CN103012568B - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白FnbA1及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原FnbA1及制备方法和应用。本发明还公开了构建所述重组蛋白的表达载体、转化宿主菌而制备该重组蛋白的方法以及所述重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及相关检测试剂盒中的用途。本发明采用上述方法制备的重组蛋白，便于分离纯化而且高效安全，表达量高。动物试验证明制备的重组蛋白可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白FnbA1及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBA1重组蛋白，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。 

背景技术

抗药性金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus或Multiple-resistant Staphylococcus aureus，简称MRSA）是金黄色葡萄球菌的一个独特菌株，能抵抗所有青霉素，包括甲氧西林及其他抗β内醘胺酶的青霉素。MRSA首次发现于1961年的英国，现时已广泛散播，在医院中它更被称为“超级细菌”。 

目前MRSA已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。2005年美国的MRSA感染监控資料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。2010年CHINET耐药监测结果显示：MRSA检出率较高，在金黄色葡萄球菌中，其平均检出率为51.7%。因其传播途径广泛，易暴发流行；又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。 

目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。美国研发的MRSA疫苗已进入Ⅲ期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、 生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。 

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。 

金黄色葡萄球菌表面的粘附素是一类能够介导细菌粘附与寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白，其中纤连蛋白结合蛋白A是重要的粘附素之一，能够介导金黄色葡萄球菌结合与细胞表面的纤连蛋白，使细菌黏附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤连蛋白特异性的结合。 

发明内容

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBA1重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。 

鉴于FnBA蛋白为两次跨膜蛋白，其胞外区对应28-943的氨基酸序列，并且其粘附主要由胞外区的蛋白质发挥作用，为了在最大限度上保持FnBA的结构和功能不发生较大的变化，本发明为将FnBA（其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示）截短后进行克隆、表达和保护性免疫的评价，将FnBA截短后的片段命名为FnBA1（其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示）。 

本发明还提供一种用于表达FnBA1重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述FnBA1重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。 

本发明优选采用pGEX-6p-2载体来构建重组表达载体，表达FnBA1重组蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。 

因此，本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。 

本发明还提供一种表达FnBA1重组蛋白的方法，其包含以下步骤：1）设计下身引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA蛋白活性片段的核酸序列；2）使用步骤1）所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；以及4）纯化重组蛋白。 

本发明设计的正向引物和反向引物的优选核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。 

所使用的宿主菌优选大肠杆菌XL1 bule。 

本发明还提供一种FnBA1重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。 

本发明还提供一种FnBA1重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。 

本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分FnBA1蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。FnBA1重组蛋白可以直接与佐剂（如Al(OH)₃佐剂、MF59、AlS0₃、AlS0₄、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等）配合使用，适用于注射免疫接种。 

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点：1）FnBA1重组蛋白表达质粒在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达；2）选择pGEX载体系列时，FnBA1重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的FnBA1重组蛋白纯度大于95%；3）FnBA1重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。 

利用本发明FnBA1重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。 为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。 

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

附图说明

图1是FnBA1基因片段的PCR扩增结果，其中 

泳道1：核酸(DNA)分子量标准（Marker）； 

泳道2：目的基因片段FnBA1(1419bp)。 

图2为表达载体pGEX-6p-2-FnBA1（1419bp）的酶切鉴定结果： 

泳道1：核酸(DNA)分子量标准（Marker）； 

泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-FnBA1经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段4800bp和1419bp； 

图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果： 

泳道10：蛋白分子量标准（Marker）； 

泳道1、3、5：表达载体分别在16℃、25℃、30℃下诱导表达后，在上清中获得的蛋白； 

泳道2、4、6：表达载体分别在16℃、25℃、30℃下诱导表达后，在沉淀中获得的蛋白。 

图4表示含GST标签的融合蛋白酶切结果 

泳道1：蛋白分子量标准（Marker）； 

泳道2：酶切前，含有GST标签的融合蛋白； 

泳道3：酶切后，在上清获取的目的蛋白； 

泳道4：酶切后，洗涤用于结合表达蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶柱（beads）获取的目的蛋白； 

泳道5：酶切后，非特异性结合在beads的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。 

图5是利用在线生物信息软件对FnBA蛋白跨膜区预测结果图。 

图6重组表达载体测序后与FnBA1的核酸序列对比结果。 

具体实施方式

本发明所使用的菌株与各种试剂如下： 

1.菌株 

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供； 

2.试剂 

质粒pGEX-6p-2、大肠杆菌菌株XL-1blue为申请人教研室保存， 

prime STAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品； 

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品； 

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品； 

T4 DNA Ligase为Fermentas公司产品; 

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。 

实施例1：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBA1活性片段的克隆 

1.首先根据MRSA-252 FnBA蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的FnBA1目的基因片段。 

2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增FnBA1目的基因片段，扩增步骤如下： 

1）设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO：5-6（下划线示酶切位点碱基序列） 

FnBA1-F：SEQ ID NO：5 

5′-CGCGGATCCATG GGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3′ 

BamH Ⅰ 

FnBA1-R：SEQ ID NO：6 

5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAT CCATTATCCCATGTTAATGTAT-3′ 

Not Ⅰ 

2）-80℃冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。 

3）以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增FnBA1基因片段 

PCR体系： 

PCR扩增反应条件98℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。 

4）使用凝胶回收试剂盒回收FnBA1 PCR产物。 

3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下： 

1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和FnBA1 PCR产物酶切反应体系： 

37℃酶切2h。 

2）使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。 

3）连接和转化 

通过紫外分光光度计测定FnBA1酶切回收产物核酸浓度：21ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl。 

连接反应体系： 

混匀，16℃连接2h。 

4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2 质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。 

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。 

5）pGEX-6p-2/FnBA1阳性重组质粒的筛选、鉴定 

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行； 

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切； 

双酶切反应体系： 

37℃酶切2h； 

④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-2/FnBA1重组质粒； 

⑤pGEX-6p-2/FnBA1重组质粒送往上海英俊公司测序，测序结果比对结果示于图6，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。 

实施例2：MRSA-252 FnBA亚单位活性片段FnBA1在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定 

1.目的蛋白诱导表达 

1）取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp抗性的TB培养基中，80rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mL Amp抗性的TB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），37℃培养2~3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG 4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃ 3h，25℃ 5h，16℃过夜诱导表达。 

2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mLlysis buffer混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃ 14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。 

2.处理上清 

取Glutathione Sepharose 4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20ul 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。 

3.处理沉淀 

在沉淀中加入500μL lysis buffer重悬菌体，取80uL重悬菌液加入20μL 5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。 

4.SDS-PAGE电泳，将5%浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。 

5.将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1~2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图3，PGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue在16℃、25℃、30℃均为可溶性蛋白，且无明显差异。 

实施例3：FnBA1抗原的制备 

1.放大培养获取蛋白 

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue菌液400μL加入到 20mL含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5~6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的TB培养基中进行二次活化，37℃培养3~4h至OD600为1.0时，加入80ul IPTG（终浓度为200uM）置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加20mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶珠（beads）结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。 

2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取FnBA1目的蛋白 

向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μL PBS和120μL PreScission protease（PP酶），室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳（方法同上），在呈相系统下观察结果，酶切前GST融合蛋白分子量在96kDa左右，酶切下来的FnBA1蛋白分子量在72kDa-95kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图4，其中泳道1表示酶切前，含有GST标签的融合蛋白；泳道2表示酶切后，由于目的蛋白与结合与凝胶珠的GST标签分离，因此在上清获取的目的蛋白；泳道3表示酶切后，洗涤Glutathione Sepharose 4B凝胶珠（beads）获取的非特异性结合在beads上的目的蛋白；泳道4表示酶切后，非特异性结合在beads上的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。 

3.BCA法测定蛋白含量，最高浓度为1.7mg/mL。 

实施例4：感染用金黄色葡萄球菌菌株（国际标准株MRSA-252）标准定量曲线的建立 

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度（OD600），并取各个稀释度的菌液100ul涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。 

结果：标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051（10⁹CFU/ml），相关系数为 0.9999。 

实施例5：脓毒血症动物模型的构建 

1.将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释（或浓缩）为2.0×10¹⁰CFU/mL、1.5×10¹⁰CFU/mL、1.25×10¹⁰CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6~8周龄、体重为18~20g的BALB/C小鼠（100μl/只）进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率。 

2.感染后计时每隔24小时（至感染后7天）采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5~1mL，取20μL血样用180μL肝素稀释10倍后用于细菌计数，取50μL涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取1mL均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。 

结果显示于表1： 

表1 MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定 

2.0×10⁹CFU剂量组12小时（h）内小鼠死亡率为100%；1.5×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90%，72h内死亡率为100%；1.25×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为80%，96h内死亡率为小鼠死亡率为90%,120h内死亡率为小鼠 死亡率为100%；1.0×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为10%，72h内死亡率为小鼠死亡率为20%,7天（d）内死亡率为小鼠死亡率为70%；由此可见MRSA-252最小致死剂量约为1.25×10⁹CFU，亚致死剂量为1.0~1.25×10⁹CFU。 

3．MRSA-252感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量： 

感染后血液中细菌的在48h时达到峰值，最大定植量达到8.0×10⁹CFU/ml，在72h时血液中细菌量开始减少，到96h时血液中未检测出细菌；感染后脾、肾、肝脏中定植的细菌均在72时达到峰值，最大定植量均达到8.0×10⁹CFU/ml；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。 

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为MRSA单个亚单位疫苗和MRSA多亚单位融合疫苗的成功研制及MRSA感染的发病机制的研究奠定了基础。 

实施例6：免疫动物及抗体的检测 

1.免疫动物 

1）首次免疫，用PBS稀释FnBA1蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100uL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组； 

2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上； 

3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上； 

2.第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2_a体液应答水平。 

1）制备液体 

①包被液的配制：称取NaHCO₃ 1.6g，Na₂CO₃ 2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6； 

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)； 

③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween 20， 再用PH计将pH调至7.4； 

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4； 

⑤显色液（TMB），为天根公司产品； 

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。 

2）ELISA检测FnBA1重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价 

①用包被液将纯化后的FnBA1重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL； 

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200uL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用； 

③封闭：酶标板加封闭液100uL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍； 

④将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释； 

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100uL/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干； 

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液； 

⑦加入稀释抗体工作液，100uL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干； 

⑧加入底物显色液（TMB）100uL/孔，室温避光反应5min； 

⑨加入终止液（2M H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值； 

⑩结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。 

结果：检测FnBA1蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:512000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90%，说明本发明构建的FnBA亚单位活性片段FnBA1重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。 

实施例7：通过免疫小鼠确定FnBA重组蛋白免疫动物的攻毒保护 

同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。 

表2 

表2显示：阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为15%和20%，FnBA活性功能片段FnBA1加Al(OH)₃佐剂组的平均免疫保护率为75%。因此，本发明的FnBA活性功能片段FnBA1重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对MRSA-252感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。 

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染金黄色葡萄菌、确定预后等。 

本领域技术人员可以将本发明FnBA1重组蛋白用于其他任何适用的用途。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。 

Claims (10)

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌FnBA蛋白活性片段的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核酸序列如SEQ ID NO:1所示，制备重组蛋白包括以下步骤：

1）设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA蛋白活性片段的重组蛋白的核酸序列；

2）将步骤1）所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌； 

3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；

4）纯化重组蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

3. 一种表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1中所述重组蛋白的核酸序列。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex-6P-2。

6. 一种包含如权利要求3或4所述表达载体的宿主菌。

7.如权利要求6所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列。

8.如权利要求7所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue。

9.权利要求1中所述的重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

10. 权利要求1中所述的重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。