CN106177932A

CN106177932A - 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗

Info

Publication number: CN106177932A
Application number: CN201610532788.XA
Authority: CN
Inventors: 查文娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-07-03
Filing date: 2016-07-03
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗及制备方法和应用。本发明还公开了用于疫苗的增效蛋白，以及构建所述重组蛋白的表达载体、转化宿主菌而制备该重组蛋白的方法以及所述重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗的用途。本发明的疫苗免疫原性高，抗体滴度大，制备简单，成本低廉，副作用小。

Description

一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及用于人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染免疫和治疗的疫苗及其制备方法。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20％，自1961年被首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。2005年美国的MRSA感染监控资料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为I.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。中国CHINET 2005年度的调查结果，各大医院MRSA的检出率平均为69％。因其传播途径广泛，易暴发流行；又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。

目前，万古霉素是治疗MRSA的最后一道防线，但1997以来年耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。因此，研发一种有效的疫苗可能是预防和控制MRSA感染及其耐药性发展有效途径。

但是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程单独IsdB亚单位疫苗已进入II期临床试验阶段。与此同时，多亚单位融合蛋白疫苗也越来越受到人们的关注。Ruggiero等认为在细菌感染过程中，由于宿主和致病菌之间有着复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生完全有效的保护作用，在MRSA单个保护性抗原疫苗研究基础上，构建的多亚单位疫苗具有MRSA多个抗原组分，能够激发机体产生比单一亚单位成分更强的免疫反应，抗原成分相对于全菌疫苗更为简单，能够减少机体变态反应的发生。

细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。新近研究证明，在MRSA所有致病作用因子中，ClfA是MRSA非常重要的外膜蛋白，在MRSA感染的第一步粘附定植中起重要作用。针对ClfA单克隆抗体用于被动免疫接种的疫苗已完成II期临床试验。IsdB不仅是MRSA一个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。以IsdB为组分的基因工程疫苗正在进行II期临床试验。

肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是超抗原外毒素,通常由致病性金葡菌特别是MRSA产生。SE可通过促使多数T细胞释放大量细胞因子而产生生物学效应，引起毒素休克综合征等临床症状。目前SE有SEA、SEB、SEC、SED和SEE等5个血清型，其中SEC又可分为SEC1，SEC2和SEC3三个亚型。MRSA常为C、D型肠毒素。有学者构建无毒的缺乏超抗原活性的突变体(mSEC)注射免疫小鼠，疫苗诱导了保护性Th2反应，并能抵抗MRSA的攻击。说明无毒无超抗原特性的mSEC可以作为MRSA的疫苗候选抗原分子。ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。

金黄色葡萄球菌表面的粘附素是一类能够介导细菌粘附与寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白，其中纤连蛋白结合蛋白A是重要的粘附素之一，能够介导金黄色葡萄球菌结合与细胞表面的纤连蛋白，使细菌黏附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤连蛋白特异性的结合。

CN 103012568A种公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白FnbA1，该蛋白具有具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果，但是其免疫原性和产生抗体的滴度方面还有待提高。因此，开发一种具有更高免疫原性和产生抗体滴度的疫苗是本领域一直的追求。

发明内容

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的疫苗。

本发明另外一个技术方案为，一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的疫苗，其特征在于，该疫苗为增效蛋白通过连接子与SEQ ID NO：20的氨基酸序列连接后获得。

本发明另外一个技术方案提供一种增效蛋白，其序列为SEQ ID NO：1-18任一所示的氨基酸序列。

本发明另外一个技术方案提供一种增效蛋白的获得方法，

增效蛋白的获得：以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表面抗原为筛选分子，利用印迹免疫筛选的方法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌cDNA表达库进行筛选，得到18株阳性的cDNA克隆。对该cDNA进行测序分析，结果显示该cDNA具有独立的开放阅读框架(ORF)，所述氨基酸序列如SEQ ID No：1-18任一所示。进一歩的实验证明其编码的蛋白确实对乙肝表面抗原有特异性。

本发明另外提供一种连接子，所述连接子进一步优选地，所述连接子具有如GGGGS所示的氨基酸序列。

作为优选，所述连接子由4-8个、优选4-6个、更优选5个氨基酸构成；

所述连接子能够使表达得到的融合蛋白增效蛋白和抗原蛋白的功能保持完整。

本发明还提供一种用于表达所述疫苗重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述重组蛋白的核苷酸序列及载体序列。

本发明优选采用pGEX-6P-2载体来构建重组表达载体，表达重组蛋白，pGEX是由Smith和化hnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷脫甘肤-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

因此，本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。

本发明还提供一种表达重组蛋白的方法，其包含以下步骤；1)基因合成所述SEQID NO：19的核酸序列以及含有SEQ ID No：1-18任一序列与(GGGS)5对应的核苷酸序列连接后的核酸序列；2)扩增步骤一的二个片段，并连接，随后克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；以及4)纯化重组蛋白。

本发明还提供一种重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

本发明采用基因工程技术克隆表达重组蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。重组蛋白可以直接与佐剂(如Al(OH)3佐剂、MF59、ais〇3、ais〇4、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。

利用本发明重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点；1)蛋白表达量高，免疫原性高，抗体滴度大。2)制备简单，成本低廉，副作用小。

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1增效蛋白的获得

以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表面抗原为筛选分子，利用印迹免疫筛选的方法对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌cDNA表达库进行筛选(所述文库的构建方法采用金黄色葡萄球菌N315T7噬菌体cDNA展示文库的构建，于俊媛等)，得到18株阳性的cDNA克隆。对该cDNA进行测序分析，结果显示该cDNA具有独立的开放阅读框架(ORF)，所述氨基酸序列如SEQ IDNo：1-18任一所示。

实施例2重组蛋白的表达

1)基因合成所述SEQ ID NO：19的核酸序列以及含有SEQ ID No：1序列与(GGGS)5对应的核苷酸序列连接后的核酸序列；

2)扩增步骤一的二个片段，并连接，随后克隆至表达载体pGEX-6P-2载体；

3)采用常规方法将所述的载体转化

采用本领域常规的方法构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌大肠杆菌XL1-blue；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；以及采用常规的方法纯化所述的重组蛋白，使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，蛋白命名为ZX1蛋白。

SEQ ID No：2～18分别按照实施例2的方法分别通过连接子与SEQ ID NO：19构建融合蛋白，并采用相同的表达菌株进行表达，并纯化所述的蛋白，使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开。蛋白命名为ZX2～18蛋白。

以SEQ ID NO：20蛋白本身表达的蛋白作为对照，不含有SEQ ID No：1-18任一所述的增强蛋白。

实施例3效果验证

1.免疫效果评价

1)首次免疫，用PBS稀释2mg重组蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为lOOuL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2,免疫途径同上；

3)第H次免疫，第21天进行第H次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；

在第14天采用致死剂量，尾静脉注射国标菌株MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25*10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。

表1显示；阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为15％和17.5％，添加了增强蛋白的重组蛋白加Al(OH)3佐剂组的平均免疫保护率为100％。而不添加增强蛋白的疫苗组的免疫保护率为72.5％，比不添加增强蛋白的重组蛋白的效果要差很多。因此，本发明的添加了增强蛋白的重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对MRSA-252感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可作为疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。

2、抗体效价评价

将上述免疫保护后剩余的小鼠分别取小鼠的尾血，用ELISA检测抗体效价，通过检测发现阴性对照组、空白对照组、SEQ ID NO：20蛋白本身组、ZX1蛋白组对应的效果比例分别为1.2:1.3:6.0:9.3，ZX2～18蛋白组的抗体效价与ZX1蛋白效价相似。由此可见，ZX1～18蛋白具有较好的免疫效果，能够较好的产生抗体。

3、安全性评价

将ZX1～18蛋白免疫后的小鼠在攻毒实验结束后，继续培养1月，进行解剖，发现小鼠各个器官正常，没有任何变异。这充分的说明，本发明的疫苗安全可靠。

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染金黄色葡萄菌、确定预后等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

序列表

〈110〉查文娟

〈120〉一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗

〈210〉1

〈211〉18

〈212〉PRT

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〈210〉19

<211> 1419

<212> DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>基因序列

atgggacaag ataaagaagc tgcagcatca gaacaaaaga caactacagt agaagaaaat

gggaattcag ctactgataa taaagtaagc gaaacacaaa caactacaac taacgttaat

actatagatg aaacacaatc atacagcgca acagcaacag aacaaccgtc aaacgcaaca

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〈210〉20

<211> 472

<212> PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>蛋白质序列

1 MGQDKEAAAS EQKTTTVEEN

21 GNSATDNKVS ETQTTTTNVN

41 TIDETQSYSA TATEQPSNAT

61 QVTTEEAPKA VQAPQTAQPA

81 NVETVKEEVV KEEANPQVKE

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121 ATQNQVAETQ VEVAQPRTAL

141 ESKPRVTRST DVAEAKEASD

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221 NNVNTHGVAT TRKVPDIKNG

241 SLVMAKGQVL DNGRIRYTFT

261 DYIKDKVNVT ANLEINLFID

281 PKTVQSNGQQ TITSKLNGKE

301 TSGTMQITYK DGVKNQYTNV

321 NGSIETFDKE KNKFTHVAYI

341 KPINGNNSDS VTVTGMLTQG

361 SNENGTQPNV KIYEYVGVEN

381 GLPQSVYANT VDSTQLKDVT

401 NQMGDKLKVQ NNGSYSLNFD

421 KLDKTYVIHY TGDYLNGTSE

441 VNFRTQLTGY PENRYKTYYY

461 YNNGYTLTWD NG*

Claims

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗，其含有抗原蛋白与佐剂。

2.如权利要求1所述的疫苗，其中抗原蛋白为SEQ ID NO：20的序列通过连接子序列与SEQ ID No：1连接后制得。

3. 如权利要求1所述的疫苗，其中抗原蛋白为SEQ ID NO：20的序列通过连接子序列与SEQ ID No：2连接后制得。

4. 如权利要求1所述的疫苗，其中抗原蛋白为SEQ ID NO：20的序列通过连接子序列与SEQ ID No：3-18连接后制得。

5. 如权利要求1-4任一所述的疫苗，其中连接子为GGGSGGGSGGGS GGGSGGGS。