量均达到8.0×10⁹CFU/ml；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为MRSA单个亚单位疫苗和MRSA多亚单位融合疫苗的成功研制及MRSA感染的发病机制的研究奠定了基础。

实施例6：免疫动物及抗体的检测

SPF级BALB/C4~6周龄雌性小鼠80只，分成阳性对照组、实验组、阴性对照组、空白对照组，购于北京华阜康公司。

1）首次免疫，用PBS稀释I₁₂C蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃，调节I₁₂C蛋白抗原终浓度至0.4mg/mL；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100uL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；

3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；

2．第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2_a体液应答水平。

1）制备液体

①包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，用 PH计将pH调至9.6；

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween20，再用PH计将pH调至7.4；

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween20，再用PH计将pH调至7.4；

⑤显色液（TMB），为天根公司产品；

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2）ELISA检测I₁₂C重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

①用包被液将纯化后的IsdB2重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200uL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

③封闭：酶标板加封闭液100uL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

④将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100uL/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑦加入稀释抗体工作液，100uL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

⑧加入底物显色液（TMB）100uL/孔，室温避光反应5min；

⑨加入终止液（2M H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑩结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。

结果：检测I₁₂C蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:256000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90%，免疫后第7天的抗体阳性率达到95%；说明本发明构建的I₁₂C多亚单位重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例7：通过免疫小鼠确定I₁₂C重组蛋白免疫动物的攻毒保护

同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

表2

表2显示：为动物免疫试验结果，表中结果显示阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为45.0%、15.0%和5.0%，I₁₂C融合蛋白加Al(OH)₃佐剂组的免疫保护性为85.0%。

因此，本发明的重组蛋白I₁₂C具有良好的免疫原性，并且能够对MRSA-252感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染金黄色葡萄菌、确定预后等。

本领域技术人员可以将本发明重组蛋白I₁₂C用于其他任何适用的用途，如I₁₂C用于金黄色葡萄球菌的预防性和治疗性疫苗的研发，以及I₁₂C在金黄色葡萄球菌感染检测试剂盒的制备及应用等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在

本发明权利要求的保护范围当中。

Claims

1.一种重组融合蛋白I₁₂C，其特征在于：该融合蛋白由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段IsdB1、IsdB2与ClfA抗原分子的一个活性片段组成，各片段通过连接肽融合，所述重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I₁₂C，其特征在于，所述连接肽为Linker，该连接肽的氨基酸序列结构-(GGGGS)n，n为1。

3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I₁₂C，其特征在于：活性片段IsdB1的核苷酸如SEQ ID NO:3所示；活性片段IsdB2的核苷酸如SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I₁₂C，其特征在于：所述的Clfa的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

5.权利要求1-4任一所述的重组融合蛋白I₁₂C的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建融合基因使用的引物如下：

P1：5’-GCGGATCCATGGGCAGCGCACCAAACTCTCG-3’

I₁₂-Linker-

P2：5’-GCTTCTTTACTGCTGCTGCCACCGCCACCGGCATTGGCTTTAGTAAA-3’

P3：5’-GCCAATGCCGGTGGCGGTGGCAGCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCA-3’

-Linker-ClfA_97–639

P4：5’-ATGCGGCCGCTTATCACTCGAGCATACGAGGCGCAC-3’

2）使用步骤1）设计的引物P1及P2，通过PCR扩增出编码I₁₂-Linker-的基因片段；使用P3及P4，扩增出编码-Linker-ClfA_97–639的基因片段；再以扩增出的基因片段为模板，用引物P1及P4扩增出编码I₁₂C的基因片段；

3）将步骤2）所获得的基因片段克隆至表达重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；

4）诱导转化后的宿主菌表达I₁₂C重组蛋白；

5）纯化重组蛋白。

6.一种表达载体，其特征在于：包含编码权利要求1所述重组蛋白的核酸序列。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体及pQE系列载体。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex-6P-2。

9.一种表达如权利要求7或8所述表达载体的宿主菌。

10.如权利要求9所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列。

11.权利要求10所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue。

12.权利要求1所述的重组融合蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

13.权利要求1所述的重组融合蛋白的抗体在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。