CN103957931B - 艰难梭状芽胞杆菌毒素a和毒素b蛋白的分离多肽及其用途 - Google Patents

艰难梭状芽胞杆菌毒素a和毒素b蛋白的分离多肽及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列中所示的艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)毒素A和毒素B的受体结合结构域的C‑TAB.G5和C‑TAB.G5.1分离多肽。所述C‑TAB.G5和C‑TAB.G5.1分离多肽可用于中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和/或毒素B的毒性作用。

Description

艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B蛋白的分离多肽及其用途
发明领域
本发明涉及含有艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素A和毒素B的受体结合结构域的分离多肽及其作为疫苗的用途。这种分离多肽提供了对两种毒素的抗毒素免疫。
发明背景
艰难梭状芽胞杆菌是医院抗生素相关性腹泻的主要原因并且已经成为医院、疗养院和其它护理机构的主要健康问题。经估计医院的成本在欧洲为20亿美元，在美国为32亿美元。
病原体为革兰氏阳性、产孢厌氧细菌，在环境中常见但是也存在于2-3%健康成人群体的肠道中。艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)由正常结肠菌群的破坏引起，这通常是施用抗生素的结果。在暴露于环境中的艰难梭状芽胞杆菌孢子后，生物可定植于肠粘膜，在那里致病毒素的生成可导致CDAD。疾病范围可从轻度单纯性腹泻至重度假膜性结肠炎和中毒性巨结肠。
CDAD已经在卫生保健机构中日益变得更成问题。最近研究报道，31%接受抗生素的住院患者变得有艰难梭状芽胞杆菌定植而56%变得有定植的那些患者继续发展CDAD。总的而言，艰难梭状芽胞杆菌是造成所有抗生素相关性腹泻的10-25%，50-75%抗生素相关结肠炎和90-100%抗生素相关假膜性结肠炎的原因。CDAD的治疗牵涉停止病因性抗生素，接着用甲硝哒唑(metronidazole)或万古霉素(vancomycin)治疗。停止抗生素治疗后在约20%的患者中出现复发，往往是艰难梭状芽胞杆菌再定植的结果。
2003年，在加拿大魁北克的艰难梭状芽胞杆菌爆发表明出现了称为北美表现型1/027(NAP1)，毒性更强的艰难梭状芽胞杆菌菌株。已经将NAP1与和先前菌株相比毒力更强、结果不好及发病率和死亡率更高联系起来。这种菌株的出现增加了在试图控制CDAD发生率中已经遇到的问题。
用于预防复发性疾病的非达霉素(Fidaxomicin,)是第一种新类别的窄谱型大环类抗生素药物(Revill,P.；Serradell,N.；Bolos,J.(2006)."Tiacumicin B:macrolide antibiotic treatment of C.difficile-associated diarrhea".Drugs ofthe Future31(6):494–497)。它是从放线菌类(actinomycete)桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)亚种hamdenesis获得的发酵产物。非达霉素为非全身性，意味着其最低程度地吸收到血流中，具有杀菌性，并且已经展示出对病原艰难梭状芽胞杆菌的选择性根除，而对构成正常、健康肠道菌群的多个物种的细菌的破坏最小。在结肠中维持正常生理条件可降低艰难梭状芽胞杆菌感染复发的可能性(Johnson,Stuart(2009-06)."Recurrent Clostridium difficile infection:a review of risk factors,treatments,and outcomes".Journal of Infection58(6):403–410)。尽管认为引入这种新类别的抗生素药物会改善对CDAD的治疗，但是尤其是对高危患者例如老年和免疫低下患者而言，仍存在对预防性药物的医疗需求。
CDAD是艰难梭状芽胞杆菌生成的两种外毒素，毒素A和毒素B(也分别称为CTA和CTB)的作用结果。两种毒素均为具有多个功能结构域的高分子量(～300kDa)分泌蛋白(Voth DE和Ballard JD，Clinical Microbiology Reviews18:247-263(2005))。两种毒素的N末端结构域含有修饰Rho样GTP酶的ADP葡萄糖基转移酶活性。这种修饰导致失去了肌动蛋白聚合和细胞骨架变化，导致结肠上皮紧密连接破坏。这导致过量液体渗入结肠和引起的腹泻。中央结构域含有疏水性结构域并且预测牵涉膜转运。两种毒素的C末端结构域含有称为重复单元(RU)的多个同源区域，其牵涉毒素与靶细胞的结合(Ho等，PNAS102:18373-18378(2005))。重复单元分类为短(21-30个氨基酸)或长(～50个氨基酸)重复单元。重复单元组合形成聚簇，每个通常含一个长重复单元和3-5个短重复单元。全长毒素A具有39个组织成8个聚簇的重复单元(ARU)(Dove等Infect.Immun.58:480-488(1990))，而全长毒素B含24个组织成5个聚簇的重复单元(BRU)(Barroso等，Nucleic Acids Res.18:4004(1990)；Eichel-Streiber等，Gene96:107-113(1992))。
来自动物模型和临床的许多研究已经表明抗毒素抗体在防护艰难梭状芽胞杆菌相关疾病中的作用。经福尔马林(formalin)灭活毒素A和毒素B免疫的仓鼠产生高水平的抗毒素抗体并且受保护免受艰难梭状芽胞杆菌的致死性攻毒(Giannasca PJ和Warny M，Vaccine22:848-856(2004))。另外，被动转运小鼠抗毒素抗体以剂量依赖方式保护仓鼠。Kyne L等(The Lancet357:189-193(2001))报道，CDAD首次发作期间抗毒素A抗体反应的发展与对疾病复发的防护相关。
保护性抗毒素抗体识别的决定簇已经定位于含有起受体结合结构域作用的重复单位的C末端结构域中。最初，Lyerly等(Current Microbiology21:29-32(1990))透露，含33个重复单元的毒素A C末端结构域能够诱导中和抗毒素抗体的生成并且可防止艰难梭状芽胞杆菌感染。在这项研究中，用细菌攻毒之前，仓鼠皮下注射纯化重组多肽多次，然而仅实现部分保护。另一项研究(Ryan等，Infect.Immun.65:2941-49(1997))显示，含有来自CTA的C末端的720个氨基酸残基和大肠杆菌(E.coli)溶血素A(在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中表达)的分泌信号的分离多肽在兔CDAD模型中诱导对小剂量CTA的保护性全身和粘膜免疫。
还有报道称，对毒素A和B的C末端结构域的抗体反应是实现全面保护所必需的(Kink和Williams，Infect.Immun.66:2018-25(1998)，美国专利No.5,736,139(1998))。这项研究揭示，每种毒素的C末端结构域在生成毒素中和抗体中最有效。证明了经口递送的对CTA和CTB的C末端结构域产生的禽类抗体(抗毒素)在仓鼠致死模型中的有效性。结果还表明，抗毒素可能在人类CDAD的治疗和管理中有效。在另一项研究中，报道人抗毒素A和B单克隆抗体赋予了对艰难梭状芽胞杆菌诱导的仓鼠死亡率的防护(Babcock等，Infect.Immun.74:6339-6347(2006))。仅用对抗任一毒素的受体结合结构域的抗体观察到保护并且在用抗毒素A和B抗体治疗后观察到保护增强。
另一方面，Ward等(Infect.Immun.67:5124-32(1999))考虑到来自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的14个重复单元(14CTA)以研究佐剂活性。克隆重复单元并且表达具有N末端多组氨酸标签(14CTA-HIS)或与来自破伤风毒素的无毒结合结构域融合(14CTA-TETC)。鼻内施用的两种融合蛋白产生抗毒素A血清抗体，但是在小鼠的粘膜表面无反应。与大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其突变形式LTR72联合施用后观察到增强的系统性和粘膜抗毒素A反应。根据数据，Ward等建议使用无毒14CTA-TETC融合蛋白作为对抗梭状芽胞杆菌病原体的人类疫苗中的粘膜佐剂。
最近对艰难梭状芽胞杆菌毒素的重复单元结构域的生物化学研究已着眼于形成稳定三级结构的最低序列要求(Demarest SJ等，J.Mol.Bio.346:1197-1206(2005))。发现源自毒素A的11重复单元肽具有正确的三级结构，但是来自毒素A和B的6和7个重复单元不具有正确的三级结构。发现正确折叠的11重复单元区段维持了受体结合性质。第二项研究检查了含有6、11或15个重复单元的毒素A片段的功能性质(Dingle T，Glycobiology18:698-706(2008))。只有所述11和15个重复单元能够竞争性抑制抗毒素A抗体的毒素中和能力。虽然发现3个片段全部具有红血球凝聚活性，但是较长片段展现出比较短片段更高的红血球凝聚活性。数据表明，在含有大于11-14个重复序列的结构域片段中维持了毒素受体结合结构域结构和免疫原性。
Thomas等(WO97/02836，美国专利No.5,919,463(1999))还公开了作为粘膜佐剂的艰难梭状芽胞杆菌毒素A、毒素B及其某些片段(例如，包含一些或全部重复单元的C末端结构域)。他们证实，鼻内施用CTA或CTB显著增强了对多个小鼠腔隙中异种抗原例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、卵清蛋白或钥孔戚血蓝素(KLH)的粘膜免疫反应并且与对螺杆菌(Helicobacter)攻毒的防护相关。另外，评估了毒素A融合蛋白的佐剂活性：包含ARU(毒素A重复单元)的CTA的794个C末端氨基酸残基与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合并且所得多肽GST-ARU在大肠杆菌中表达。这项研究证明在血清和粘膜分泌中，GST-ARU显著增强了对联合施用的抗原的免疫反应。
这些研究全部表明了包含艰难梭状芽胞杆菌毒素A或毒素B或其片段或其组合的无毒、重组蛋白用于生产抗CDAD活性疫苗的用途。目前，虽然已经在人类I和IIa期研究中评估了由福尔马林解毒的完整毒素A和B组成的候选疫苗，但是抗艰难梭状芽胞杆菌的疫苗无法商购获得。据报道，用这种疫苗肠胃外免疫诱导抗毒素IgG和毒素中和抗体反应(KotloffKL等，Infect.Immun.69:988-995(2001)；Aboudola S等，Infect.Immun.71:1608-1610(2003))。
文献进一步表明，构建含有艰难梭状芽胞杆菌的完整毒素A和B受体结合结构域或其片段的重组融合蛋白将是有效且具商业利益的疫苗研发方法。Varfolomeeva等(Mol.Genetics，Microb.and Virol.3:6-10(2003))已经尝试了此类方法，作为毒素A的700碱基对片段和毒素B的1300碱基对片段的两部分融合蛋白。Belyi和Varfolomeeva(FEMSLetters225:325-9(2003))也已描述了此方法，证明构建由3个部分组成的重组融合蛋白：由艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的重复单元构成的两个C末端结构域，后面是产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)肠毒素Cpe的片段。融合蛋白在大肠杆菌中表达，但是产物在内含体中累积并且不稳定。而且，在这项研究中获得的纯净产物的产量(50μg/100ml培养物)相当低。
Wilkins等(WO00/61762，美国专利No.6,733,760(2004))也描述了重组艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B重复单元(重组ARU和重组BRU)及其多糖偶联物用于制备抗CDAD疫苗的用途。在长度上，所得重组ARU蛋白包含867个氨基酸残基，而重组BRU蛋白含有622个氨基酸。与先前提到的研究不同，本文证明了重组ARU和BRU可溶性蛋白在大肠杆菌中的高水平表达。接种重组ARU和多肽偶联的重组ARU的小鼠均维持了高水平的中和抗毒素A抗体并且受高度保护免受艰难梭状芽胞杆菌毒素A的致死性攻毒。另外，Wilkins等建议使用由ARU和BRU组成的重组融合蛋白制备疫苗。
对研发抗CDAD的疫苗很有兴趣。由ARU和BRU组成的重组融合蛋白作为疫苗可能有用。
发明概述
本发明提供了设计、生产和使用来自艰难梭状芽胞杆菌的毒素A和毒素B的新工具和方法。本发明提供了包含SEQ ID NO:2(C-TAB.G5)或其衍生物SEQ ID NO:4(C-TAB.G5.1)的分离多肽C-TAB。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1包含毒素A的C末端结构域的19个重复单元，这些重复单元与毒素B的C末端结构域的23个重复单元融合。本发明还包括包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的组合物和制剂。所述组合物或制剂可含分离多肽、附加抗原、佐剂和/或赋形剂。可选地，所述组合物或制剂可基本上由分离多肽组成，没有佐剂或其它活性成分(但是任选地包含赋形剂例如载体、缓冲液和/或稳定剂)。而且，尤其(例如)在患有复发性CDAD的受试者或需要经常和/或长期使用抗生素的受试者中，本发明的组合物或制剂可伴随其它药物例如抗生素一起施用。
本发明还提供了包含本发明的分离多肽的疫苗。疫苗可进一步包含佐剂，例如明矾、源自ADP-核糖基化外毒素的佐剂等。可按一剂方案、两剂方案(例如在3-20天内，例如在第一剂10-15天后施用)、三剂方案(例如在第一剂约7天和约21天后施用)或三剂以上的方案施用疫苗，优选两剂或三剂方案，其中所述剂量包含20μg至200μg量的本发明多肽。
本发明提供了通过向有需要的受试者施用本发明的分离多肽预防、治疗或缓解疾病(例如CDAD)的一种或多种症状的方法。可经肌肉内或通过其它递送途径向受试者施用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了通过向有CDAD风险的受试者施用本发明的分离多肽或包含所述多肽的组合物预防疾病(例如CDAD)的方法，例如具有下列特征的受试者：i)免疫系统较弱的受试者，例如老年受试者(例如65岁以上的受试者)或2岁以下的受试者；ii)免疫力低下的受试者，例如患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室(ICU)的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者；viii)患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；ix)有以上提到的两种或更多种特征的受试者，例如计划接受胃肠道手术的老年受试者；x)有炎症性肠病的受试者；和/或xi)患有复发性CDAD的受试者，例如已经历一次或多次CDAD发作的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供了生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的方法。可使用细菌表达系统，例如大肠杆菌表达系统由编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。
在一个实施方案中本发明提供了C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，其中毒素A的19个重复单元经由至少4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成的连接子与毒素B的23个重复单元连接。举例而言，本发明的连接子可包含序列RSMH(Arg-Ser-Met-His)(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸439-442)。
在另一个实施方案中本发明提供了(例如)在ARU和/或BRU中包含至少一个突变(例如，插入、取代或缺失)的分离多肽变异体。变异体的序列与SEQ ID NO:2可能有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
本发明还提供了通过重组DNA工程、细菌发酵和蛋白质纯化生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽或其变异体的方法。在一个实施方案中，本发明提供了构建编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了使用细菌表达系统，例如大肠杆菌表达系统生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的方法。
本发明进一步提供了预防和治疗有需要的受试者，例如人类的CDAD的方法。在此方法中向受试者单独施用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1或与一种或多种佐剂例如明矾等联合施用。受试者可能是有暴露于艰难梭状芽胞杆菌风险的健康个体，已经治疗并从艰难梭状芽胞杆菌感染中恢复并且有受艰难梭状芽胞杆菌再感染风险的人类受试者，或当前受艰难梭状芽胞杆菌感染并且可通过诱导艰难梭状芽胞杆菌毒素中和抗体改善其状况的人类受试者。
本发明提供了包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的免疫原性组合物。免疫原性组合物可进一步包括呈适合应用于有需要的受试者的剂型，增强抗原特异性免疫反应的佐剂和/或药学上可接受的载体和/或其它组分。可通过肌肉内(IM)递送、皮内(ID)递送、皮下(SC)递送、腹膜内(IP)递送、口服递送、鼻腔递送、口腔递送或直肠递送来递送免疫原性组合物。
在本发明的另一个实施方案中，免疫原性组合物诱导结合天然艰难梭状芽胞杆菌毒素并且中和其细胞毒活性的抗体，从而对艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)提供了长期、主动防护和/或治疗。
因此，本发明提供了对预防或治疗有需要的受试者的艰难梭状芽胞杆菌相关疾病有用的免疫原性组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的核酸或其片段或变异体。本发明还提供了包含编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的核酸的表达载体。
本发明的另一个实施方案提供了对C-TAB.G5或C-TAB.G5.1有特异性的抗体及其片段，例如中和、人源化、单克隆、嵌合和多克隆抗体。抗体或其片段可识别毒素A和/或毒素B。
另一个实施方案提供了包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽的疫苗。
本发明的另一个实施方案提供了包含本发明的核酸、多肽和/或抗体的诊断试剂盒。
在下面的描述中部分陈述了本发明的其它实施方案和优点，并且部分可从该描述中显而易见，或可从本发明的实践中获知。
附图简述
图1A示出了编码C-TAB.G5分离多肽的核酸(SEQ ID NO:1)。图1B示出了C-TAB.G5分离多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。毒素A结构域和毒素B结构域之间的氨基酸连接子加有下划线。
图2A示出了编码C-TAB.G5.1分离多肽的核酸(SEQ ID NO:3)。图2B示出了C-TAB.G5.1分离多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。毒素A结构域和毒素B结构域之间的氨基酸连接子加有下划线。
图3示出了通过增大C-TAB.G5的剂量并且与明矾佐剂一起联合递送，接种C-TAB.G5的小鼠体内抗体生成增加。小鼠通过IM注射接受2次接种。第一和第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。
图4示出了通过2次IM注射接受剂量增大的C-TAB.G5(有和无明矾)的小鼠体内，抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B IgG诱导的图示。
图5示出了在明矾存在或缺乏时，用C-TAB.G5免疫的小鼠体内，一个对数剂量范围内的抗体滴度。第二次免疫2周后通过ELISA评估IgG滴度。数据证明，明矾显著增加了经接种小鼠体内的抗体生成。
图6示出了对接种C-TAB.G5(有和无明矾)，然后暴露于致死剂量的毒素A或毒素B的小鼠的保护效应。3周后攻毒(IP)在2周间隔内接受了2次接种(IM)的小鼠。第二次注射2周后估计毒素A和毒素B中和抗体(TNA)，并测定幸免于致死性攻毒的动物百分比。剂量增大的C-TAB.G5赋予更强的TNA生成，以及对致死性攻毒的更强防护。明矾的存在进一步增加了TNA生成，以及在较低剂量下赋予较高存活率。
图7示出了对经接种的幼龄(6-7周)和老龄(18个月)小鼠体内C-TAB.G5的抗体反应和保护效果的比较。3周后攻毒(IP)在2周间隔内接受了2次接种(IM)的小鼠。估计抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的ELISA IgG滴度、TNA生成以及总存活率。幼龄小鼠甚至没有明矾也展示出较高抗体反应，并且当在明矾的存在下接种时，两个组均显示出存活率提高。
图8示出了对经接种的幼龄和老龄小鼠体内抗C-TAB IgG抗体发展的动力学的比较。幼龄小鼠展示出较高速率和较早的IgG生成，并且当在明矾的存在下接种时，两个组均展示出反应提高。
图9示出了对用C-TAB.G5.1或类毒素A和B混合物(1:1)免疫的小鼠体内，抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体生成的比较。小鼠通过IM注射接受2次接种。第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。用类毒素免疫诱导出对毒素分子的N末端部分的抗体，而用C-TAB免疫诱导出对毒素分子的C末端部分的抗体。
图10示出了对用C-TAB.G5.1或类毒素A和B混合物免疫的小鼠体内的TNA生成和对毒素A或B攻毒的防护的比较。3周后用致死剂量的毒素A或毒素B攻毒(IP)在2周间隔内接受了2次接种(IM)的小鼠。
图11示出了在用C-TAB.G5.1(有和无明矾)免疫的仓鼠体内的抗C-TAB(A)、抗毒素A(B)和抗毒素B(C)IgG生成。在第0天和第14天仓鼠通过IM注射接受3次接种。在第14、28和35天通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。
图12示出了在用C-TAB.G5.1(有或无明矾)免疫的仓鼠体内抗C-TAB IgG抗体发展的图示。
图13示出了对用C-TAB.G5.1(有或无明矾)免疫的仓鼠体内TNA和保护的比较。第三次接种2周后仓鼠通过IP注射接受致死剂量的毒素A或毒素B。
图14示出了在灌胃施用致死剂量的艰难梭状芽胞杆菌孢子后接种C-TAB.G5.1的仓鼠的存活率。将存活率数据标绘为Kaplan-Meier存活拟合曲线并使用对数秩分析进行统计分析。在所有孢子剂量(102、103和104)下，在经接种组内观察到100%仓鼠存活率并且与安慰剂组相比存活率显著提高。
图15示出了在明矾存在或缺乏时，用C-TAB.G5.1免疫的食蟹猴体内的抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体生成。两组猴(3只/组，4-6岁)接受200μg的C-TAB.G5.1(有或无250μg明矾)。在研究第0、14、28和42天取血样。使用ELISA法估计抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B IgG滴度。
图16示出了于PBS或组氨酸缓冲液中递送的1μg-30μg剂量范围内的C-TAB.G5和C-TAB.G5.1的免疫原性的比较。小鼠在2周间隔内接受2次接种(IM)。第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。于PBS或组氨酸缓冲液中递送的C-TAB.G5和于组氨酸缓冲液中递送的C-TAB.G5.1之间，3个抗体滴度全部差异显著(T检验分析)。
图17示出了对小鼠体内C-TAB.G5、C-TABNCTB和C-TADCTB的免疫原性的比较。小鼠在2周间隔内通过IM注射接受每种重组蛋白2次接种。所有免疫均在明矾佐剂缺乏时进行。第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。所有3种融合蛋白均展示出高免疫原性。
图18示出了小鼠体内对天然毒素B攻毒的防护。如图17所示使小鼠免疫并且3周后通过IP注射用致死剂量的天然毒素B攻毒小鼠。
图19示出了对在明矾缺乏或存在时接种C-TAB.G5.1或C-TADCTB的仓鼠体内TNA和保护的比较。第三次接种2周后仓鼠通过IP注射接受致死剂量的毒素A或毒素B。
图20示出了在以不同方案用C-TAB.G5.1免疫的小鼠体内的TNA生成和对毒素A或毒素B攻毒的防护。比较在第0、3和14天或在第0、7和21天或在第0、14和28天通过IM注射接种3次的小鼠组间TNA生成和保护。最后一次注射3周后，用致死剂量的毒素A或毒素B攻毒小鼠(图A呈表格形式而图B呈图形形式)。
图21示出了在用单独剂量的10μg C-TAB.G5.1和12.5μg明矾(100μl)免疫的小鼠体内，对艰难梭状芽胞杆菌毒素A(55ng/只小鼠)攻毒的防护。所述攻毒在免疫21天、35天或49天后进行。
发明详述
概述
本发明提供了用于诱导对艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B的保护性和/或治疗性免疫反应的免疫原性组合物，包括使用分离多肽C-TAB.G5(SEQ ID NO:2)或其衍生物C-TAB.G5.1(SEQ ID NO:4)的用途，所述分离多肽或其衍生物包含毒素A的19个重复单元(RU)和毒素B的23个重复单元(RU)或其肽片段或变异体。
本发明还提供了生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的方法和制备可用于预防和/或治疗哺乳动物CDAD的组合物(例如，疫苗)的方法。下列描述对重组分离多肽的构建、表达和纯化，其作为抗原诱导特异性免疫反应的用途以及评估在受试者中的保护的更多详情和实例。受试者可为动物或人类。
可使用几种标准方法中的任一种制备用于本发明方法和组合物中的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。例如，可使用标准重组DNA技术生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1，其中用含有毒素编码核酸片段的部分的适当表达载体转化适合宿主细胞(见例如Dove等，Infect.Immun.58:480-8(1990)，和Barroso等，Nucleic Acids Research18:4004(1990)。各种表达系统的任一种均可用于生成重组多肽。可在原核宿主(例如细菌(例如大肠杆菌或杆菌(Bacillus)))或真核宿主(例如酵母细胞、哺乳动物细胞(例如COS1、NIH3T3或JEG3细胞)或昆虫细胞(例如表皮球菌(Spodoptera frugiperda)(SF9)细胞))中生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1。此类细胞可从(例如)美国模式培养物保藏所(ATCC)获得。转化和转染方法及表达载体的选择将取决于所选宿主系统。例如，Ausubel等，ISBN:047132938X描述了转化和转染方法。也可通过化学合成，例如通过Solid Phase Peptide Synthesis,1984，第2版，Stewart和Young编辑，Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill中描述的方法或通过标准体外翻译方法生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1，特别是短片段。
除C-TAB.G5或C-TAB.G5.1序列外，本发明提供了其具功能活性和免疫原性的变异体。所述变异体可具有与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1相同水平的免疫原性。与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相比，变异体可具有氨基酸取代、缺失或插入。可使用标准方法制备编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1或其变异体的基因(见下文；还参见例如Ausubel等，同上)。
除C-TAB.G5或C-TAB.G5.1序列外，本发明进一步提供了包含附加重复序列的C-TAB.G5衍生物。举例而言，与C-TAB.G5一样，融合蛋白C-TABNCTB(SEQ ID NO:18，由SEQ IDNO:17编码)包含CTA的19个重复单元(氨基酸2272-2710)、CTB的23个重复单元(氨基酸1850-2366)和与CTB的C末端融合的CTB的另10个附加重复序列(氨基酸1834-2057)。另一变异体C-TADCTB融合蛋白(SEQ ID NO:20，由SEQ ID NO:19编码)包含C-TAB.G5(CTA的19个重复序列和CTB的23个重复序列)加上与C-TAB.G5的C末端融合的CTB的24个附加重复单元(氨基酸1834-2366)。变异体还可包含附加拷贝的C-TAB.G5或其部分。例如，C-TADCTB包含C-TAB.G5中存在的双份CTB重复单元。
本发明提供了在细菌系统例如大肠杆菌中高水平表达C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的方法，包括向细菌宿主细胞中引入编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的核酸并且表达C-TAB.G5或C-TAB.G5.1。
另外，本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可与佐剂共价偶联或交联(见，例如，Cryz等，Vaccine13:67-71(1994)；Liang等，J.Immunology141:1495-501(1988)和Czerkinsky等，Infect.Immun.57:1072-77(1989))。
本发明提供了包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的疫苗，其可防护CDAD并提供对CDAD的治疗。本发明的疫苗包含可经肌肉内(IM)、皮内(ID)、皮下(SC)、口服、鼻腔、口腔或直肠途径递送的新型抗原。疫苗可提供免疫保护或诱导抗体进行被动免疫。
本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽提供了对CDAD免疫的疫苗。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽或其变异体为靶向以将对艰难梭状芽胞杆菌相关疾病例如CDAD的保护覆盖范围扩宽至迄今未知或未公布的水平的联合疫苗候选物。单个疫苗提供保护或削弱艰难梭状芽胞杆菌相关疾病的严重程度的该理念代表了在全球水平上管理公共卫生并且特别是缓解流行病的严重程度(例如疗养院、游船)中前进的独特一步。
如本文所使用，“毒素A蛋白”或“毒素B蛋白”指是造成CDAD的主要原因的艰难梭状芽胞杆菌的毒性蛋白。毒素A和毒素B包含是C末端结合结构域中造成免疫原性的原因的多个重复单元。
如本文所使用，“野生型”或“天然”指由如同宿主细胞中内源存在的核酸或氨基酸序列构成的全长蛋白。
如本文所使用，术语“艰难梭状芽胞杆菌相关疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌有关疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌相关的疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌毒素介导的疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌感染”和“CDAD”指由艰难梭状芽胞杆菌感染直接或间接引起的疾病。
“抗原”指当呈递于生物体的免疫细胞时，诱导特异性免疫反应的物质。例如，抗原可为核酸、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白、融合蛋白、磷脂或其组合的偶联物。抗原可包含B细胞受体(即，B细胞膜上的抗体)或T细胞受体识别的单个免疫原性表位或多个免疫原性表位。可呈病毒样颗粒(VLP)或全细菌或微生物例如细菌或病毒体提供抗原。抗原可为灭活或减毒活病毒。可从来自全细胞或单独膜的提取物或溶解产物获得抗原；或可经化学合成或通过重组方式生成抗原。抗原可单独或与佐剂一起施用。单个抗原分子可具有抗原和佐剂性质。
用“佐剂”指可能通过抗原呈递细胞的激活，用于特异性或非特异性加强抗原特异性免疫反应的任何物质。佐剂的实例包括油乳液(例如完全或不完全弗氏佐剂(completeor incomplete Freund's adjuvant))、Montanide不完全Seppic佐剂(例如ISA)、水包油乳液佐剂(例如Ribi佐剂系统)、含胞壁酰二肽的syntex佐剂制剂、铝盐佐剂(明矾)、聚阳离子聚合物，特别是聚阳离子肽，特别是多聚精氨酸或含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是KLKLLLLLKLK,在限定的碱基范围内含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODN)(例如，如WO96/02555中所述)或基于肌苷和胞苷的ODN(例如，如WO01/93903中所述)，或含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(如WO01/93905和WO02/095027中所述)，特别是寡聚(dIdC)13(如WO01/93903和WO01/93905中所述)；神经活性化合物，特别是人生长激素(在WO01/24822中有描述)或其组合；趋化因子(例如，防御素1或2、RANTES、MIP1-α、MIP-2、白细胞间素-8或细胞因子(例如，白细胞间素-1β、-2、-6、-10或-12；干扰素-γ；肿瘤坏死因子-α；或粒细胞-单核细胞-菌落刺激因子))(查阅Nohria和Rubin,1994)、胞壁酰二肽变异体(例如，莫拉丁酯(murabutide)、苏氨酰基-MDP或胞壁酰基三肽)、MDP的合成变异体、热休克蛋白或变异体、利什曼原虫(Leishmania)主要LeIF的变异体(Skeiky等，1995,J.Exp.Med.181:1527-1537)、细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)的无毒变异体，包括胰蛋白酶裂解位点的变异体(Dickenson和Clements，(1995)Infection andImmunity63(5):1617–1623)和/或影响ADP-核糖基化的变异体(Douce等，1997)或化学解毒bARE(类毒素)、QS21,Quill A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-[1,2-二棕榈酰基-s-甘油基-3-(羟磷酰氧基)]乙酰胺(MTP-PE)和含有可代谢油和乳化剂的组合物。佐剂可与抗原一起施用或可通过与所述抗原相同的途径或通过与所述抗原不同的途径单独施用。单个佐剂分子可具有佐剂和抗原性质。
所谓“有效量”是指治疗剂足以诱导或增强抗原特异性免疫反应(对于抗原而言)，或治疗或诊断病状(对于药物而言)的量。对免疫反应的此类诱导可提供治疗例如自身免疫性疾病的免疫保护、脱敏、免疫抑制、调节，癌症免疫监视的增强或对确定传染病的治疗性接种。治疗包括治愈、改善或预防。
所谓“核酸”是指单个脱氧核糖核酸碱基或核糖核酸或其通过磷酸二酯键连接的序列。
所谓“治疗剂”是指能够用于治疗疾病，缓解疾病的症状，预防疾病或诊断疾病的任何分子。例如，治疗剂可为抗原或药物。
所谓“受试者”是指动物。受试者可为任何动物，包括任何脊椎动物。受试者可为家畜、实验动物(包括但不限于啮齿动物，例如大鼠、仓鼠、沙鼠或小鼠)或宠物。在一个实施方案中，动物可为哺乳动物。哺乳动物的实例包括人类、灵长类动物、有袋动物、犬、猴子、啮齿动物、猫、猿、鲸、海豚、牛、猪和马。受试者可能需要治疗疾病或可能需要预防性治疗。
如本文所使用，术语“抗体”指具有特异性结合特定抗原的能力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。抗体为免疫科学中的普通技术人员众所周知。如本文所使用，术语“抗体”不仅指全长抗体分子而且指维持了抗原结合能力的抗体分子片段。此类片段也在本领域中众所周知并且在体外和体内经常性使用。具体而言，如本文所使用，术语“抗体”不仅指全长免疫球蛋白分子而且指抗原结合活性片段，例如众所周知的活性片段F(ab’)2、Fab、Fv和Fd。
如本文所使用，术语“变异体”可包括不同于野生型多肽的蛋白质和/或多肽和/或肽，其中一个或多个残基已经功能相似的残基保守性取代，并且其进一步展示出野生型多肽大体上相同的功能性质。保守性取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基取代另一个(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)，一个极性(亲水性)残基取代另一个(例如精氨酸与赖氨酸之间，谷氨酰胺与天冬酰胺之间，甘氨酸与丝氨酸之间)，一个碱性残基取代另一个(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)或一个酸性残基取代另一个(例如天冬氨酸或谷氨酸)。变异体可包括具有与本发明多肽大体上相同的三级结构，也展示出如本文所述多肽的功能性质的任何多肽。变异体可为野生型多肽的突变体。
如本文所使用，“治疗”可包括用于试图改变个体或细胞自然进程的任何类型的干预。治疗可包括但不限于单独或联合本领域通常所知的其它治疗方式施用(例如)药物组合物。“治疗”可预防性进行，或在病理事件开始之后进行。
如本文所使用，“药学上可接受的载体”可包括当与活性成分组合时，允许所述成分保持生物活性并且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。药学上可接受的载体和/或赋形剂可包括缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。一般而言，载体或赋形剂的特性将取决于采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含注射液体，包括药学和生理学上可接受的液体，例如作为媒介物的水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)而言，常规无毒固体载体可包括(例如)药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨醇酐酯。
如本文所使用，“融合”可指核酸和多肽包含未发现按根据本发明放置的顺序或前后关系相互自然缔合的序列。融合核酸或多肽不一定包含核酸或多肽的整个自然序列。融合蛋白具有通过正常肽键连在一起的两个或更多个区段。融合核酸具有通过正常磷酸二酯键连在一起的两个或更多个区段。
分离多肽
本发明提供了分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中所示的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，其包含艰难梭状芽胞杆菌毒素A的19个重复单元和艰难梭状芽胞杆菌毒素B的23个重复单元。C-TAB.G5的同系物，例如C-TAB.G5.1与C-TAB.G5可有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同。C-TAB.G5.1多肽是含有与C-TAB.G5相同的毒素B的C末端结构域的融合蛋白，但是源自艰难梭状芽胞杆菌VPI-10463菌株的毒素A的C末端结构域为源自艰难梭状芽胞杆菌630菌株的相应C-TAB.G5多肽的同系物并且在位置155-156位置的两个氨基酸不同。如SEQ ID NO:3中所示的C-TAB.G5.1编码序列是优化为在大肠杆菌宿主细胞中表达增强的密码子。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽在中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的毒性作用中可能有效。
毒素A和毒素B分别由艰难梭状芽胞杆菌菌株630的trdA(SEQ ID NO:5)和trdB(SEQ ID NO:7)基因编码。在结构上，艰难梭状芽胞杆菌毒素包含ADP-葡糖基转移酶结构域、半胱氨酸蛋白酶结构域、疏水区和受体结合区。C末端结构域含有高度重复单元(RU)(也称为组合重复寡肽(CROPS))。RU可为长或短寡肽并且可包含20-50个氨基酸，具有重复的共有YYF基序。RU分组为聚簇。例如，野生型trdA基因(SEQ ID NO:5)编码的毒素A，菌株630(SEQ ID NO:6)含有39个RU。39个RU分组为8个聚簇。野生型trdB基因(SEQ ID NO:7)编码的毒素B，菌株630(SEQ ID NO:8)含有24个分组为5个聚簇的RU。以下表1和2示出了trdA基因和trdB基因编码的艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B中每个RU的氨基酸位置。
表1：毒素A重复单元(ARU)
S：表示短重复单元
L：表示长重复单元
表2：毒素B重复单元(BRU)
S：表示短重复单元
L：表示长重复单元
因此，C-TAB.G5和C-TAB.G5.1分离多肽分别包含来自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的C末端结构域的19个RU和来自艰难梭状芽胞杆菌毒素B的C末端结构域的23个RU。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1包含SEQ ID NO:6的毒素A氨基酸2272-2710，其与SEQ ID NO:8的毒素B氨基酸1850-2366融合。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽分别包含如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽中的各个RU也可能来自艰难梭状芽胞杆菌毒素A或毒素B的变异体。C-TAB分离多肽中的这些RU也可为自然发生的艰难梭状芽胞杆菌毒素A或毒素B或变异体的组合。
C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽中的RU包含长RU和短RU，并且长RU和短RU排列呈聚簇。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽包含3-5个短RU的4个聚簇，后面是艰难梭状芽胞杆菌毒素A的一个长RU，和3-5个短RU的5个聚簇，后面是艰难梭状芽胞杆菌毒素B的一个长RU。
短和长RU含保守基序。短重复单元可包含15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个氨基酸。每个短重复单元可包含保守酪氨酸基序，例如YYF、FYF、YFF、FYI或HYF。如果后面的重复单元为长重复单元，在酪氨酸基序之前短重复单元可进一步包含天冬氨酸/组氨酸残基。长重复单元可包含27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸。每个长重复单元可包含酪氨酸重复基序，例如FEYF、FKYF或YKYF。
在本发明中，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的毒素A和毒素B部分可直接融合在一起。毒素A和毒素B部分可被连接子区域间隔开。连接子区域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、20-30、40、45或50个氨基酸。本领域的技术人员将认识到，连接子区域可适于改变毒素A和毒素B部分的定位，以致在其表达和折叠形状方面，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽中的每个毒素重复单元定位为最佳暴露潜在表位并保持其免疫原性。C-TAB分离多肽中的RU和聚簇也可被连接子分开。在一个实施方案中，连接子包含肽RSMH(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的439-442)。
本发明的C-TAB分离多肽可与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性或序列相似性。如本领域所知，通过比较一个多聚核苷酸或多肽的氨基酸或核苷酸序列及其保守性核苷酸或氨基酸取代物与第二个多聚核苷酸或多肽的序列测定两个多肽或多聚核苷酸之间的“相似性”。本领域也已知“同一性”，指通过两串此类序列之间的匹配同一性测定的两个多肽或两个多聚核苷酸序列之间的序列关联性程度。同一性和相似性均可容易地计算(ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M Stockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多聚核苷酸或多肽序列之间的同一性和相似性的方法，但是术语“同一性”和“相似性”为技术人员众所周知(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，MStockton Press,New York,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。测定两个序列之间同一性或相似性通常采用的方法包括但不限于Guide toHuge Computers,Martin J.Bishop编辑，Academic Press,San Diego,1994及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)中公开的方法。
本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽具免疫原性。例如，本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可具有相应细菌毒素A的至少50%、60%、70%、80%或90%免疫活性，并且C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可具有相应细菌毒素B的至少50%、60%、70%、80%或90%免疫活性。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可用作治疗、预防或缓解CDAD症状的疫苗。
本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽还包括分别具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的变异体。变异体可具有对分离多肽的活性、功能或形状具有最小影响至无影响的氨基酸插入、取代和/或缺失。此类取代的实例包括一个非极性残基取代另一个，一个极性残基取代另一个，一个碱性残基取代另一个或一个酸性残基取代另一个。与天然毒素A或毒素B的胞外结构域的氨基酸序列相比，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽变异体可进一步包括对多肽的活性、功能和/或结构产生最小影响的氨基酸插入、取代和/或缺失。本领域的技术人员将认识到也可使用非天然氨基酸。非天然氨基酸包括(例如)β-丙氨酸(β-Ala)或其它ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸(2,3-diaP)、4-氨基丁酸等，α-氨基异丁酸(Aib)、肌氨酸(Sat)、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)和环己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、磺基丙氨酸(Cya)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；和蛋氨酸亚砜(MSO)。
编码本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核苷酸序列可经密码子优化以增强在不同宿主细胞中的表达。密码子优化指通过以宿主细胞的基因或从中得到细胞的宿主的基因中使用更频繁的密码子置换天然序列的一个或多个密码子，修饰核苷酸序列以便增强在目标宿主细胞中的蛋白质表达。各种物种表现出对特定氨基酸某些密码子的特定偏向。本发明提供了编码C-TAB.G5.1分离多肽的密码子优化核苷酸序列以增强在大肠杆菌中的表达。
可通过任何已知技术制备本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。例如，可通过基因工程表达分离多肽。举例而言，翻译重组DNA。也可合成制备C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。举例而言，可使用最初由通过引用并入本文的Merrifield(J.Am Chem.Soc.85:2149-2154)描述的固相合成技术合成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。例如，Kent等(1985)，Synthetic Peptides in Biology and Medicine，Alitalo等编辑，ElsevierScience Publishers,295-358中可找到其它多肽合成技术。
可分离或获得呈大体纯净形式的本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。大体纯净指在其预期用途实用且适用的程度上，蛋白质和/或多肽和/或肽基本上没有可在自然界或体内系统中发现的其它物质。具体而言，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽足够纯净并且充分不含其宿主细胞的其它生物组成部分，以致在(例如)生成抗体、测序或生产药物制剂中有用。通过本领域众所周知的技术，可根据本文公开的核酸和氨基酸序列生成大体纯净的多肽。因为在药物制剂中，本发明大体纯化的分离多肽可混有药学上可接受的载体，所以分离多肽可能仅包含一定重量百分比的制剂。尽管如此分离多肽大体上纯净，因为其已经大体上与在生命系统中可能与之缔合的物质分开。
本发明进一步提供了包含附加多肽的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。附加多肽可为较大多肽的片段。在一个实施方案中，有1、2、3、4个或更多个附加多肽与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽融合。在一些实施方案中，附加多肽与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的氨基末端融合。在其它实施方案中，附加多肽与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的羧基末端融合。在更多实施方案中，附加多肽侧接C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。还有更多实施方案中，附加多肽分散于C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的毒素A部分和毒素B部分之间。
在一些实施方案中，附加多肽有助于指示C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的分泌或亚细胞定位。此类多肽称为“信号序列”。例如，美国专利6,291,212和美国专利5,547,871描述了分泌信号，二者通过引用整体并入本文。分泌信号序列编码分泌肽。分泌肽是起指示C-TAB.G5或C-TAB.G5.1从细胞分泌的作用的氨基酸序列。分泌肽通常特征在于疏水性氨基酸核并且通常(但不完全)存在于新合成蛋白质的氨基末端。分泌期间分泌肽可从C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离肽裂解。分泌肽可含有允许信号肽在其通过分泌途径时从成熟蛋白质上裂解的加工位点。可在信号肽内编码加工位点或可通过(例如)体外诱变添加到信号肽中。一系列复杂的翻译后加工步骤可能需要分泌信号序列以允许C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分泌。信号序列可紧跟在起始密码子之后并且编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1氨基末端的信号肽。信号序列可在终止密码子之前并且编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1羧基末端的信号肽。在多数情况下，由称为信号肽酶的特定蛋白酶裂解掉信号序列。分泌信号序列的实例包括但不限于ompA、pelB和ST pre-pro。
在一些实施方案中，附加多肽有助于C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的稳定、结构和/或纯化。在一些实施方案中，附加多肽可包含表位。在其它实施方案中，附加多肽可包含亲和标签。举例而言，包含表位和/或亲和标签的多肽与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的融合可有助于多肽的纯化和/或鉴定。举例而言，多肽片段可为His-标签、myc-标签、S-肽标签、MBP标签(麦芽糖结合蛋白)、GST标签(谷胱甘肽S-转移酶)、FLAG标签、硫氧还蛋白标签、GFP标签(绿色荧光蛋白)、BCCP(生物素羧基载体蛋白)、钙调蛋白标签、Strep标签、HSV-表位标签、V5-表位标签和CBP标签。此类表位和亲和标签的用途为本领域技术人员已知。
在更多实施方案中，附加多肽可提供包含供多肽裂解的位点的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。例如，可通过水解肽键裂解多肽。在一些实施方案中，用酶进行裂解。在一些实施方案中，在细胞中发生裂解。在其它实施方案中，通过人工操纵和/或人工引入裂解酶发生裂解。举例而言，裂解酶可包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和/或因子Xa。裂解使得易于从多肽中分离C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。裂解可进一步允许将毒素A部分与毒素B部分分开。裂解也可允许将与多肽融合的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽与其它多肽分离，例如通过用于纯化表达蛋白的表位裂解。
C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可进一步具有并非相同有机合成肽共有的附加结构修饰，例如腺苷酰化、羧化、糖基化、羟基化、甲基化、磷酸化或十四烷基化。可通过适当选择重组表达系统进一步选择或优选这些添加的结构修饰。另一方面，融合多肽的序列可按照有机合成的原理和实践扩展。
本发明还提供了编码包含从艰难梭状芽胞杆菌毒素A获得的多肽部分和从艰难梭状芽胞杆菌毒素B获得的多肽部分的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸。核酸可包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其聚合物。本发明提供了编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核糖核酸。本发明还提供了在严格条件下与编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸及其补体杂交的核酸。严格条件指探针和滤器结合核酸之间的同源程度；严格性越高，探针和滤器结合核酸之间的同源百分比越高。可基于核酸的Tm(基于G/C含量)测定严格洗涤的温度。严格条件可进一步受缓冲液中的盐浓度影响，例如标准柠檬酸钠(SSC)。本发明提供了与SEQ ID NO:1具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似性或序列同一性的核酸。
C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可进一步包含连接子区域，例如小于约50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的连接子。连接子可与源自毒素A的多肽部分或其一部分和源自毒素B的多肽部分共价连接并介于二者之间。
本发明提供了编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，分别与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3简并的核酸。遗传密码的简并允许毒素A蛋白、毒素B蛋白和/或目标分离多肽的核苷酸序列变异，同时仍生成具有与天然DNA序列编码的多肽相同的氨基酸序列的多肽。称为“密码子优化”的程序(在美国专利5,547,871中有描述，其通过引用整体并入本文)为人们提供了设计此类改变DNA序列的方式。密码子优化基因的设计应考虑多种因素，包括生物体中密码子使用的频率、最近相邻频率、RNA稳定性、二级结构形成的可能、合成途径和该基因的预期未来DNA操纵。具体而言，可使用可用方法改变编码指定分离多肽的密码子，使密码子在使用酵母表达系统时酵母最易识别或在使用昆虫细胞表达系统时昆虫细胞最易识别。遗传密码的简并还允许以许多不同方式编码和翻译相同氨基酸序列。例如，亮氨酸、丝氨酸和精氨酸各由6个不同密码子编码，而缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和甘氨酸各由4个不同密码子编码。然而，使用此类同义密码子的频率在真核细胞和原核细胞中的基因组间不同。例如，哺乳动物中同义密码子选择模式非常相似，而进化关系甚远的生物例如酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、细菌(例如大肠杆菌)和昆虫(例如黑腹果蝇(D.melanogaster))展现出明显不同模式的基因组密码子使用频率(Grantham,R.等，Nucl.Acid Res.,8,49-62(1980)；Grantham,R.等，Nucl.Acid Res.,9,43-74(1981)；Maroyama,T.等，Nucl.Acid Res.,14,151-197(1986)；Aota,S.等，Nucl.Acid Res.,16,315-402(1988)；
Wada,K.等，Nucl.Acid Res.,19Supp.,1981-1985(1991)；Kurland,C.G.,FEBSLett.,285,165-169(1991))。密码子选择模式的这些差异似乎通过调节肽延伸速率有助于单个基因的总体表达水平。(Kurland,C.G.,FEBS Lett.,285,165-169(1991)；Pedersen,S.,EMBO J.,3,2895-2898(1984)；Sorensen,M.A.,J.Mol.Biol.,207,365-377(1989)；Randall,L.L.等，Eur.J.Biochem.,107,375-379(1980)；Curran,J.F.和Yarus,M.，J.Mol.Biol.,209,65-77(1989)；Varenne,S.等，J.Mol.Biol.,180,549-576(1984),Varenne,S.等，J.Mol,Biol.,180,549-576(1984)；Garel,J.-P.,J.Theor.Biol.,43,211-225(1974)；Ikemura,T.,J.Mol.Biol.,146,1-21(1981)；Ikemura,T.,J.Mol.Biol.,151,389-409(1981))。
合成基因的优选密码子使用频率应反映源自预期用于重组蛋白表达的细胞/生物体的确切(或尽可能密切相关)基因组的核基因的密码子使用。
设计测定同一性的优选方法以在两个测试序列之间产生最大匹配。以计算机程序编篡测定同一性和相似性的方法。测定两个序列之间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，Nucl.Acid Res.12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等，J.Mol.Biol.215:403(1990))。测定以上提到的相似性或同一性程度作为两个序列之间的同一性程度，常常指第一个序列源自第二个。可通过本领域已知的计算机程序方式，例如GCG程序包中提供的GAP(Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48:443-453(1970))测定两个核酸之间的同一性程度。为了为本发明测定两个核酸之间的同一性程度，用下列设置使用GAP：GAP生成罚分5.0和GAP扩展罚分0.3。
本发明还提供了包含编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸的载体。载体可为通过限制和连接向其中插入所需序列以在不同遗传环境之间转运或在宿主细胞中表达的许多核酸中的任一种。虽然RNA载体也可用，但是载体通常由DNA构成。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能够在宿主细胞中复制并且进一步特征在于一个或多个核酸内切酶限制位点的载体，在核酸内切酶限制位点可按可测方式切割载体并且可向其中连接所需DNA序列，以致新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。就质粒而言，所需序列的复制当宿主细菌中质粒拷贝数量增多时可发生许多次或在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅可发生一次。就噬菌体而言，复制可在溶解期主动发生或在溶原期被动发生。
载体可进一步含有启动子序列。启动子可包括一般位于含有核酸转录的起始位点的编码区域上游的未翻译核酸。启动子区域也可包括起基因表达的调节因子作用的其它元件。在本发明更多的实施方案中，表达载体含有附加区域以有助于选择有表达载体并入的细胞。启动子序列常常通过转录起始位点结合(包括在内)在其3’末端并且向上游延伸(5’方向)以包括在高于本底的可检水平下开始转录所必需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列中将发现转录起始位点以及负责结合RNA聚合酶的结合结构域。真核启动子将往往但并非总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。
载体可进一步含有适合用于鉴定和选择已经用载体转化或转染的细胞的一个或多个标记序列。标记包括，例如，编码增强或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码可通过本领域已知的标准测定检测其活性的酶(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因和明显影响转化或转染细胞、宿主、菌落或菌斑的表现型的基因。优选载体是能够自主复制并表达与之可操作连接的DNA片段中存在的结构基因产物的载体。
表达载体是可通过限制和连接向其中插入所需核酸，以致其与调控序列可操作地连接并且可表达为RNA转录产物的表达载体。表达指内源基因、转基因或编码区域在细胞内的转录和/或翻译。
当编码序列和调控序列以将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下的方式共价连接时，它们可操作地连接。如果期望编码序列翻译为功能蛋白，则如果5’调控序列中启动子的诱导导致编码序列转录并且如果两个DNA序列之间的连接性质不会(1)导致诱导移码突变，(2)干扰启动子区域指示编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录产物翻译为蛋白质的能力，称两个DNA序列可操作地连接。因此，如果启动子区域能够实现该DNA序列的转录，以致所得转录产物可翻译为所需蛋白质或多肽，则启动子区域将与相应序列可操作地连接。
可通过在宿主细胞中表达编码核酸生成本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。核酸可转化或转染至宿主细胞中。因此，本发明的一些方面包括转化和/或转染编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸。转化是向原核细胞内部引入外源或异源核酸。转染是向真核细胞内部引入外源或异源核酸。转化或转染核酸可能或可能不整合(共价连接)至构成细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物中，例如，转化核酸可保持在附加体元件，例如质粒或病毒载体上。至于真核细胞，经稳定转染的细胞是其中转染核酸已经变得整合至染色体中，以致其由子细胞通过染色体复制遗传的细胞。真核细胞建立由含转染核酸的子细胞群构成的细胞系或克隆的能力证明了这种稳定性。
高等真核细胞培养物可用于表达本发明的蛋白质，无论来自脊椎动物还是无脊椎动物细胞，包括昆虫，并且其繁殖程序已知(见，例如，Kruse等(1973)Tissue Culture,Academic Press)。
还提供了用于复制核酸和表达编码的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的宿主细胞和载体。可使用任何载体或宿主细胞，无论原核还是真核。在本领域中已知许多载体和宿主细胞用于此目的。在本领域技术范围内有必要选择供所需应用的适当装置。
可由源自艰难梭状芽胞杆菌和本领域已知的表达毒素A和毒素B的其它已知原核生物的多种基因组或cDNA库克隆编码毒素A和毒素B的DNA序列或其部分。使用基于探针的方法分离此类DNA序列的技术为常规技术并且为本领域技术人员众所周知。分离此类DNA序列的探针可基于公开的DNA或蛋白质序列。可选地，可使用通过引用并入本文的Mullis等(美国专利No.4,683,195)和Mullis(美国专利No.4,683,202)公开的聚合酶链式反应(PCR)方法。库的选择和分离此类DNA序列的探针的选择在本领域普通技术水平范围内。
适合宿主细胞可源自原核生物或真核生物。适合原核生物宿主包括：假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis))、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、杆菌属(Bacillus)(例如枯草杆菌(B.subtillis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium))、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridiumsporogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、微球菌属(Micrococcus)(例如藤黄微球菌(M.luteus)和玫瑰色微球菌(M.roseus))和普通变形菌(Proteus vulgaris)。高等真核生物中表达本发明多肽的适合宿主细胞包括：酵母例如酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母)；293(人胚肾)(ATCC CRL-1573)；293F(Invitrogen,Carlsbad CA)；293T和变异体293T/17(293tsA1609neo和变异体ATCC CRL-11268)(用SV40T抗原转化的人胚肾)；COS-7(用SV40转化的猴肾CVI系)(ATCC CRL1651)；BHK(幼仓鼠肾细胞)(ATCC CRL10)；CHO(中国仓鼠卵巢细胞)；小鼠Sertoli细胞；CVI(猴肾细胞)(ATCC CCL70)；VERO76(非洲绿猴肾细胞)(ATCC CRL1587)；HeLa(人宫颈癌细胞)(ATCC CCL2)；MDCK(犬肾细胞)(ATCC CCL34)；BRL3A(大鼠肝细胞)(ATCC CRL1442)；W138(人肺细胞)(ATCC CCL75)；HepG2(人肝细胞)(HB8065)；和MMT060652(小鼠乳房肿瘤)(ATCC CCL51)。
在其它实施方案中，本发明提供了编码包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和附加多肽的分离多肽的核酸。用于构建生成融合多肽的真核表达系统的载体包含编码与适当转录活化序列例如启动子和/或操纵子可操作地连接的分离多肽的核酸。其它典型特征可包括适当的核糖体结合位点、终止密码子、增强子、终止子或复制子元件。可通过常规剪接技术例如限制核酸内切酶消化和连接将这些附加特征插入载体的适当位点。
在一些实施方案中，附加核酸可与编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸融合。融合核酸可编码可能有助于纯化和/或免疫原性和/或稳定性的多肽，而不会移动C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的密码子阅读框。融合核酸可编码可能或可能不从C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽上裂解的分泌序列。融合核酸可能不显著延伸表达的多肽。融合核酸可为C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽编码少于60个额外核酸。在一些实施方案中，融合核酸跟随在编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸之后。在其它实施方案中，融合核酸在编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸之前。在其它实施方案中，融合核酸侧接编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸。
在一些实施方案中，融合核酸可编码帮助纯化C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的多肽。在一些实施方案中融合核酸将编码表位和/或亲和标签。帮助纯化的多肽的实例包括但不限于His-标签、myc-标签、S-肽标签、MBP标签、GST标签、FLAG标签、硫氧还蛋白标签、GFP标签、BCCP、钙调蛋白标签、Strep标签、HSV-表位标签、V5-表位标签和CBP标签。在其它实施方案中，融合核酸可编码具有定向或易于裂解的位点的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。在一个实施方案中，融合核酸可编码包含酶裂解位点的多肽。在更多实施方案中，酶裂解可能有助于从其它多肽分离C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽以及其它融合多肽。举例而言，对置于编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和表位的核酸之间的酶裂解位点进行编码的中间核酸可允许稍后分离表达的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和表位。此类位点也可存在于毒素A部分和毒素B部分之间。
本发明还提供了设计用于辅助表达并提供C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的表达系统。表达系统可包含经编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可为原核生物。原核生物可为大肠杆菌。宿主细胞可为真核细胞。
表达系统可进一步包含有助于选择经编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸成功转化或转染的宿主细胞的试剂。例如，编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸可进一步表达帮助宿主细胞抵抗抗生素的基因，例如抗卡那霉素(kanamycin)或庆大霉素(gentamycin)或氨苄青霉素(ampicillin)或青霉素(penicillin)的基因。如本领域技术人员所知，此类抗性基因将允许选择已经恰当并入编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸的宿主细胞。
本发明的另一方面涉及抗体的生成。本发明涵盖的抗体的实例包括但不限于通过用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽使受试者免疫产生的抗体。通过用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽免疫生成的抗体可与毒素A或毒素B特异性结合，或它们可与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽交叉反应。可使用本领域众所周知的方法表征本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽产生的抗体。
使用本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽产生的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、只有重链的抗体、异源偶联抗体、单链(ScFv)、单结构域抗体、其变异体、包含抗体部分的分离多肽、人源化抗体和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，包括抗体的糖基化变异体、抗体的氨基酸序列变异体和经共价修饰的抗体。优选抗体源自鼠科动物、大鼠、兔、犬、猪、单峰驼、骆驼、美洲驼、猫、灵长类动物或任何其它来源(包括嵌合抗体、片段和/或人源化抗体)。
在其它实施方案中，然后通过本领域已知的方法对用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽免疫产生的抗体进行人源化。人源化抗体是含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。还有其它实施方案中，使用市场上可买到的已经工程化为表达特异性人免疫球蛋白的小鼠获得全人抗体。在其它实施方案中，抗体嵌合。嵌合抗体是结合了来自两种不同抗体的特征的抗体。制备嵌合抗体的方法在本领域中已知。
在其它实施方案中，获得编码抗体的核苷酸序列，然后克隆至载体中进行表达或繁殖。在另一个实施方案中，经重组制备抗体并且使用本领域已知的方法表达。举例而言，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可用作抗原，用于通过这些技术分离重组抗体的目的。可使用在宿主细胞中重组表达抗体的基因序列经重组制备抗体。制备抗体变异体和重组抗体的方法在本领域中已知。
在其它实施方案中，通过本领域的常规方法使抗体与载体结合，用于(例如)分离或纯化天然毒素A或毒素B或检测生物样品或样本中的天然毒素A或毒素B或艰难梭状芽胞杆菌。
组合物和制剂
本发明还提供了包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的组合物。所述组合物可为包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。举例而非限制，用于本发明方法中的组合物通常包含有效量的本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽(例如，足以诱导免疫反应的量)或抗C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的抗体(例如，足以减轻感染、缓解感染症状和/或预防感染的中和抗体的量)。药物组合物可进一步包含本领域已知的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(通常见Remington,(2005)The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams and Wilkins)。
本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可用于免疫或治疗有CDAD的人类和/或动物的方法。因此，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可用于药物组合物中。本发明的药物组合物可进一步涵盖药学上可接受的载体和/或赋形剂。在本发明中有用的药学上可接受的载体和/或赋形剂为常规的并且可包括缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。Remington's Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)描述了适合本文公开的多肽的药物递送的组合物和制剂。一般而言，载体或赋形剂的性质将取决于采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含注射液体，包括药学和生理学上可接受的液体，例如作为媒介物的水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)而言，常规无毒固体载体可包括(例如)药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨醇酐酯。
在一个实施方案中药物组合物可进一步包含免疫刺激物质，例如佐剂。佐剂可基于施用方法选择并且可包括矿物油基佐剂例如完全或不完全弗氏佐剂、Montanide不完全Seppic佐剂(例如ISA)、水包油乳液佐剂(例如Ribi佐剂系统)、含胞壁酰二肽的syntex佐剂制剂、氢氧化铝或铝盐佐剂(明矾)、聚阳离子聚合物，特别是聚阳离子肽，特别是多聚精氨酸或含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是KLKLLLLLKLK；在限定的碱基范围内含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODN)(例如，如WO96/02555中所述)或基于肌苷和胞苷的ODN(例如，如WO01/93903中所述)，或含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(如WO01/93905和WO02/095027中所述)，特别是寡聚(dIdC)13(如WO01/93903和WO01/93905中所述)；神经活性化合物，特别是人生长激素(在WO01/24822中有描述)或其组合。此类组合根据(例如)WO01/93905、WO02/32451、WO01/54720、WO01/93903、WO02/13857、WO02/095027和WO03/047602中描述的组合。优选地，佐剂为氢氧化铝佐剂。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在施用的剂量和浓度下对受体无毒性。载体、赋形剂或稳定剂可进一步包含缓冲液。赋形剂的实例包括但不限于碳水化合物(例如单糖和二糖)、糖(例如蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇)、磷酸盐、柠檬酸盐、抗氧化剂(例如抗坏血酸和蛋氨酸)、防腐剂(例如苯酚、丁醇、苯甲醇；烷基苯甲酸酯、儿茶酚(catechol)、十八烷基二甲苄基氯化铵、氯化六烃季铵、雷琐酚(resorcinol)、环己醇、3-戊醇、杀藻胺、氯化苄乙氧铵和间甲酚)、低分子量多肽、蛋白质(例如血清白蛋白或免疫球蛋白)、亲水性聚合物氨基酸、螯合剂(例如EDTA)、成盐平衡离子、金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)和非离子表面活性剂(例如TWEENTM和聚乙二醇)。
本发明的药物组合物可进一步包含用于增强和/或补充预期效果的附加试剂。举例而言，为增强作为亚单位疫苗施用的本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的免疫原性，药物组合物可进一步包含佐剂。
药物组合物的实例可为免疫原性组合物。本发明提供了包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的免疫原性组合物。免疫原性组合物可进一步包括药学上可接受的载体或呈适合在哺乳动物中注射的剂型的载体和/或赋形剂。免疫原性组合物可为当注射或引入免疫原性组合物时在哺乳动物宿主中引起免疫反应的任何材料的组合物。免疫反应可为体液性、细胞性或二者。增强效果指在哺乳动物宿主随后暴露于相同免疫原性组合物后，对免疫原性组合物的免疫反应提高。体液反应导致哺乳动物宿主在暴露于免疫原性组合物后生成抗体。
本发明的免疫原性组合物在哺乳动物宿主，包括人类和其它动物中引起免疫反应。免疫反应可为细胞依赖性反应或抗体依赖性反应或二者；并且进一步地，反应可在哺乳动物宿主中提供免疫记忆或增强效果或二者。这些免疫原性组合物可用作疫苗并且可提供哺乳动物受试者或宿主对受艰难梭状芽胞杆菌菌株感染的保护性反应。
本发明进一步包括通过构建编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸并且在微生物宿主中表达C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽组分；从宿主培养物中回收C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽；使C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽与第二蛋白质组分偶联，并且回收偶联的蛋白质和多糖组分生成免疫原性组合物的方法。可通过持续且稳定的选择压力在整个宿主生长期间保持着编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸。可通过在表达载体中并入编码选择基因型的基因序列赋予对表达载体的保持，选择基因型在微生物宿主细胞中的表达产生选择表现型。选择基因型序列也可包括补充条件致死突变的基因。在表达载体中可并入其它基因序列，例如其它药物抗性基因或补充致死突变的基因。微生物宿主包括：革兰氏阳性细菌；革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌；酵母；丝状真菌；哺乳动物细胞；昆虫细胞；或植物细胞。
本发明的方法还在宿主中提供了一定表达水平的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，水平高于约50mg/L培养物，水平高于约100mg/L培养物，水平高于约500mg/L培养物或水平高于约1g/L培养物。本发明还提出可通过本领域技术人员已知的任何数量的分离和回收蛋白质的方法（例如通过硫酸铵沉淀，接着通过离子交换色谱法）来回收蛋白质。
本发明进一步包括制备免疫原性组合物的方法，提出通过本领域技术人员已知的多种方式之一（例如酰胺化反应）使得蛋白质组分与第二蛋白质组分偶联。
本发明还提供了用于治疗和预防CDAD的包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂。在一个实施方案中，所述制剂可包含本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽、佐剂和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，所述制剂包含本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，或基本上由本发明的一种或多种C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽组成。所述制剂可包含本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和佐剂。所述制剂可进一步包含附加抗原或药物。而且，所述制剂可包含一种或多种药物并且除分离多肽和/或佐剂外可包含一种或多种药物。
包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂可呈液体或干燥形式。干燥制剂可易于储存和运输。干燥制剂打破了从疫苗生产地点到接种发生场所所需的冷藏链。可选地，制剂的干燥活性成分本身可通过提供受抗原呈递细胞摄取和加工的固体颗粒形式改良。讨论这些可能机制并不是要限制本发明或其等效物的范围，而是要阐明本发明的操作并且指导这种制剂在免疫和接种中的使用。
C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的干燥制剂可呈各种形式提供：例如，细粉或粒状粉、冻干粉、均匀薄膜、小丸和片剂。干燥制剂可风干、升温干燥、冻干、冷冻或喷雾干燥，涂或喷在固体基质上然后干燥，撒在固体基质上迅速冷冻，然后在真空下缓慢干燥，或其组合。如果制剂的活性成分为不同分子，则它们可混于溶液中，然后干燥，或仅以干燥形式混合。
呈液体或固体形式例如干燥形式的包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂可与一种或多种佐剂一起施加在相同或单独部位或同时或频繁重复施加。制剂可包含其它抗原，以致施用制剂诱导对多种抗原的免疫反应。在这种情况下，其它抗原可具有不同化学结构以便诱导对不同抗原有特异性的免疫反应。在施用之前可保至少一种抗原和/或佐剂呈干燥形式。液体随后从含有制剂的干燥成分的储器中释放或液体进入储器将至少部分溶解该成分。
固体(例如，纳米或微米尺寸的颗粒)也可掺入制剂中。固体形式(例如，纳米颗粒或微粒)可有助于活性成分的分散或溶解；提供了佐剂、C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽或二者与可受抗原呈递细胞调理的基质的附着点，或其组合。从形成薄片、棒或珠粒的多孔固体持续释放的制剂起贮库的作用。
在施用制剂之前，制剂的至少一种成分或组分(即，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽、佐剂或药物)可以干燥形式提供。这种制剂也可连同常规的肠、粘膜或肠胃外免疫技术一起使用。
可在适当管理结构(例如，食品和药物管理局，EMEA)对生物制剂和疫苗可接受的无菌条件下生产包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂。任选地，即使组分例如干燥剂、赋形剂、稳定剂、湿润剂、防腐剂或其组合无免疫活性，它们也可包括在制剂中。然而，它们可具有其它所需性质或特征。
生产药物制剂的工艺众所周知。制剂的组分可与药学上可接受的载体或媒介物以及任选添加剂的任何组合(例如，稀释剂、粘合剂、赋形剂、稳定剂、干燥剂、防腐剂、着色剂)组合。使用固体载体和添加有助于有免疫原或佐剂活性的干燥组分或稳定剂溶解的赋形剂为优选实施方案。通常参见Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版(电子版，2003)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第22版(Gennaro,2005,MackPublishing)；Pharmaceutical Dosage Forms，第2版(多位编者，1989-1998,MarcelDekker)；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Ansel等，2005,Williams&Wilkins)。
良好生产规范的在制药工业中是已知的并且由政府机构(例如，食品和药物管理局，EMEA)规定。可通过将制剂的预期组分溶于足够量的适当溶解中，接着通过过滤灭菌以去除污染微生物制备无菌液体制剂。通常，通过将制剂的各种灭菌组分并入含碱性分散介质的无菌媒介物中制备分散体。为生产要求无菌的固体形式，可使用真空干燥或冷冻干燥。
一般而言，可由制剂的至少一种活性成分或组分制成固体剂型(例如，粉末、颗粒、小丸、片剂)。
已知适合的压片程序。也可通过将固体形式的至少一种活性成分装入隔室或腔体内或保持其与液体分离生产所述制剂。每个剂量的大小和向受试者的给药间隔可用于确定片剂、胶囊、隔室或腔体的适合尺寸。
制剂将含有有效量的活性成分(例如，药物、抗原和佐剂)和载体或适合量的媒介物以便提供适合向人类或动物施用的药学上可接受的组合物。
可适当调节剂量和给药方案中活性成分的相对量，例如C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的量，以向受试者(例如，动物或人类)有效施用。这种调节也可取决于受试者的疾病或病状和旨在治疗还是预防。为简化制剂向受试者的施用，每个单位剂量含有供单轮免疫的预定量的活性成分。
多肽不稳定或降解有许多原因，包括水解和变性。就变性而言，扰乱了蛋白质的构象或三维结构并且蛋白质由其常见球状结构展开。不再折叠成其天然构象，疏水相互作用可引起分子凝集在一起(即，聚集)或再折叠成非天然构象。这些结果的任一种均可能需要减少或失去免疫原性或佐剂活性。可添加稳定剂以减少或预防此类问题。
制剂或其生产中的任何中间产物均可用防护剂(即，防冻剂和干燥稳定剂)预处理，然后受到将冰晶形成减到最少的冷却速率和最终温度。通过恰当选择低温防护剂和使用预选干燥参数，几乎所有制剂均可低温制备供适合的所需最终用途。
应理解，在下面对任选添加剂如赋形剂的讨论中，按其功能描述了稳定剂、干燥剂和防腐剂。因此，特定化学药品可起受体、稳定剂、干燥剂和/或防腐剂的一些组合的作用。此类化学药品将无免疫活性，因为它不会直接诱导免疫反应，但是它通过增强抗原或佐剂的免疫活性增强了反应：例如，通过减少抗原或佐剂的修饰，或干燥和溶解周期的变性。
稳定剂包括环糊精及其变异体(参见美国专利No.5,730,969)。也可添加适合的防腐剂例如蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、葡聚糖和甘油以稳定最终制剂(Howell和Miller，1983)。可向制剂中添加选自非离子表面活性剂、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡糖醛酸、D-葡糖醛酸的盐、海藻糖、葡聚糖、羟乙基淀粉及其混合物的稳定剂。添加碱金属盐或氯化镁可稳定C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，任选包括血清白蛋白并且冷冻干燥以进一步增强稳定性。也可通过使其与选自葡聚糖、硫酸软骨素、淀粉、糖原、胰岛素、糊精和藻酸盐的糖接触稳定C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。可添加的其它糖包括单糖、二糖、糖醇及其混合物(例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖醇、木糖醇)。多元醇可稳定多肽并且为水可混溶的或水溶性的。适合多元醇可为多羟基醇、单糖和二糖，包括甘露糖醇、丙三醇、乙二醇、丙二醇、三甲基乙二醇、乙烯基吡咯烷酮、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖及其聚合物。各种赋形剂也可稳定多肽，包括血清白蛋白、氨基酸、肝素、脂肪酸和磷脂、表面活性剂、金属、多元醇、还原剂、金属螯合剂、聚乙烯基吡咯烷酮、水解明胶和硫酸铵。
例如，可通过适当选择赋形剂或稳定剂(Sanchez等，1999)使C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽制剂稳定于蔗糖、海藻糖、聚(乳酸)(PLA)和聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)微球中。因为其为非还原糖，因此不会引起与携带氨基的物质例如蛋白质的氨羰基反应，所以蔗糖或海藻糖可有利地用作添加剂。蔗糖或海藻糖可与其它稳定剂例如糖组合。
另外，包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂可包括治疗剂，例如麻醉剂、止痛剂、抗炎药、类固醇、抗生素、抗关节炎药、食欲抑制药、抗组胺和抗肿瘤药。此类治疗剂的实例包括利多卡因(lidocaine)和非类固醇抗炎药物(NSAID)。在另一个实施方案中，治疗剂为抗原和佐剂。在又一实施方案中，包含抗原和/或佐剂的制剂可单独，但是连同其它治疗剂例如麻醉剂、止痛剂、抗炎药、类固醇、抗生素、抗关节炎药、食欲抑制药、抗组胺和抗肿瘤药一起施加。在一个优选实施方案中，抗生素为非达霉素、甲硝哒唑或万古霉素。
可经由各种施用途径，例如经肌肉内递送包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂。
可向制剂中添加聚合物并且可充当活性成分的赋形剂、稳定剂和/或防腐剂的作用，以及减小使得用于溶解干燥形式的活性成分的溶液饱和的活性成分的浓度。因为聚合物通过填充“空白”空间减小了溶液的有效体积，所以发生此类减小。因此，可保持抗原/佐剂的量，而不减小饱和溶液的量。重要的热力学因素是，饱和溶液中的活性成分将被“驱动”到较低浓度区域中。在溶液中，聚合物也可稳定和/或保护制剂的溶解成分的抗原/佐剂活性。此类聚合物包括乙二醇或丙二醇、乙烯基吡咯烷酮和0-环糊精聚合物和共聚物。
提供了适合施用的单剂量或单位剂量的包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂。单位剂量中佐剂和/或C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的量可在从约0.001μg至约10mg的大范围的任何点。该范围可从约0.1μg至约1mg；较窄范围从约5μg至约500μg。其它适合范围介于约20μg至约200μg，例如约20μg、约75μg或约200μg。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的优选剂量为约20μg或200μg或更少。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽与佐剂之间的比例可为约1:1或约1:1.25，但是也可使用更高比例(例如，约1:10或更小)，或也可使用更低比例的C-TAB分离多肽与佐剂(例如，约10:1或更高)。
C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可用作抗原并且可呈递至免疫细胞，并且诱导抗原特异性免疫反应。这可发生在受病原体，例如艰难梭状芽胞杆菌感染之前、期间或之后。如果制剂的免疫原性足以不需要佐剂活性，则可仅需C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，但不需要附加佐剂。制剂可包括附加抗原，以致施加制剂诱导了对多种抗原(即，多价)的免疫反应。抗原特异性淋巴细胞可参与免疫反应并且，在B淋巴细胞参与的情况下，抗原特异性抗体可为免疫反应的部分。上述制剂可包括本领域已知的干燥剂、赋形剂、湿润剂、稳定剂和防腐剂。
包含本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂可用于治疗受试者(例如，需要治疗，例如预防疾病、防止感染作用、减轻或缓解疾病(例如CDAD)的症状或其组合的人类或动物)。例如，包含本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂可用于治疗有CDAD风险的受试者，例如具有下列特征的受试者：i)免疫系统较弱的受试者，例如老年受试者(例如65岁以上的受试者)或2岁以下的受试者；ii)免疫力低下的受试者，例如患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室(ICU)的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者；viii)患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；ix)有以上提到的两种或更多种特征的受试者，例如计划接受胃肠道手术的老年受试者；x)有炎症性肠病的受试者；和/或xi)患有复发性CDAD的受试者，例如已经历一次或多次CDAD发作的受试者。
治疗可为受试者接种以防止受病原体感染或防止其致病作用，例如毒素分泌引起的致病作用。制剂可治疗性用于治疗现有疾病，保护性用于预防疾病，减轻(减少)疾病的严重程度和/或持续时间，改善疾病的症状或其组合。
包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的制剂可通过各种施用途径递送，包括但不限于口服、皮下、皮内、静脉内、动脉内、肌肉内、心脏内、脊柱内、胸内、腹膜内、心室内和/或舌下途径。
制剂也可包含一种或多种佐剂或佐剂组合。通常，在抗原呈递之前混合佐剂和制剂，但是可选地，它们可在短的间隔时间内单独呈递。
佐剂包括(例如)油乳液(例如完全或不完全弗氏佐剂)、Montanide不完全Seppic佐剂(例如ISA)、水包油乳液佐剂(例如Ribi佐剂系统)、含胞壁酰二肽的syntex佐剂制剂、氢氧化铝或铝盐佐剂(明矾)、聚阳离子聚合物，特别是聚阳离子肽，特别是多聚精氨酸或含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是KLKLLLLLKLK；在限定的碱基范围内含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODN)(例如，如WO96/02555中所述)或基于肌苷和胞苷的ODN(例如，如WO01/93903中所述)，或含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(如WO01/93905和WO02/095027中所述)，特别是寡聚(dIdC)13(如WO01/93903和WO01/93905中所述)；神经活性化合物，特别是人生长激素(在WO01/24822中有描述)或其组合；趋化因子(例如，防御素1或2、RANTES、MIP1-α、MIP-2、白细胞间素-8或细胞因子(例如，白细胞间素-1β、-2、-6、-10或-12；干扰素-γ；肿瘤坏死因子-α；或粒细胞-单核细胞-菌落刺激因子))(查阅Nohria和Rubin,1994)、胞壁酰二肽变异体(例如，莫拉丁酯、苏氨酰基-MDP或胞壁酰基三肽)、MDP的合成变异体、热休克蛋白或变异体、利什曼原虫主要LeIF的变异体(Skeiky等，1995)、细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)的无毒变异体，包括胰蛋白酶裂解位点的变异体(Dickenson和Clements，(1995)和/或影响ADP-核糖基化的变异体(Douce等，1997)或化学解毒bARE(类毒素)、QS21,Quill A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-[1,2-二棕榈酰基-s-甘油基-3-(羟磷酰氧基)]乙酰胺(MTP-PE)和含有可代谢油和乳化剂的组合物，其中油和乳化剂以水包油乳液形式存在，油滴直径大体上全部小于1μm(见，例如，EP0399843)。同样，用于免疫的其它佐剂，见Richards等(1995)。
可选择佐剂以优先诱导抗体或细胞效应子，特异性抗体同型(例如，IgM、IgD、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgE、IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4)或特异性T细胞亚群(例如，CTL、Th1、Th2和/或TDTH)(参见例如，Munoz等，1990；Glenn等，1995)。
已知未甲基化CpG二核苷酸或基序活化B细胞和巨噬细胞(Stacey等，1996)。可使用其它形式的DNA作为佐剂。细菌DNA属于其模式允许免疫系统识别其致病原以刺激导致适应性免疫反应的先天性免疫反应的一类结构(Medzhitov和Janeway，1997,Curr.Opin.Immunol.9(1):4-9)。这些结构称为病原体相关分子模式(PAMP)并且包括脂多糖、磷壁酸、未甲基化CpG基序、双链RNA和mannin。PAMP诱导可介导炎症反应，起T细胞功能的辅助刺激因子作用并且控制效应子功能的内源信号。PAMP诱导这些反应的能力在其作为佐剂的潜能中起作用并且其靶标为APC，例如巨噬细胞和树突细胞。PAMP也可连同其它佐剂一起使用以诱导不同辅助刺激分子并且控制不同效应子功能指导免疫反应，例如从Th2到Th1的反应。
本发明的其它方面涉及C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽作为接种剂的用途。本发明的疫苗或免疫原性组合物可采用有效量的抗原。将包括一定量会使受试者产生特异性且足够的免疫反应的抗原，以便给予受试者对随后暴露于艰难梭状芽胞杆菌的保护。抗原可为C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。在一个实施方案中，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽单独或联合佐剂一起施用。
本发明的另一方面包括C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽作为亚单位疫苗的用途。亚单位疫苗指病原体作为孕育剂的用途。本领域的技术人员将了解，亚单位疫苗提供了对病原体的特定部分或区域生成抗体的方式。
可通过本领域已知的方法确定施用剂量方案和疫苗功效。疫苗的量和免疫方案可取决于采用的特定抗原和佐剂、施用模式和频率和预期效果(例如，保护和/或治疗)。一般而言，可按范围介于1μg和100mg之间，例如介于60μg和600μg之间的量施用本发明的疫苗。包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的疫苗的单次剂量可在从约1μg至约1mg，优选从约5μg至约500μg，更优选从约20μg至约200μg的范围内。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽与佐剂(例如明矾)之间的比例可为约1:1，例如1:1.25，但是也可使用更高比例(例如，约1:10或更小)，或也可使用更低比例(例如，约10:1或更高)。在一个实施方案中，在包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的疫苗中，将使用范围从约50μg/mL至约200μg/mL的氢氧化铝佐剂，优选量为约125μg/mL的最终制剂。
包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的疫苗可经口服、静脉、皮下、动脉、肌肉内、心脏内、脊柱内、胸内、腹膜内、心室内和/或舌下施用。
可通过本领域已知的方法确定免疫方案。正如经本领域技术人员确定有必要那样，可重复施用疫苗。例如，初次剂量后可为间隔一周、两周或一个月的1、2、3次或更多次加强剂量。在本发明的一个实施方案中，初次剂量后为1或2次加强施用，间隔约7至约14天，例如在初免7天和21天后。在一个优选实施方案中，间隔14天+/-1、2、3天(两周一次)，向受试者施用治疗有效量的疫苗2或3次。在本发明的一个实施方案中，施用治疗有效量的疫苗一次。
又一方面涉及可根据本发明治疗的群体。在一个实施方案中，所述群体包括有暴露于艰难梭状芽胞杆菌风险的健康个体，特别是即将住院或居住在护理机构的个体以及在医院、疗养院和其它护理机构的个人。在另一个实施方案中，所述群体包括先前受感染，在停止抗生素治疗后复发的患者，或对其而言抗生素治疗无效的患者。
在本发明的一个实施方案中，所述群体包括至少18岁或更大年龄的个体。在一个优选实施方案中，人类受试者为18-65岁。在另一优选实施方案中，人类受试者为65岁以上的老年个体。后一年龄组是遭受艰难梭状芽胞杆菌感染的最脆弱的群体。在更多实施方案中，人类受试者为18岁以下。
使用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的方法
本发明还提供了使用分离多肽的方法。例如，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可用于预防或治疗与艰难梭状芽胞杆菌相关的疾病。举例而言，向受试者的免疫系统中引入本发明的分离多肽可诱导包括受试者产生对抗分离多肽的抗体在内的免疫反应。此类抗体对识别艰难梭状芽胞杆菌有用。
本发明提供了向受试者递送分离多肽的方法，包括向受试者施用分离多肽。分离多肽可以液体形式或以固体形式施用。分离多肽可进一步包括药学上可接受的载体。
本发明还提供了鉴定和分离识别并结合毒素A和/或毒素B的抗体的可变结构域，包括使用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽产生免疫反应，纯化，然后表征响应于C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽产生的抗体。鉴定的表位可具有克隆更多抗体或其片段的用途。
本发明的一个方面部分涉及对艰难梭状芽胞杆菌的治疗、预防和检测。在一些实施方案中，受试者，例如动物接受对艰难梭状芽胞杆菌的治疗和/或预防和/或检测。在其它实施方案中，动物为人类。例如，本发明的多肽可用于在体内产生艰难梭状芽胞杆菌的抗体。再举例而言，本发明的多肽可用于确定受试者是否对艰难梭状芽胞杆菌产生抗体。在一些实施方案中，多肽用于分离抗体。举例而言，多肽可与亲和基质结合。
再举例而言，本发明的核酸可用于转化和/或转染细胞以重组生成本发明的多肽和/或抗体。例如，本发明的核酸也可用于确定受试者是否受艰难梭状芽胞杆菌感染。举例而言，这可使用放射性标记杂交方法实现。
再举例而言，本发明的抗体可用于识别艰难梭状芽胞杆菌的感染。举例而言，抗体可识别作为抗原的天然毒素A和/或毒素B。本发明的抗体也可用于抵抗艰难梭状芽胞杆菌的感染。举例而言，人源化抗体或抗体片段或单克隆抗体可采用受试者自身对艰难梭状芽胞杆菌感染的免疫反应。再举例而言，本发明的抗体可与细胞因子或毒素或酶或标记偶联以帮助治疗和检测感染。
本发明另外的方面涉及诊断测定法。本发明与本领域已知的许多测定法一起使用。本领域的技术人员将认识到，广泛研究基于本发明多肽、核酸和抗体的用途。例如，本发明的多肽、抗体和核酸可经(例如)放射性、化学发光、荧光和/或染料分子标记。本发明的抗体、核酸和多肽参与使用测定法，例如DNA测定法(例如DNA印迹法)、RNA测定法(例如RNA印迹法)、蛋白质测定法(例如蛋白质印迹法)、色谱测定(例如气相、液相、HPLC、尺寸排阻)、免疫测定法(例如ELISA)和结构测定法(例如结晶学和NMR光谱法)。本发明的抗体、多肽和核酸可进一步用作探针。增强来自探针的信号的测定也为本领域的技术人员已知。
试剂盒
本发明提供了包含(举例而非限制而言)编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸、C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和/或抗C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的抗体的试剂盒。试剂盒可包括一个或多个容器和根据本文描述的本发明的任何方法使用的说明书。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽和/或抗体可用于各种测定法中，报考检测艰难梭状芽胞杆菌的免疫测定法。在一个实施方案中，C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽用于起抗原的作用，用于检测生物样品中的抗体的目的。容器可为单位剂量、散装(例如，多剂量包)或亚单位剂量。本发明的试剂盒具有合适的包装。还考虑到联合特定装置，例如吸入器、鼻腔施用装置或输注装置一起使用的包装。试剂盒可具有无菌进入孔。容器也可具有无菌进入孔。试剂盒可任选地提供附加组分例如缓冲液和解释信息。
试剂盒可用于检测艰难梭状芽胞杆菌的存在或检测与艰难梭状芽胞杆菌相关的疾病，例如CDAD。试剂盒可用于预防或治疗与艰难梭状芽胞杆菌相关的疾病。本发明的试剂盒也可用于缓解与艰难梭状芽胞杆菌相关的疾病的症状。
无需进一步描述，据信本领域的普通技术人员可使用前面的描述和下列说明性实施例获得并利用要求保护的发明。因此，下列工作实施例特别指出了本发明的优选实施方案，并且不得解释为以任何方式限制其余公开内容。本申请通篇提到的所有论文、出版物、专利和文件据此通过引用整体并入。
实施例
实施例1：C-TAB.G5和C-TAB.G5.1分离多肽的制备
本实施例描述了制备包含艰难梭状芽胞杆菌毒素A(CTA)和B(CTB)的在大肠杆菌细胞中表达的部分的分离多肽。下面描述的方法可用于制备包含CTA和CTB的各种分离多肽。例如，描述了包含CTA的C末端结构域的部分和CTB的C末端结构域的部分的分离多肽。
实施例1.1：C-TAB.G5和C-TAB.G5.1基因构建体的克隆
使用下列引物，通过PCR由艰难梭状芽胞杆菌菌株630(ATCC BAA-1382)的基因组DNA扩增CTA基因(登录号YP-001087137)的编码C末端结构域的氨基酸2026-2710的部分：
正向：5’-caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc-3’(SEQ ID NO:9)和
反向：5’-CTCGAGttagccatatatcccaggggc-3’(SEQ ID NO:10)。
用正向引物扩增产生SpeI位点，并且用反向引物扩增产生Xhol位点。
使用下列引物，通过PCR扩增CTB基因(登录号：YP-00108735)的编码C末端结构域的氨基酸1850-2366的部分：
正向：5’-caccATGCATatgagtttagttaatagaaaacag-3’(SEQ ID NO:11)和
反向：5’-ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc-3’(SEQ ID NO:12)。
用正向引物扩增产生Nsil位点，并且用反向引物扩增产生Xhol位点。
使用PCR Super-Mix(Invitrogen)进行PCR反应。循环条件为95℃下2分钟、95℃下45秒、55℃下50秒、68℃下8分钟(循环30次)和72℃下10分钟。用快速基因提取试剂盒(Invitrogen)纯化PCR产物并且连至PCR2.1TOPO载体(Invitrogen)中。连接混合物用于通过热休克转化大肠杆菌Mech-1细胞。将转化体接种在ImMedia Amp Blue板(Invitrogen)上。挑取白色菌落并且在15ml管中用4ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养。在37℃下培育培养物过夜并且用快速质粒小量提取试剂盒(Invitrogen)提取。
用SpeI和XhoI消化PCR2.1-TOPO/TA载体中的CTA基因片段，并且使用T4DNA连接酶将片段克隆至中间载体中，中间载体也用SpeI和XhoI消化。然后使用下列合成引物，通过PCR将含有3个限制位点(BgLII-NsiI-SacI)的连接子插入CTA基因片段的3’端：
正向：
5’-AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacgaaaggctcagc-3’(SEQ ID NO:13)
反向：5’-cggtccggggccatatatcccaggggcttttactcc-3'(SEQ ID NO:14)。
用Nsil和Xhol消化PCR2.1-TOPO/TB中的CTB基因片段，并且将经消化的CTB基因片段连接至含有CTA基因和连接子的中间载体中，中间载体也用Nsil和Xhol消化。CTB基因插入连接子的3’，产生构建体序列5’-CTA-连接子-CTB-3’。这种融合构建体称为C-TAB.V1中间载体。
使用引物通过PCR由C-TAB.V1中间载体扩增C-TAB.G5基因：
正向：5’-caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagga(SEQ ID NO:15)
反向：5’-CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg(SEQ ID NO:16)。
使用PCR Super mix(Invitrogen)进行PCR反应。循环条件为95℃下2分钟、95℃下45秒、55℃下50秒、68℃下4分钟(循环30次)和72℃下10分钟。用快速基因提取试剂盒(Invitrogen)纯化PCR产物并且连至PCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中。连接混合物用于通过热休克转化大肠杆菌Mech-1细胞。将转化体接种在ImMedia Amp Blue板(Invitrogen)上。挑取白色菌落并且于15ml管中用4ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养。在37℃下培育培养物过夜并且用快速质粒小量提取试剂盒(Invitrogen)提取。用NcoI和XhoI限制酶消化PCR2.1-TOPOTA载体中的C-TAB.G5融合基因。将这些C-TAB片段连接至用相同限制酶消化的pET28表达载体中。这种所得构建体编码与毒素B C末端结构域氨基酸1851-2366融合的毒素A C末端结构域氨基酸2272-2710。将pET28/C-TAB.G5构建体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。选择5个含C-TAB.G5融合基因的菌落进行分析。
通过密码子优化获得C-TAB.G5.1编码序列以增强在大肠杆菌宿主细胞中的表达。密码子使用适于大肠杆菌基因的密码子偏向。另外，调节GC含量以延长mRNA半衰期；已避开了极高(>80%)或极低(<30%)GC含量的区域。因此，优化基因允许在大肠杆菌中高而稳定的表达。原位合成密码子优化的C-TAB.G5.1基因并且亚克隆至表达载体pET-28b(+)中。
DNA测序：使用染料终止循环测序化学法，用d-若丹明染料确认质粒DNA序列。使用Jellyfish软件分析测序数据。
实施例1.2：重组C-TAB.G5或C-TAB.G5.1融合蛋白在大肠杆菌中的表达
C-TAB.G5和C-TAB.G5.1基因构建体的表达可使用标准程序进行，以在大肠杆菌中表达。
筛选表达重组C-TAB融合蛋白的菌落：为了筛选的目的，挑取菌落并且于15ml离心管(Falcon tube)中用4ml具有50μg/ml卡那霉素的LB培养基培养。在37℃下经250rpm混合培养所述管过夜。生长初期后，从每根管转移1ml培养物到24孔组织培养板并且在30℃下用1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)诱导3h。通过于微型离心机中在12,000g下离心1min收集细胞团块。制备细胞团块溶解产物，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析测定可溶部分的C-TAB融合蛋白的表达。选择阳性克隆做进一步评估。
分批发酵以表达C-TAB.G5：种子培养物在5个各装有150ml补充了30μg/ml卡那霉素的超级肉汤培养基的500ml摇瓶中生长。培养物在28℃下，于275rpm下连续搅动生长12h，直至OD600达到2-2.5。用摇瓶接种装有10L超级肉汤的发酵罐。培养物在37℃下生长约4.5h至OD600=3.5-4。为诱导产物表达，添加0.1mM IPTG并且在25℃下再继续生长4h。然后通过离心收获细胞并且细胞糊在-70℃下冷冻储存。该发酵过程达到的典型产物特异性表达速率为约200mg/ml。
分批补料发酵以用于C-TAB.G5.1制备：使用种子库的500μl甘油原料等分试样(储存于-75℃)接种1L烧瓶中100ml补充了30μg/ml卡那霉素的预培养基。在37℃下在～150rpm连续搅动下培育预培养物约7h，直至其达到OD600=1.0–2.0。用25mL的预培养物接种装备有过程控制系统，能够进行分批补料发酵的标准工业15L发酵罐中的7L分批发酵培养基。7L分批培养期在37℃下进行12h(OD600=12-15)，直至葡萄糖耗尽。然后在37℃下，在比生长速率常数μ=0.25/h下通过指数补料模式开始葡萄糖补料期6h(OD600=40-50)。转为持续补料期并且以最终浓度1mM IPTG诱导(产物生成)1h前，温度降至30℃以降低内含体形成的风险。产物表达期在30℃下随着持续补料再持续5h(OD600=～100)，导致总发酵过程时间为23h并且最终培养体积为～8.2L。通过离心收获约1.2kg的湿细胞生物质并且储存在≤-70℃下。此分批补料发酵达到的典型产物特异性表达速率高达1.3g/L。
实施例1.3：重组C-TAB.G5或C-TAB.G5.1融合蛋白的纯化
C-TAB.G5分析样品的纯化：解冻冷冻的细胞糊并且重悬于pH5.6的10mM柠檬酸/NaOH缓冲液中，并且在550巴下使细胞浆料通过均化器(GEA Niro Soavi均化器)两次。离心悬浮液两次：一次在13500rpm下进行30min而第二次于超速离心机中在18000rpm下进行1h。汇合上清液，用pH3的50mM柠檬酸缓冲液将pH调至5.6。澄清细胞溶解产物通过具有pH5.6的10mM柠檬酸/NaOH缓冲液的SP快速流量柱。用20mM NaPi中从0升至500mM的线性梯度的氯化钠洗脱蛋白质。汇合含C-TAB.G5的部分。用蒸馏H2O将传导率调低至5mS/cm。添加Tris至25mM最终浓度。汇合部分通过DEAE快速流量柱。用25mM Tris中从50升至500mM的线性梯度的氯化钠洗脱蛋白质。同样，汇合含C-TAB.G5的部分并且添加1.5M Na-柠檬酸盐(pH7.5)至最终浓度为0.4M。将C-TAB.V1汇合物装入用25mM Tris、0.4M Na-柠檬酸盐(pH7.5)平衡的苯酚琼脂糖HP柱。使用5mM Tris(pH7.5)，以呈线性梯度降低的盐浓度洗脱C-TAB.G5融合蛋白。用AKTA Prime色谱系统监测所有柱。使用50K膜将纯化的C-TAB融合蛋白缓冲液交换为PBS。
C-TAB.G5.1散装制剂的纯化：生物质储存在-80℃下直至加工。用4体积的裂解缓冲液(20mM Hepes，pH7.5，～0.6mS/cm)(例如450g糊+1800mL缓冲液)稀释450g冷冻细胞糊并且通过这种方式在机械搅动下解冻～1h±0.5h。任选地，可使用Ultraturrax重悬剩余凝块(例如在8000rpm下5min)。在Niro Soavi Panda高均化器上进行细胞裂解(640±25巴，循环3次)。使用热交换器将溶解产物冷却至<10℃并且保持在该温度下直至离心。将粗细胞溶解产物提交至分批离心步骤(Beckmann Avanti JLA60.25)，在14000rpm(30000g)、4℃下操作30min。收集并汇合上清液。将团块的半液体部分也丢弃，以降低阻碍过滤步骤的风险。然后通过Supercap PDH4100/5英寸深的过滤器囊(Pall)(250cm2有效过滤面积)过滤汇合的上清液。用裂解缓冲液冲洗过滤器壳中的剩余溶解产物。澄清后，向溶解产物中添加等分试样的1M Tris原液(pH7.5)至25mM的最终浓度。最终溶解产物的缓冲液组成为20mM Hepes、25mM Tris(pH7.5，传导率～6mS/cm)。过滤后溶解产物可能仍稍有混浊，但是这不影响后面的捕获步骤。在室温下于下列尺寸的XK50/30柱(GE Healthcare)中，用DEAE琼脂糖FF(GEHealthcare)进行捕获步骤：直径50mm、填充床高度20cm、填充床体积～400mL。装料密度为约0.8-1.2g生物质/mL凝胶。用系统(GE Healthcare)进行所述过程并且在280nm下监测。在100cm/h下用约5CV的25mM Tris、20mM Hepes、25mM NaCl(pH7.5，传导率～5mS/cm)进行平衡，直至pH、传导率和280nm吸光度稳定。在75cm/h下将溶解产物装入柱中并且丢弃流过物。当装入所有过滤溶解产物时，用约5CV的平衡缓冲液恢复流量，直至280nm吸光度稳定。在洗涤步骤2期间用5CV的25mM Tris、175mM NaCl(pH7.5，传导率19mS/cm)从柱中去除杂质。用3CV的25mM Tris、375mM NaCl(pH7.5，传导率36mS/cm)，通过分步洗脱从柱中洗脱C-TAB蛋白。当280nm吸光度开始升高时(通常在1CV后)开始收集含C-TAB的部分并且持续约0.5-1.0CV。含C-TAB的汇合部分可储存在2-8℃下过夜。在室温下于具有下列尺寸的XK50/30柱(GE Healthcare)中用SP-琼脂糖FF(GE Healthcare)进行中间产物纯化步骤：直径50mm、填充床高度20cm、填充床体积～400mL。最高装料密度为约4-5mgC-TAB/mL凝胶。用系统(GE Healthcare)进行所述过程并且在280nm下监测。除非过度背压(>4巴)对其有妨碍，则在200cm/h(65mL/min)的最大流量下进行平衡、洗涤和线性梯度洗脱步骤。在200cm/h下用约5-10CV的缓冲液进行平衡，直至pH、传导率和280nm吸光度稳定。装料之前，必须调节DEAE汇合物以允许C-TAB结合在SP-FF树脂上。用SP-FF平衡缓冲液(10mM柠檬酸、2mM EDTA，pH5.5±0.1，传导率～2mS/cm)稀释DEAE汇合物25倍至最终传导率不超过3.5mS/cm，pH5.5±0.1。如有必要，添加额外的MilliQ水以达到所需传导率。注意，低传导率对允许C-TAB结合在SP-FF上非常关键。在150cm/h下将样品装入柱中并且丢弃流过物。装入样品后，在200cm/h下用约5CV的平衡缓冲液恢复流量，直至280nm吸光度稳定。在100cm/h下通过超过10CV，从0%平衡缓冲液到的30%20mM磷酸钠、500mM NaCl(pH7.0)的线性梯度进行洗脱。收集部分并且按UV280nm吸光度进行汇合。在15%的最大峰值下开始汇合并且在15%的最大峰值下结束。立即使用1.5M柠檬酸盐原液(pH8.0)将汇合物调节为400mM柠檬酸盐(最终pH7，约49mS/cm)。经调节的SPFF汇合物应具有pH7和约49mS/cm并且储存在2-8℃下过夜。
在室温下于具有下列尺寸的XK50/30柱(GE Healthcare)中，用苯基-琼脂糖HP(GEHealthcare)进行精制色谱步骤：直径50mm、填充床高度15cm、填充床体积～300mL。装料密度为约4-5mg C-TAB/mL凝胶。用系统(GE Healthcare)进行所述过程并且在280nm下监测。除非过度背压(>4巴)对其有妨碍，则在100cm/h(33mL/min)的最大流量下进行平衡、装料、洗涤和洗脱步骤。在这种情况下必须降低流量。在100cm/h下用约5-10CV的25mMTris、400mM柠檬酸钠(pH7.5，46mS/cm)进行平衡，直至pH、传导率和280nm吸光度稳定。在100cm/h下将样品装入柱中并丢弃流过物。装入样品后，在100cm/h下用约5CV的平衡缓冲液恢复流量，直至280nm吸光度稳定。在100cm/h下用超过20CV，从100%平衡缓冲液/0%5mMTris(pH7.5，0.5mS/cm)到100%5mM Tris(pH7.5，0.5mS/cm)的线性梯度进行平衡。收集部分并且按UV280nm吸光度进行汇合。在约10-15%的最大峰值下开始汇合并且在约20%的最大峰值下结束。将经调节的汇合物储存在2-8℃下过夜。通过在室温下操作的30kDa截止切向流过滤(TFF，Pellicon2膜，Millipore)完成最终C-TAB药物蛋白溶液的制备。用制剂缓冲液(20mM组氨酸、75mMNaCl、5%蔗糖、0.025%pH6.5)渗滤蛋白溶液，直至渗透pH等于6.5±0.2。
在280nm下根据UV测量，使用1.566作为280nm下C-TAB(蛋白质浓度1mg/mL，1cm比色杯)的比消光系数将最终蛋白质浓度调至2mg/mL。
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：将全细胞溶解产物和经纯化的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1融合蛋白重悬于含β-巯基乙醇的Nu-Page样品缓冲液中并且煮沸10min。将样品(25μl)装入3-8%Tris-醋酸盐凝胶中。电泳后(150V，持续1h)，通过用全蓝变为凝胶染色可视化蛋白质或用于蛋白质印迹分析。
使用毒素特异性抗体通过蛋白质印迹分析确定C-TAB.G5或C-TAB.G5.1特异性表达。在23V下60min，使用于10%甲醇中的1×转移缓冲液将蛋白质转移到PVDF膜上。在室温下用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.5%酪蛋白封闭膜1h。在室温下用抗毒素B的单克隆抗体(GenWay；克隆B426M)或抗毒素A的内部衍生化豚鼠多克隆抗体(List Biological Labs)培育转移膜2小时。用辣根过氧化物酶偶联的抗豚鼠IgG或抗小鼠IgG培育经洗涤的膜。洗涤印迹并且添加AEC底物。经轻轻混合培育印迹5-10min。用水冲洗印迹以终止显色。
RBC血细胞凝集：已经证实毒素A而非毒素B的细胞结合结构域能够使兔红细胞(RBC)凝集。凝集过程是毒素A与兔RBC上的血型抗原上发现的多糖序列结合的结果。样品(C-TAB.G5和天然毒素A)于PBS中稀释至100μg/ml。在V型底部微量滴定板中，在板上制备两倍连续稀释物，一式两份，从100μg/ml开始并且在每个孔中留50μl的稀释物。向微量滴定板的每个孔添加50μl的0.75%兔RBC/PBS悬浮液并且在室温下培育所述板1h。不能在板的底部形成RBC团块表明血细胞凝集。用具有最高样品稀释，其中未观察到RBC团块的孔中存在的蛋白质的浓度表示血细胞凝集滴度。
实施例2：小鼠体内明矾存在和缺失时重组C-TAB.G5融合蛋白的剂量滴定
该研究是按C-TAB效能测定法测定有和无明矾佐剂的C-TAB.G5的体内剂量滴定的可能性。利用的明矾为Alydragel(明矾氢氧化物，Brenntag)。利用介于8至9周龄之间的C57BL/6雌性小鼠(Charles River Labs.)进行免疫。在第0天所有动物通过向右大腿肌肉经肌肉内(IM)注射(50μl)接受首次免疫。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次免疫。总共72只小鼠分为如下接种的12个组：-第1组：仅PBS
-第2组：100(154)ng C-TAB.G5
-第3组：300(462)ng C-TAB.G5
-第4组：1,000(1,540)ng C-TAB.G5
-第5组：3,000(4,620)ng C-TAB.G5
-第6组：10,000(15,400)ng C-TAB.G5
-第7组：含有50μg明矾的PBS
-第8组：10.0(15.4)ng含有50μg明矾OH的C-TAB.G5
-第9组：30.0(46.2)ng含有50μg明矾OH的C-TAB.G5
-第10组：100(154)ng含有50μg明矾OH的C-TAB.G5
-第11组：300(462)ng含有50μg明矾OH的C-TAB.G5
-第12组：1,000(1,540)ng含有50μg明矾OH的C-TAB.G5
在该研究中，首先根据标准方案Quick StartTM Bradford蛋白测定法(Bio-Rad)测定蛋白质浓度。近来，根据实施例1.3中描述的程序，在280nm下通过UV测量重新测定蛋白质浓度(示于括号内)。在所有随访研究中，通过UV法测量蛋白质浓度。
首次免疫2周后(研究第14天)和第二次免疫2周后(研究第28天)从所有动物收集血样。将血清储存在-20℃下，直至分析。
血清IgG ELISA：在酶联免疫吸附测定(ELISA)中评估对C-TAB.G5或C-TAB.G5.1(称为C-TAB)、毒素A和毒素B或类毒素产生的血清抗体。简言之，在PBS中制备1.0μg/ml的毒素A、毒素B或C-TAB.G5分离多肽原液并且向96孔板的每个孔添加100μl。在4℃下培育过夜之后，用0.5%酪蛋白封闭缓冲液洗涤并封闭所述板。板经再次洗涤并且向板添加连续稀释两倍的试验血清。在4℃下第二次培育过夜之后，用过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG(H+L)洗涤并培育板。在室温下培育2h后，再次洗涤板，添加过氧化物酶底物(2,2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸盐)并且允许在室温下显色2h。通过向孔中添加50μl的2%SDS终止反应。用ELISA酶标仪在405nm吸光度下读板。报道血清抗体滴度作为产生1.0的OD405nm读数的血清稀释物的ELISA单位的几何平均数。作为阴性对照，使用在首次免疫前预先放血的动物获得免疫前血清汇合样品评估抗体反应。
接受C-TAB.G5的动物展现出在抗体滴度方面的剂量依赖性升高，明矾佐剂允许在较低剂量的C-TAB.G5下抗体滴度显著升高。图3示出了抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B IgG的滴度。图4示出了在明矾存在或缺乏时抗体滴度的图解比较。
实施例3：小鼠体内C-TAB.G5的免疫原性和保护效力
该研究是评估接受艰难梭状芽胞杆菌毒素A或毒素B的致死性攻毒的经接种小鼠体内，C-TAB.G5的免疫原性和保护效力。利用6-7周龄的雌性C57BL/6小鼠(Charles RiverLabs.)进行该研究。在第0天所有动物通过向右大腿肌肉经肌肉内(IM)注射(50μl)接受首次接种。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次接种。将116只小鼠分为如下接种的组：
·第1组：仅PBS
·第2组：3μg C-TAB.G5
·第3组：10μg C-TAB.G5
·第4组：30μg C-TAB.G5
·第5组：3μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
·第6组：10μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
·第7组：30μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
·第8组：仅PBS
·第9组：3μg C-TAB.G5
·第10组：10μg C-TAB.G5
·第11组：30μg C-TAB.G5
·第12组：3μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
·第13组：10μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
·第14组：30μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
在第二次免疫2周后(研究第28天)从所有动物收集血样。将血清储存在-20℃下，直至分析。然后通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以ELISA单位(EU)报道。
图5示出了在第二次免疫2周后(研究第28天)评估的小鼠体内C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度。该研究证明，C-TAB.G5融合蛋白在小鼠体内有高度免疫原性并且即使不添加佐剂，也能够诱导抗毒素A和毒素B的强烈抗体反应。可通过与明矾氢氧化物一起联合递送可显著增加(大于一个对数)C-TAB.G5免疫原性。接受C-TAB.G5(有或无明矾)的动物在一个对数剂量范围内展示出抗体反应增强2倍。
除评估抗体滴度外，在体外毒素中和测定(TNA)中估计通过用C-TAB.G5免疫产生的抗体中和天然毒素A和B的能力。
毒素中和抗体测定(TNA)。对于体外分析，用从经免疫的小鼠获得的125μl连续稀释的抗血清培育125μl毒素A(5ng/ml)或毒素B(1ng/ml)。在37℃下培育1h后，向装有Vero细胞(猴肾细胞)的微量滴定板添加毒素:血清混合物，并且培育微量滴定板18h。毒素A或B与Vero细胞一起培育导致细胞形态变化和失去细胞粘附，这通过在去除非粘附细胞后中性红染色经毒素处理的细胞测量。报道血清的毒素中和滴度作为毒素活性降低50%的血清稀释度。
图6中示出了TNA测定的结果。数据表明，单独用C-TAB.G5免疫后产生的抗体能够中和天然毒素A而非毒素B的毒活性。当C-TAB.G5与明矾一起联合递送时，抗毒素A TNA的TNA滴度增加约6倍而抗毒素B TNA的滴度仅降低2倍。该数据表明，C-TAB.G5分离多肽不但保留了天然毒素中存在的抗体识别抗原表位，而且包含生成功能毒素中和抗体所需的关键抗原表位。因此，C-TAB.G5对中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的毒性作用有效，因此在接种中有用。
除评估抗体反应外，还测定了C-TAB.G5免疫保护小鼠免受天然毒素的致死性攻毒的能力。第二次接种3周后(研究第35天)，接种和未接种组的动物(N=8)经腹膜内(IP)接受致死剂量的25ng毒素A或50ng毒素B。在后面9天监测小鼠的存活率并且将结果示于图6中。该实验证明，在明矾佐剂缺乏时用C-TAB.G5使小鼠免疫能够赋予对天然毒素A致死性攻毒的100%防护和对毒素B攻毒的50%防护。C-TAB.G5与明矾联合递送增强对毒素B的保护性免疫至100%防护。该数据表明，在致死性攻毒模型中C-TAB.G5接种诱导了足以保护小鼠免受毒素A和B的毒性作用的免疫反应。
实施例4：评估幼龄和老龄小鼠体内C-TAB.G5的免疫原性和保护效力
该研究是比较幼龄和老龄小鼠体内对C-TAB.G5发动的免疫反应。利用分别6-7周龄和18月龄的雌性C57BL/6小鼠(Charles River Labs.)进行该研究。在第0天所有动物通过向右大腿肌肉经肌肉内(IM)注射(50μl)接受首次接种。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次接种。将192只小鼠分为如下接种的组：
-第1组：对幼龄小鼠接种PBS
-第2组：对老龄小鼠接种PBS
-第3组：对幼龄小鼠接种10μg C-TAB.G5
-第4组：对幼龄小鼠接种30μg C-TAB.G5
-第5组：对老龄小鼠接种10μg C-TAB.G5
-第6组：对老龄小鼠接种30μg C-TAB.G5
-第7组：对幼龄小鼠接种10μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第8组：对幼龄小鼠接种30μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第9组：对老龄小鼠接种10μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第10组：对老龄小鼠接种30μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第11组：对幼龄小鼠接种PBS
-第12组：对老龄小鼠接种PBS
-第13组：对幼龄小鼠接种10μg C-TAB.G5
-第14组：对幼龄小鼠接种30μg C-TAB.G5
-第15组：对老龄小鼠接种10μg C-TAB.G5
-第16组：对老龄小鼠接种30μg C-TAB.G5th
-第17组：对幼龄小鼠接种10μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第18组：对幼龄小鼠接种30μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第19组：对老龄小鼠接种10μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
-第20组：对老龄小鼠接种30μg C-TAB.G5+50μg明矾OH
第二次接种3周后(研究第35天)，接种和未接种组的动物(N=6)接受经腹膜内(IP)注射25ng毒素A或50ng毒素B的致死性攻毒。在后面9天监测小鼠的存活率。
首次免疫两周后(研究第14天)和第二次免疫两周后(研究第28天)从所有动物收集血样。血清储存在-20℃下直至分析。然后通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以ELISA单位(EU)报道。使用经细胞毒性量的重组毒素A和毒素B处理的Vero细胞测定毒素A和毒素B中和抗体(TNA)。
接受C-TAB.G5疫苗的幼龄动物与老龄动物相比，展示出所有测试抗体的水平明显更高。在明矾氢氧化物的存在下接种C-TAB.G5的幼龄小鼠中获得了特别高的抗体滴度(图7)。在毒素B TNA滴度上获得特别明显的提高。同时，幼龄和老龄小鼠之间在抵挡毒素A和毒素B攻毒的能力上没有大的差异。然而，当在明矾的存在下接种时，两个小组均展示出保护率提高。图7示出了对幼龄和老龄小鼠的C-TAB.G5免疫原性和保护效力的比较。图8示出了幼龄和老龄小鼠中抗C-TAB抗体发展的动力学。
实施例5：C-TAB.G5.1与类毒素A和B的免疫原性和保护效力的比较
该研究是比较C-TAB.G5.1与类毒素A/B的免疫原性和保护效力。所用类毒素A/B是相等份数(1:1)的类毒素A(批号#1009132)和类毒素B(批号#1009133)的混合物。通过福尔马林固定制备类毒素并且由TechLab提供。利用6-7周龄的雌性C57BL/6小鼠(CharlesRiver Labs.)进行该研究。在第0天所有动物通过向右大腿肌肉经肌肉内(IM)注射(50μl)接受首次接种。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次接种。将180只小鼠分为如下接种的组：
-第1组：仅PBS
-第2组：10μg C-TAB.G5.1
-第3组：30μg C-TAB.G5.1
-第4组：10μg C-TAB.G5.1+50μg明矾OH
-第5组：30μg C-TAB.G5.1+50μg明矾OH
-第6组：30μg类毒素A/B
-第7组：10μg类毒素A/B
-第8组：30μg类毒素A/B+50μg明矾OH
-第9组：30μg类毒素A/B+50μg明矾OH
-第10组：PBS
-第11组：10μg C-TAB.G5.1
-第12组：30μg C-TAB.G5.1
-第13组：10μg C-TAB.G5.1+50μg明矾OH
-第14组：30μg C-TAB.G5.1+50μg明矾OH
-第15组：10μg类毒素A/B
-第16组：30μg类毒素A/B
-第17组：10μg类毒素A/B+50μg明矾OH
-第18组：30μg类毒素A/B+50μg明矾OH
第二次接种3周后(研究第35天)，接种和未接种组的动物(N=6)接受经腹膜内(IP)注射28ng毒素A或50ng毒素B的致死性攻毒。在后面9天监测小鼠的存活率。
首次免疫两周后(研究第14天)和第二次免疫两周后(研究第28天)从所有动物收集血样。血清储存在-20℃下直至分析。然后通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以ELISA单位(EU)报道。使用经细胞毒性量的重组毒素A和毒素B处理的Vero细胞测定毒素A和毒素B中和抗体(TNA)。
该研究证明了两次接种后小鼠体内C-TAB.G5.1和类毒素A/B的免疫原性和保护效力。与接受类毒素A/B的动物相比，接受C-TAB.G5.1的动物显示出更低但是显著的抗C-TAB抗体滴度。同样，联合递送明矾大大增强了测试的所有抗体反应。因此，在明矾的存在下经C-TAB.G5.1或类毒素A/B免疫的动物体内达到的抗C-TAB和抗毒素A抗体的水平相似。与经类毒素A/B免疫的小鼠相比，当用C-TAB.G5.1使小鼠免疫时，对于抗毒素B抗体而言观察到唯一更低的抗体滴度。值得注意的是，与对C-TAB.G5.1产生的识别毒素分子C末端部分中的表位的抗体不同，经类毒素免疫诱导的抗体对毒素分子的N末端部分有特异性，这在抗毒素ELISA中读出。因此，在经C-TAB.G5.1和类毒素A/B免疫的小鼠体内产生的抗毒素A和抗毒素B抗体是有不同特异性的抗体，并且因此不可以直接比较。然而，数据表明，与在用类毒素免疫的情况一样，对C-TAB.G5.1免疫的抗体反应相当高。另外，毒素攻毒研究证明，C-TAB.G5.1免疫保护小鼠免受致死性攻毒的能力比得上类毒素A和B的保护效力。图9示出了对C-TAB.G5.1和类毒素A/B的免疫原性的比较。图10示出了与经类毒素A/B免疫的小鼠相比，经C-TAB.G5.1免疫的小鼠的毒素中和和保护数据。
实施例5.1：对不同免疫方案中C-TAB.G5.1的抗体滴度和保护效力的比较
该研究是比较在不同免疫方案中，接受了3个剂量疫苗的小鼠体内C-TAB.G5.1的免疫原性和保护效力。利用6-7周龄的雌性C57BL/6小鼠(Charles River Labs.)进行该研究。将135只小鼠分为14组。在以下示出的天数中，第2-13组内的所有动物通过向右大腿肌肉或左大腿肌肉经肌肉内(IM)注射(50μl)接受3次接种。第1和8组的小鼠未接受接种；它们用作阴性对照。免疫如下进行：
R)=右大腿肌肉(L)-左大腿肌肉
在研究第0、3、7、14、21、28、35和42天从所有动物收集血样。将血清储存在-20℃下直至分析。通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以ELISA单位(EU)报道。在研究第42天使用经细胞毒性量的重组毒素A和毒素B处理的Vero细胞测定毒素A和毒素B中和抗体(TNA)。
最后一次接种3周后(研究第49天)，接种和未接种组的动物(N=8)经腹膜内(IP)注射28ng毒素A或50ng毒素B接受致死性攻毒。在后面9天监测小鼠的存活率。
该研究证明，虽然0/14/28的免疫方案显示出最佳抗体反应，但是在所有免疫方案中，第三次接种两周后或在研究第35和42天测量的所有抗体滴度均可比。如果比较第二次接种两周后测量的抗体滴度，则0/14/28的免疫方案比0/7/21的免疫方案好，并且比0/3/14的免疫方案好得多。该研究确认，当抗原与明矾氢氧化物一起联合注射时(数据未示出)，抗毒素A/B抗体滴度显著提高。研究还证实，即使在两周间隔内施用两个剂量的具有明矾的疫苗可引起高抗体水平，但是比得上接种3个剂量后获得的水平。
在0/7/21和0/14/28的免疫方案中，毒素A/B中和抗体的水平比0/3/14的免疫方案高得多。
在0/7/21和0/14/28而非0/3/14的免疫方案中，对毒素A攻毒的完全防护不需要明矾。用明矾的0/14/28免疫方案诱导了对毒素B攻毒的最高水平的防护（87.5%），而0/7/21免疫方案提供了37.5%的保护而0/3/14显示出28.6%的保护。图20中示出了该研究的结果。
实施例6：评估重组C-TAB.G5.1融合蛋白在仓鼠中的免疫原性和保护效力
该研究是进一步评估在不同动物模型中，有或没有佐剂一起施用的重组融合蛋白C-TAB.G5.1的免疫原性。
利用7周龄以上且重量介于80与90g之间的雌性仓鼠(Harlan)进行该研究。在第0天所有动物通过向右大腿肌肉大剂量(50μl)肌肉内(IM)注射接受首次接种。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次接种并且在第28天通过IM注射进行第三次接种。将仓鼠分组(N=6)并且接种如下：
·第1组：仅制剂缓冲液
·第2组：10μg C-TAB.G5.1
·第3组：10μg C-TAB.G5.1 + 100μg明矾OH
·第4组：30μg C-TAB.G5.1
·第5组：30μg C-TAB.G5.1 + 100μg明矾OH
·第6组：100μg C-TAB.G5.1
·第7组：100μg C-TAB.G5.1 + 100μg明矾OH
·第10组：仅制剂缓冲液
·第11组：10μg C-TAB.G5.1
·第12组：10μg C-TAB.G5.1+100μg明矾OH
·第13组：30μg C-TAB.G5.1
·第14组：30μg C-TAB.G5.1+100μg明矾OH
·第15组：100μg C-TAB.G5.1
·第16组：100μg C-TAB.G5.1+100μg明矾OH
第三次接种两周后(研究第42天)，接种和未接种组的动物(N=6)经腹膜内(IP)注射75ng毒素A或125ng毒素B接受致死性攻毒。在第44天，另外12只仓鼠用于毒素A或毒素B攻毒的剂量滴定。在后面8天监测仓鼠的存活率。
首次免疫(研究第14天)、第二次免疫(研究第28天)和第三次免疫(研究第35天)两周后从所有动物收集血样。血清储存在-20℃下直至分析。然后通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以ELISA单位(EU)报道。使用经细胞毒性量的重组毒素A和毒素B处理的Vero细胞测定毒素A和毒素B中和抗体(TNA)。
该研究证明，与小鼠类似，仓鼠能够积极响应于C-TAB.G5.1接种。接受C-TAB.G5.1的动物在测试的所有抗体滴度上展示出剂量依赖性增加，而明矾佐剂显著提高了所有C-TAB.G5剂量下的抗体滴度。在第二针两周后(研究第28天)观察到最高抗体滴度。图11(A-C)示出了每组经免疫仓鼠的抗体滴度。图12示出了在明矾氢氧化物存在或缺乏时，经C-TAB.G5免疫的仓鼠体内抗C-TAB抗体发展的动力学。
图13示出了TNA测定的结果。这些结果与对小鼠获得的结果相似并且表明仓鼠体内对C-TAB.G5.1融合蛋白产生的抗体在中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的毒性作用中有效。
图13还示出了在致死毒素攻毒后，经C-TAB.G5.1免疫的仓鼠的保护数据。即使在佐剂缺乏时用C-TAB.G5.1接种也实现了高度保护。通过向疫苗中添加明矾将保护水平提高到100%。
实施例7：经氯洁霉素处理的仓鼠体内C-TAB.G5.1融合蛋白对抗艰难梭状芽胞杆菌孢子攻毒的保护效力
抗生素治疗后，艰难梭状芽胞杆菌可定植于内脏并且，如果产生毒素，可引起抗生素相关性腹泻。使用氯洁霉素在仓鼠中模拟人的艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)以通常在接种产毒菌株几天后，产生易于定植、腹泻和死亡的动物。为估计C-TAB.G5.1疫苗的效力，用氯洁霉素和艰难梭状芽胞杆菌菌株630攻毒接种和未接种仓鼠。100μg的C-TAB.G5.1混有125μg明矾氢氧化物佐剂。在第0、14和28天，重～100g的雌性成年仓鼠通过肌肉内(IM)注射接受3次接种。安慰剂为PBS。将48只仓鼠分为如下接种的8只仓鼠的组：
第1组：仅PBS+102个孢子攻毒
第2组：C-TAB.G5.1+102个孢子攻毒
第3组：仅PBS+103个孢子攻毒
第4组：C-TAB.G5.1+102个孢子攻毒
第5组：仅PBS+104个孢子攻毒
第6组：C-TAB.G5.1+104个孢子攻毒
在第42天，所有组中的所有动物接受口服剂量的10mg氯洁霉素磷酸盐/kg体重。在第43天，所有组中的所有动物经口腔强饲服用经洗涤的艰难梭状芽胞杆菌菌株630孢子。使用3个水平的孢子攻毒(～102、103和104)。继续观察，但不治疗，直至第54天。在研究结束时，所有存活动物无病>5天。
在第0、14、28、42天和第54天(研究结束时)吸取血样以获得血清做血清学研究。在第1和42天直接从仓鼠的肛门收集粪便，或如果需要，从草垫中收集粪便。
图14中示出了结果，展示了孢子攻毒后仓鼠的存活曲线。将存活率数据标绘为Kaplan-Meier存活拟合曲线并使用对数秩分析进行统计分析。在所有孢子剂量下，在经接种组内观察到100%仓鼠存活率并且与安慰剂组相比存活率显著提高：102个孢子时p=0.0245，103个孢子时p=0.0006，104个孢子时p<0.0001。
实施例8：猴子体内C-TAB.G5.1的免疫原性和保护效力
该研究是评估猕猴体内C-TAB.G5.1的免疫原性和保护。将6只介于4至6岁且重量介于2至4kg的雌性猕猴用于该研究。安排3只猴的两个组，第一组(第1组)接受200μg的C-TAB.G5.1并且第二组(第2组)接受200μg的C-TAB.G5.1和250μg明矾。使用吸附剂氢氧化铝凝胶(Rehydragel)(Reheis，批号#534401，稀释于PBS中至2mg/ml)作为明矾佐剂。收集血液或免疫之前，为动物剃毛(如有必要)。
在左臂(三角肌)注射进行第一次(研究第0天)和第三次(研究第28天)免疫，向右臂(三角肌)注射进行第二次免疫（研究第14天）。第1组通过IM注射接受于0.5ml1×PBS中的200μg单独的C-TAB.G5.1并且第2组通过IM注射接受于0.5ml1×PBS中具有250μg明矾的200μg C-TAB.G5.1。
在确定时间点(研究第0、14、28和42天)，通过标准方法取2-3mL全血到血清分离管中。在约-20℃下冷冻血清样品。然后用ELISA法估计抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B IgG滴度。抗体滴度以ELISA单位(EU)呈现。
图15显示，C-TAB.G5.1剂量增加导致识别所有这3种蛋白的抗体生成增多，而明矾的存在显著提高了抗体水平。在第42天经两次接种观察到最高抗体滴度。这些数据明确表明了使用重组C-TAB.G5或C-TAB.G5.1融合蛋白接种有需要的受试者的可行性。
实施例9：C-TAB.G5和C-TAB.G5.1的免疫原性的比较
该研究是比较C-TAB.G5和C-TAB.G5.1的免疫原性以及在其中递送C-TAB的两种不同缓冲液的效果。利用介于8至9周龄之间的C57BL/6雌性小鼠(Charles River Labs.)进行免疫。在第0天所有动物通过向右大腿肌肉经肌肉内(IM)注射(50μl)接受首次免疫。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次免疫。总共72只小鼠分为如下接种的12个组：
第1组：在PBS中1μg C-TAB.G5
第2组：在PBS中3μg C-TAB.G5
第3组：在PBS中10μg C-TAB.G5
第4组：在PBS中30μg C-TAB.G5
第5组：在组氨酸缓冲液中1μg C-TAB.G5
第6组：在组氨酸缓冲液中3μg C-TAB.G5
第7组：在组氨酸缓冲液中10μg C-TAB.G5
第8组：在组氨酸缓冲液中30μg C-TAB.G5
第9组：在组氨酸缓冲液中1μg C-TAB.G5.1
第10组：在组氨酸缓冲液中3μg C-TAB.G5.1
第11组：在组氨酸缓冲液中10μg C-TAB.G5.1
第12组：在组氨酸缓冲液中30μg C-TAB.G5.1
在第二次免疫2周后(研究第28天)从所有动物收集血样。将血清储存在-20℃下，直至分析。然后通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以ELISA单位(EU)报道。
图16显示，对于3种疫苗制剂而言，在1-30μg剂量范围内所有抗体滴度(抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B)差异不显著(如T检验分析所示)。与PBS相比，用组氨酸缓冲液中的C-TAB.G5制剂实现了略高的抗体生成。在用C-TAB.G5和C-TAB.G5.1组氨酸制剂免疫间未观察到显著差异。因此，该研究证明C-TAB.G5和C-TAB.G5.1构建体的免疫原性相等。
实施例10：替代性C-TABNCTB和C-TADCTB融合蛋白的制备和评估
本实施例描述了包含源自艰难梭状芽胞杆菌VPI-10463菌株CTA的C末端结构域的一个部分和CTB的C末端结构域的两个部分的另外两种融合蛋白的制备。和C-TAB.G5一样，C-TABNCTB融合蛋白(SEQ ID NO:18)包含CTA的19个重复单元(氨基酸2272-2710)、CTB的23个重复单元(氨基酸1850-2366)加上与CTB的C末端融合的CTB另外10个重复序列(氨基酸1834-2057)。C-TADCTB融合蛋白(SEQ ID NO:20)包含C-TAB.G5序列(CTA的19个重复序列和CTB的23个重复序列)加上与C-TAB.G5的C末端融合的CTB另外24个重复单元(氨基酸1834-2366)。因此，C-TADCTB包含双份的CTB重复单元。以类似于实施例1.1中描述的方式进行C-TABNCTB和C-TADCTB基因构建体的克隆。在大肠杆菌细胞中表达重复融合蛋白并且使用如实施例1.2中描述的标准程序纯化。在对动物的免疫原性和保护研究中对分离多肽进行了评估。
实施例10.1：小鼠体内C-TAB.G5、C-TABNCTB和C-TADCTB的免疫原性和保护效力的比较
该研究是比较在经双对数范围内5个抗原剂量接种的小鼠体内，C-TAB.G5、C-TABNCTB和C-TADCTB的免疫原性和保护效力。利用6-7周龄的雌性C57BL/6小鼠(CharlesRiver Labs.)进行该研究。所有动物接受两次接种：第一次在第0天向右大腿肌肉经肌肉(IM)注射(50μl)。在第14天通过向左大腿肌肉IM注射进行第二次接种。所有免疫均在明矾缺失时进行。在第二次免疫2周后(研究第28天)收集血样。将血清储存在-20℃下，直至分析。通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度并以图17所示的ELISA单位(EU)报道。
该研究证明，替代融合蛋白C-TADCTB和C-TABNCTB以及C-TAB.G5有高度免疫原性并且即使不添加佐剂，也能够诱导对毒素A和毒素B的强烈抗体反应。
除评估抗体反应外，还测定了C-TADCTB和C-TABNCTB免疫保护小鼠免受天然毒素B的致死性攻毒的能力。第二次接种3周后(研究第35天)，接种和未接种组的动物(N=6)经腹膜内(IP)接受致死剂量的50ng毒素B。在后面9天监测小鼠的存活率并且将结果示于图18中。该实验证明，在明矾佐剂缺乏时用33μg的C-TADCTB使小鼠免疫能够赋予对天然毒素B致死性攻毒的100%防护，而相同剂量的C-TAB.G5和C-TABNCTB仅诱导部分保护。该数据表明，与C-TAB.G5类似，另外两种融合蛋白C-TADCTB和C-TABNCTB可对天然毒素的致死性攻毒有防护性。
实施例10.2：仓鼠体内C-TAB.G5.1和C-TADCTB的免疫原性和保护效力的比较
该研究是进一步评估在不同动物模型中，有或没有明矾一起施用的替代性融合蛋白C-TADCTB的免疫原性。
如实施例6中所述设计研究：在100μg明矾氢氧化物存在或缺乏时通过IM注射为雌性仓鼠接种3次(研究第0、14和28天)。第三次接种两周后(研究第42天)，所有动物经腹膜内(IP)注射75ng毒素A或125ng毒素B接受致死性攻毒。在研究第14、28和35天收集血样并且通过ELISA测定C-TAB、毒素A和毒素B的血清抗体滴度。在第35天测量血清中的毒素A和毒素B中和抗体(TNA)。监测仓鼠的存活率并以防护%报道。
该研究证明，与小鼠类似，在仓鼠体内融合蛋白C-TADCTB可诱导抗毒素抗体反应。明矾佐剂显著提高了测试的所抗体滴度。图19所示的TNA测定结果表明，对C-TADCTB产生的抗体在中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的毒性作用中有效。图19还展示了对经C-TAB.G5.1或C-TADCTB免疫的仓鼠的保护数据的比较。用两种重组融合蛋白接种均实现了高度保护。
实施例11：开放标签期1研究评估包含C-TAB.G5.1的药物组合物的安全性、免疫原性和剂量反应
所述药物组合物包含C-TAB.G5.1、由截短艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)毒素A和毒素B组成的一种重组融合蛋白，所述组合物将通过肌肉(IM)注射分别以3个不同剂量施用：20μg有Al(OH)3(明矾)，75和200μg无或有Al(OH)3，在第0、7和21天进行3次接种。
研究目标
主要目标
■第3次接种达6个月后，研究包含C-TAB.G5.1的药物组合物的安全性和耐受性。
次要目标
■研究在首次接种后第0、7、14、21、28、113、201天测量的3个不同剂量和两种制剂对疫苗抗原C-TAB.G5.1和艰难梭状芽胞杆菌天然毒素A和B的免疫反应，以获得最佳剂量和制剂的首个指示。
■研究C-TAB.G5.1疫苗诱导的IgG抗体中和体外艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的能力。
研究设计
这是开放标签、部分随机化的剂量递增1期研究，将由对年龄介于≥18和<65岁之间的健康成人的部分A和对≥65岁的健康老年人的部分B组成，后一年龄组是遭受艰难梭状芽胞杆菌感染的最脆弱的群体。将用第0、7和21天的接种方案，对12位健康成人受试者的5个治疗组进行部分A，以分别研究20μg C-TAB.G5.1疫苗(有佐剂)及75μg和200μg C-TAB.G5.1疫苗(有或无佐剂)的安全性和剂量反应。将在部分A的所有成人受试者接受第3次接种后分析安全性和免疫原性，将在来自部分B的受试者加入之前由数据安全监控委员会(DSMB)审查所有安全性数据。如果期中分析期间鉴定了非安全或无效治疗组(即，未诱导大量IgG反应的剂量)，停止这些治疗组并且不转到部分B。
研究的部分B将寻求老年群体中的剂量确认。因此，将对每个组20个老年健康受试者的5个治疗组进行部分B。将应用第0、7和21天的接种方案。该研究设计将允许比较成人和老年人中的剂量反应。后一年龄组将是艰难梭状芽胞杆菌疫苗的主要目标群体，代表对于艰难梭状芽胞杆菌疫苗研发途径中两个目标指示而言最脆弱的群体，即在基于年龄或基于年龄-风险的预防性接种方法中预防复发性艰难梭状芽胞杆菌腹泻和预防原发性艰难梭状芽胞杆菌感染。然而，老年受试者对接种的反应可能比年轻人更低；因此，需要对来自早期研究阶段的老年目标群体的剂量确认。来自部分A的所有成人接种后，期中分析将允许停止在成人中未诱导大量IgG反应的非安全或剂量/制剂，以便减少使老年组的受试者暴露于疫苗潜在不安全或无效的剂量(例如最低剂量)和/或制剂(例如无佐剂的制剂)的风险。
C-TAB.G5.1疫苗为通过标准方法生产的C-TAB.G5.1于20mM L-组氨酸、75mMNaCl、5%蔗糖、0.025%(pH6.5)中的水溶液。序列
优选方面：
优选多肽及其用途：
1.一种分离多肽，其包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选99%序列同一性的氨基酸序列。
2.一种分离多肽，其包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选99%序列同一性的氨基酸序列。
3.根据方面1或2所述的分离多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的C末端结构域的19个重复单元和源自艰难梭状芽胞杆菌毒素B的C末端结构域的23个重复单元。
4.根据方面1所述的分离多肽，其中所述多肽具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
5.根据方面1所述的分离多肽，其中所述多肽具有如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
6.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选99%序列同一性的氨基酸序列。
7.根据方面6所述的分离多肽，其中接种所述分离多肽的仓鼠幸在所有孢子剂量下(102、103和104)历经灌胃施用致死剂量的艰难梭状芽胞杆菌孢子而存活。
8.根据方面6或7所述的多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的C末端结构域的19个重复单元。
9.根据方面6至8中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素B的C末端结构域的23、33或47个重复单元。
10.根据方面6至9中任一项所述的多肽，其中所述多肽选自SEQ ID:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO:20和与SEQ ID:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO:20中任一个95%、96%、97%、98%、99%同一的多肽。
11.根据方面6至10中任一项所述的多肽，其中所述多肽是分离的。
12.根据方面6至11中任一项所述的多肽，其用于药物中。
13.根据方面6至11中任一项所述的多肽，其用于预防和治疗CDAD。
14.根据方面6至11中任一项所述的多肽，其用于预防有CDAD风险的受试者的CDAD。
15.根据方面6至11中任一项所述的多肽，其用于预防有CDAD风险的受试者的CDAD的多肽，其中有CDAD风险的所述受试者为：i)65岁以上的受试者或2岁以下的受试者；ii)患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者；viii)患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；或ix)患有复发性CDAD的受试者。
16.根据方面6至11中任一项所述的多肽用于制备用于医学中的药剂的用途。
17.根据方面6至11中任一项所述的多肽用于制备预防和治疗CDAD的药剂的用途。
18.根据方面6至11中任一项所述的多肽用于制备预防有CDAD风险的受试者的CDAD的药剂的用途。
19.根据方面6至11中任一项所述的多肽用于制备预防有CDAD风险的受试者的CDAD的药剂的用途，其中有CDAD风险的所述受试者为：i)65岁以上的受试者或2岁以下的受试者；ii)患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者；viii)患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；或ix)患有复发性CDAD的受试者。
20.一种诊断试剂盒，其包含根据方面1至11中任一项所述的多肽，其用于检测受试者的艰难梭状芽胞杆菌感染。
优选核酸：
1a.一种核酸，其包含编码根据方面1至11中任一项所述的任何多肽的核苷酸序列。
2a.根据方面1a所述的核酸，其基本上由编码根据方面1至11中任一项所述的多肽的核苷酸序列组成。
3a.根据方面1a或2a所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
4a.根据方面1a或2a所述的核酸，其基本上由选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:17和SEQ ID NO:19的核苷酸序列组成。
优选药物组合物：
1c.一种药物组合物，其包含根据方面1至11中任一项所述的多肽或根据方面1a-4a中任一项所述的核酸和药学上可接受的载体或赋形剂。
2c.根据方面1c所述的药物组合物，其中所述组合物诱导中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B的抗体。
3c.根据方面1c或方面2c所述的药物组合物，其中所述组合物在受试者中诱导对艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B的保护性免疫反应。
4c.根据方面1c至3c中任一项所述的药物组合物，其进一步包含佐剂。
5c.根据方面4c所述的药物组合物，其中所述佐剂包括明矾。
6c.根据方面1c至5c中任一项所述的药物组合物，其进一步包含附加抗原或药物。
优选抗体：1d.一种抗体，其对抗根据方面1至11中任一项所述的多肽，但不识别艰难梭状芽胞杆菌毒素A(SEQ ID NO:6)和艰难梭状芽胞杆菌毒素B(SEQ ID NO:8)的任一种或二者。
优选方法：
1e.一种生成根据方面1至10中任一项所述的多肽的方法，其包括向宿主细胞中引入编码所述多肽的核酸，在允许所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞，并且分离所述多肽。
2e.根据方面1e所述的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
3e.一种治疗和/或预防受试者的艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)的方法，其包括向有需要的受试者施用根据方面1至11中任一项所述的分离多肽。
4e.一种在受试者中诱导对艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B的特异性免疫反应的方法，其包括向受试者施用根据方面1至11中任一项所述的多肽或根据方面1c-6c中任一项所述的药物组合物。
5e.一种预防受试者由艰难梭状芽胞杆菌感染引起的原发性疾病的方法，其包括向受试者施用根据方面1至11中任一项所述的多肽或根据方面1c-6c中任一项所述的药物组合物。
6e.一种在有艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)风险的受试者中预防由艰难梭状芽胞杆菌感染引起的原发性疾病的方法，其中有CDAD风险的所述受试者为：i)65岁以上的受试者或2岁以下的受试者；ii)患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者；viii)患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；或ix)患有复发性CDAD的受试者；包括向所述受试者施用根据方面1至11中任一项所述的多肽或根据方面1c-6c中任一项所述的药物组合物。7e.根据方面1e至6e中任一项所述的方法，其中经肌肉内、皮内、皮下、口服、鼻腔或直肠，优选经肌肉内向受试者施用所述多肽或所述药物组合物。
8e.根据方面1e至7e中任一项所述的方法，其中在短时间间隔内(每周一次或每两周一次)向所述受试者施用至少两个剂量的所述多肽或所述药物组合物。
9e.一种检测生物样品中的艰难梭状芽胞杆菌的方法，其包括使所述生物样品与根据方面1至11中任一项所述的多肽接触并且检测所述多肽与所述生物样品的结合，其中所述多肽的结合表明所述生物样品中艰难梭状芽胞杆菌的存在。

Claims (7)

1.一种免疫原性或疫苗组合物，其包含分离多肽，所述多肽由SEQ ID NO:2或SEQ IDNO: 4中所示的氨基酸序列组成，以及包含药学上可接受的载体或赋形剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽为接种所述分离多肽的历经在102、103和104的孢子剂量下灌胃施用致死剂量的艰难梭状芽胞杆菌孢子的仓鼠提供100%存活率。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其还包含佐剂。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述佐剂包含明矾。
5.由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列组成的分离多肽，或者权利要求1至4任一项所述的组合物，其用于预防和治疗艰难梭状芽胞杆菌相关疾病。
6.根据权利要求5所述的多肽或组合物，其用于预防有艰难梭状芽胞杆菌相关疾病风险的受试者的艰难梭状芽胞杆菌相关疾病。
7.根据权利要求6所述的多肽或组合物，其中有艰难梭状芽胞杆菌相关疾病风险的所述受试者为：i) 65岁以上的受试者或2岁以下的受试者；ii) 患有AIDS的受试者；iii) 服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv) 计划住院的受试者或住院受试者；v) 在重症监护室或预期前往重症监护室的受试者；vi) 接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii) 进入或计划进入长期护理的受试者；viii) 患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；或ix) 患有复发性艰难梭状芽胞杆菌相关疾病的受试者。
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