BR112014004896A2 - polipeptídeo isolado de proteínas de toxina b de c. difficile e usos do mesmo - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO DE PROTEÍNAS DE TOXINA A E TOXINA DE C. DIFFICILE E USOS DO MESMO. A presente invenção fornece polipeptídeos isolados C-TAB,G5 e C-TAB, G5.1 compreendendo os domínios de ligação ao receptor de toxina A e toxina B de C. difficileconforme estabelecido nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4. Os polipeptídeos isolados C-TAB, G5 e C TAB.G5.1 podem ser utilizados para neutralizar efeitos tóxicos de toxina A e/ou toxina B de C. difficile.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "POLIPEPTÏDEO ISOLADO DE PROTEÍNAS DE TOXINA A E TOXINA B DE C. DIFFICILE E USOS DO MESMO".

CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se a um polipeptídeo isolado, contendo os domínios de ligação ao receptor das toxinas A e B do Clostridium difficile e a sua utilização como uma vacina. Este polipeptídeo isolado fornece imunidade antitoxina de ambas astoxinas.

10 FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Clostridium difficile é a principal causa de diarreia associada a antibióticos nosocomial e tornou-se um importante problema de saúde em hospitais, casas de repouso e outras instalações de cuidados.O custo para os hospitais 15 foi estimado em 2 bilhões de dólares na Europa e 3,2 bilhões de dólares nos Estados Unidos.

O agente causador é uma bactéria gram positiva, formadora de esporo anaeróbica, comumente encontrada em todo o ambiente, mas também presentes no trato intestinal de 2- 20 3% da população adulta saudável. Doença associada a C.

difficile (CDAD) é induzida pela perturbação da flora normal do cólon, normalmente o resultado da administração de antibióticos. Após a exposição a esporos de C. difficile no ambiente, o organismo pode colonizar a mucosa intestinal,

onde a produção de toxinas que causam a doença pode resultar em CDAD. A doença pode variar desde diarreia simples leve não complicada a colite pseudomembranosa grave e megacólon tóxico.

5 CDAD tornou-se cada vez mais problemática em ambientes de cuidados de saúde. Um estudo recente relatou que 31% dos pacientes do hospital que recebem antibióticos tornam-se colonizados por C. difficile e 56% destes pacientes que se tornaram colonizadosirão desenvolver CDAD. Em geral, o C.

10 difficile é responsável por 10-25% de todas as diarreias associadas a antibióticos, 50-75% de colite relacionada a antibiótico e 90-100% de colite pseudomembranosa colite pseudomembranosa a antibiótico. Tratamento de CDAD envolve a suspensão do antibiótico causal seguido por tratamento com 15 metronidazol ou a vancomicina. Recidiva após o tratamento com antibióticos é interrompidae ocorre em aproximadamente2o% dos pacientes, muitas vezes o resultado de recolonização por C. difficile.

Em 2003, um surto de C. difficile em Quebec, Canadá 20 indicou o surgimento de uma cepa mais virulenta de C.

difficile conhecida como North American Phenotyoe 1/027 (NAP1). NAP1 tem sido associada com maior virulência, resultados fracos e maiores taxas de morbidade e mortalidade em comparação com cepas anteriores. O aparecimento desta cepa contribui para os problemas já encontrados na tentativa para conter a incidência de CDAD.

Fidaxomicin (Dificid©) para a prevenção da doença recorrente é o primeiro de uma nova classe de antibióticos macrocíclicos de espectro estreito (Revill, P.; Serradell, N.; Bolos, J. (2006). "Tiacumicin Bmacrolide antibiotic treatmento of C. difficile-associated diarrhea". Drugs of the Future 31 (6) : 494-497). É um produto de fermentação obtido a partir de actinomiceto Dactylosporangium Aurantiacumsubespecies hamdenesis. Fidaxomicina não é sistêmica, o que significa que é minimamente absorvido pela corrente sanguínea, é bactericida, e demonstrou a erradicação seletiva de Clostridium difficile patogênica com o mínimo de interrupção para as múltiplas espécies de bactérias que compõem a flora intestinal saudável e normal.

A manutenção das condições fisiológicas normais do cólon pode reduzir a probabilidade de infecção recorrente por Clostridium difficile (Johnson, Stuart (2009-06) "Recurrent Clorstridium difficile infection:a review of risck factors, treatmentos, and outcomes". Journal of Infection 58 (6) 403-410). Embora seja pensado que a introdução desta nova classe de droga antibiótica irá melhorar o tratamento de CDAD, ainda existe uma necessidade médica de um medicamento preventivo, em especial para pacientes de alto risco, como os idosos, e os pacientes imunocomprometidos.

CDAD é o resultado das ações de duas exotoxinas produzidas por C. difficile, toxina A e toxina B (também chamados de CTA e CTB, respectivamente). Ambas as toxinas são proteínas secretadas de alto peso molecular (-300 kDa) que possuem vários domínios funcionais (Voth DE e Ballard JD, Clinical Microbiology Reviews 18:247-253 (2005)). 0 domínio N-terminal de ambas as toxinas contém atividade ADP- glucosiltransferase que modifica as GTPases Rho-like. Esta modificação causa uma perda de polimerização de atina e alterações do citoesqueleto que resultam na ruptura das junções apertadas do epitélio do cólon. Isto leva a exsudação excessiva de fluido para dentro do cólon e uma diarreia resultante. O domínio central contém um domínio hidrofóbico e prevê-se que esteja envolvido no transporte da membrana.

O domínio C-terminal de ambas as toxinas contém várias regiões homólogas chamadas unidades de repetição (RUs) que são envolvidas na ligação da toxina às células-alvo (Ho et ai, PNAS 102:18.373-18.378 (2005)). As unidades de repetição são classificadas como curtas (21-30 aminoácidos) ou longas (-50 aminoácidos). Unidades de repetição se combinam para formar aglomerados, cada um contendo geralmente um comprimento e 3-5 unidades de repetição curtas. O comprimento total de toxina A possui 39 unidades de repetição (ARUs),

organizadas em oito aglomerados (Dove et al. Infect. Immun.

58:480-488 (1990), enquanto que o comprimento total toxina B contém 24 unidades de repetição (BRUs), organizados em 5 aglomerados (Barroso et al, Nucleic Acids Res 18:4004 (1990) ; 5 Eichel-Streiber et al, Gene 96:, 107-1 13 (1992)).

Um número de estudos, de ambos modelos animais e clínicos, têm indicado um papel para o anticorpo antitoxina na proteção de doença associada ao C. difficile. Hamsters imunizados com toxina A e toxina B inativados por formalina geraram níveis elevados de anticorpos antitoxina e foram protegidos contra um desafio letal de bactérias C. difficile (Giannasca PJ e Warny M, Vaccine 22:848-856 (2004)). Além disso, a transferência passiva de anticorpo antitoxinade camundongo a hamsters protegidos de uma forma dependente da dose. Kyne L et al. (The Lancet, 357: 189-193 (2001)) reportaram que o desenvolvimento de umaresposta de anticorpo antitoxina A durante um episódio inicial de CDAD correlacionada com a proteção contra a recorrência da doença.

Os determinantes reconhecidos por anticorpos antitoxina de proteção foram localizadosao domínio C-terminal contendo as unidades de repetição que funcionam como o domínio de ligação ao receptor. Inicialmente, Lyerly et al. (Current Microbiology 21 :29-32 (1990)) revelaram que o domínio C- terminal da toxina A contendo 33 unidades de repetição é capaz de induzir a produção de anticorpos neutralizantes antitoxina e pode proteger da infecção por C. difficile.

Neste estudo os hamsters foram injetados por via subcutânea com o polipeptídeo recombinants purificado várias vezes antes do desafio com bactérias, no entanto, apenas uma proteção parcial foi conseguida. Outro estudo (Ryan et al, Infect. Immun. 65:2941 -49 (1997)) mostrou que o polipeptídeo isolado que contém 720 resíduos de aminoácidos da extremidade C-terminal de CTA e o sinal de secreção da hemolisina A de E. coli (expressos em Vibrio cho.lerae) induziu imunidade sistêmica e mucosa protetora contra uma pequena dose de CTA no modelo CDADem coelho.

Também foi relatado que a resposta de anticorpos contra o domínio C-terminal de ambas toxina A e B foi necessária para conseguir uma proteção completa (Kink and Williams, Infect. Immun. 66:2018-25 (1998), Patente US 5.736.139 (1998)). Este estudo revelou que o domínio C-terminal de cada toxina era mais eficaz na produção de anticorpos neutralizantes de toxinas. Foi demonstradaa efetividade de anticorpos de aves oralmente liberados (antitoxinas) elevados contra domínio C-terminal de CTA e CTB no modelo letal de hamster. Os resultados também indicam que a antitoxina pode ser eficaz no tratamento e na gestão de CDAD em humanos. Em outro estudo, foi reportado que os anticorpos monocionais antitoxina A e B humanos conferem proteção contra a mortalidade induzida por C. difficile em hamsters (Babcock et al. Infect. Immun. 74:6339-6347 (2006)) . A proteção apenas foi observada por anticorpos direcionados contra o domínio de ligação ao receptor da toxina e proteção reforçada foi observada após o tratamento com ambosanticorpos antitoxina A e B.

Por outro lado, Ward et al. (Infect. Immun 67:. 5124- 32 (1999)) consideraram 14 unidades repetitivas de C.

difficile toxina A (14 CTA) para o estudo da atividade adjuvante. As unidades de repetição foram clonadas e expressas com a tag de poli-histidina N-terminal (14 CTA- HIS) ou fundidas com o domínio de ligação não tóxico da toxina do tétano (14 CTA-TETC). Ambas as proteínas de fusão administradas por via intranasal geraramanticorpos antitoxina A no soro, mas não em resposta a superfície da mucosa em camundongos. Respostas antitoxina A sistêmica e mucosa melhoradas foram observardas após coadministração comtoxina termo-lábil de E. coli (LT) ou a sua forma mutada LTR72.Com base nos dados, Ward et al. spgeriram a utilização de fusão de 14 CTA-TETO não toxica como um adjuvante das mucosas na vacina humana direcionada contra patógenos clostridiais.

Estudos bioquímicos recentes sobre os domínios unidade de repetição de toxinas de C. difficíle analisaram os requisitos de sequência mínimos para a formação da estrutura terciária estavelmente formada (Demarest SJ et al., J. Moi.

Bio. 346:1197-1206 (2005)). Um peptídeo de repetição de 11 unidades derivado de toxina A foi encontrado com uma estrutura terciária correta, mas 6 e 7 unidades de repetição de toxinas A e B não. O segmento 11 de unidade de repetição corretamente dobrado demonstrou manter a propriedade de ligação ao receptor. Um segundo estudo examinou as propriedades funcionais de fragmentos de toxina A contendo 6, 11 ou 15 unidades de repetição (Dingle T, Glycobiology 18:698-706 (2008)). Apenas as unidades de repetição de 11 e 15 foram capazes de inibir competitivamente a capacidade de neutralização da toxina de anticorpo antitoxina A. Embora todos os 3fragmentos demonstrassem ter atividade de hemaglutinação, os fragmentos mais longos apresentaram atividade hemaglutinante maior do que os mais curtos. Os dados indicam que a estrutura do domínio de ligação ao receptor da toxina e imunogenicidade é retida nos fragmentos de domínio que contêm mais do que 11-14 repetições.

Thomas et ai. (W097/02836, Patente US5.919.463 (1999)) também revelou toxina A, toxina B de e certos fragmentos de C. difficile (por exemplo, o domínio C-terminal contendo uma parte ou todas as unidades de repetição) como adjuvantes de mucosa. Eles mostraram que a administração intranasal de CTA ou CTB aumentou significativamente a resposta imune de mucosa aos antígenos heterólogos como Helicobacter pylori urease, ovalbumina ou keyhole limpet hemocianina (KLH) em vários compartimentos do camundongo e foi associada à proteção contra o desafio com Helicobacter.Além disso, a atividade adjuvante de uma proteína de fusão de toxina A foi avaliada: 794 resíduos de aminoácidos C-terminais de CTA compreendendo ARUs(unidades de repetição de toxina A) foram fundidos com glutationa-S-transferase (GST) e GST-ARU resultado foi expresso em E. coil. Este estudo demonstrou aumento significativo da resposta imune por GST-ARU aos antígenos coadministrados nas secreções do soro e das mucosas.

Todos estes estudos sggerem que o uso potencial de uma proteína nãotóxica recombinante compreendendo toxina A ou toxina Bde C. difficile, ou fragmentos dos mesmos, ou as suas combinações para produzir uma vacina ativa contra CDAD.Atualmente, nenhuma vacina contra a C. difficile está disponível comercialmente, embora uma vacina candidata que consiste em toxinas A e B foram avaliadas em estudos de fase I e IIa humanos. Relata-se que a imunização parenteral com esta vacina induz respostas de anticorpos IgG antitoxina e neutralizantes de toxina (Kotloff KL et al, Infect Immun 69:988-995 (2001) ,Aboudola S et al, Infect Immun.71: 1608-

1610 (2003)).

A literatura indica ainda que a construção de uma proteína de fusão recombinante contendo ambos os domínios de ligação ao receptor de toxina A e B de C. difficile, na sua 5 totalidade ou fragmentos dos mesmos, seria uma abordagem eficiente e comercialmente viável para o desenvolvimento de vacinas. Dita abordagem tem sido tentada como umaproteina de fusão de duas partes de um fragmento de 700 pares de bases de toxina A e um fragmento de 1300 pares de base de toxina B por Varfolomeeva et al. (Moi. Genetics, Microb. and Virol.

3:6-10 (2003)). Esta abordagem também tem sido descrita por Belyi e Varfolomeeva (FEMS Letters 225:325-9 (2003)) demonstrando a construção da proteína de fusão recombinante que consiste em três partes: dois domínios C-terminais compostos por unidades de repetição de toxina A e toxina B de C. difficile seguido por um fragmento de enterotoxina Cpe de Clostridium perfringens. A proteína de fusão foi expressa em E. coli, mas o produto foi acumulado em corpos de inclusão e não foi estável. Além disso, o rendimento do produto puro alcançado neste estudo (50 pg por 100 ml de cultura) foi consideravelmente reduzido.

Wilkins et al. (WO 00/61762, Patente US 6.733.760 (2004)) também descreveram a utilização de unidades de repetição de toxina A e B de C. difficiie (ARU recombinante e BRU recombinante) e seus conjpgados de polissacarídeo para a preparação de uma vacina contra CDAD. A proteína recombinante ARU resultante compreendia 867 de resíduos de aminoácidos, enquanto a proteína recombinante BRU contém 622 aminoácidos em comprimento. Ao contrário dos trabalhos citados anteriormente, este trabalho demonstrou expressão de alto nível de proteínas solúveis recombinantes ARU e BRU em E. coli. Os camundongos vacinados com ARU recombinante e com ARU recombinante conjpgada com polissacarídeo ambos montaram um nível elevado de anticorpos neutralizantes de antitoxina A e foram altamente protegidos contra o desafio letal com toxina A de C. difficile. Além disso, Wilkins et al.

spgeriram a utilização de uma proteína de fusão recombinante que consiste em ambos ARU e BRU e para a preparação de uma vacina.

Há um interesse no desenvolvimento de uma vacina contra CDAD. Uma proteína de fusão recombinante que consiste em ARU e BRU e pode ser potencialmente útil como uma vacina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 20 A presente invenção fornece novas ferramentas e métodos para a concepção, produção e utilização da toxina A e toxina B de C. difficile. A presente invenção fornece um polipeptídeo C -TAB isolado que compreende a SEQ ID NO:2 (C- TAB.G5) ou um derivado do mesmo, SEQ ID NO:4 (C-TAB.G5.1).

O C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 compreende 19 unidades de repetição do domínio C-terminal da toxina A fundida a 23 unidades de repetição do domínio C-terminal da toxina B. A presente invenção também inclui composições e formulações compreendendo o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1.

As composições ou formulações podem conter o polipeptídeo isolado, um antígeno adicional, um adjuvante, e/ou um excipiente. Alternativamente, as composições ou as formulações podem ser constituídas, essencialmente, do polipeptídeo isolado, sem um adjuvante ou outros ingredientes ativos (mas opcionalmente compreendendo um excipiente, como um carreador, tampão e/ou estabilizador).

Além disso, as composições ou formulações da invenção podem ser administradas concomitantemente com outros medicamentos, como um antibiótico, em particular, por exemplo, em indivíduos com CDAD recorrente ou em indivíduos que requerem o uso de antibióticos frequente e/ou prolongado.

A presente invenção também fornece uma vacina compreendendo o polipeptídeo isolado da presente invenção.

A vacina pode ainda compreender um adjuvante, como, como o alum, um adjuvante derivado de uma exotoxina ADP-ribosilante ou outros. A vacina pode ser administrada em um regime de uma dose, regime de duas doses (por exemplo, administrado dentro de 3 a20dias, por exemplo, após 10 a 15 dias após a

U primeira dose), regime de três doses (por exemplo, administrado após cerca de 7 dias e cerca de 21 dias da primeira dose), ou mais do que regime de três doses, preferencialmente, um regime de duas ou três doses, em que a dose compreende uma quantidade de 20 pg a 200 pg do polipeptídeo da invenção.

A presente invenção fornece um método para prevenir, tratar, ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença, como CDAD através da administração do polipeptídeo isolado dainvenção a um indivíduo em necessidade do mesmo. O polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser administrado ao indivíduo por via intramuscular ou por outras vias de liberação.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para prevénir uma doença, como CDAD através da administração do polipeptídeo isolado das invenções ou uma composição compreendendo o dito polipeptídeo a um indivíduo em risco de CDAD, como, por exemplo, um indivíduo com o seguinte perfil: i) um indivíduo com um sistema imunológico mais fraco como, por exemplo, um indivíduo idoso (por exemplo, um indivíduo com mais de 65 anos de idade) um indivíduo com menos de 2 anos de idade, ii) um indivíduo imunocomprometido, como por exemplo, um indivíduo com AIDS; iii) um indivíduo que toma ou planeja tomar drogas imunossupressoras; iv) um indivíduo com hospitalização planejada ou um indivíduo que está no hospital, v) um indivíduo que está ou que está esperando para uma unidade de terapia intensiva (ICU), vi) um indivíduo que está realizando ou está planejando realizar uma cirurgia gastrointestinal vii) um indivíduo que está ou planejando ir para um local de cuidados de longa duração, como uma casa de enfermagem; viii) um indivíduo com co-morbidades que requerem o uso de antibióticos frequente e/ou prolongado; ix) um indivíduo que é um indivíduo com dois ou mais dos perfis acima mencionados, como por exemplo, um indivíduo idoso que está planejando passar por uma cirurgia gastrointestinal; x) um indivíduo com doença inflamatória intestinal, e/ou xi) um indivíduo com CDAD recorrente, como por exemplo, um indivíduo experimentando um ou mais episódios de CDAD.

Em uma modalidade, a invenção fornece métodos para produzir polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. O polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.lpode ser produzido a partir de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 utilizando um sistema de expressão bacteriano, como um sistema de expressão em E. Cali.

Em uma modalidade a presente invenção fornece a polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1, em que as 19 unidades de repetição de toxina estão ligadas às 23 unidades repetidas de toxina B através de um ligante que consiste em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 resíduos de aminoácidos.

A titulo de exemplo, o ligante da presente invenção pode compreender a sequência RSMH (Arg-Ser-Met-His) (aminoácidos 439-442 de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID N0:4).

Em outra modalidade, a invenção fornece uma variante do polipeptídeo isolado que compreende pelo menos uma mutação (por exemplo, inserção, substituição ou deleção), por exemplo, em URA e/ou BRU. A sequência da variante pode ter 85%, 85°s, 87~, 88%, 89%, 900, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96~, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2.

A presente invenção também fornece métodos para a produção de polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 ou suas variantes, por meio de engenharia de DNA recombinante, a fermentação bacteriana e purificação de proteínas. Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos para a construção de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para produzir polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 utilizando um sistema de expressão bacteriano, como um sistema de expressão de E. coli.

A invenção ainda fornece métodos para prevenir e tratar CDAD em indivíduos em necessidade do mesmo, como os seres humanos. Neste método, o C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 é administrado a um indivíduo, isolado ou co-administrado com um ou mais adjuvantes, como o alum ou outros. Indivíduos podem ser indivíduos saudáveis que estão em risco de 5 exposição a C. difficile, indivíduos humanos que foram tratados e recuperados de infecção por C. difficile e que estão em risco de re-infecção por C. difficile, ou indivíduos humanos que estão atualmente infectadas com C. difficile e cujacondição pode ser melhorada através da indução de anticorpos neutralizantes de toxina de C. difficile.

A presente invenção fornece uma composição imunogênica que compreende C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. A composição imunogênica pode incluir ainda um adjuvante para aumentar uma resposta imune especifica para o antígeno e/ou um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou outros componentes em uma formulação apropriada para aplicação a um indivíduo em necessidade do mesmo. A composição imunogênica pode ser liberada por liberação via intramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutânea (SC), intraperitoneal (IP), administração oral, administração nasal, administração bucal, ou retal.

Em outra modalidade da invenção, a composição imunogênica induz anticorpos que se ligam a toxinas de C.

difficile nativas e neutraliza a sua atividade citotóxica,

assim fornecendo proteção ativa de longo prazo e/ou tratamento contra doença associada a C. difficile (CDAD).

Por conseguinte, a invenção fornece composições imunogênicas úteis para a prevenção ou tratamento de doença associada a C. difficile em indivíduos em necessidade dos mesmos.

Em outra modalidade, a invenção fornece ácidos nucleicos e fragmentos ou variantes do mesmo que codificam C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. A invenção fornece também vetores de expressão compreendendo o ácido nucleico que codifica C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1.

Outra modalidade da presente invenção fornece anticorpos e fragmentos dos mesmos, como anticorpos neutralizantes, humanizados, monoclonais, quiméricos e policlonais, específicos para C--TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Os anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem reconhecer a toxina A e/ou toxina B.

Outra modalidade fornece uma vacina que compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.

Outra modalidade da presente invenção fornece kits de diagnóstico compreendendo os ácidos nucleicos, polipeptídeos e/ou anticorpos da invenção.

Outras modalidades e vantagens da invenção são apresentadas em parte na descrição que se segue, e em parte, pode ser evidente a partir desta descrição, ou podem ser aprendidas a partir da prática da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 5 A Figura 1A mostra o ácido nucleico que codifica para o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 (SEQ ID NO:1). A Figura 1B mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado C- TAB.G5 (SEQ ID NO:2). 0 ligante de aminoácidos entre o domínio de toxina A e o domínio B da toxina está sublinhado.

10 A Figura 2A mostra que ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.G5.1 (SEQ ID NO:3). A Figura 2B mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado C- TAB.G5.1 (SEQ ID NO:4). O ligante de aminoácidos entre o domínio de toxina A e o domínio B da toxina está sublinhado.

15 A Figura 3 mostra o aumento da produção de anticorpos em camundongos vacinados com C-TAB.G5 com as doses crescentes de C-TAB.GS e co-liberação com o adjuvante alum. Os camundongos receberam duas vacinações por injecção IM.

Títulos de anticorpos IgG para os antocorpos anti-C-TAB, 20 antitoxina A e antitoxina B foram avaliados por ELISA duas semanas após a primeira e segunda injecção.

A Figura 4 mostra uma representação gráfica de inducao de IgG anti-C-TAB, antitoxina A, e antitoxina B em camundongos que receberam doses crescentes de C-TAB.G5 com e sem alum por duas injecção IM.

A Figura 5 mostra os títulos de anticorpo sobre uma faixa de dose log em camundongos imunizados com C-TAB.G5 na presença ou na ausência de alum. Os títulos de IgG foram avaliados por ELISA duas semanas apôs a segunda imunização.

Os dados demonstram que o alum aumenta significativamente a produção de anticorpos em camundongos vacinados.

A Figura 6 mostra o efeito protetor em camundongos vacinados com C-TAB.GS (com e sem alum) e, em seguida, expostos a uma dose letal da toxina A ou toxina B. Os camundongos que receberam duas vacinações (IM) no intervalo de duas semanas foram desafiados (IP), três semanas mais tarde. Anticorpos neutralizantes de toxina A e toxina B (TNA) foram avaliados duas semanas após a segunda injecção, e o percentual de animais sobreviveram ao desafio letal foi determinado. O aumento das doses de C--TAB.GS conferiram uma maior produção de TNA, bem como o aumento da proteção para o desafio letal. A presença de alum aumentou ainda mais a produção de TNA, bem como conferiu maior sobrevivência em doses mais baixas.

Figura 7 mostra uma comparação da resposta de anticorpos e da eficácia de proteção de C-TAB.GS em camundongos jovens vacinados (6-7 semanas de idade) e velhos (18 meses). Os camundongos que receberam duas vacinações (IM) no intervalo de duas semanas foram desafiados (IP) , três semanas mais tarde. Os títulos em ELISA de anticorpos IgG anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B, produção de TNA, bem como a sobrevivência total foram avaliados. Camundongos jovens 5, demonstraram maior resposta de anticorpos, mesmo sem alum, e ambos os grupos apresentaram melhora da sobrevida quando vacinados na presença de alum.

A Figura 8 mostra uma comparação da cinética do desenvolvimento de anticorpo anti-C-TAB IgG em camundongos jovens e velhos vacinados. Camundongos jovens demonstraram maiores taxas e produção mais precoce de IgG, e ambos os grupos demonstraram respostas melhoradas quando vacinados na presença de alum.

A Figura 9 mostra uma comparação da produção de anticorpo anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B em camundongos imunizados com C-TAB.G5.1 ou uma mistura de toxoide A e B (1:1) . Os camundongos receberam duas vacinações de injeção IM. Títulos IgG de antocorpos anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B foram avaliados por ELISA duas semanas após a segunda injeção. A imunização com toxoide induz anticorpos para a porção N-terminal da molécula de toxina, enquanto a imunização com o C-TAB induz anticorpos contra a porção C-terminal da molécula de toxina.

A Figura 10 mostra uma comparação da produção de TNA e proteção contra o desafio com a toxina A ou B, em camundongos imunizados com C-TAB. G5 . 1 ou mistura de toxoide A e B. Os camundongos que receberam duas vacinações (IM) no intervalo de duas semanas foram desafiados (IP), três semanas mais 5, tarde com uma dose letal da toxina A ou toxina B.

A Figura 11 mostra uma produção de anticorpos IgG anti- C-TAB (A), antitoxina A (B), e antitoxina B (C) em hamsters imunizados com C-TAB.G5.1 com e sem alum. Os hamsters receberam três doses de vacina por injeção IM no dia Q e no 10 dia 14. Títulos de IgG de anticorpos anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B foram avaliados por ELISA nos dias 14, 28 e 35.

A Figura 12 mostra uma representação gráfica do desenvolvimento de anticorpo IgGanti-C-TAB em hamsters 15 imunizados com C-TAB.G5.1 com ou sem alum.

A Figura 13 mostra uma comparação da TNA e proteção em hamsters imunizados com C-TAB.G5.1 com ou sem alum. Duas semanas depois da terceira vacinação hamsters receberam uma dose letal da toxina A ou toxina B por injeção IP.

20 A Fig. 14 mostra a sobrevivência de hamsters vacinados com C-TAB.G5.1 após a administração intragástrica de uma dose letal de esporos de C. difficile. Dados de sobrevivência foram plotados como curvas de ajuste de sobrevida Kaplan- Meier e análise estatística foi feita por meio de uma análise de log rank. Em todas as doses de esporos (102, 103e 104 ) foram observados100% de sobrevivência dos hamsters no grupo vacinado e a sobrevivência foi significativamente aumentada quando comparado com o grupo placebo.

5~ A Figura 15 mostra produção de anticorpo anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B em macacos cyanomologous imunizados com C -TAB. G5 . 1 na presença ou na ausência de alum.

Dois grupos de macacos (três por grupo, 4-6 anos) receberam 200 mg de C-TAB.G5.1 com ou sem 250 pg alum. As amostras de 10 sangue foram tomadas nos dias de estudo 0, 14, 28 e 42.

Método de ELISA foi utilizado para avaliar os títulos de IgG de anti-C-TAB, antitoxinaA e antitoxina B.

A Figura 16 mostra uma comparação da imunogenicidade de C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 liberadosao longo de um intervalo de 15 dose de 1pg - 30 pg em PBS ou tampão de histidina. Camundongos receberam duas vacinações (IM) em dois intervalos de uma semana. Títulos de IgG de anticorpos anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B foram avaliados por ELISA duas semanas após a segunda injeção. Todos os três títulos de anticorpos não 20 foram significativamente diferentes (análise de teste-T) entre C-TAB.GS liberadoem PBS ou tampão de histidina e C- TAB.G5.1 liberadoem tampão de histidina.

A Figura 17 mostra uma comparação da imunogenicidade de C-TAB.G5, C-TABNCTB e C-TADCTB em camundongos. Os camundongos receberam duas vacinas de cada proteína recombinante em intervalo de duas semanas através de injeção IM. Todas as imunizações foram realizadas na ausência de adjuvante alum. Títulos de IgG para anticorpos anti-C-TAB, 5) antitoxina A e antitoxina B foram avaliados por ELISA duas semanas após a segunda injeção. Todas as três proteínas de fusão mostraram elevada imunogenicidade.

A Figura 18 mostra a proteção contra o desafio com a toxina nativa B em camundongos. Os camundongos foram imunizados como indicado para a Figura 17, e, três semanas mais tarde, eles foram desafiados por injeção IP com uma dose letal da toxina nativa B.

A Figura 19 mostra uma comparação da TNA e proteção em hamsters vacinados com o C-TAB.G5.1 ou C-TADCTB na ausência ou na presença de alum. Duas semanas depois da terceira vacinação hamsters receberam uma dose letal da toxina A ou toxina B por injeção IP.

A Figura20mostra a produção de TNA e proteção contra o desafio com a toxina A ou Toxina B em camundongos imunizados com C-TAB.G5.1 em diferentes regimes de TNA. Comparação da produção de TNA e proteção entre grupos de camundongos vacinados pela injeção IM três vezes no dia 0, 3 e 14, ou no dia 0, 7 e 21, ou no dia 0, 14 e 28. Três semanas após a última injeção os camundongos foram desafiados com uma dose letal da toxina A ou toxina B (painel A está na forma de tabela e painel B está na forma de um gráfico).

A Figura 21 mostra a proteção (sobrevivência) contra o desafio com toxina A de C. difficile (55 ng/camundongo) em ! camundongos imunizados com um único shot de lOpg de C- TAB.G5 . 1 e 12,5 jig alum (em 100 p1) . Disse desafio foi feito 21 dias, 35 dias ou 49 dias após a imunização.

DESCRIÇÃO DETALHADA Descricão Geral 10 A presente invenção fornece uma composição imunogênica para a indução de respostas imunitárias protetoras e/ou terapêuticos para as toxinas A e B de C. difficile, compreendendo o uso de um polipeptídeo isolado C-TAB.G5 (SEQ ID NO : 2) ou um derivado do mesmo, C-TAB. G5 . 1 (SEQ ID NO: 4 ) 15 que compreende 19 unidades de repetição (RU) de toxina A e 23 unidades de repetição (RU) de toxina B ou fragmentos peptídicos, ou variantes dos mesmos.

A presente invenção também fornece métodos de produção de polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 e o método de 20 preparação da composição (por exemplo, uma vacina) útil para a prevenção e/ou tratamento de CDAD em mamíferos. A descrição seguinte fornece mais detalhes e exemplos para a construção, expressão, e purificação dos polipeptídeos recombinantes isolados, a sua utilização como antígenos para induzir uma resposta imunitária específica bem como na avaliação da proteção em indivíduos. Os indivíduos podem ser animais ou seres humanos.

Os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 para utilização nos métodos e nas composições da presente invenção podem ser preparados utilizando qualquer um de vários métodos convencionais.Por exemplo, C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode ser produzido usando técnicas de DNA recombinante convencionais, em que uma célula hospedeira apropriada é transformada com l0 um vector de expressão apropriado contendo uma parte de um fragmento de ácido nucleico que codifica a toxina ( ver, por exemplo Dove et a1, Infect. Immun. 58:480-8 (1990) , e Barroso et al, Nucleic Acids Research 18:4004 (1990). Qualquer um de uma ampla variedade de sistemas de expressão pode ser utilizado para produzir os polipeptídeos recombinantes. C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser produzidoem um hospedeiro procariótico (por exemplo, uma bactéria, como E. coli ou Bacillus), ou em um hospedeiro eucariota (por exemplo, células de leveduras, células de mamíferos(por exemplo, COSI, células NIH3T3 ou células JEG3), ou de inseto (por exemplo, Spodoptera frugiperda (células SF9))). Essas células estão disponíveis, por exemplo, a partir da American Type Culture Collection (ATCC). O método de transformação e de transfecção e a escolha do vetor de expressão dependerá do sistema hospedeiro selecionado. Os métodos de transformação e de transfecção são descritos por, por exemplo, Ausubel et ah, ISBN:047132938X C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.1, fragmentos particularmente curtos, podem também ser produzidos por síntese química, por exemplo, pelos métodos descritos em Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, 2a ed., Stewart e Young, Eds., Pierce Chemical Co., Rockford, III, ou por métodos padrões de tradução in vitro.

Além das sequências C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, a presente invençãofornece variantes da mesma, que são funcionalmente ativos e imunogênicos. As variantes podem ter o mesmo nível de imunogenicidade como C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. As variantespodem ter substituições de aminoácidos, deleções, ou inserções, em comparação com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.

Os genes que codificam C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 ou variantes dos mesmos podem ser preparados utilizando métodos padronizados (ver abaixo, ver também, por exemplo, Ausubel et al, supra) Além das sequências C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1, a presente invenção fornece novos derivados de C-TAB.GS que compreendem repetições adicionais. A título de exemplo, uma proteína de fusão, C-TABNCTB (SEQ ID NO:18, codificada pela SEQ ID NO:17), compreende, 19 unidades de repetição de CTA tipo C- TAB.G5(aminoácidos 2272-2710), 23 unidades de repeticao de

CTB (aminoácidos 1850-2366), e mais 10 repetições adicionais de CTB (aminoácidos 1834-2057) fundidos com o C-terminal de CTB. Outra variante, a proteína de fusão C-TADCTB (SEQ ID NO:20, codificada pela SEQ IDNO:19) compreende C--TAB.GS (19 5 repetições de CTA e 23 repetições de CTB), mais um adicional de 24 unidades de repetição de CTB (aminoácidos 1834-2366) fundidos com o C-terminal do C-TAB.GS. Uma variante pode também conter cópias adicionais de C-TAB.GS ou porções dos mesmos. Por exemplo, C-TADCTB compreende uma porção dupla das unidades de repetição de CTB presentes no C-TAB.G5.

A presente invenção fornece métodos para o elevado nível de expressão de C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 em sistema bacteriano, como E. coil, compreendendo introduzir um ácido que codifica C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 em uma célula hospedeira bacteriana e qe expressa C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1.

Além disso, o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1 da presente invenção pode ser ligado de forma covalente ou de ligação cruzada aos adjuvantes (ver, por exemplo, Cryz et al, Vaccine 13:67-71 (1994); Liang et al, J. Immunology 141 :1495-501 (1988) e Czerkinsky et al, Infect.Imune. 57: 1072-1077 (1989)).

A presente invenção fornece uma vacina que compreende o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 que pode proteger e fornecer terapia contra CDAD. A vacina da presente

V 28/198 invenção compreende um novo antígeno que pode ser liberadopor via intramuscular (IM), por via intradérmica (ID), por via subcutânea (SC) , por via oral, nasal, bucal, retal. A vacina pode fornecer proteção imunológica ou induzir anticorpos 5 para a imunização passiva.

O polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 da presente invenção fornece uma vacina para imunizar contra CDAD. 0 polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção ou variantes dos mesmos, é umavacina 10 candidata combinada direcionada para ampliar a cobertura de proteção contra doenças associadas a C. difficile, como CDAD, em um nível não conhecido ou não publicado até o momento.

Este conceito de umavacina única oferecendo proteção ou uma gravidade diminuída de doenças associadas a C. difficile 15 representa um passo para frente na gestão de saúde pública em nível global e, especialmente, reduzindo a gravidade das epidemias (por exemplo, lares de idosos, navios de cruzeiro) .

Comousado aqui, "proteína toxina A" ou "proteína toxina B" refere-se às proteínas tóxicas de C. difficile que são 20 principalmente responsáveis por CDAD. A toxina A e toxina B compreendem múltiplas unidades de repetição responsáveis pela imunogenicidade nos domínios de ligação de C-terminal.

Comousado aqui, "tipo selvagem" ou "nativa" refere-se a uma proteína de comprimento completo composta por um ácido

N nucleico ou sequência de aminoácidos que seriam encontrados endogenamente em uma célula hospedeira.

Comousado aqui, os termos "doença associada aClostridiurn difficile", "doenças relacionadas a Clostridium 5 difficile", "doença associada a Clostridium difficile", "doençamediado por toxina de Clostridium difficile", "infecção por Clostridium difficile", e "CDAD"referem-se às doenças causadas direta ou indiretamente, por infecção por Clostridium difficile.

10 "Antígeno" refere-se a uma substância que induz uma resposta imunológica específica quando apresentada às células imunes de um organismo. Por exemplo, um antígeno pode ser um ácido nucleico, uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, uma glicoproteína, um carboidrato, um lipídeo, 15 um glicolipídeo, uma lipoproteina, uma proteína de fusão, um fosfolipídeo, ou um conjugado de uma combinação dos mesmos.

Um antígeno pode compreender um único epítopo imunogénico, ou uma multiplicidade de epítopos imunogênicos reconhecidos por um receptor de células B (ou seja, anticorpos na membrana 20 da célula B) ou um receptor de células T. Antígeno pode ser fornecido como um uma partícula tipo vírus (VLP) ou um micróbio todo ou micro-organismo, como por exemplo, uma bactéria ou vírion. O antígeno pode ser um vírus vivo atenuado ou inativado. O antígeno pode ser obtido a partir

4. 30/198 de um extrato ou usado, ou a partir de células inteiras ou membranas isoladas, ou o antígeno pode ser sintetizado quimicamente ou produzido por meios recombinantes. Um antígeno pode ser administrado por si só ou com um adjuvante.

5 Uma única molécula de antígeno pode ter ambosantígeno e propriedades adjuvantes.

Por "adjuvante" entende-se qualquer substância que é usada para especificamente ou nãoespecificamente potencializar uma resposta imunológica especifica para o 10 antígeno, possivelmente através da ativação de células apresentadoras de antígenos. Exemplos de adjuvantes incluem uma emulsão de óleo (por exemplo, adjuvante completo ou incompleto de Freund), adjuvante Seppic incompleto de Montanide como ISA, óleo em adjuvantes de emulsão em água, 15 como o sistema de adjuvante Ribi, formulação adjuvante syntax contendo muramildipeptídeo, adjuvante de sal alumínio (ALUM), polímero policatiônico, especialmente peptídeo policatiônico, especialmente poliarginina, ou um peptídeo contendo pelo menos dois motivos LysLeuLys, especialmente 20 KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleotídeo imunoestimulante (ODN) contendo dinucleotídeos de citosina-guanina não metilados (CpG) em um contexto de base definida (por exemplo, como descrito em WO 96/02555) ou ODNs baseados em inosina e citidina (por exemplo, como descrito em WO 01/93903), ou

V 31/198 f ácido desoxinucleico contendo resíduos desoxi-inosina e/ou desoxiuridina (como descrito em WO 01/93905 e WO 02/095027)

, especialmente Oligo (dIdC)13(como descrito em WO 01/93903 e WO 01/93905), composto neuroativo, especialmente hormônio

5 de crescimento humano (descrito em WO01/24822), ou combinações dos mesmos, uma quimiocina (por exemplo,

defensinas 1 ou 2, RANTES, M1P1-a,MIP-2, interleucina-8, ou uma citocina (por exemplo, interleucina-113, -2, -6, -10, ou

-12; interferon-y, fator-a de necrose tumoral; fator de

10 estimulação de colônia de granulócitos-monócitos) (revisto em Nohria e Rubin, 1994), uma variante de muramil dipeptídeo

(por exemplo, murabutida, treonil-MDP ou tripeptídeo de muramil), variantes sintéticos do MDP, uma proteína de choque térmico ou uma variante, uma variante de Leishmania major

15 LeIF (Skeiky et al, 1995, J.

Exp.

Med. 181: 1527-1537), as variantes náotóxicas de exotoxinas ADP-ribosilantes bacterianas (bAREs), incluindo variantes no sítio de clivagem da tripsina (Dickenson e Clements, (1995) Infection and Immunity 63 (5): 1617-1623) e/ou afetando a ADP-

20 ribosilação (Douce et al, 1997) ou bAREs quimicamente desintoxicados (toxoides), QS21, Quill A, N-acetilmuramil-

L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-s-

glicero-3-(hidroxifosforiloxi)] etilamida (MTP-PE) e composições contendo um óleo metabolizável e um agente emulsionante. Um adjuvante pode ser administrado com um antígeno ou pode ser administrado por si só, ou, pela mesma via que a do antígeno ou por uma via diferente da do antígeno.

Uma única molécula adjuvante pode ter ambas as propriedades 5 adjuvantes e antígenos.

Por "quantidade eficaz" entende-se uma quantidade de um agente terapêutico suficiente para induzir ou aumentar uma resposta imunológica específica a um antígeno, para um antígeno, ou tratar ou diagnosticar uma condição, para uma 10 droga. Dita indução de uma resposta imune pode fornecer um tratamento como, por exemplo, imunoproteção, dessensibilização, imunossupressão, modulação de doença autoimune, potencialização de imunovigilância de câncer, ou a vacinação terapêutica contra uma doença infecciosa 15 estabelecida. O tratamento inclui a cura, melhoria, ou prevenção.

Por "ácido nucleico" entende-se uma única base de ácido desoxirribonucleico ou um ácido ribonucleico ou uma sequência do mesmo unida por ligações fosfodiéster.

20 Por termo "agente terapêutico" entende-se qualquer molécula capaz de ser utilizada no tratamento de uma doença, aliviar os sintomas de uma doença, prevenir uma doença, ou diagnosticar uma doença. Por exemplo, um agente terapêutico pode ser um antígeno ou umadroga.

Por "indivíduo" entede-se um animal. O indivíduo pode ser qualquer animal, incluindo qualquer vertebrado. O indivíduo pode ser um animal de fazenda, animais de laboratório (incluindo, entre outros, roedores, como rato, hamster, gerbil, ou camundongo) ou animais de companhia. Em uma modalidade, o animal pode ser um mamífero. Exemplos de mamíferos incluem os seres humanos, primatas, caninos, marsupiais, macacos, roedores, felinos, macacos, baleias, golfinhos, vacas, porcos e cavalos. O indivíduo pode estar em necessidade de tratamento de uma doença ou pode estar em necessidade de um tratamento profiláctico.

Comousado aqui, o termo "anticorpo" significa uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento de uma molécula de imunoglobulina possuindo a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno particular. Os anticorpos são bem conhecidos aos especialistas na ciência da imunologia.

Comousado aqui, o termo "anticorpo" significa não só moléculas de anticorpo de comprimento total, mas também fragmentos de moléculas de anticorpo contendo a capacidade de ligação do antígeno. Ditos fragmentos são bem conhecidos na técnica e são regularmente empregados tanto in vitro como in vivo. Em particular, comousado aqui, o termo "anticorpo" significa não só moléculas de imunoglobulina de comprimento total, mas também fragmentos ativos de ligação ao antígeno,

como os fragmentos ativos bem conhecidos F(ab')2, Fab, Fv e Fd.

Comousado aqui, o termo "variantes" pode incluir as proteínas e/ou polipeptideos e/ou peptídeos que são diferentes de um polipeptídeo do tipo selvagem, em que um ou mais resíduos foram conservadoramente substituídos por um resíduo funcionalmente semelhante e, além disso, que apresenta as propriedades funcionais substancialmente idênticas do polipeptídeo tipo selvagem. Exemplos de l0 substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo nãopolar (hidrofóbico) por outro (por exemplo, isoleucina, valina, leucina ou metionina) por outro, a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por outro (por exemplo, entre a arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre glicina e serina), substituição de um resíduo básico por outro (por exemplo, lisina, arginina ou histidina), ou substituição de um resíduo ácido por um outro (por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutãmico). Uma variante pode incluir qualquer polipeptídeo possuindo uma estrutura terciária substancialmente idêntica a um polipeptídeo da invenção que também mostra as propriedades funcionais dos polipeptídeos como aqui descritos. Uma variante pode ser um mutante de um polipeptídeo do tipo selvagem.

Comousado aqui "tratamento" pode incluir qualquer tipo de intervenção utilizada em uma tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou da célula. O tratamento pode incluir, entre outros, administração de, por exemplo, uma composição farmacêutica, isolada ou em combinação com outras modalidades de tratamento, geralmente conhecidos na técnica.

O "tratamento" pode ser realizado profilaticamente, ou subsequente à iniciação de um evento patológico.

Comousado aqui, "carreador farmaceuticamente aceitável" pode incluir qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e não é reativa com o sistema imunológico do indivíduo. Os carreadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem incluir tampões, estabilizantes, diluentes, conservantes e solubilizantes. Em geral, a natureza do carreador ou excipientes vai depender do modo de administração particular a ser empregado. Por exemplo, formulações parenterais em geral compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, como água, soro fisiológico, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como veículo. Para composições sólidas(por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), carreadores sólidos nãotóxicos convencionais podem incluir,

por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, ou estearato de magnésio. Além de carreadpres biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares 5 nãotóxicas, como agentes molhantes ou emulsificantes, • conservantes e agentes tamponantes de pH e semelhantes, por exemplo acetato de sódio ou o monolaurato de sorbitano.

Comousado aqui, "fusão" pode referir-se aos ácidos nucleicos e polipeptídeos que compreendem sequências que não 10 são naturalmente encontradas associadas entre si na ordem ou contexto em que estas são colocadas de acordo com a presente invenção. Um ácido nucleico ou polipeptídeo de fusão não necessariamente compreendem a sequência natural do ácido nucleico ou polipeptídeo na sua totalidade.As proteínas de 15 fusão têm dois ou mais segmentos unidos entre si através de ligações peptídicas normais. Ácidosnucleicos de fusão têm os dois ou mais segmentos unidos entre si por meio de ligações fosfodiéster normais.

Poliieotídeos Isolados 20 A presente invenção forneceos polipeptídeos isolados C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 como descrito em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, respectivamente, que compreendem 19 unidades de repetição de toxina A C. difficilee 23 unidades de repetição de toxina B C. difficile. Um homólogo de C-TAB.GS, como C-

TAB.G5.1, pode ser diferente a partir de C-TAB.G5 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos. O polipeptídeo C- TAB.G5.1 é uma proteína de fusão que contém o mesmo domínio do C-terminal da toxina B como C-TAB.G5, mas o domínio C- ' 5 terminal da toxina A derivada de C. difficilecepa VPI-10463 que é um homólogo de acordo com o polipeptídeo C-TAB.GS derivado de cepa 630 de C. difficile e difere por dois aminoácidos nas posições 155-156. A sequência de codificação C-TAB.G5.1, conforme estabelecido na SEQ ID NO:3, foi 10 otimizada por cõdons para expressão melhorada dentro de uma célula hospedeira de E. coli. Os polipeptídeos isolados C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser eficazes na neutralização dos efeitos tóxicos de toxina A e toxina B de C. difficile.

15 A toxina A e toxina B são codificadas pelo trdA (SEQ ID NO:5) e trdB (SEQ ID NO:7), os genes da C. difficilecepa 630, respectivamente. Estruturalmente, as toxinas de C.

difficile compreendem um domínio de ADP-glucosil- transferase, um domínio de cisteína protease, uma região 20 hidrofóbica e uma região de ligação ao receptor. O domínio C-terminal contém unidades altamente repetitivas (RUs) (também conhecido como oligopeptídeos repetitivos combinados (CROPS)). As RUs podem ser oligopeptideos curtos ou longos e podem compreenderde 20a 50 aminoácidos com um motivo YYF de consenso que é repetido. Os RUs são agrupados em aglomerados. Como um exemplo, a toxina A, a cepa 630 (SEQ ID NO:6) codificada pelo gene trdAtipo selvagem (SEQ ID NO:5) contém 39 RUs. Os 39 RUs são agrupados em oito aglomerados.

5 A toxina B, cepa 630 (SEQ ID NO:8) codificada pelo gene • trdBtipo selvagem (SEQ ID NO:7) contém 24 RUs que estão agrupados em 5 aglomerados. As Tabelas 1 e 2 abaixo mostram as posições de aminoácidos de cada uma das RUs de toxina A e toxina B de C. difficile codificadas pelo gene trdAe gene 10 t rdB .

Tabela 1: Unidades de Repetição de Toxina A (ARU)

AA INICIAL AGLOMERADO REPETIÇÃO (SEQ ID SEQ NO: 6) 51 1832 GLININNSLFYFDPIEFNLVT Si 1853 GWQTINGKKYYFDINTGAAL S3 1874 SYKI INGKHFYFNND G VMQL L 1894 GVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQS Si 1925 KFLTLN GKKYYFDNN SKA VT S2 1945 GW RIINNEKYYFNPNNAIAA V S3 1966 GLQVIDNNKYYFNPDTAIISK 2 S4 1987 GWQTVNGSRYYFDTDTAIAFN S5 2008 GYKTIDGKHFYFDSDCVVKI L 2028 GVFSTSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQS

Si 2059 KFLTLNGKKYYFDNNSKAVT

52 2079 GLQTIDSKKYYFNTNTAEAAT

S3 2100 GWQT1DGKKYYFNTNTAEAAT 3 S4 2121 GWQTIDGKKYYFNTNTAIAST

S5 2112 GYTIINGKHFYFNTDGIMQI

L 2162 GVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN

SI 2193 EFLTLNGKKYYFGSDSKAVT

S2 2213 GWRI1NNKKYYFNPNNAIAAI

4 S3 2234 HLCTINNDKYYFSYDGILQN

S4 2254 GYITIERNNFYFDANNESKMVT

L 2276 GVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQN

SI 2307 KFLTLNGKKYYFDNDSKAVT

S2 2328 GWQTIDGKKYYFNLNTAEAAT

S3 2349 GWQTIDGKKYYFNLNTAEAAT

S4 2370 GWQTIDGKKYYFNTNTFIAST

S5 2391 GYTSINGKHFYFNTDGIMQI

L 2411 GVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN si 2441 KFLTLN GKKYYFGSDSKA VT

S2 2460 GLRTIDGKKYYFNTNTAVAVT

6 S3 2482 GWQTINGKKYYFNTNTSIAST

S4 2503 GYTIISGKHFYFNTDGIMQI

L 2523 GVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN

Si 2554 RFLYLHDNIYYFGNNSKAAT

7 Si 2574 GWVTIDGNRYYFEPNTAMGAN

S3 2595 GYKTIDNKNFYFRNGLPQI

L 2614 GVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN

SI 2645 RFLHLLGKIYYFGNNSKAVT

8 S2 2665 GWQTINGKVYYFMPDTAMAAAG

S3 2687 GLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG

S: indica uma unidade de repetição curta

L: indica uma unidade de repetição longa

Tabela 2: Unidades de repetição de Toxina B (BRU)

AA NICJAJ.

A(WOMLaAIX) RLPE FI át11. (SEQ ID SEQ NO: 8)

SI 1834 GLIYINDSLYYFKPPVNNLIT

S2 I 1854 GFVTVGDAKYYFNPINGGAASI

S3 [877 G1 TIIDDKNYYFNQSGVLQT

L 1897 GVFSTEDGFKYFAPANTLDENI.EGEAIDFT

SI 1927 GKLIIDENIYYFDDNYRGAV

S2 1947 EWKELDGEMHYFSPETGKAFK

S3 1968 GLNQIGDYKYYSNSDGçfNIQK

S4 1988 GFVNI NDKTFYFDDSG VAMKS

S5 2(0$ GYTEIDGKHFYFAENG1 MQ1

L 2028 GVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYS

SI 2058 GILNFNNKIYYFDDSFTAVG

S2 207R WKDLEDGSKYYFDEDTAEAI

S3 2098 GLSLINDGQYYFNDDGIMMQV 3 S4 2119 GFVTINDKVFYFSDSGIIES

S5 2139 GVQNIDDNYFYIDDNGIVQI

L 2159 GVFDTSDGYKYFAI'ANTVNDNIYGQAVEYS

4 E SI 2189 GLVRVGEDVYYFGF.TYTI GW1

S2 2213 YDh1ENESDKYYFNPETKKACK

S3 2234 GINLIDDIKYYFDEKGtMRT

54 2254 GLISFENNNYYFN.ENGEMQF

S5 2273 GYINIEDI{M.FYFGEDGVMQ[

L 2294 GVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESFNYT

Si 2324 GWLDLDEKRYYFTDEYIAAT 5 S2 2344 GSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE

S: indica uma unidade de repetição curta

L: indica uma unidade de repetição longa

Assim, os polipeptideos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 compreende 19 RUs do domínio C-terminal da toxina A de C.

difficile e 23 RUs do domínio C-terminal da toxina B deC. difficile, respectivamente. O C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 compreende aminoácidos 2272-2710 de toxina A de SEQ ID NO:6 5 fundido aos aminoácidos 1850-2366 de toxina B de SEQ ID NO:8.

. 0 polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 compreende a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, respectivamente.

As respectivas RUs no polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 também podem ser a partir de variantes da toxina A ou toxina B de C. difficile. Estes RUs no polipeptídeo isolado C-TAB pode também ser uma combinação de variantes de ocorrência natural ou toxina A ou toxina B de C. difficile.

As RUs nospolipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1 compreendem RUs longas e RUs curtas, eRUs longas e RUs curtas são organizadas em um aglomerado. Ospolipeptídeos isolados C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção compreende 4 aglomerados de 3 a 5 RUs curtas seguido por umaRU longa de toxina A de C. difficile e 5 aglomerados de 3 a 5 RUs curtas seguido por uma RU longa de toxina B de C. difficile.

As RUs curtas e longascontêm motivos conservados. A unidade de repetição curta pode compreender 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 aminoácidos. Cada unidade de repetição curta pode conter motivos tirosina conservados,

como YYF, FYF, YFF, FYI, ou HYF. Uma unidade de repetição curta pode ainda compreender um resíduo de aspartato/histidina antes do motivo de tirosinase a seguinte unidade de repetição é uma unidade de repetição longa. A 5 unidade de repetição longa pode compreender 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ou 35 aminoácidos. Cada unidade de repetição londa pode compreender um motivo de repetição tirosina como FEYF, FKYF ou YKYF.

Na presente invenção, as porções de toxina A e toxina 10 B da polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 podem ser fundidas diretamente juntas. As porções de toxina A e toxina B podem ser separadas por uma região ligante. A região ligante pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a 15, 20a 30, 40, 45, ou 50 aminoácidos. Os especialistas na 15 técnica reconhecerão que a região ligante pode ser adaptada para alterar o posicionamento das porções da toxina A e toxina B de modo a que em suas formas expressa e dobrada cada unidade de repetição da toxina nos polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 está posicionada de forma 20 ideal para expor potenciais epítopos e para manter a sua imunogenicidade. As RUs e os aglomerados nos polipeptideos isolados C-TAB também podem ser separadoa por ligantes. Em uma modalidade, o ligante compreende o peptídeo RSMH (439- 442 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4).

Os polipeptídeos isolados C-TAB da presente invenção pode ter, pelo menos, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência ou similaridade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou

5 SEQ ID NO:4. Como é conhecido na técnica "similaridade" entre dois polipeptídeos ou polinucleotideos é determinada pela comparação da sequência ou nucleotídeo e seus substitutos conservadosde nucleotídeos ou aminoácidos de um polinucleotídeo ou polipeptídeo com a sequência de um segundo

10 polinucleotídeo ou polipeptídeo.

Também conhecida na técnica é a "identidade", que significa o grau de relação de sequências entre dois polipeptídeo ou duas sequências de polinucleotídeos, como determinado pela identidade da combinação entre duas cadeias de ditas sequências.

Ambos

15 identidade e similaridade podem ser facilmente calculados

(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed, Oxford

University Press, New York, 1988; Biocomputing:. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed, Academic Press, New

York, 1993., Computer Analysis of Sequence Data, Part I,

20 Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds, Humana Press, New

Jersey, 1994;. Sequence Analysis in Molecular Biology, von

Heinje, G., Academic Press, 1987, e Sequence Analysis Primer,

Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New

York, 1991). Embora exista uma série de métodos para medir a identidade e similaridade entre duas sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeos, os termos "identidade" e "similaridade" são bem conhecidos dos especialistas na técnica (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds, M Stockton Press, New York, 1991, e Carillo, H, e Lipman, D., SIAM J. Applied Math, 48:1073 (1988). Métodos comumente empregados para determinar a identidade ou similaridade entre duas sequências incluem, entre outros, aqueles revelados em Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988) .

Os polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1 da presente invenção são imunogênicos. Por exemplo, os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ter, pelo menos, 50%, 60%, 700, 80%, ou 90% da atividade imunológica da correspondente toxina A bacteriana, e os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C- TAB.G5.1 podem ter, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% da atividade imunológica da correspondente toxina Bbacteriana Os polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser utilizados como vacinas para tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de CDAD.

Os polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1 da presente invenção também incluem variantes de polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 tendo a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID

NO:4, respectivamente.

As variantes podem ter inserções de aminoácidos, substituições e/ou deleções, que têm um mínimo ou nenhum efeito sobre a atividade, função ou na forma do polipeptídeo isolado.

Exemplos de tais substituições incluem a substituição de um resíduo não polar por outro, a substituição de um resíduo polar por outro, a substituição de um resíduo básico por outro, ou a substituição de um resíduo ácido por outro.

As variantes dos polipeptídeos isolados C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 podem incluir outras inserções, substituições e/ou deleções de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos do domínio extracelular de uma toxina A ou toxina B nativa que gera um efeito mínimo sobre a atividade, função e/ou a estrutura do polipeptídeo.

Os especialistas na técnica reconhecerão aminoácidos não naturais que podem também ser utilizados.

Os aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, beta-alanina

(beta-Ala), ou outros ômega-aminoácidos, como 3-

aminopropiônico, 2,3-diamino-propiônico (2,3-diaP), 4 -amino butírico e assim por diante, ácido alfa-aminisobutírico

(Aib), sarcosina (Sat), ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-

butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-

metilisoleucina (N-Melle), fenilglicina (Phg) e ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle) , ácido cisteico (Cya) 2-naftilalanina (2-Nal);ácido 1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina-3-carboxilico (Tic); beta-2-tienilalanina 5 (Thi), e sulfóxido de metionina (MSO).

As sequências de nucleotideos que codificam polipeptideos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser otimizadas por códon para aumentar a expressão em células hospedeiras diferentes.Otimização por códon refere-se à modificação da sequência de nucleotídeos, a fim de aumentar a expressão da proteínaem uma célula hospedeira de interesse, substituindo um ou mais códons da sequência nativa com os códons que são mais frequentemente utilizados nos genes daquela célula hospedeira ou nos genes do hospedeiro celular do qual foi derivado. Várias espécies apresentam viés para determinados códons de um aminoácido especifico. A presente invenção fornece sequência de nucleotídeos otimizadas por códons que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.G5.1 para uma maior expressão em E. coil.

Os polipeptïdeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser preparados através de quaisquer técnicas conhecidas. Por exemplo, os polipeptídeos isolados podem ser expressos por meio de engenharia genética. A título de exemplo, a tradução do DNA recombinante. Os polipeptideos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 podem também ser preparados sinteticamente. A título de exemplo, os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 podem ser sintetizados utilizando a técnica sintética em fase sólida inicialmente descrita por Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), que é aqui incorporada por referência. Outras técnicas de síntese de polipeptídeo podem ser encontradas, por exemplo, Kent et ai. (1985) em Synthetic Peptides in Biology and Medicine, eds.Alitalo et al., Elsevier Science Publishers, 295-358.

Os polipeptideos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser isolados ou obtidosem uma forma substancialmente pura. Substancialmente puro significa que as proteínas e/ou polipeptídeos e/ou peptídeos são essencialmente isentos de outras substâncias com as quais podem ser encontrados na natureza ou em sistemas in vivo até uma extensão prática e apropriada para a utilização pretendida. Em particular, os polipeptideos isolados C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 são suficientemente puros e são suficientemente livres de outros constituintes biológicos de suas células hospedeiras de modo a ser útil, por exemplo, para gerar anticorpos, sequenciamento, ou na produção de preparações farmacêuticas. Através de técnicas bem conhecidas na técnica, os polipeptídeos substancialmente puros podem ser produzidos à luz das sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos aqui divulgadas. Devido ao fato de um polipeptideo substancialmente purificado isolado da invenção poder ser misturado com um carreador farmaceuticamente aceitável em uma preparação farmacêutica, o polipeptídeo isolado pode compreender apenas um determinado percentual em peso da preparação. O polipeptideo isolado é, todavia, substancialmente puro, em que foi substancialmente separado das substâncias com as quais pode estar associado em sistemas vivos.

A presente invenção fornece ainda polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 compreendendos polipeptideos adicionais. Os polipeptídeos adicionais podem ser fragmentos de um polipeptídeo maior. Em uma modalidade, há um, dois, três, quatro, ou mais polipeptideos adicionais fundidos aos polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. Em algumasmodalidades, os polipeptideos adicionais são fundidos para o terminal amino dos polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1. Em outras modalidades, os polipeptídeos adicionais são fundidos para o terminal carboxil dos polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1. Em outras modalidades, os polipeptideos adicionais flanqueiam polipeptideos isolados C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Em ainda outras modalidades, os polipeptideos adicionais se encontram dispersos entre a porção da toxina A e a porção da toxina B de polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos adicionais ajudam no direcionamento da secreção ou localização subcelular de polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1.

Ditos polipeptídeos são referidos como uma "sequência sinal". Um sinal de secreção é descrito, por exemplo, na Patente US6.291.212 e Patente US 5.547.871, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Sequência sinal secretora codifica peptídeos secretores. Um peptídeo secretor é uma sequência de aminoácidos que atua para direcionar a secreção de C-TAB. G5 ou C-TAB. G5 . 1 a partir de uma célula. Peptideos secretores são geralmente caracterizados por um núcleo de amino ácidos hidrofóbicos e são tipicamente (mas não exclusivamente) encontrados nos terminais amino das proteínas recentemente sintetizadas. O peptídeo de secreção pode ser clivado a partir do polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 durante a secreção. Peptídeos secretores podem conter sítios de processamento que permitem a clivagem do peptídeo de sinal a partir da proteína madura conforme passa através da via secretora. Os sítios de processamento podem ser codificados dentro do peptideo sinal, ou podem ser adicionadosao peptídeo sinal, por exemplo, por mutagênesein vitro. As sequências sinal secretoras podem ser necessárias para uma série complexa de etapas de processamento pós-tradução para permitir a secreção de C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. A sequência sinal pode seguir-se imediatamente à iniciação de códon e codifica um peptídeo sinal na extremidade amino-terminal de C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. A sequência sinal pode preceder o códon de parada e codifica um peptídeo sinal na extremidade carboxi-terminal de C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. Na maioria dos casos, a sequência sinal é clivada por uma protease especifica, denominada um sinal de peptidase. Exemplos de uma sequência sinal de secreção incluem, entre outras,ompA, pe1B, e pré-pró de ST.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos adicionais auxiliam a estabilização, estrutura e/ou purificação dos polipeptídeos isolados C-TAE.GS ou C-TAB.G5.1. Em algumas modalidades os polipeptideos adicionais podem compreender um epítopo. Em outras modalidades, os polipeptideos adicionais podem compreender um tag de afinidade. A título de exemplo, a fusão de um polipeptídeo compreendendo um epítopoe/ou um tag de afinidade para o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1 pode auxiliar a purificação e/ou identificação do polipeptídeo. A título de exemplo, o segmento de polipeptídeo pode ser um His-tag, um myc-tag, um tag S-peptídeo, um tag de MBP (proteína de ligação à maltose), um tag GST (glutationa S-transferase), um tag FLAG, uma tag tiorredoxina, um tag GFP (proteína fluorescente verde), uma BCCP (proteína transportadora de biotina carboxil), um tag de calmodulina, um tag Strep, um tag de epítopo-HSV, um tag V5-epítopo, e um tag de CBP. O uso de ditos epitopos e tag de afinidade é conhecido dos especialistas na técnica.

Em outras modalidades, os polipeptídeos adicionais podem fornecer um polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.1 compreendendo sítios para clivagem do polipeptídeo.

Como exemplo, um polipeptídeo pode ser clivado por hidrólise da ligação peptídica. Em algumas modalidades, a clivagem é realizada por uma enzima. Em algumas modalidades, a clivagem ocorre na célula. Em outras modalidades, a clivagem ocorre através da manipulação artificial e/ou a introdução artificial de uma enzima de clivagem. A título de exemplo, as enzimas de clivagem pode incluir a pepsina, tripsina, quimotripsina, trombina, e/ou factor Xa. A clivagem permite a facilidade de isolamento dos polipeptídeos isolados C- TAB.GS ou C-TAB.G5.la partir dos polipeptídeos. A clivagem pode ainda permitir a separação da porção toxina A da porção da toxina B. A clivagem também pode permitir o isolamento do polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 fundido com polipeptideos de outros polipeptídeos, como através de clivagem de um epítopo utilizada para purificar a proteína expressa.

Os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 podem possuir mais modificações estruturais adicionais que não são partilhadas com o mesmo peptídeo sintetizado organicamente, como adenilação, carboxilação, glicosilação, hidroxilação, metilação, fosforilação ou miristilação. Estas modificações estruturais podem ser adicionadas ainda ou preferenciais pela escolha apropriada do sistema de expressão recombinante. Por outro lado, polipeptídeos de fusão podem ter sua sequência extendida pelos princípios ea prática de síntese orgânica.

A presente invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C--TAB.G5.1 que compreendem uma porção de polipeptídeo obtida de toxina A de C. difficilee uma porção de polipeptídeo obtida a partir de toxina B de C. difficile. Os ácidos nucleicos podem incluir formas de fita simples ou duplas de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou os polímeros dos mesmos. A presente invençãofornece ácidos ribonucleicos que codificam polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1.

A presente invenção também fornece ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas com um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 e o complemento do mesmo. Condições rigorosas referem-se ao grau de homologia entre uma sonda e um ácido nucleico ligado ao filtro, quanto maior o rigor mais elevado o percentual de homologia entre a sonda e o ácido nucleico ligado ao filtro.

5 A temperatura para uma lavagem rigorosa pode ser determinada com base na Tm do ácido nucleico (com base em conteúdo G/C).

As condições rigorosas podem ser ainda afetadas pela concentração de sal em um tampão, como citrato de sódio (SSC). A presente invençãofornece ácidos nucleicos com cerca 10 de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , ou 99% de similaridade de sequência ou identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.

O polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ainda compreender uma região ligante, por exemplo um ligante 15 de menos do que cerca de 50, 40, 30,20, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2, 1 ou resíduos de aminoácidos. O ligante pode ser covalentemente ligado a e entre a porção de polipeptídeo derivado da toxina A ou uma porção do mesmo e a porção de polipeptídeo derivada da toxina B.

20 A presente invenção fornece ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5,1 que são degenerados à SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3, respectivamente. A degenerância do código genético permite variações da sequência de nucleotídeos de uma proteína toxina

A, uma proteína toxina B e/ou o polipeptídeo isolado de interesse, enquanto continua a produzir um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos idêntica à do polipeptídeo codificado pela sequência de DNA nativa.

O procedimento,

conhecido como "otimização de códons" (descrito na Patente

US 5.547.871 que está aqui incorporada por referência na sua totalidade), fornece um com um meio de criação de uma dita sequência de DNA alterada.

O projeto de genes otimizados por códon deve levar em consideração uma variedade de fatores,

incluindo a frequência de uso de códons em um organismo, as frequências de vizinhos mais próximos, a estabilidade do

RNA, o potencial para a formação de estrutura secundária, a via de síntese e as manipulações de DNA futuras previstas deste gene.

Em particular, os métodos disponíveis podem ser utilizados para alterar os códons que codificam para um dado polipeptídeo isolado com aqueles mais prontamente reconhecidos por levedura, quando são utilizados os sistemas de expressão em levedura, ou por células de insetos, quando o sistema de expressão em célula de inseto é utilizado.

A degeneração do código genético permite também a mesma sequência de aminoácidos a ser codificada e traduzida em muitas formas diferentes.

Por exemplo, leucina, serina e arginina são cada uma codificada por seis códons diferentes,

enquanto que a valina, prolina, treonina, alanina e glicina são cada uma delas codificada por quatro códons diferentes.

No entanto, a frequência de uso desses códons sinônimos varia de genoma para genoma entre eucariontes e procariontes. Por exemplo, os padrões de escolha de códons sinônimos entre 5 mamíferos são muito semelhantes, enquantoorganismos evolutivamente distantes, como levedura (como S.

cerevisiae), bactérias (como E. coli) e insetos (como D.

melanogaster) revelam um padrão claramente diferente de frequências de utilização de códons genômicos (Grantham, R., 10 et al, Nucl Acid Res., 8, 49-62 (1980),Grantham, R., et al., Nucl Acido Res., 9, 43-74 (1981),Maroyama, T., et al., Nucl.

Acid Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., et al., Nucl Acido Res., 16, 315-402 (1988),Wada, K., et al., Nucl Acid Res., 19, Supp., 1981 -1985 (1991);. Kurland, C. G, FEBS Lett, 15 285, 165-169 (1991)). Estas diferenças nos padrões de códons de escolha parecem contribuir para os níveis globais de expressão de genes individuais modulando as taxas de alongamento de peptídeos. (Kurland, C. G, FEBS Lett, 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 20 (1984);Sorensen, M.A., J. Mol. Biol, 207, 365-377 (1989); Randall, L.L., et al., Eur J. Biochem, 107, 375-379 (1980);Curran, J.F., e Yarus, M., J. Mol. Biol, 209, 65- 77(1989),Varenne, S., et ai., J. Mol, Biol, 180, 549-576 (1984), Varenne, S., et al., J. Mol. Biol., 180, 549-576

(1984);. Garel, J. -P, J. Theor Biol, 43, 211-225 (1974),Ikemura, T. , J. Mol. Biol, 146, 1 -21 (1981); Ikemura, T., J . Mol. Biol, 151, 389-409 (1981)).

A frequência de utilização de códons preferenciais para 5 um gene sintético deve refletir as utilizações de códons de genes nucleares derivadas do exato genoma (ou como mais intimamente relacionado possível) da célula/organismo que se destina a ser utilizado para a expressão da proteína recombinante.

10 Os métodos preferenciais para determinar a identidade são projetados para conferir a maior correspondência entre as duas sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade estão codificados em programas de computador. Os métodos de programas de computador 15 preferenciais para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem, entre outros, pacote de programas GCG (Devereux, et al., Nucl Acido Res. 12 (1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul of a1., J. Mol, Biol.

215:403 (1990)). O grau de similaridade ou de identidade 20 acima referido é determinado como o grau de identidade entre as duas sequências, muitas vezes, indicando uma derivação da primeira sequência da segunda. O grau de identidade entre dois ácidos nucleicos pode ser determinado por meio deprogramas de computador conhecidos na técnica, como GAP fornecido no pacote de programas GCG (Needleman e Wunsch, J.

Moi. Biol. 48:443-453 (1970)). Para fins de determinação do grau de identidade entre dois ácidos nucleicos para a presente invenção, GAP é utilizado com as seguintes definições: penalidade de criação de GAP de 5,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,3.

A presente invenção também fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica para o polipeptideo isolado C--TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Um vetor pode ser qualquer um de uma série de ácidos nucleicos em que a sequência desejada pode ser inserida por restrição e ligação para transporte entre diferentes ambientes genéticos ou para expressão em uma célula hospedeira. Os vetores são tipicamente compostos de DNA, apesar de vetores de RNA também estarem disponíveis. Os vetores incluem, entre outros, plasmídeos e fagemideos. Um vetor de clonagem é um que é capaz de se replicar em uma célula hospedeira, e que é ainda caracterizado por um ou mais sítios de restrição de endonuclease em que o vetor pode ser cortado de uma determinada maneira e nos quais uma sequência de DNA desejada pode ser ligada de modo a que o novo vetor recombinante mantém a sua capacidade de se replicar na célula hospedeira.

No caso dos plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes à medida que aumenta o número de cópias de plasmídeos dentro da bactéria hospedeira ou apenas uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso dos fagos, a replicação pode ocorrer ativamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogênica.

Os vetores podem ainda conter uma sequência de promotor.

Um promotor pode incluir um ácido nucleico não traduzido normalmente localizado à montante da região de codificação que contém o local de iniciação da transcrição do ácido nucleico. A região do promotor pode também incluir outros elementos que atuam como reguladores de expressão do gene.

Em outras modalidades da invenção, o vetor de expressão contém uma região adicional para auxiliar na seleção de células que possuem o vetor de expressão incorporado. A sequência do promotor é frequentemente limitada (inclusive), em seu terminal 3' pelo sítio de iniciação da transcrição e prolonga-se à montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do fundo.Dentro da sequência promotora será encontrado um sítio de iniciação da transcrição, assim como domínios de ligação às proteínas responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos, muitas vezes, mas não sempre, contêm caixas "TATÁ" e caixas "CAT".

Os vetores podem ainda conter uma ou mais sequências de marcadores apropriadas para utilização na identificação e seleção de células que tenham sido transformadas ou transfectadas com o vetor.Os marcadores incluem, por exemplo, os genes que codificam para proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou a sensibilidade aos antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas atividades são detectáveis através de ensaios padrão conhecidos na técnica (por exemplo, 3-galactosidase ou fosfatase alcalina), e genes que afetam visivelmente o fenõtipo de células transtormaclas ou transtectaaas, hospedeiros, colônias ou placas. Os vetores preferenciais são aqueles capazes de replicação autónoma e de expressão dos produtos dos genes estruturais, presentes nos segmentos de DNA aos quais estão operativamente unidos.

Um vetor de expressão é um em que um ácido nucleico desejado pode ser inserido por restrição e ligação de tal forma que é operativamente ligadoàs sequências reguladoras e pode ser expresso como um transcrito de RNA. Expressão refere-se à transcrição e/ou tradução de um gene endógeno, transgene ou a região de codificação em uma célula.

Uma sequência de codificação e sequências reguladoras são operativamente unidas quando são covalentemente ligadas de tal modo a colocar a expressão ou transcrição da sequência de codificação sob a influência ou controle das sequências reguladoras. Se for desejado que as sequências de codificação sejam traduzidasem uma proteína funcional, duas sequências de DNA são ditas sendo operativamente ligadas, se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' resulta na transcrição da sequência de codificação e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação frame-shift, (2) interferir com a capacidade da região promotora para direcionar a transcrição das sequências de codificação, ou (3) interferir com a capacidade da transcrição do RNA correspondente a ser traduzido em uma proteína. Assim, uma região promotora estaria operativamente ligada a uma sequência de codificação se a região promotora fosse capaz de efetuar a transcrição dessa sequência de DNA de tal forma que o transcrito resultante possa ser traduzido na proteína ou polipeptïdeo desejado.

Os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser produzidos por expressão do ácido nucleico de codificação em células hospedeiras. O ácido nucleico pode ser transformado ou transfectado em células hospedeiras. Deste modo, alguns aspectos da presente invenção incluem a transformação e/ou a transfecção de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e

C-TAB.G5.1. Transformação é a introdução de ácido nucleico exógeno ou heterólogo para o interior de uma célula procariótica. A transfecção é a introdução de ácido nucleico exógeno ou heterólogo para o interior de uma célula 5 eucariótica. 0 ácido nucleico de transformação ou transfecção pode ou não ser integrado (ligado covalentemente) no DNA cromossômico que constitui o genoma da célula. Em procarióticos, por exemplo, o ácido nucleico de transformação pode ser mantido em um elemento epissomal 10 como um plasmídeo ou vetor viral. No que diz respeito às células eucarióticas, uma célula estavelmente transfectada é aquela em que o ácido nucleico de transfecção se tornou integrado em um cromossomo de modo que seja herdado pelas células filhas através da replicação do cromossomo. Esta 15 estabilidade é demonstrada pela capacidade de a célula eucariótica em estabelecer linhagens celulares ou clones constituídos por uma população de células filhas contendo o ácido nucleico transfectado.

Culturas de células eucarióticas superiores podem ser 20 utilizadas para expressar as proteínas da presente invenção, a partir de vertebrados ou de invertebrados, incluindo células de insetos, e os procedimentos de propagação dos mesmos são conhecidos (ver, por exemplo, Kruse et al. (1973) Tissue Culture, Academic Press).

As células hospedeiras e os vetores para a replicação dos ácidos nucleicos e para a expressão de polipeptideos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 codificados são também fornecidas. Quaisquer vetores ou células hospedeiras podem 5 ser usados, quer procarióticos ou eucarióticos. Muitos vetores e células hospedeiras que são conhecidos na técnica para ditos fins. Está dentro da especialidade da técnica selecionar um conjunto apropriado para a aplicação pretendida.

10 As sequências de DNA que codificam para a toxina A e toxina B, ou porções das mesmas, podem ser clonadas a partir de uma variedade de bibliotecas genômicas ou de cDNA derivadas de C. difficile e outros procarióticos que expressam toxina A e toxina B conhecidas na técnica. As 15 técnicas para isolar ditas sequências de DNA utilizando métodos à base de sonda são técnicas convencionais e são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Sondas para isolar ditas sequências de DNA podem basear-se em DNA ou sequências proteicas publicadas. Alternativamente, o método de reação 20 em cadeia da polimerase (PCR) divulgada por Mullis et al.

(Patente US4.683.195) e Mullis (Patente US4.683.202) , aqui incorporada por referência pode ser utilizado. A escolha da biblioteca e seleção de sondas para o isolamento de ditas sequências de DNA está dentro do nível dos especialistas na técnica.

As células hospedeiras apropriadas podem ser derivadas de procarióticas ou eucarióticas. Hospedeiros procarióticos apropriados incluem: Pseudomonas,tal como P. aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus, tal como S. aureus e S.

epidermidis, Serratia marcescens, Bacillus, tal como B.

subtilis e B. megaterium, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Micrococcus, talcomo M. luteus eM.roseus, e Proteus vulgaris. As células hospedeiras apropriadas para a expressão de polipeptídeos da presente invenção, em eucarióticas superiores incluem: leveduras, como Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae); 293 (rim embrionário humano) (ATCC CRL-1573); 293F (Invitrogen, Carlsbad CA) , e 293Te 293T/17 variante (293tsAl6O9neo e variante ATCC CRL-11268) (rim embrionário humano transformado pelo antígeno T de SV40), COS-7 (linhagemCVl de rim de macaco transformada por SV40) (ATCC CRL1651), BHK (células de rim de hamster bebê) (ATCC CRL10); CHO (células de ovário de hamster chinês), células de Sertoli do camundongo; CVI (células de rim de macaco) (ATCC CCL70); VERO76 (células de rim de macaco verde Africano) (ATCC CRL1587), células HeLa (células de carcinoma cervical humano) (ATCC CCL2) , MDCK (células de rim canino) (ATCC CCL34); BRL3A (células do fígado de ratos de búfalo) (ATCC

CRL1442); W138 (células de pulmão humano) (ATCC CCL75); HepG2 (células de fígado humano) (HB8065), e MMT 060652 (tumor mamário de camundongo) (ATCC CCL51).

Em outras modalidades, a presente invenção fornece 5 ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo isolado que compreende os polipeptideos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 e polipeptídeos adicionais. os vetores úteis para a construção de sistemas de expressão em eucariôticos para a produção de polipeptídeos de fusão compreendem ácido 10 nucleico que codifica o polipeptídeo isolado operativamente ligado a uma sequência de ativação da transcrição apropriada, como um promotor e/ou operador. Outras características típicas podem incluir sítios apropriados de ligação ao ribossoma, códons de terminação, potencializadores, 15 elementos terminadores ou de replicação. Estas características adicionais podem ser inseridas no vetor no sítio ou sítios apropriados por técnicas de splicing convencionais, como digestão com endonucleases de restrição e de ligação.

20 Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos complementares podem ser fundidos com o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1.

O ácido nucleico pode codificar polipeptídeos fundidos que podem auxiliar na purificação e/ou a imunogenicidade e/ou a estabilidade, sem deslocamento da região de leitura decódondo polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Os ácidos nucleicos fundidos podem codificar uma sequência secretora, que pode ou não pode ser clivada a partir dos polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1. Os ácidos nucleicos fundidos podem não alongar o polipeptídeo expresso significativamente. Os ácidos nucleicos fundidos podem codificar para menos de sessenta aminoácidos extra para os polipeptideos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos fundidos seguem após o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1. Em outras modalidades, os ácidos nucleicos fundidos precedem o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1. Em outras modalidades, os ácidos nucleicos fundidos flanqueiam o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1.

Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos fundidos podem codificar para um polipeptídeo para auxiliar a purificação dos polipeptideos isolados C-TAB.G5 e C- TAB.G5.1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico fundido irá codificar para um epítopo e/ou um tag de afinidade.

Exemplos de polipeptídeos que ajudama purificação incluem, entre outros, um tag His, um tag myc, um tag S-peptídeo, um tag de MBP, um tag de GST, um tag FLAG, um tag de tiorredoxina, um tag GFP, um BCCP, um tag de calmodulina, um tag Strep, um tag de epítopo-HSV, um tag V5-epítopo, e um tag de CBP. Em outras modalidades, o ácido nucleico fundido 5 pode codificar o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 que tem um sítio direcionado para, ou propenso a, clivagem.

Em uma modalidade, o ácido nucleico fundido pode codificar polipeptídeos compreendendo sítios de clivagem enzimática.

Em outras modalidades, a clivagem enzimática pode ajudar a 10 isolar polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1, bem como outros segmentos de polipeptídeo fundidos, de ainda outros polipeptídeos. A título de exemplo, um ácido nucleico intermediário que codifica para um sítio de clivagem enzimática colocado entre os ácidos nucleicos que codificam 15 para o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 e um epítopo pode permitir a separação posterior dospolipeptídeos isolados C-TAB.G5ou C-TAB.G5.1 expressos e o epítopo. Ditos sítios podem também estar presentes entre a porção da toxina A e a porção da toxina B.

20 A presente invenção também fornece sistemas de expressão concebidos para ajudar na expressão e fornece os polipeptideos isolados C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. O sistema de expressão pode compreender uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. A célula hospedeira pode ser procariõtica. 0 procariota pode ser E. co1í. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariõtica.

5 O sistema de expressão pode compreender ainda agentes para auxiliar na selecção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com êxito com um ácido nucleico que codifica os polipeptideos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica o 10 polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode expressar ainda um gene auxiliar para a célula hospedeira na resistência aos antibióticos, como os genes de resistência à canamicina ou gentamicina ou ampicilina ou penicilina.

Ditos genes resistentes irão permitir a seleção das células 15 hospedeiras que incorporaram corretamente o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, como é conhecido pelos especialistas na técnica.

Outro aspecto da invenção é direcionado para a produção de anticorpos. Os exemplos de anticorpos incluídos pela 20 presente invenção, incluem, entre outros, os anticorpos produzidos por imunização de um indivíduo com o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. Os anticorpos gerados por imunização com o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode ligar-se especificamente à toxina A ou toxina B, ou podem reagir de modo cruzado com o polipeptídeo isolado C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1. Os anticorpos produzidos pelo polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção podem ser caracterizados usando métodos bem 5 conhecidos na técnica.

Os anticorpos produzidos usando o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção podem incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecificos, anticorpos somente de cadeia pesada, anticorpos heteroconj)Igados, cadeia simples (ScFv), anticorpos de domínio simples, as variantes dos mesmos, os polipeptídeos isolados que compreendem uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sitio de reconhecimento do antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequências de amino ácidos dos anticorpos, e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos preferencais são derivados de murino, rato, humano, coelho, caninos, suínos, dromedário, camelo, lhama, felino, primata, ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos, fragmentos e/ou humanizados).

Em outras modalidades, os anticorpos produzidos por imunização com o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 são então humanizados por métodos conhecidos na técnica. Um anticorpo humanizado é uma molécula de imunoglobulina que 5 contém uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Ainda em outras modalidades, os anticorpos totalmente humanos são obtidos usando camundongos comercialmente disponíveis que foram manipulados para expressar as proteínas de imunoglobulina humana específicas.

10 Em outras modalidades, os anticorpos são quiméricos. Um anticorpo quimérico é um anticorpo que combina as características de dois anticorpos diferentes. Métodos de preparação de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica.

15 Em outras modalidades, a sequência de nucleotideos que codifica os anticorpos é obtida e, em seguida, clonada em um vetor de expressão ou propagação. Em outra modalidade, os anticorpos são preparados por recombinação e expressos através de métodos conhecidos na técnica. A título de 20 exemplo, o polipeptïdeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser usado como um antígeno para os fins de isolamento de anticorpos recombinantes por estas técnicas. Os anticorpos podem ser preparados de forma recombinante, utilizando a sequência do gene para expressar o anticorpo de forma recombinante em células hospedeiras. Os métodos para a produção de variantes de anticorpos e anticorpos recombinantes são conhecidos na técnica.

Em outras modalidades, os anticorpos são ligados a um veículo por métodos convencionais na técnica, para utilização em, por exemplo, isolamento e purificação da toxina nativa A ou toxina B ou detecção da toxina nativa A ou toxina B de C. difficile em uma amostra biológica ou espécime.

l0 Composições e formulações A presente invenção também fornece composições compreendendos polipeptídeos isolados C-TAB.GS e C-TAB.G5.1.

As composições podem ser composições farmacêuticas que compreendem o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições utilizadas nos métodos da presente invenção compreendem, geralmente, a título de exemplo e não de limitação, e quantidade eficaz de polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1 (por exemplo, uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imunológica) da invenção, ou um anticorpo contra os polipeptídeos isolados C-TAB.G5 e C- TAB.G5.1 (por exemplo, uma quantidade de um anticorpo neutralizante suficiente para mitigar a infecção, aliviar um sintoma de infecção e/ou prevenir a infecção). A composição farmacêutica pode ainda compreender carreadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores conhecidos na técnica (ver geralmente Remington, (2005), The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins).

O polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.I da invenção pode ser utilizado para os métodos de imunização de seres humanos ou de tratamento de humanos e/ou animais com CDAD. Portanto, os polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.ls podem ser usados dentro de umacomposição farmacêutica. A composição farmacêutica da presente invenção pode incluir ainda carreadorese/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou excipientes úteis na presente invenção são convencionais e podem incluir tampões, estabilizantes, diluentes, conservantes e solubilizantes.

Remington's Pharmaceutical Sciences, por E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edição (1975), descreve composições e formulações apropriadas para administração farmacêutica dos polipeptideos aqui descritos. Em geral, a natureza do carreador ou excipientes dependerá do modo de administração particular a ser empregado. Por exemplo, formulações parenterais em geral compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, como água, soro fisiológico, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), carreadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, ou estearato de magnésio. Além de carreadores biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes molhantes ou emulsificantes, conservantes e agentes tamponantes de pH e semelhantes, por exemplo acetato de sódio ou o monolaurato de sorbitano.

Em uma modalidade a composição farmacêutica pode ainda compreender uma substância imunoestimulante, como um adjuvante. O adjuvante pode ser selecionado com base no modo de administração e pode incluir adjuvantes baseados em óleos minerais, como adjuvante completo e incompleto de Freund, adjuvante Seppic incompleto Montanide como ISA, adjuvantes de emulsão de óleo em água, como o sistema adjuvante Ribi, formulação sintaxe adjuvante contendo dipeptideo muramil, hidróxido de alumínio ou adjuvante sal de alumínio (alum), polímero policatiônico, especialmente peptideo policatiônico, especialmente poliarginina, ou um peptídeo contendo pelo menos dois motivos LysLeuLys, especialmente

KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleotídeo imunoestimulante (ODN) contendo dinucleotídeos citosina-guanina não metilada (CpG) em um contexto de base definida (por exemplo, como descrito em WO 96/02555) ou ODNs baseado em inosina e citidina (por exemplo, como descrito em WO 01/93903), ou ácido deoxinucleico contendo resíduos desoxi-inosina e/ou desoxiuridina (como descrito em WO 01/93905 e WO 02/095027), especialmente Oligo (dIdC)i3(como descrito em WO 01/93903 e WO 01/93905), composto neuroativo, especialmente hormônio de crescimento humano (descrito em WO 01/24822), ou combinações dos mesmos. Ditas combinações são de acordo com os descritos, por exemplo, em WO 01/93905, WO 02/32451, WO 01/54720, WO 01/93903, WO 02/13857, WO 02/095027 e WO 03/047602.

Preferencialmente, o adjuvante é adjuvante hidróxido de alumínio.

Os carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações que são administrados. Os carreadores, excipientes ou estabilizantes podem ainda compreender tampões. Exemplos de excipientes incluem, entre outros, carboidratos (como monossacarídeos e dissacarídeos), açúcares (como sacarose, manitol e sorbitol), fosfato, citrato, antioxidantes (como ácido ascórbico e metionina), conservantes (como fenol, butanol, benzanol;

alquilparabenos, catecol, cloreto de amônio octadecildimetilbenzil, cloreto de hexametônio, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, e m-cresol), polipeptïdeos de baixo peso 5 molecular, proteínas (como albumina do soro ou imunoglobulinas), polimeros de aminoácidos hidrofïlicos, agentes quelantes (como EDTA), contraíons de formação de sal, complexos de metais (como complexos de Zn-proteína), e surfactantes não iônicos (como TWEENTM e polietileno glicol).

10 A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender agentes adicionais que servem para melhorar e/ou complementar o efeito desejado. A título de exemplo, para melhorar a imunogenicidade do polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 da invenção a ser administrado 15 como uma vacina de subunidade, a composição farmacêutica pode compreender ainda um adjuvante.

Um exemplo de uma composição farmacêutica pode ser uma composição imunogênica. A presente invençãofornece composições imunogênicas que compreendem a polipeptídeos 20 isolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1. A composição imunogênica pode incluir ainda um carreador farmaceuticamente aceitável ou outros carreadores e/ou excipientes em uma formulação apropriada para injeçãoem um mamífero. Uma composição imunogênica é qualquer composição de material que provoca uma resposta imunológica em um hospedeiro mamífero, quando a composição imunogênica é injetada ou de outra forma introduzida. A resposta imunológica pode ser humoral, celular ou ambas. Um efeito de reforço refere-se a um aumento da resposta imunológica a uma composição imunogênica mediante a subsequente exposição do hospedeiro mamífero à mesma composição imunogênica. Uma resposta humoral resulta na produção de anticorpos pelo hospedeiro mamífero após a exposição à composição imunogênica.

10 As composições imunogênicas da presente invenção induzem uma resposta imune em um hospedeiro mamífero, incluindo seres humanos e outros animais. A resposta imune pode ser umresposta celular dependente ou uma resposta dependente de anticorpo ou ambos, e ainda a resposta pode fornecer memória imunológica, ou um efeito de reforço, ou ambos no hospedeiro mamífero. Estas composições imunogênicas são úteis como vacinas e podem fornecer uma resposta protetora pelo indivíduo mamífero ou hospedeiro à infecção por cepas de C. dzfficile.

20 A presente invenção inclui ainda métodos produzir uma composição imunogênica mediante a construção do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1 e expressaro componente polipeptídeo isolado C- TAB.GS ou C-TAB.G5.1 em um hospedeiro microbiano; recuperar o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 a partir de uma cultura do hospedeiro; conjpgar o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 com um segundo componente de proteína, e recuperar a proteína conjigada e componente polissacarídeo. O ácido nucleico que codifica o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser mantido durante todo o crescimento do hospedeiro por pressão seletiva constante e estável. A manutenção do vetor de expressão pode ser conferida através da incorporação no vetor de expressão de uma sequência genética que codifica para um genótipo seletivo, a expressão da qual na célula hospedeira microbiana resulta em fenótipo seletivo. Uma sequência de genótipo seletivo pode também incluir um gene complementando a mutação letal condicional. Outras sequências genéticas podem ser incorporadas no vetor de expressão, como outros genes de resistência à drogas ou genes que complementam as mutações letais. Hospedeiros microbianos podem incluir: bactérias Gram-positivas; bactérias Gram-negativas, como E. coil; leveduras;fungos filamentosos; células de mamífero, células de inseto, ou células de plantas.

Os métodos da presente invenção também fornecem um nível de expressão de polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 no hospedeiro em um nível superior a cerca de 50 mg/litro de cultura, um nível superior a cerca de 100 mg/litro, um nível superior a cerca de 500 mg/litro, ou um nível superior a cerca de 1 g/litro. Esta invenção também fornece que a proteína pode ser recuperada por qualquer número de métodos conhecidos pelos especialistas na técnica para o isolamento e recuperação das proteínas, como por precipitação com sulfato de amônio seguido por cromatografia de troca iônica.

A presente invenção inclui ainda métodos para a preparação da composição imunogênica que fornece que o componente proteico é conjugado com um segundo componente de proteína por um de uma série de meios conhecidos pelos especialistas na técnica, como uma reação de amidação.

A presente invenção também fornece formulações compreendendo o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 para tratar e prevenir CDAD. Em uma modalidade, a formulação pode incluir o Polipeptïdeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção, um adjuvante, e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a formulação inclui o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.1 da presente invenção, ou consiste essencialmente em um ou mais polipeptídeos isolados C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção. A formulação pode compreender o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção e um adjuvante. A formulação pode ainda incluir um antígeno ou umadroga adicional. Além disso, a formulação pode incluir uma ou mais drogas e pode, além do polipeptídeo isolado e/ou adjuvante, incluir uma ou mais drogas.

A formulação compreendendoum polipeptídeo isolado C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode estar na forma líquida ou seca.

Uma formulação seca pode ser facilmente armazenada e transportada. Formulações quebram a cadeia de frio necessária de local da de fabricação da vacina para o local onde ocorre a vacinação. Alternativamente, o ingrediente ativo seco da formulação por si só pode ser uma melhoria fornecendo uma forma de particulado sólido que é absorvido e processado por células apresentadoras de antígenos. Estes mecanismos possíveis são discutidos não para limitar o escopo da invenção ou os seus equivalentes, mas para fornecer uma visão sobre o funcionamento da invenção e para orientar o uso desta formulação de imunização e vacinação.

As formulações secas do polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 podem ser fornecidas em várias formas: por exemplo, pós finos ou granulados, pó liofilizado, filmes uniformes, pastilhas, e comprimidos. Podem ser secas ao ar, secas com uma temperatura elevada, liofilizadas ou freeze ou spray dried, revestidas ou pulverizadas sobre um substrato sólido e depois secas, polvilhadas sobre um substrato sólido, congeladas rapidamente e depois secas sob vácuo, lentamente, ou combinações dos mesmos. Se as moléculas diferentes são s0/198 ingredientes ativos da formulação, podem ser misturadas em solução e, em seguida, secas, ou misturadas na forma seca somente.

As formulações que compreendem o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 na forma líquida ou sólida, como uma forma seca, podem ser aplicadas com um ou mais adjuvantes com os mesmos ou diferentes sítios ou simultaneamente ou em aplicações frequentes e repetidas. A formulação pode incluir outros antígenos de modo que a administração da formulação induz uma resposta imunológica aos vários antígenos. Em dito caso, os outros antígenos podem ter diferentes estruturas químicas de modo a induzir uma resposta imunológica específica para antígenos diferentes. Pelo menos um antígeno e/ou adjuvante podem ser mantidos na forma seca antes da sua administração. Subsequente liberação de líquido a partir de um reservatório ou a entrada de líquido para dentro de um reservatório que contém o ingrediente seco da formulação irá dissolver pelo menos parcialmente esse ingrediente.

Os sólidos (por exemplo, partículas de dimensões nanométricas ou micrômetros) também podem ser incorporados na formulação. As formas sólidas (por exemplo, nanopartículas ou microparticulas) podem ajudar na dispersão ou solubilização dos ingredientes ativos; fornecer um ponto de ligação para o adjuvante, ou polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, ou ambos, para um substrato que pode ser opsonizado por células apresentadoras de antígeno, ou combinações dos mesmos. Liberação prolongada da formulação de um sólido poroso formado como uma folha, haste, ou grânulo atua como um depósito.

Pelo menos um ingrediente ou componente da formulação (ou seja, polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, adjuvante, ou droga) pode ser fornecido na forma seca antes da administração da formulação. Esta formulação pode também ser usada em conjunto com técnicas de imunização enteral convencional, mucosa, ou parenteral.

A formulação que compreende o polipeptídeo isolado C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser fabricado sob condições assépticas aceitáveis para as agências reguladoras apropriadas (por exemplo, Food and Drug Administration, EMEA para produtos biológicos e vacinas). Opcionalmente, componentes como dessecantes, excipientes, estabilizadores, umectantes, conservantes, ou combinações dos mesmos, podem ser incluídos na formulação, embora sejam imunologicamente inativas. Estes podem, no entanto, ter outras propriedades ou características desejáveis.

Os processos para afabricação de uma formulação farmacêutica são bem conhecidos. Os componentes da formulação podem ser combinados com um carreador farmaceuticamente aceitável ou um veiculo, bem como qualquer combinação de aditivos opcionais (por exemplo, diluentes, aglutinantes, excipientes, estabilizadores, dessecantes, agentes conservantes, corantes). A utilização de carreadores 5 sólidos, e a adição de excipientes para ajudar a solubilização dos componentes ou estabilizadores de atividadeimunogênica ou adjuvante secos, são modalidades preferenciais. Ver, em geral, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6aed. (Edição eletrônica de 2003); 10 Remington's Pharmaceutical Sciences, 22d (Gennaro, de 2005, Mack Publishing); Pharmaceutical Dosage Forms, 2aed. (vários editores,1989-1998, Marcel Dekker); e Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems (Ansel et al, 2005, Williams & Wilkins).

15 Boas práticas de fabricação são conhecidas na indústria farmacêutica e reguladas por agências governamentais (por exemplo, Food and Drug Administration, da EMEA). As formulações líquidas estéreis podem ser preparadas por dissolução de um componente pretendidoda formulação em uma 20 quantidade suficiente de um solvente apropriado, seguido de esterilização por filtração, para remover contaminantes de micróbios. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários componentes da formulação esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico. Para a produção de formas sólidas que tenham de ser estéreis, secagem sob vácuo ou liofilização podem ser usadas.

Em geral, as formas sólidas de dosagem (por exemplo, 5 pós, grânulos, pastilhas, comprimidos) , podem ser preparadas a partir de, pelo menos, um ingrediente ativo ou componente da formulação.

Processos de comprimidos apropriados são conhecidos. A formulação pode também ser produzida através do 10 encapsulamento de formas sólidas de pelo menos um ingrediente ativo, ou mantendo-os separados de líquidos nos compartimentos ou câmaras. O tamanho de cada dose e o intervalo de doseagem ao indivíduo podem ser utilizados para determinar um tamanho apropriado e forma do comprimido, 15 cápsula, compartimento ou câmara.

As formulações irão conter uma quantidade eficaz dos ingredientes ativos (por exemplo, drogas, antigeno e adjuvante) em conjunto com carreador ou quantidades apropriadas de veículos, a fim de fornecer composições 20 farmaceuticamente aceitáveis apropriadas para a administração a um ser humano ou animal.

As quantidades relativas de ingredientes ativos, como as quantidades de polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1, dentro de uma dose e o esquema de dosagem podem ser ajustados de forma apropriada para a administração eficaz a um paciente (por exemplo, animal ou humano). Este ajuste pode também depender da doença ou condição particular do indivíduo, e se o tratamento ou profilaxia é pretendido.

5 Para simplificar a administração da formulação ao indivíduo, cada dose unitária contém os ingredientes ativos em quantidades predeterminadas para uma única rodada de imunização.

Existem muitas causas de instabilidade ou de degradação 10 do polipeptídeo, incluindo hidrólise e desnaturação. No caso de desnaturação, a conformação ou a estrutura tridimensional da proteína é perturbada e a proteína se desenrola a partir da sua estrutura globular habitual. Ao invés de redobrar para a sua conformação natural, a interação hidrofôbica pode 15 causar aglomeração de moléculas (ou seja, agregação) ou redobragem para uma conformação não natural. Qualquer destes resultados pode implicar a diminuição ou perda de atividadeimunogênica ou adjuvante. Estabilizadores poderão ser adicionados para reduzir ou impedir esses problemas.

20 A formulação, ou qualquer intermediário na sua produção, podem ser pré-tratados com agentes protetores (ou seja, crioprotetores e estabilizantes secos) e depois submetidos a taxas de resfriamento e as temperaturas finais que minimizam a formação de cristais de gelo. Através de uma seleção apropriada dos agentes crioprotetores e utilização de parâmetros de secagem pré-selecionados, quase qualquer formulação pode ser criopreparada para uma utilização final pretendida apropriada.

5 Deve entender-se na discussão que se segue de aditivos opcionais como excipientes, estabilizadores, dessecadores, e conservantes, são descritos pela sua função. Assim, um produto químico particular pode atuar como uma combinação de receptor, estabilizador, dessecante, e/ou conservante. Dito 10 produto químico seria imunologicamente inativo porque não induz diretamente uma resposta imunológica, mas aumenta a resposta, aumentando a atividade imunológica do antígeno ou adjuvante: por exemplo, através da redução de modificação do antígeno ou adjuvante, ou desnaturação durante a secagem e 15 ciclos de dissolução.

Estabilizadores incluir ciclodextrina e variantes dos mesmos (ver Patente US5.730.959). Os conservantes apropriados, como sacarose, manitol, sorbitol, trealose, dextrano, e glicerina, também podem ser adicionados para 20 estabilizar a formulação final (Howell e Miller, 1983). Um estabilizador selecionado a partir de surfactantes não iônicos, D-glicose, D-galactose, D-xilose, ácido D- glucurônico, sais de ácido D-glucorônico, trealose, dextrano, amidos hidroxietil, e misturas dos mesmos, podem ser adicionados à formulação.A adição de um sal de metal alcalino ou cloreto de magnésio pode estabilizar o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, opcionalmente incluindo albumina do soro e liofilização para melhorar ainda mais a estabilidade. O polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.1 também pode ser estabilizado por contato com um sacarídeo selecionadodo grupo que consiste em dextrano, ácido sulfúrico condroitina, amido, glicogênio, insulina, dextrina, e sal de ácido algínico. Outros açúcares que podem ser adicionados incluem monossacarídeos, dissacarídeos, alcoóis de açúcar, e misturas dos mesmos (por exemplo, glicose, manose, galactose, frutose, sacarose, maltose, lactose, manitol, xilitol). Polióis podem estabilizar um polipeptídeo, e são miscíveis em água ou solúveis em água.

Os poliáis apropriados podem ser polihidroxi alcoóis, monossacarídeos e dissacarídeos, incluindo manitol, glicerol, etileno glicol, propileno glicol, trimetilglicol, vinilpirrolidona, glicose, frutose, arabinose, manose, maltose, sacarose, e polímeros dos mesmos. Vários excipientes podem também estabilizar polipeptídeos, incluindo a albumina do soro, aminoácidos, heparina, ácidos graxos e fosfolipídeos, surfactantes, metais, polióis, agentes redutores, agentes quelantes de metais, polivinilpirrolidona, gelatina hidrolisada, e sulfato de amônio.

Como um exemplo, a formulação de polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser estabilizada em sacarose, trealose, poli(ácido láctico) (PLA) e poli(lactida-co- 5 glicolida) (PLGA) em microesferas por escolha apropriada do excipiente ou estabilizador (Sanchez et al., 1999).Sacarose ou trealose pode ser vantajosamente utilizadas como um aditivo, porque é um sacarídeo não redutor, e portanto não provoca reações de aminocarbonil com substâncias portadoras 10 de grupos amino como as proteínas. Sacarose ou trealose podem ser combinadas com outros estabilizadores, como sacarídeos.

Além disso, a formulação compreendendoo polipeptideo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode incluir agentes terapêuticos, como por exemplo, anestésicos, analgésicos, 15 anti-inflamatórios, esteroides, antibióticos, antiartríticos, anorexígenos, anti-histamínicos e anti- neoplásicos. Exemplos de ditos agentes terapêuticos incluem a lidocaina e drogas anti-inflamatórias não esteroidais (AINEs). Em outra modalidade, os agentes terapêuticos são 20 antígenos e adjuvantes. Ainda em outra modalidade, a formulação compreendendo o antígeno e/ou adjuvante pode ser aplicada separadamente, mas junto com outros agentes terapêuticos, como, por exemplo, anestésicos, analgésicos, anti-inflamatórios, esteroides, antibióticos,

antiartríticos, anorexígenos, anti-histamínicos e anti- neoplásicos. Em uma modalidadepreferencial, os antibióticos são fidaxomicina, metronidazol ou vancomicina.

A formulação compreendendoo polipeptídeo isolado C- TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode ser liberada através de várias vias de administração, como por exemplo, por via intramuscular.

Os polímeros podem ser adicionados à formulação e podem atuar como um excipiente, estabilizador, e/ou conservante de um ingrediente ativo, bem como a redução da concentração do ingrediente ativo que satura uma solução usada para dissolver a forma seca do ingrediente ativo. Esta redução ocorre porque o polímero diminui o volume efetivo da solução através do enchimento do espaço "vazio". Assim, as quantidades de antígeno/adjuvante podem ser conservadas sem reduzir a quantidade de solução saturada. Uma consideração termodinâmica importante é que um ingrediente ativo na solução saturada vai ser "direcionado" em regiões de baixa concentração. Em solução, os polímeros também podem estabilizar e/ou conservar a atividade deantígeno/adjuvante dos ingredientes solubilizados da formulação. Ditos polímeros incluem etileno ou propileno glicol, vinilpirrolidona e polímeros de 0-ciclodextrina e copolímeros.

Uma dose única ou unitária da formulação que compreende o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 apropriado para administração é fornecida. A quantidade de adjuvante e/ou polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 na dose unitária pode ser em qualquer parte de uma ampla faixa a partir de cerca de 0,001 pg a cerca de 10 mg. Esta faixa pode ser de cerca de 0,lug a cerca de 1 mg; uma faixa mais estreita de cerca de 5 pg a cerca de 500 pg. Outras faixas apropriadas são entre cerca de20 pg a cerca de 200 pg, como por exemplo, cerca de20 jig, a cerca de 75 mg ou cerca de 200 pg.Uma dose preferencial de um polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 é de cerca de20 pg ou 200 pg ou menos. A relação entre polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 e adjuvante pode ser de cerca de 1:1 ou cerca de 1:1,25, mas percentuais mais elevados podem também ser utilizados (por exemplo, cerca de 1:10 ou menos) , ou relações mais baixas de polipeptídeo isolado C -TAB e adjuvante podem também ser utilizadas (por exemplo, cerca de 10:1 ou mais).

O polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode ser usado como um antígeno e pode ser apresentado às células imunes, e uma resposta imunológica específica para o antígeno é induzida. Isto pode ocorrer antes, durante, ou depois da infecção por um agente patogênico, como o C. difficile.

Apenas polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode ser necessário, mas sem adjuvante adicional, quando a imunogenicidade da formulação é suficiente para não exigir a atividade adjuvante. A formulação pode incluir um antígeno adicional de tal modo que a aplicação da formulação induz uma resposta imunológica contra antígenos múltiplos (ou seja, multivalentes). Os linfócitos específicos para o antígeno podem participar na resposta imune e, no caso de participação por linfácitos B, de anticorpos específicos para o antígeno podem ser parte de uma resposta imune. As formulações descritas acima podem incluir dessecadores, excipientes, umectantes, estabilizadores, e conservantes conhecidos na técnica.

A formulação compreende o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB. G5 . 1 da presente invenção pode ser usada para tratar um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou animal em necessidade de tratamento, como a prevenção da doença, proteção contra os efeitos da infecção, reduzir ou aliviar os sintomas de uma doença, comoCDAD, ou combinações dos mesmos). Por exemplo, a formulaçãocompreendendo o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 da presente invenção pode ser utilizado para tratar um indivíduo em risco de CDAD, como por exemplo, um indivíduo com o seguinte perfil: i) um indivíduo com um sistema imunológico mais fraco, como por exemplo, um indivíduo idoso (por exemplo, um indivíduo de 65 anos de idade) ou um indivíduo abaixo de 2 anos de idade; ii) um indivíduo imunocomprometidos, como por " exemplo, um indivíduo com AIDS; iii) um indivíduo tomando ou pretendendo tomar drogas imunossupressoras; iv) um indivíduo 5 com hospitalização planejada ou um indivíduo que está no hospital, v) um indivíduo em ou esperando para ir para uma unidade de terapia intensiva (ICU), vi) um indivíduo que está passando ou está planejando fazer uma cirurgia gastrointestinal vii) um indivíduo que está dentro ou 10 planejando ir para a cuidados de longa duração, como uma casa de enfermagem; viii) um indivíduo com co-morbidades que requerem o uso de antibióticos frequente e/ou prolongado; ix) um indivíduo que é um indivíduo com dois ou mais dos perfis acima mencionados, como por exemplo, um indivíduo 15 idoso que está planejando fazer uma cirurgia gastrointestinal; x) um indivíduo com doença inflamatória do intestino e/ou xi) um indivíduo com CDAD recorrente, como por exemplo, um indivíduo que tenha sofrido um ou mais episódios de CDAD.

20 0 tratamento pode vacinar o indivíduo contra a infecção pelo agente patogênico ou contra os seus efeitos patogênicos, como as causadas por secreção da toxina. A formulação pode ser usada terapeuticamente para tratar a doença já existente, protetivamente para prevenir a doença, reduzir a gravidade e/ou duração da doença, para melhorar os sintomas da doença, ou combinações dos mesmos.

As formulações compreendendo polipeptídeos isolados C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser liberada por diversas vias de administração, incluindo, entre outras, as vias oral, subcutânea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardiaca, intraespinhal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, e/ou sublinguais.

A formulação pode também compreender um ou mais adjuvantes ou combinações de adjuvantes. Normalmente, o adjuvante e a formulação são misturados antes da apresentação do antígeno, mas, em alternativa, podem ser apresentados separadamente dentro de um curto intervalo de tempo.

Os adjuvantes incluem, por exemplo, uma emulsão de óleo (por exemplo, adjuvante de Freund completo ou incompleto), adjuvante Seppic incompleto Montanide como ISA, adjuvantes de emulsão de óleo em água, como o sistema de adjuvante Ribi, formulação sintaxe adjuvante contendo dipeptídeo de muramil, hidróxido de alumínio ou sal adjuvante (ALUM), polímero policatiônico, especialmente peptideo policatiônico, especialmente poliarginina, ou um peptídeo contendo pelo menos dois motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, imunoestimulante oligodesoxinucleotídeo (ODN) contendo dinucleotideos de citosina-guanina não metilados (CpG) em um contexto de base definida (por exemplo, como descrito em WO

96/02555) ou ODNs baseados em inosina e citidina (por exemplo, como descrito em WO 01/93903), ou ácido deoxinucleico contendo resíduos desoxi-inosina e/ou desoxiuridina (como descrito em WO 01/93905 e WO 02/095027),

especialmente Oligo(dldC)i3(como descrito em WO 01/93903 e

WO 01/93905), composto neuroativo, especialmente hormônio de crescimentohumano (descrito em WO 01/24822), ou combinações dos mesmos, uma quimiocina (por exemplo, defensinas 1 ou 2,

RANTES, MIP1-a, MIP-2, interleucina-8, ou uma citocina (por exemplo, interleucina-l1, -2, -6, -10, ou -12; interferon-

y; fator a de necrose tumoral; ou fator estimulante de colônia granulácitos-monôcitos) (revisto em Nohria e Rubin,

1994), uma variante de dipeptídeo de muramil (por exemplo,

murabutida, treonil-MDP ou tripeptídeo de muramil),

variantes sintéticos do MDP, uma proteína de choque térmico uma variantede Leishmania major LeIF (Skeiky et a1., 1995),

variantes não tóxicos de exotoxinas bacterianas ADP-

ribosilantes (bAREs), incluindo as variantes no local de clivagem da tripsina (Dickenson e Clements, 1995) e/ou afetando a ADP-ribosilação (Douce et al., 1997), ou bAREs quimicamente desintoxicados (toxoides), QS21, Quill A, N-

acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina- 2- [1,2-

dipalmitoil-s-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida

(MTP-PE) e as composições que contêm um óleo metabolizável e um agente emulsionante, em que o agente emulsionante e o óleo estão presentes sob a forma de uma emulsão de óleo-em- água tendo goticulas de óleo substancialmente todos os quais 5 sejam menos do que um mícron de diâmetro (ver, por exemplo, EP 0399843). Além disso, veja Richards et al. (1995) para outros adjuvantes úteis na imunização.

Um adjuvante pode ser escolhido para induzir preferencialmente anticorpos ou efetores celulares, isotipos 10 de anticorpos específicos (por exemplo, IgM, IgD, IgAI, IgA2, IgA secretora, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4), ou subconjuntos de célula T específica (por exemplo, CTL, Th1, Th2 e/ou TDTH) (ver, por exemplo, Munoz et al, 1990;. Glenn et al, 1995).

15 Dinucleotídeos de CpG não metilados ou motivos são conhecidos para ativar as células B e macrófagos (Stacey et al., 1996). Outras formas de DNA podem ser utilizadas como adjuvantes. DNAs bacterianos encontram-se entre uma classe de estruturas que têm padrões que permitem o sistema 20 imunológico para reconhecer as suas origens patogênicas para estimular a resposta imune inata levando às respostas imunes adaptativas (Medzhitov e Janeway, 1997, Curr Opin Immunol 9 (1):4-9). Essas estruturas são chamadas de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e incluemlipopolissacarídeos, ácidos teicóicos, motivos CpG não metilados, RNA de fita dupla e maninas. PAMPs induzem sinais endógenos que podem mediar a resposta inflamatória, atuam como co-estimuladores da função das células T e controlam a função efetora. A capacidade de PAMPs em induzir essas respostas desempenha um papel no seu potencial como adjuvantes e os seus alvos são APCs, como macrófagos e células dendríticas. PAMPs também poderiam ser usados em conjunto com outros adjuvantes para induzir moléculas co- l0 estimuladoras diferentes e controlar diferentes funções efetoras para orientar a resposta imune, por exemplo, a partir de uma resposta Th2 a Thl.

Outros aspectos da invenção são direcionados para o uso do polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 como agente de vacinação. As vacinas ou composições imunogênicas da presente invenção podem empregar uma quantidade eficaz de antígeno. Será incluída uma quantidade de antígeno que fará com que o indivíduo produza uma resposta imunológica especifica e suficientede modo a conferir proteção ao indivíduo à exposição subsequente a C. difficile. O antígeno pode ser o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Em uma modalidade, o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1 é administrado isolado ou em combinação com um adjuvante.

Outro aspecto da invenção inclui o uso do polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 como uma vacina de subunidade.

Uma vacina de subunidade refere-se à utilização de um fragmento de um agente patogénico como um agente de 5 inoculação. Os especialistas na técnica saberão quais vacinas de subunidades oferecer para gerar anticorpos para uma parte ou região específica de um agente patogênico.

O cronograma de dosagem de administração e a eficácia da vacina podem ser determinados por métodos conhecidos na técnica. A quantidade da vacina e o regime de imunização podem depender do antígeno particular e o adjuvante utilizado, o modo e frequência da administração, e o efeito desejado (por exemplo, proteção e/ou de tratamento). Em geral, a vacina da invenção pode ser administrada em quantidades que variam entre 1ppg e 100 mg, como por exemplo, entre 60 pg e 600 pg. Uma dose única da vacina compreendendo o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode estar em uma faixa de cerca de 1 pg a cerca de 1 mg, preferencialmente entre cerca de 5 pg e cerca de 500 pg, mais preferencialmente de cerca de20pg a cerca de 200 pg. A relação entre polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 e adjuvante, comoalum pode ser de cerca de 1:1, como por exemplo, 1:1,25, mas podem também ser usadas relações mais elevadas (por exemplo, cerca de 1:10 ou menos), ou relações mais baixas também podem ser utilizadas (por exemplo, cerca de 10:1 ou mais). Em uma modalidade, em que a vacina que compreende o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 o adjuvante hidróxido de alumínio será utilizado em uma faixa de cerca de 50 lig/mL a cerca de 200 pg/mL, preferencialmente na quantidade de cerca de 125pg/mL da formulação final.

A vacina compreendendo o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 pode ser administrada por via oral, intravenosa, subcutânea, intra-arterial, intramuscular,intracardíaca, intraespinhal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, e/ou sublingual.

O regime de imunização pode ser determinado pelos métodos conhecidos na técnica.A administração da vacina pode ser repetida como é determinado sendo necessário, por um especialista na técnica. Por exemplo, uma dose de iniciação pode ser seguida por 1, 2, 3 ou mais doses de reforço, em intervalos quinzenais ou mensais. Em uma modalidade da presente invenção, a dose de iniciação é seguida por uma ou duas administrações de reforço em intervalos de cerca de 7 a cerca de 14 dias, como por exemplo, depois de 7 dias e 21 dias após a primeira iniciação. Em uma modalidade preferencial, a quantidade terapeuticamente efetiva da vacina é administrada duas ou três vezes, em intervalos de 14 dias +/- 1, 2 ou 3 dias (quinzenais) a um indivíduo. Em uma modalidade da presente invenção, a quantidade terapeuticamente efetiva da vacina é administrada uma vez.

Ainda outro aspecto refere-se à população que pode ser tratada de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, a população inclui indivíduos saudáveis que estão em risco de exposição a C. difficile, principalmente, os indivíduos iminentes de hospitalização ou residência em um centro de cuidados, bem como equipes em hospitais, asilos e outras instalações de cuidados. Em outra modalidade, a população inclui pacientes previamente infectados que recidivaram apósdescontinuação do tratamento com antibióticos, ou pacientes para os quais o tratamento com antibióticos não é eficiente.

Em mais uma modalidade da invenção, a população inclui os indivíduos que são pelo menos 18 anos ou mais de idade.

Em uma modalidadepreferencial, o indivíduo humano é entre 18 e 65 anos de idade. Em outra modalidadepreferencial, o indivíduo é humano idoso com mais de 65 anos de idade. A faixa etária deste último a população mais vulnerável que sofre de infecções por C. difficile. Em mais uma modalidade, o indivíduo humano tem menos de 18 anos de idade.

Métodos de utilização do polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 A presente invenção também fornece métodos de uso do polipeptídeo isolado. Por exemplo, o polipeptídeo isolado C- TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 pode ser utilizado para prevenir ou tratar doenças associadas com C. difficile. A título de exemplo, a introdução dos polipeptídeos isolados da presente 5 invenção para o sistema imunológico de um indivíduo pode induzir uma resposta imune que inclui o indivíduo que produz anticorpos direcionados contra o polipeptídeo isolado. Ditos anticorpos são úteis para o reconhecimento de C. difficile.

A presente invenção fornece métodos para a liberação de 10 polipeptídeos isolados de um indivíduo, que compreende administrar o polipeptídeo isolado a um indivíduo. O polipeptídeo isolado pode ser administrado como um líquido ou como um sólido. O polipeptídeo isolado pode ainda incluir umcarreador farmaceuticamente aceitável.

15 A presente invenção também fornece métodos para identificar e isolar os domínios variáveis de um anticorpo que reconhecem e se ligam a toxina A e toxina B ou compreendendo o uso do polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.1 para produzir uma resposta imunológica, purificar 20 e então caracterizar os anticorpos produzidos em resposta ao polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1. Epítopos identificados podem ser úteis para a clonagem de outros anticorpos ou fragmentos dos mesmos.

Um aspecto da presente invenção é direcionado, em parte,

para o tratamento, prevenção, e detecção de C. difficile. Em algumas modalidades, um indivíduo, como um animal, recebe o tratamento e/ou prevenção e/ou detecção de C. difficile. Em outras modalidades, o animal é um ser humano. Por exemplo, os polipeptídeos da presente invenção podem ser utilizados para produzir anticorpos para C. dífficilein vivo. A título de exemplo adicional, os polipeptídeos da presente invenção podem ser utilizados para determinar se um indivíduo que produz anticorpos para C. difficile. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é utilizado para isolar anticorpos. A título de exemplo, os polipeptídeos podem ser ligados a uma matriz de afinidade.

A título de exemplo, o ácido nucleico da presente invenção pode ser usado para transformar e/ou transfectar células para produzir de forma recombinante os polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção. Os ácidos nucleicos da presente invenção também podem ser usados, por exemplo, para determinar se um indivíduo está infectado com C. difficile.

A título de exemplo, isto pode ser conseguido utilizando métodos de hibridização marcada radioctivamente.

A título de exemplo adicional, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para reconhecer uma infecção por C. difficile. A título de exemplo, os anticorpos podem reconhecer toxina A e/ou toxina B nativascomo um antígeno.

Os anticorpos da presente invenção também poden ser utilizados para combater uma infecção por C. difficile. A título de exemplo, anticorpos humanizados ou fragmentos de anticorpos ou anticorpos monoclonais podem empregar resposta 5 imunológica própria de um indivíduo a uma infecção por C.

difficile. A titulo de exemplo adicional, os anticorpos da presente invenção podem ser acoplados a uma citocina ou uma toxina ou uma enzima ou um marcador para auxiliar no tratamento e detecção de uma infecção.

10 Outros aspectos da presente invenção referem-se aos ensaios de diagnóstico. A presente invenção é de utilização com muitos ensaios conhecidos na técnica. os especialistas na técnica reconhecerão a grande variedade de usos baseados em pesquisa para os polipeptídeos, ácidos nucleicos e 15 anticorpos da presente invenção. Os polipeptídeos, anticorpos e ácidos nucleicos da presente invenção podem, por exemplo, ser marcados, como com um radioativo, quimioluminescentes, fluorescentes e/ou moléculas de corantes. Os anticorpos, ácidos nucleicos e polipeptídeos da 20 presente invenção prestam-se aos ensaios, por exemplo, ensaios de DNA (como Southern blotting), ensaios de RNA (como Northern blotting), ensaios de proteína (como Western blotting), ensaios cromatográficos (como gás, líquido, HPLC, exclusão de tamanho) , imunoensaios (como ELISA) e ensaios estruturais (como cristalografia e espectroscopia de RMN).

Os anticorpos, polipeptídeos e ácidos nucleicos da presente invenção podem ainda ser utilizados como sondas. Os ensaios ' que amplificam os sinais a partir de uma sonda são também 5 conhecidos dos especialistas na técnica.

Kits A presente invenção fornece kits compreendendo a título de exemplo, e não como limitação, os ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, 10 e/ou o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1, e/ou anticorpos contra o polipeptídeo isolado C-TAB.GS ou C- TAB.G5.1. Os kits podem incluir um ou mais recipientes e as instruções para o uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos. O polipeptídeo isolado C-TAB.GS 15 ou C-TAB.G5.1 e/ou anticorpos da invenção podem ser usados em uma variedade de ensaios incluindo imunoensaios para a detecção de C. difficile. Em uma modalidade, o polipeptídeo isolado C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 serve para funcionar como um antigeno para efeitos de detecção de anticorpos em amostras 20 biológicas. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multi-dose) ou doses subunitárias. Os kits da presente invenção são em embalagem apropriada. Também estão contemplados os pacotes para o uso em combinação com um aparelho específico, como um inalador, dispositivo de administração por via nasal ou um dispositivo de infusão. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril. O recipiente pode também ter uma porta de acesso estéril. Os kits podem fornecer opcionalmente componentes 5 adicionais como tampões e informação interpretativa.

Os kits podem ser utilizados para detectar a presença de C. difficile, ou para detectar uma doença associada a C.

difficile, como CDAD. Os kits podem ser utilizados para prevenir ou tratar doenças associadas com o C. difficile. Os kits da presente invenção também podem ser utilizados para aliviar os sintomas de uma doença associada a C. difficile.

Sem mais descrição, acredita-se que um especialista na técnica pode, utilizando a descrição precedente e os exemplos ilustrativos seguintes, preparar e utilizar a invenção reivindicada. Os seguintes exemplos de trabalho, portanto, apontam especificamente modalidadespreferenciais da presente invenção, e não devem ser interpretados como limitando de qualquer forma o restante da divulgação. Todos os artigos, publicações, patentes e documentos referidos ao longo deste pedido são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

EXEMPLOS Exemplo 1: Preparação de polipeptideosisolados C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 .

Este exemplo descreve a preparação de polipeptídeos isolados compreendendo porções do toxina A (CTA) e B (CTB) de C. difficile para expressão de células E. coli. O método descrito abaixo pode ser utilizado para a preparação de 5 diversos polipeptídeos isolados compreendendo CTA e CTB.

Como exemplo, um polipeptídeo isolado compreendendo uma porção do domínio C-terminal de CTA e uma porção do domínio C-terminal da CTB é descrito.

Exemplo 1.1: Clonagem dos construtos de gene C-TAB.GS 10 e C-TAB.G5.1.

A porção do gene CTA (No. de Acessão YP-001087137) que codifica os aminoácidos 2026 a 2710 do domínio C-terminal foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de C.

difficilecepa630 (ATCC BAA-1382) usando os seguintes 15 iniciadores: direto: 5'-caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc -3' (SEQ ID NO: 9) e reverso: 5'-CTCGAGttagccatatatcccaggggc -3'(SEQ ID NO:10) .

20 A amplificação com o iniciador direto criou um local SpeI, e a amplificação com o iniciador inverso criou um sítio Xhol.

A porção do gene de CTB (No. de Acessão: YP-00108735) que codifica os aminoácidos 1850 a 2366 do domínio C-terminal foi amplificada por PCR usando os seguintes iniciadores: direto: 5'-caccATGCATatgagtttagttaatag 3' (SEQ ID NO:11) e reverso: 5'-ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc -3' (SEQ 5 ID NO:12).

A amplificação com o iniciador direto criou um sitio Nsil, e a amplificação com o iniciador inverso criou um sítio Xhol. As reações de PCR foram realizadas utilizando PCR Super- Mix (Invitrogen) . As condições do ciclo foram de 95°C durante 2 minutos, 95°C durante 45 segundos, 55°C durante 50 segundos, 68°C durante 8 minutos (30 ciclos), e 72°C durante 10 minutos.Os produtos de PCR foram purificados com o kit de extração do gene rápido (Invitrogen) e foi ligado no vetor PCR 2.1 TOPO (Invitrogen). As misturas de ligação foram usadas para transformar células E. coli Mech-1 células por choque térmico. Os transformantes foram semeados em ImMedia Amp Blue (Invitrogen). As colônias brancas foram repicadas e cultivadas em tubos de 15 mL com 4 ml de meio LB contendo 100 pg/ml de ampicilina. As culturas foram incubadas durante a noite a 37°C e os plasmideos foram extraídos com o kit de plasmídeo miniprep rápida (Invitrogen).

O fragmento do gene de CTA no vetor PCR 2.1 -TOPO/TA foi digerido com Spei eXhol, e o fragmento foi clonado em um

10&/198 vetor intermediário, também digerido com SpeI e Xhol, usando T4 DNA lipase. Um ligante contendo três sítios de restrição (BgLII-NsiI-Saci) foi então inserido na extremidade 3' do fragmento do gene de CTA por PCR utilizando o seguinte 5 conjunto de iniciadores de síntese: direto: 5'- AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacgaaaggctcagc-3' (SEQ ID NO: 13) reverso: 5'-cggtccggggccatatatcccaggggcttttactcc-3' 10 (SEQ ID NO:14).

O fragmento do gene de CTB em PCR 2.1-TOPO/TB foi digerido com NsiI e XhoI, e o fragmento do gene de CTB digerido foi ligado ao vetor intermediário contendo o gene CTA e ligante, que também foi digerido com Nsil e Xhol. O 15 gene CTB foi inseridoem 3' do ligante que confere a sequência de construção de 5'-CTA-ligante-CTB-3'. Esta construção de fusão é referida como vetor intermediário C-TAB.Vl.

O gene C-TAB.G5 foi amplificado por PCR a partir de vetor intermediário C-TAB.V1, utilizando os iniciadores: 20 direto: 5'-caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagga (SEQ ID NO: 15) reverso: 5'- CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg (SEQ ID NO:16).

As reações de PCR foram realizadas utilizando PCR Super

Mix (Invitrogen). A condição do ciclo foi de 95°C durante 2 minutos, 95°C durante 45 segundos, 55°C durante 50 segundos, 68°C durante 4 minutos (30 ciclos) e 72°C durante 10 minutos.

Os produtos de PCR foram purificados com o kit de extração 5 do gene rápida (Invitrogen) e foi ligado no vetorPCR2.1-TOPO (Invitrogen). As misturas de ligação foram usadas para transformar células de E. coli Mech-1 por choque térmico. Os transformantes foram semeados em placas de ImMedia Amp Blue (Invitrogen). As colônias brancas foram repicadas e cultivadas em tubos de 15 mL com 4 ml de meio LB contendo 100 ig/ml de ampicilina. As culturas foram incubadas durante a noite a 37°C e os plasmídeos foram extraídos com kit mini- prep de plasmídeo Quick (Invitrogen). O gene de fusão C- TAB.GS no vetor PCR 2.1-TOPOTA foi digerido com enzimas de restrição Ncoí e Xhoí. Estes fragmentos C-TAB foram ligados no vetor de expressão pET28 digerido com as mesmas enzimas de restrição. Esta construção resultante codifica o domínio C-terminal da toxina A a partir de aminoácidos 2272 a 2710 fundido ao domínio C-terminal de toxina B de aminoácidos 1851 a 2366. A construção pET28/C-TAB.G5 foi transformada em E. coli BL21 (DE3) para expressão. Cinco colônias contendo o gene de fusão C-TAB.GS foram selecionadas para análise.

A sequência de codificação C-TAB.G5.1 foi obtida por otimização de côdons para expressão melhorada dentro de células hospedeiras de E. coil. A utilização de códons foi adaptada para o enviesamento de códons de genes de E. coai.

Além disso, o teor de GC foi ajustado para prolongar a meia- vida do mRNA; uma região de conteúdo em GC muito elevada (> 5 80%) ou muito baixo (<30%) foi evitada. Portanto, o gene otimizado permite taxas de expressão elevadas e estáveis em E. coil. O gene C-TAB. G5 . 1 otimizadopor códon foi sintetizado in situ e subclonado no vetor de expressão pET-28b (+).

Sequenciamento de DNA: sequências de DNA de plasmideo 10 foram confirmadas usando química de sequenciamento em ciclo terminador corante com corantes d-Rodamina. Dados de sequenciamento foram analisados usando o software Medusa.

Exemplo 1.2: Expressão de proteínas de fusão C-TAB.G5 ou de C-TAB.G5.recombinantesem E. coli.

15 A expressão de construções de gene C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 pode ser realizada utilizando um procedimento padrão para a expressão em E. coli.

Triagem de colônias para a expressão da proteína de fusão C -TAB recombinante: Para fins de triagem, as colônias 20 foram repicadas e cultivadas em tubos Falcon de 15 mL de 4 ml de meio LB com 50 p/ml de canamicina. Os tubos foram cultivados durante a noite a 37°C com agitação a 250 rpm.

Após a fase de crescimento inicial, 1 ml de cultura de cada tubo foi transferido para uma placa de cultura de tecidos de

24 poços e a expressão foi induzida com 1 mM de isopropil- ~3D-1--tiogalacto-puranoside (IPTG), durante 3 horas a 30°C.

Os pellets celulares foram coletados por centrifpgação a

12.000 g, durante 1 min em microcentrífpga. Lisados de pellet de células foram preparados, e a fração solúvel foi analisada por SDS-PAGE e análise de Western Blot para expressão de proteína de fusão C-TAB.Os clones positivos foram selecionados para uma avaliação mais aprofundada.

Fermentação em lote para expressão de C-TAB.GS:culturas de sementes foram cultivadas em cinco balões de agitação de 500 ml contendo cada um 150 ml de meio Super Broth suplementado com 30 p g/ml canamicina. As culturas foram cultivadas durante 12 h a 28°C com agitação continua a 275 rpm, até 0D600 atingir 2-2,5. Os frascos de agitação foram usados para inocular um fermentador contendo 10 L de Super Broth. A cultura foi cultivada aproximadamente 4,5 h a 37°Cpara 0D600 = 3,5-4. Paraindução de expressão do produto IPTG 0,1 mM foi adicionado e o crescimento continuou durante mais 4 h a 25°C. Em seguida, as células foram coletadas por centrifpgação e a pasta celular armazenada congelada a - 70°C. Uma taxa de expressão específica de típica obtida por este processo de fermentação foi de cerca de 200 mg/ml.

Fermentação em lote de batelada para preparação C- TAB.G5.1: Uma alíquota de 500 plde estoque de glicerol de um banco de sementes (armazenada a -75°C) foi usada para inocular 100 ml de meio de pré-cultura suplementado com 30 jig/mL de canamicina em um balão de agitação de 1 L.

A pré-

cultura foi incubada a 37°C, sob agitação constante a -150 rpm durante cerca de 7 h até atingir OD600 = 1,0 -2,0. 25 mL de pré-cultura foi usada para inocular 7 Lde meio de fermentação em lote em um fermentador de 15 L de padrão da indústria equipado com sistema de controlo de processo, capaz de realizar fermentações alimentadas por lotes.

Fase de cultura em lote de 7 L foi realizada durante 12h a 37°C (OD6 00

= 12-15) até que a glicose estavisse esgotada.

Fase de alimentação de glicose (biomassa de produção) foi então iniciada por um modo de alimentação exponencial a uma taxa de crescimento constante p = 0,25/h especifico a 37°C durante

6 h (OD600 = 40-50). Uma hora antes de passar para uma fase de alimentação constante e indução com uma concentração final de 1 mM de IPTG (produção de produto), a temperatura foi reduzida para 30°C para reduzir o risco de formação de corpos de inclusão.

A fase de expressão de produto foi continuada durante mais 5 h, com alimentação constante a 30°C (OD600 =

-100), resultando em um tempo de processo de fermentação total de 23 horas e um volume de cultura final -8,2 L.

A biomassa celular úmida de cerca de 1,2 kg, foi coletada por centrifpgação e armazenada a <-70°C.

Uma taxa de expressão específica do produto típica alcançada por dita fermentação em batelada alimentada foi de até 1,3 g/L.

- Exemplo 1.3: Purificação de proteínas de fusão C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 recombinante.

5 Purificação de amostra analítica C-TAB.GS:pasta de células congelada foi descongelada e ressuspensa em tampão de NaOH/ ácido cítrico 10 mM a pH 5,6, e a suspensão de células foi passada duas vezes através de um homogeneizador (GEA Niro Soavi homogeneizador) a 550 bar. A suspensão foi 10 centrifugada duas vezes: uma vez a 13500 rpm durante 30 minutos e a segunda vez em 18000 rpm em uma ultracentrífpga durante uma hora. Os sobrenadantes foram reunidas, e o pH ajustado para 5,6 com tampão de ácido cítrico 50 mM, pH 3.

Os usados celulares clarificados foram passados por uma 15 coluna de fluxo rápido SP com tampão 10 mM de ácido cítrico/NaOH a pH 5,6. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de cloreto de sódio crescente de 0 a 500 mM em20mM de NaPi. As frações contendo o C-TAB.GS foram agrupadas. A condutividade foi ajustada até 5 mS/cm com H2 O 20 destilada. Tris foi adicionado a uma concentração final de 25 mM. As frações agrupadas foram passadas por uma coluna de fluxo rápido DEAE. A proteína foi eluída com um gradiente linear de cloreto de sódio crescente de 50 a 500 mM em Tris 25 mM. Novamente, as frações contendo C-TAB.G5 foram agrupadas e 1,5 M de Na-citrato, pH 7,5 foi adicionado a uma concentração final de 0,4 M. O grupo de C-TAB.Vl foi carregado em uma coluna Sepharose HP fenolequilibrada com Tris 25 mM, 0,4 M de Na-citrato, pH 7,5. Proteína de fusão 5 C-TAB.GS foi eluída com uma concentração de sal redutor em um gradiente linear utilizando 5 mM de Tris, pH 7,5. Todas as colunas foram monitoradas por um sistema de cromatograf ia AKTA Prime. Proteína de fusão C-TAB purificada foi trocada de tampão para PBS utilizando uma membrana de 50 K.

10 Purificação de preparação de bulk de C-TAB.G5.1: A biomassa foi armazenada a -80°C até processamento. 450 g de pasta de células congelada (equivalente a fermentador de 2,90 L) é diluído com 4 volumes de tampão de lise (20mM de Hepes, pH 7, 5, -0,6 mS/cm) (por exemplo, 450 g de pasta + 15 1,800 mL de tampão) e descongeladas desta forma para -1 h ± 0,5 horas, sob agitação mecânica. Opcionais, aglomerados restantes podem ser ressuspensas utilizando um Ultraturrax (por exemplo, 5 min a 8000 rpm). A lise celular é efetuada em uma Niro Soavi Panda homogeneizador alto (640 ± 25 bar, 20 3 ciclos). O lisado é resfriado a X10°C utilizando um trocador de calor e mantida esta temperatura até acentrifpgação. O lisado celular bruto é submetido a umaetapa de centrifpgação em lotes (Beckmann Avanti JLA 60.25) operado a 14000 rpm (30000 g) a 4°C durante 30 min. Os sobrenadantes são coletados e agrupados. A parte semi-liquido do sedimento rejeitado também, para diminuir o risco de entupimento da etapa de filtração.Os sobrenadantes agrupados são, em seguida, filtrados através de umacápsula de filtro profundo Supercap PDH4 100/5 polegadas (Pall) (250 centïmetroszdeárea de filtração efetiva). O lisado restante no compartimento do filtro é lavado com tampão de lise. Após a clarificação, uma alíquota de solução de estoque de Tris 1M, pH 7,5 é adicionado ao lisado até uma concentração final de 25 mM. A composição do tampão do lisado final éde 20mM de Hepes, 25 mM Tris, pH 7,5, condutividade -6 mS/cm). O lisado pode ser ainda ligeiramente turvo após a filtração, mas isso não afeta a seguinte etapa de captura. A etapa de captura é realizadaem temperatura ambiente com DEAE Sepharose FF (GE Healthcare) em uma coluna XK50/30 (GE Healthcare) de dimensões seguintes: diâmetro de 50 mm, altura do leito empacotado 20cm, volume do leito empacotado -400 mL. A densidade de carga é de aprox.

0,8 a 1,2 g de biomassa/mL de gel. O processo é executado por um sistema Akta Explorer (GE Healthcare) e monitorado a 280 nm. Equilíbrio é realizado a 100 cm/h, com aprox. 5 CV de 25 mM Tris,20 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7,5, condutividade -5 mS/cm, até pH, condutividade e absorbância a 280 nm serem estáveis. O lisado é carregado na coluna a 75 cm/h e o fluido é descartado. Quando todo o lisado filtrado é carregado, o fluxo é retomado com aprox. 5 CV de tampão de equilíbrio até a absorbância de 280 nm serestabilizada. As impurezas são removidas da coluna durante aetapa de lavagem 2 com 5 CV de Tris 25 mM, NaCl 175 mM, pH 7,5, condutividade 19 mS/cm. A proteína C-TAB é eluída a partir da coluna por etapa de eluição com 3 CV de Tris 25 mM, NaCl 375 mM, pH 7,5, condutividade 36 mS/cm. A coleta das frações contendo C-TAB começa quando absorbância de 280 nm começa a aumentar (geralmente após 1CV) e tem a duração de cerca de 0,5 a 1,0 CV. As frações agrupadas contendo C-TAB podem ser armazenadas a 2-8°C durante a noite. Etapa de purificação intermediária é realizada com SP-Sepharose FF (GE Healthcare) em uma coluna XK50/30 (GE Healthcare), em temperatura ambiente com as seguintes dimensões: diâmetro de 50 mm, altura do leito empacotado 20cm, volume do leito empacotado--400 mL. A densidade de carga máxima é de aprox. 4-5 mg C-TAB/mL gel.

O processo é executado por um sistema Âkta Explorer (GE Healthcare) e monitorado a 280 nm. Etapas de equilíbrio, lavagem e gradiente linear de eluição são realizadas a uma taxa máxima de fluxo de 200 cm/h (65 mL/min), salvo se pressão de retorno excedente (> 4 bar) impedir. Equilíbrio é realizado com aprox. 5-10 CV de tampão G a 200 cm/h, até o pH, condutividade e absorbância a 280 nm ficarem estáveis.

Antes do carregamento, o agrupado DEAE deve ser ajustado para permitir a ligação de C-TAB em resina SP-FF. Agrupado de DEAF é diluído 25 vezes com tampão de equilíbrio de SP- FF (ácido cítrico 10 mM, EDTA 2 mM, pH 5,5 ± 0,1, condutividade -2 mS/cm) para uma condutividade final de não mais do que 3,5 mS/cm, pH 5,5 ± 0,1. Se necessário, a água MilliQ adicional é adicionada para atingir a condutividade desejada. Note-se que baixa condutividade é muito crítica para permitir a ligação de C-TAB para SP-FF. A amostra é carregada na coluna a 150 cm/h, e o fluido é descartado.

Após o carregamento da amostra, o fluxo é retomado com aprox.

5 CV de tampão de equilíbrio a 200 cm/h, até a absorbância a 280 nm estabilizar. A eluição é realizada por um gradiente linear a 100 cm/h a partir de um tampão de equilíbrio de 0% a 30%de 20mM fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 7,0 ao longo de 10 CV. Frações são coletadas e agrupamento é realizado por UV 280 nm de absorbância. 0 agrupamento começa em 15% do pico máximo e termina em 15% do pico máximo. O agrupamento é imediatamente ajustado para citrato 400 mM (pH final de 7, aproximadamente49 mS/cm), utilizando uma solução estoque de citrato 1,5 M, pH 8,0. O agrupado SPFF ajustado deve ter um pH de 7 e aprox. 49 mS/cm e é armazenado a 2-8°C durante a noite.

Etapa de cromatografia de polimento é realizada com Phenyl-Sepharose HP (GE Healthcare) em uma coluna XK50/30

(GE Healthcare) em temperatura ambiente com as seguintes dimensões: diâmetro de 50 mm, altura do leito empacotado 15 • cm, volume de leitoempacotado-300 ml. A densidade de carregamento é de aprox. 4-5 mg C-TAB/mL gel. O processo é 5 executado por um sistemakta Explorer (GE Healthcare) e monitorado a 280 nm. Etapas de equilíbrio, carregamento, lavagem e eluição são realizadas a uma taxa máxima de fluxo de 100 cm/h (33 mL/min), salvo se pressão de retorno excedente (> 4 bar) impedir. Em dito caso, a taxa de fluxo 10 deve ser reduzida. Equilíbrio é realizado com aprox. 5-10 CV de Tris 25 mM, citrato de sódio 400 mM, pH 7,5, 46 mS/cm a 100 cm/h, até o pH, condutividade e 280 nm de absorbância são estáveis. A amostra é carregada na coluna a 100 cm/h, e o fluido é descartado. Após o carregamento da amostra, o 15 fluxo é retomado com aprox. 5 CV de tampão de equilíbrio a 100 cm/h, até a 280 nm de absorbância estabilizar. A eluição é feita por um gradiente linear a 100 cm/h a partir de 100% de tampão de equilíbrio/0s 5 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mS/cm a 100% 5 mM de Tris, pH 7,5, 0,5 mS/cm por 20CV. Frações são 20 coletadas e agrupamento é realizado por absorbância W 280nm.

Agrupamento começa em aprox. 10-15% do pico máximo e termina em aprox. 20% do pico máximo. O agrupado ajustado é armazenado a 2-8°C durante a noite. A preparação da solução de proteína da substância droga C-TAB final é conseguida através de cutoff 30 kDade filtração de fluxo tangencial (TFF, membrana Pellicon 2, Millipore) operadoem temperatura ambiente. A solução de proteína é diafiltrada contra um - tampão de formulação (20 mM de histidina, 75 mM de NaCl, 5% 5 de sacarose, 0,025% de Tween° 80, pH 6,5) até o pH do permeado igualar a 6,5 ± 0,2).

A concentração de proteína final é ajustada a 2 mg/ml, de acordo com a medição de W a 280 rim, usando 1,566 como o coeficiente de extinção a 280 nm específico para C-TAB (conc.

10 de proteína. e 1 mg/mL, cuveta de 1 cm).

Análise de SDS-PAGE e Western Blot: Os usados celulares completos e purificados de proteína de fusão C-TAB.G5 ou C- TAB.G5.1 foram ressuspensos em tampão de amostra de Nu-Page contendo beta-mercaptoetanol e fervidas durante 10 min. As 15 amostras (25 pl) foram carregadas em 3-8% de gel de Tris- Acetato. Após a electroforese (150 V durante 1 h), as proteínas foram visualizadas por coloração dos géis com corante azul ou simplesmente para análise de Western blot.

Expressão específica de C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 foi 20 determinada por análise de Western blot utilizando anticorpos específicos para a toxina. As proteínas foram transferidas a 23 V durante 60 min, para uma membrana de PVDF, utilizando tampão de transferência lx em 10% de metanol. As membranas foram bloqueadas durante 1 hora em temperatura ambiente com 0,5% de caseína em tampão fosfato salina (PBS). Membranas de transferência foram incubadas • durante 2 horas em temperatura ambiente com um anticorpo ' monoclonal contra a Toxina B (GenWay; clone B426M) ou um 5 anticorpo policlonal de cobaia derivado in-house contraToxina A (List Biological Labs). As membranas lavadas foram incubadas com IgG anti-cobaia ou IgG anti-camundongo conjugadas a peroxidase de rábano silvestre. Os blots foram lavados e os substratos AEC foram adicionados. Os blots foram -i0 incubados com agitação suave durante 5-10 minutos. Os blots foram lavados com água para parar o desenvolvimento de cor.

Hemaglutinação RBC: O domínio de ligação celular da toxina Toxina Amaspara a Toxina B demonstrou ser capaz de aglutinar os glóbulos vermelhos de coelho (RBCs). O processo 15 de aglutinação é o resultado da ligação da toxina Aàuma sequência de glicano encontrada em antígenos de sangue em RBCs de coelho. As amostras (C-TAB.G5 e toxina nativa A) são diluídas para 100 pg/ml em PBS. Em uma placa de microtitulação de fundo em V, diluições em série de duas 20 vezes são preparadas em duplicata ao longo da placa, a partir de 100 pg/ml e deixando 50 pl da diluição em cada poço.

Cinquenta microlitros de uma suspensão 0,75%RBC de coelho/PBS é adicionada a cada poço da placa de microtitulação e a placa é incubada durante 1 h em temperatura ambiente. Hemaglutinação é indicada pelo fracasso em formar um sedimento de glóbulos vermelhos no fundo da placa. 0 título de hemaglutinação de uma amostra é representado pelaconcentração de proteína presente no poço 5 com a maior diluição da amostra em que nenhum pellet de RBC é observado.

Exemplo 2: Titulação da dose da proteína recombinante de fusão C-TAB.GS na presença e na ausência de alum em camundongos.

- 10 Este estudo foi para determinar a viabilidade de - umatitulação da dose in vivo de C-TAB.GS com e sem adjuvante alum como um teste de potência C -TAB. O alum utilizado foi Alydragel, (hidrõxido de alumínio, Brenntag). Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles River Labs.), com idade entre 8 e 9 15 semanas, foram utilizados para a imunização. Todos os animais receberam a primeira imunização por injeção intramuscular (IM) (50 p1) no músculo da coxa direita no dia 0. A segundaimunização foi realizada por injeção IM no músculo da coxa esquerda no dia 14. Um total de 72 camundongos foram 20 divididos em 12 grupos de vacinados como se segue: Grupo 1: apenas PBS Grupo 2: 100 (154) ng C-TAB.GS Grupo 3: 300 (462) ng C-TAB.GS Grupo 4: 1.000 (1540) ng C-TAB.G5

Grupo 5: 3.000 (4620) ng C-TAB.GS Grupo 6: 10.000 (15400) ng C-TAB.G5 • Grupo 7: PBS com 50 pg de alum Grupo 8: 10,0 (15,4) ng C-TAB.G5 com 50 pgalum OH 5 Grupo 9; 30,0 (46,2) ng C-TAB.GS com 50 pgalum OH Grupo 10: 100 (154) ng C-TAB.GS com 50 p.galum OH Grupo 11: 300 (462) ng C-TAB.G5 com 50 pg alum OH Grupo 12: 1000 (1.540) ng C-TAB.GS com 50 pg alum OH Neste estudo, a concentração de proteína foi em primeiro - 10 legar determinada de acordo com o protocolo padrão Quick Start1M Bradford Protein Assay (Bio-Rad). Depois, a concentração de proteína (mostrada entre parêntesis) foi novamente determinada por medição UV a 280 nm, de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.3. Em todos os estudos 15 de seguimento a concentração de proteína foi medida pelo método de UV.

As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais duas semanas após a primeira imunização (dia de estudo 14) e duas semanas depois da segunda imunização (dia 20 de estudo 28). O soro foi armazenado a -20°C até serem analisadas.

ELISA de IgGno soro: Os anticorpos séricos induzidos a C-TAB.GS ou C-TAB.G5.1 (designado como C-TAB), toxina A e toxina B ou toxoides dos mesmos foram avaliados em um ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA). Resumidamente, as soluções estoque de 1,0 pg/ml de toxina A, toxina B ou - polipeptídeo isolado C-TAB.GS foram preparadas em PBS e 100 • pl foram adicionados a cada poço de uma placas de 96 poços.

5 Após incubação durante a noite a 4°C, as placas foram lavadas e bloqueadas com um tampão de bloqueio de 0,5% de caseína.

As placas foram lavadas mais uma vez e em série, diluições de duas vezes dos soros de teste para placas. Após uma segunda incubação durante a noite a 4°C, as placas foram -10 lavadas e incubadas com IgG anti-camundongo conjugado a peroxidase (H + L). Após uma incubação de 2 horas em temperatura ambiente, as placas foram novamente lavadas, o substrato de peroxidase (2,2'-azinobis (3- etilbenzotiazolina-6-sulfonato) adicionado e deixado para 15 desenvolver cor durante 2 h em temperatura ambiente. A reação foi parada adicionando 50 pl de 2% de SDS aos poços. As placas são lidas com um leitor de placas de ELISA a uma absorbância de 405 nm. Títulos de anticorpos séricos são apresentados como a média geométrica de Unidades ELISA, que 20 são as diluições de soro que resultamem uma OD 405 nm, leitura de 1,0. Como um controle negativo,um poço de amostra de soro pré-imune obtido de animais pré-sangrados antes da primeira imunização foi utilizado para avaliar uma resposta de anticorpos.

Os animais que receberam C-TAB.G5 demonstraram um aumento dependente da dose nos níveis títulos de anticorpos, com o adjuvante alum permitindo títulos significativamente melhorados de anticorpos em uma dose menor de C-TAB.G5. A Figura 3 mostra os títulos de IgG anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B. A Figura 4 mostra uma comparação gráfica dos títulos de anticorpo na presença ou na ausência de alum.

Exemplo 3: Imunogenicidade e eficácia protetora de C- TAB.G5 em camundongos.

10 Este estudo foi para avaliar a imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5 em camundongos vacinados que receberam um desafio letal de toxina A ou toxina B de C.

difficile. Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles River Labs.), com idade entre 6-7 semanas, foram utilizados para este estudo. Todos os animais receberam a primeira vacina por injeção intramuscular (IM) (50 p1) no músculo da coxa direita no dia 0. A segunda vacinação foi realizada por injeção intramuscular no músculo da coxa esquerda no dia 14. 116 camundongos foram divididos em grupos vacinados como se segue: Grupo 1: PBS apenas Grupo 2: 3 pg C-TAB.G5 Grupo 3: 10 pg C-TAB.G5 Grupo 4: 30 pg C-TAB.G5

Grupo 5: 3 pg de C-TAB.G5 + 50 pg alum OH Grupo 6: 10 pg C-TAB.G5 + 50 pg alum OH Grupo 7: 30 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH Grupo 8: PBS apenas 5 Grupo 9: 3 pg C-TAB.GS Grupo 10: 10 pg C-TAB.GS Grupo 11: 30 pg C-TAB.GS Grupo 12: 3 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH Grupo 13: 10 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH 10 Grupo 14: 30 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais duas semanas após a segundaimunização (dia de estudo 28). O soro foi armazenado a -20°C até serem analisadas. Os títulos de anticorpos séricospara C-TAB, toxina A e toxina 15 B foram então determinados por ELISA e avaliado como unidades de ELISA (EU).

A Figura 5 mostra títulos de anticorpos no soro para C- TAB, toxina A e toxina B em camundongos avaliados duas semanas após a segunda imunização (dia de estudo 28). Este 20 estudo demonstrou que a proteína de fusão C-TAB.G5 é altamente imunogênica em camundongos e é capaz de induzir forte resposta de anticorpos contra ambas toxina A e toxina B, mesmo sem a adição de um adjuvante. A imunogenicidade de C-TAB.G5 pode ser significativamente aumentada (mais de um log) por co-liberação com hidróxido de alummnio.Os animais que receberam C-TAB.GS com ou sem alum demonstraram respostas 2 vezes maiores de anticorpos ao longo de um intervalo de um log de dose.

5 Além de avaliar os títulos de anticorpo, os anticorpos gerados por imunização com C-TAB.GS foram avaliados quanto à sua capacidade para neutralizar a toxina A e B nativas em um ensaio in vitrode neutralização de toxinas (TNA).

Ensaio de Anticorpo de Neutralização de Toxina -1d (TNA).Para a análise in vitro, 125 p1 de toxina A (5 ng/ml) ou toxina B (1 ng/ml) foram incubados com 125 p1 de diluições em série de antissoros obtidos a partir de camundongos imunizados. Após uma hora de incubação a 37°C, a mistura toxina:soro foi adicionadaaos poços de microtitulação que continham as células Vero (células de rim de macaco), e as placas de microtitulação incubadas durante 18 horas. A incubação de toxina A ou B com células Vero resultou em uma mudança na morfologia celular e a perda de aderência das células que foi medida por coloração vermelha neutro de células tratadas com toxina após a remoção das células não aderentes. O título de neutralização da toxina de um soro é reportado como a diluição de soro que dá uma redução de 50% na atividade da toxina.

Os resultados do ensaio de TNA são mostrados na Figura

6. Os dados indicam que os anticorpos gerados após a imunização com o C-TAB.G5 isolado são capazes de neutralizar a atividade tóxica da toxina nativa A, mas não toxina B.

' Quando o C-TAB.G5 foi co-liberado com alum, os títulos de 5 TNA foram aumentados com aproximadamente 6 vezes de aumentos em TNA antitoxina A e títulos de apenas 2 vezes menos em TNA antitoxina B. Estes dados indicam que o polipeptídeo isolado C-TAB.GS não só retém os epitopos antigênicos de reconhecimento de anticorpos presentes nos toxinas nativas, - l0 mas compreende epítopos antigênicos críticos necessários para a geração de anticorpo de neutralização da toxina funcional. Assim, C-TAB.G5 é eficaz a neutralizar os efeitos tóxicos do toxina A e toxina B de C. difficile, portanto, é útil na vacinação.

15 Além de avaliar a resposta do anticorpo, a capacidade de imunização por C-TAB.G5em proteger os camundongos de um desafio letal de toxinas nativas foi determinada. Três semanas após a segunda vacinação (dia 35) os animais de estudo nos grupos vacinados e não vacinados (N = 8) receberam 20 por via intraperitoneal (IP) uma dose letal de uma de 25 ng da toxina A, ou 50 ng de toxina B.A sobrevivência dos camundongos foi monitorada ao longo dos 9 dias seguintes e os resultados são mostrados na Figura 6. Esta experiência demonstrou que a imunização de camundongos com C-TAB.G5 na ausência do adjuvante alum foi capaz de conferir proteção de 100% contra um desafio letal com toxina nativa A e 50% de proteção contra desafio da toxina B. Co-liberação de C-TAB.GS e com Alum aumentou a imunidade protetora à toxina B até 100% 5 de proteção. Estes dados indicam que a vacinação C-TAB.G5 induz uma resposta imunológica suficiente para proteger camundongos contra os efeitos tóxicos de toxina A e B no modelo de desafio letal.

Exemplo 4: Avaliação da imunogenicidade e eficácia - 10 protetora de C-TAB.GS em camudongos jovens e idosos.

Este estudo foi para comparar a resposta imune montada contra C-TAB.G5 em camundongos jovens e idosos. Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles River Labs.) com idade entre 6-7 semanas e 18 meses, respectivamente, foram utilizados para 15 este estudo. Todos os animais receberam a primeira vacina por via intramuscular (IM) (50 l) no músculo da coxa direita no dia 0. A segunda vacinação foi realizada por injeção intramuscular no músculo da coxa esquerda no dia 14. 192 camundongos foram divididos em grupos vacinados como se 20 segue: Grupo 1: PBS para camundongos jovens Grupo 2: PBS para camundongos mais velhos Grupo 3: 10 ug C-TAB.GS para ratos jovens Grupo 4: 30 pg C-TAB.G5 para ratos jovens

Grupo 5: 10 pg C-TAB.GS para camundongos mais velhos

Grupo 6: 30 pg de C-TAB.G5 para camundongos mais velhos

Grupo 7: 10 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH para camundongos jovens

5 Grupo 8: 30 pg C-TAB.

G5 + 50 pg alum OH para camundongos jovens

Grupo 9: 10 pg C-TAB.

G5 + 50 pg alum OH para camundongos mais velhos

Grupo 10: 30 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH para ratos

- 10 mais velhos

Grupo 11: PBS para camundongos jovens

Grupo 12: PBS para camundongos mais velhos

Grupo 13: 10 pg C-TAB.G5 para camundongos jovens

Grupo 14: 30 pg C-TAB.GS para camundongos jovens

15 Grupo 15: 10 pg C-TAB.GS para camundongos mais velhos Grupo 16: 30 pgC-TAB.GS para camundongos mais velhos

Grupo 17: 10 pg C-TAB.GS + 50 pg alum OH para camundongos jovens

Grupo 18: 30 pg C-TAB.GS + 50 mg alum OH de camundongos

20 j ovens

Grupo 19: 10 pg C-TAB.G5 + 50 pg alum OH para camundongos mais velhos

Grupo2 0 : 30 pg C-TAB.

G5 + 50 pg alum OH para camundongos mais velhos k Três semanas após a segunda vacinação (dia de estudo 35), os animais nos grupos vacinados e não vacinados (N = 6) receberam um desafio letal por injeção intraperitoneal (IP) com 25 ng de toxina A ou 50 ng de toxina B. Sobrevivência 5 dos camundongos foi monitorada durante os 9 dias seguintes.

As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais duas semanas após a primeira imunização (dia de estudo 14) e duas semanas depois da segunda imunização (dia de estudo 28). O soro foi armazenado a -20°C até serem -i6 analisadas. Os títulos de anticorpos no soro para C-TAB, toxina A e toxina B foram, em seguida, determinados por e reportados como unidades de ELISA (EU). Anticorpos de neutralização de toxina A e toxina B (TNA) foram determinados usando células Vero tratadas com uma quantidade citotóxica de toxina A e toxina B recombinantes.

Os animais jovens que recebem a vacina de C-TAB.G5 demonstraram níveis significativamente mais elevados de todos os anticorpos testados, como comparação com os animais de idade. Títulos especialmente altos de anticorpos foram obtidos em camundongos jovens vacinados com C-TAB.G5, na presença de hidróxido de alum (Figura 7). Melhoria particularmente significativa foi alcançada no tïtutlo de TNA toxina B. Ao mesmo tempo, não havia grande diferença entre os camundongos jovens e mais velhos na capacidade de resistir aos desafios com toxina A e toxina B. No entanto, ambos os grupos demonstraram taxa de proteção melhorada quando vacinados na presença de sulfato de alum. A Figura 7 • mostra uma comparação de imunogenicidade de C-TAB.G5 e 5 eficácia protetora em camundongos jovens vs mais velhos. A Figura 8 mostra a cinética de desenvolvimento de anticorpo anti-C-TAB em camundongos jovens e mais velhos.

Exemplo 5: Comparação da imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5.1 e toxoide A e B.

10 Este estudo foi para comparar a imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5.1, vs.toxoide A/B. O toxoide A/B foi utilizado uma mistura de partes iguais (1:1) de toxoide A (lote #1009132) e toxoide B (lote # 1009133).

Toxoide foi preparado por fixação em formalina e fornecido 15 por TechLab. Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles River Labs.), com idade entre 6-7 semanas, foram utilizadas para este estudo. Todos os animais receberam a primeira vacina por injeção intramuscular (IM) (50 pl) no músculo da coxa direita no dia 0. A segunda vacinação foi feita por injeção 20 IM no músculo da coxa esquerda no dia 14. 180 camundongos foram divididos em grupos vacinados como se segue: Grupo 1: apenas PBS Grupo 2: 10 pg C-TAB.G5.1 Grupo 3: 30 pg C-TAB.G5.1

Grupo 4: 10 pg C-TAB.G5.1 + 50 pg alum OH Grupo 5: 10 pg C-TAB.G5.1 + 50 pg alum OH Grupo 6: 30 ng de toxoide de A/B Grupo 7: 10 pg de toxoide A/B 5 Grupo 8: 30 pg de toxoide A/B + 50 pg alum OH • 1 Grupo 9: 30 pg de toxoide de A/B + 50 pg alum OH Grupo 10: PBS Grupo 11: 10 pg C-TAB.G5.1 Grupo 12: 30 pg C-TAB.G5.1 -1Õ Grupo 13: 10 pg C-TAB.G5.1 + 50 pg alum OH ' Grupo 14: 30 jig C-TAB.G5.1 + 50 pg alum OH Grupo 15: 10 pg de toxoide A/B Grupo 16: 30 pg de toxoide A/B Grupo 17: 10 pg de toxoide A/B + 50 pg alum OH 15 Grupo 18: 30 pg de toxoide A/B + 50 pg alum OH Três semanas após a segunda vacinação (dia do estudo 35) os animais nos grupos grupos vacinados e não vacinados (N = 6) receberam um desafio letal por injeção intraperitoneal (IP) com 28 ng de toxina A ou 50 ng da toxina B. Sobrevivência dos camundongos foi monitorada durante os 9 dias seguintes.

As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais duas semanas após a primeira imunização (dia de estudo 14) e duas semanas depois da segunda imunização (dia de estudo 28). O soro foi armazenado a -200 C até serem analisadas. Os títulos de anticorpos no soro para C-TAB, toxina A e toxina B foram então determinados por ELISA e reportados como unidades de ELISA (EU). Anticorpos de neutralização de toxina A e toxina B (TNA) foram determinados usando células Vero tratadas com uma quantidade citotóxica de toxina A e toxina B recombinantes.

Este estudo demonstra a imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5.1 e toxoide A/B em camundongos após l0 duas vacinações. Os animais que receberam C-TAB.GS.1 apresentaram títulos de anticorpos anti-C -TAB menores mas significativos, em comparação com os animais que receberam toxoide A/B. Além disso, a co-liberação do alum consideravelmente aumentou todas as respostas dos anticorpos testados. Como resultado, o nível de anticorpos anti-C -TAB e antitoxina A obtidos em animais imunizados ou com C- TAB.G5.1 ou com o toxoide A/B na presença de alum são semelhantes. O titulo de anticorpo menor foi somento observado para o anticorpoantitoxina B, quando os camundongos foram imunizados com C-TAB.G5.1, em comparação com camundongos imunizados com o toxoide A/B. Digno de nota, ao contrário dos anticorpos gerados contra epítopos de reconhecimento de C-TAB.G5.1 na porção C-terminal das moléculas de toxina, anticorpos induzidos com a imunização com toxoide foram específicos para a porção N-terminal das moléculas de toxina, que foi lido no ELISA antitoxina. Assim, os anticorpos antitoxina A e antitoxina B gerados em camundongos imunizados com C-TAB.G5.1 e toxoide A/B foram anticorpos de especificidade diferente e, por conseguinte, não podem ser comparadas diretamente. No entanto, os dados indicam que a resposta de anticorpos à imunização por C- TAB.G5.1 é significativamente elevada, como no caso da imunização com toxoides. Além disso, o estudo de desafio de toxina demonstrou que a capacidade de imunização por C- TAB . G5 . 1 para proteger os camundongos contra um desafio letal é comparável à eficácia de proteção de toxoide de A e B. A Figura 9 mostra urna comparação da imunogenicidade de C- TAB. G5 . 1 e toxoide de A/B. A Figura 10 mostra a neutralização de toxina e os dados de proteção para os camundongos imunizados com C-TAB.G5.1 quando comparados com aqueles imunizados com toxoide A/B.

Exemplo 5.1: Comparação dos títulos de anticorpos e eficácia protetora da C-TAB.G5.1 em diferentes esquemas de imunização.

Este estudo foi para comparar a imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5.1 em camundongos que receberam três doses da vacina em diferentes esquemas de imunização. Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles River

Labs.), com idade entre 6-7 semanas, foram utilizadas para este estudo. 135 camundongos foram divididos em 14 grupos.

Todos os animais nos grupos de no. 2-13 receberam três doses de vacina por injeção intramuscular (IM) (50 p1) no músculo da coxa direita ou no músculo da coxa esquerda nos dias a seguir indicados. Camundongos dos grupos 1 e 8 não receberam a vacinação, pois eles serviram como controle negativo. A imunização foi realizada como se segue: Grupo Vacina Dia da imunização (via) 1 - - 2 10pgG5.1 0(R),3(L),14(R) 3 10 pg G5.1 + 50 pg Alum 0 (R), 3 (L), 14 (R) 4 10pgG5,1 0(R),7(L),21 (R) 5 10 pg G5.1 + 50 pg Alum 0 (R), 7 (L), 21 (R) 6 10 pg G5.1 0 (R), 14 (L), 28 (R) 7 10 Ng G5.1 + 50 pg Alum 0(R)14(L),28(R) 8 - - 9 10 gg G5.1 0 (R), 3 (L), 14 (R) 10 10 pg G5.1 + 50 pg Alum 0 (R), 3 (L), 14 (R) 11 10 pg G5.1 0 (R), 7 (L), 21 (R) 12 10 pg G5.1 + 50 pg Alum 0 (R), 7 (L), 21 (R) 13 10 pg G5.1 0 (R), 14 (L), 28 (R) 14 10 pg G5.1 + 50 pg Alum 0 (R), 14 (L), 28 (R) 10 R) = músculo da coxa direita (L) - músculo da coxa esquerda

As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais no dia do estudo 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35 e 42. 0 soro foi armazenado a -200 C até ser analisado. Os títulos de anticorpos no soro para C-TAB, toxina A e toxina B foram determinados por ELISA e avaliados como unidades de ELISA (EU). Os anticorpos neutralizantes de toxina A e toxina B (TNA) foram determinados no dia do estudo 42, utilizando células Vero tratadas com uma quantidade citotôxica de toxina A e toxina B recombinantes.

10 Três semanas após a última vacinação (dia 49) os animais nos grupos vacinados e não vacinados (N = 8) receberam um desafio letal por injeção intraperitoneal (IP) com 28 ng de toxina A ou 50 ng da toxina B. Sobrevivência dos camundongos foi monitorada durante os 9 dias seguintes.

15 Este estudo demonstra que todos os títulos de anticorpos medidos duas semanas depois da terceira vacinação, ou nos dias de estudo 35 e 42 são comparáveis em todos os regimes de imunização, embora o regime de imunização de 0/14/28 mostra as melhores respostas de anticorpos. Se comparar os títulos de anticorpos medidos duas semanas apôs a segunda vacinação, então, o regime de imunização de 0/14/28 é melhor do que o regime de imunização de 0/7/21, e muito melhor do que o regime de imunização de 0/3/14. Este estudo confirmou que os títulos de anticorpos antitoxina A/B são significativamente melhorados quando o antígeno é co- injetado com hidróxido de alumínio (dados não mostrados). O estudo também mostra que mesmo duas doses de vacina com alum administradas em intervalos de duas semanas pode induzir um 5 alto nível de anticorpo, comparável ao nível obtido após três doses de vacina de dose.

O nível de anticorpos de neutralização de toxina A/B é muito mais elevado no regime de imunização de 0/7/21 e 0/14/28 do que no regime de imunização de 0/3/14.

10 Proteção completa contra o desafio com toxina A não exige alum no regime de imunização de 0/7/21 e 0/14/28, mas não em 0/3/14. 0 regime de imunização de 0/14/28/com alum induziu um maior nível de proteção (87,5%) contra o desafio de toxina B, enquanto o regime de imunização de 0/7/21 15 fornece 37,5% da proteção e 0/3/14 mostra 28,6 % de proteção.

Os resultados deste estudo são mostrados na Figura20.

Exemplo 6: Avaliação da imunogenicidade e eficácia protetora da proteína de fusão C-TAB.G5.1 recombinante em hamsters.

20 Este estudo foi para avaliar ainda mais a imunogenicidade da proteína de fusão C-TAB.G5.1 recombinante administrada com ou sem adjuvante, em um modelo animal diferente.

Hamsters fêmeas (Harlan), com mais de7 semanas e pesando entre 80 e 90 g foram utilizados para este estudo. Todos os animais receberam a primeira vacinação por injeção em bolus (50 pl) intramuscular (IM) no músculo da coxa direita no dia

0. A segunda vacinação foi por injeção IM no músculo da coxa esquerda no dia 14 ea terceira vacinação foi por injeção IM 6) e no dia 28. Os hamsters foram divididos em grupos (N = vacinados como se segue: Grupo 1: Formulação de tampão apenas Grupo 2: 10 pg C-TAB.G5.1 10 Grupo 3: 10 pg C-TAB.G5.1 +100pg de alum OH Grupo 4: 30 pg de C-TAB.G5.1 Grupo 5: 30 pg C-TAB.G5.1 + 100 pg alum OH Grupo 6: 100 pg C-TAB.G5.1 Grupo 7: 100 pg C-TAB.G5.1 + 100 pg alum OH 15 Grupo 10: Formulação de tampão apenas Grupo 11. 10 pg C-TAB.G5.1 Grupo 12. 10 pg C-TAB.G5.1 + 100 pg alum OH Grupo 13. 30 pg C-TAB.G5.1 Grupo 14. 30 pg C-TAB.G5.1 + 100 pg alum OH 20 Grupo 15. 100 pg C-TAB.G5.1 Grupo 16. 100 pg C-TAB.G5.1 + 100 pg alum OH Duas semanas depois da terceira vacinação (dia 42) os animais de estudo nos grupos vacinados e não vacinados (n = 6) receberam um desafio letal por injeção intraperitoneal

(IP) com 75 ng de toxina A ou 125 ng da toxina B. 12 animais extras foram utilizados para uma titulação da dose de desafio de toxina A ou toxina B no dia 44. A sobrevivência dos hamsters foi monitorada ao longo dos 8 dias seguintes.

5 As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais duas semanas após a primeira imunização (dia de estudo 14), após a segunda imunização (dia de estudo 28) ea terceira imunização (dia de estudo 35) . O soro foi armazenado a -20°C até ser analisado. Os títulos de anticorpos no soro 10 para C -TAB, toxina A e toxina B foram então determinados por ELISA e reportados como unidades de ELISA (EU). Anticorpos neutralizantes para toxina A e toxina B (TNA) foram determinados usando células Vero tratadas com uma quantidade citotóxica de toxina A e toxina B recombinantes.

15 Este estudo demonstrou que hamsters, de modo semelhante aos camundongos, foram capazes de responder positivamente à vacinação por C-TAB.G5.1. Os animais que receberam C- TAB.G5.1 demonstraram um aumento dependente da dose em todos os títulos de anticorpos testados, enquanto o adjuvante alum 20 melhorou significativamente os títulos de anticorpos em todas as doses de C-TAB.GS. Os maiores títulos de anticorpos foram observados duas semanas após os segundos shots (dia do estudo 28) . A Figura 11 (A-C) mostra os títulos de anticorpos para cada grupo de hamsters imunizados. A Figura 12 mostra a cinética de desenvolvimento de anticorpo anti-C-TAB em hamsters imunizados com C-TAB.GS na presença ou na ausência de hidróxido de alumínio.

Os resultados do ensaio TNA são mostrados na Figura 13.

Estes resultados são semelhantes aos obtidos para os camundongos e indicam que os anticorpos gerados contra a proteína de fusão C-TAB.G5.1 em hamsters são eficazes na neutralização de efeitos tóxicos de toxina A e toxina B de C. difficile.

10 A Figura 13 também mostra dados de proteção para hamsters imunizados com C-TAB.G5.1 após um desafio letal de toxina. Alta proteção foi conseguida mesmo por vacinação com o C-TAB.G5.1 na ausência do adjuvante. O nível de proteção foi melhorado para 100% por adição de alum à vacina.

15 Exemplo 7: A eficácia protetora da proteína de fusão C- TAB.G5.1 contra um desafio de esporos de C. difficile em hamsters tratados com clindamicina.

Após o tratamento com antibiótico C. difficile pode colonizar o intestino e, se toxigênico, pode causar uma diarreia associada aos antibióticos. Doença associada a C.

difficile (CDAD) dos seres humanos é modelada em hamsters usando clindamicina para tornar os animais suscetíveis à colonização, diarreia e morte, geralmente dentro de alguns dias após a semeadura com uma cepa toxigênica. Para avaliar a eficácia da vacina C-TAB.G5.1, hamsters vacinados e não vacinados, foram desafiados com clindamicina e C. difficile cepa 630. 100 pg de C-TAB.G5.1 foram misturados com 125 pg de adjuvante de hidróxido de alumínio. Hamsters fêmeas adultas pesando -100 g receberam 3 vacinas por injeção intramuscular (IM) nos dias 0, 14 e 28. O placebo foi PBS.

48 hamsters foram divididos em grupos de 8, como vacinados como se segue: Grupo 1: PBS 10 apenas + 102 desafio esporos 10 Grupo 2: C-TAB.G5.1 + 102 desafio esporos Grupo 3: PBS apenas + 103 desafio esporos Grupo 4: C-TAB.G5.1 + 102 desafio esporos Grupo 5: PBS apenas + 104 desafio esporos Grupo 6: C-TAB.G5.1 + 104 desafio esporos 15 Todos os animais em todos os grupos no dia 42 que receberam uma dose oral de 10 mg de fosfato de clindamicina/kg de peso corporal. No dia 43 todos os animais de todos os grupos foram tratados por gavagem oral com esporos lavados de C. difficile cepa 630. Utilizaram-se três 20 níveis de desafio com esporos (- 102 , 103 e 104 ) . A observação, mas nenhum tratamento continuou até o dia 54. No final do estudo, todos os animais sobreviventes estavam livres da doença por > 5 dias.

As amostras de sangue foram retiradas para obtenção de estudos sorológicos nos dias 0, 14, 28, 42 e 54 dias (final do estudo). As fezes foram novamente coletadas nos dias 1 e 42, diretamente a partir do ânus dos hamsters, ou, se necessário, de entre a forragem.

5 Os resultados são mostrados na Figura 14, que demonstram as curvas após o desafio com esporos em hamsters. Dados de sobrevivência foi plotado como curvas de ajuste de sobrevida de Kaplan-Meier e análise estatística foirealizada usando uma análise de log rank. Em todas as doses de esporos, 100% 10 de sobrevivência dos hamsters nogrupo vacinado foi observada e a sobrevivência foi significativamente melhorada quando comparada com agrupa placebo: p = 0,0245 a 102 de esporos, p = 0,0006 a 103de esporos, p <0,0001 a 104 de esporos.

Exemplo 8: Imunogenicidade e eficácia de proteção de C- 15 TAB.G5.1 em macacos.

Este estudo foi para avaliar a imunogenicidade e proteção do C-TAB.G5.1 em macacos cynonomolgus. Seis macacos cynonomolgus femininos, com idades entre 4 e 6 anos e pesando entre 2 e 4 kg, foram utilizadas para este estudo. Dois 20 grupos de três macacos foram dispostos, o primeiro grupo (Grupo 1) recebendo 200 pg de C-TAB.G5.1 e o segundo (Grupo 2) recebendo 200 pg de C-TAB.G5.1 e 250 ug de alum. Adjuvante alum Rehydragel (Reheis, lote # 534401, diluído em PBS a 2 mg/ml) foi usado.Antes de coletar o sangue ou imunização, os animais foram raspados (se necessário).

As la (dia 0 do estudo) e 3a (dia de estudo 28) imunizações foram injetadoa no braço esquerdo (deltoide), a 2a imunização (dia de estudo 14) foi injetada no braço direito (deltoide). O grupo 1 recebeu 200 pg C-TAB.G5.1 isolado em 1xPBS 0,5 ml por injeção IM e Grupo 2 recebeu 200 pg C-TAB. G5 . 1 com 250 pg alum em 1xPBS 0,5 ml por injeção IM.

Nos pontos de tempo estabelecidos (dia de estudo 0, 14, 28 e 42) , 2-3 mL de sangue total foi obtido através de métodos padrão em tubos de separação de soro. As amostras de soro foram congeladas a aproximadamente -20°C. Método ELISA foi, então, usado para avaliar os títulos de IgG de anti-C- TAB, antitoxina A e antitoxina B. Os títulos de anticorpos foram apresentados em unidades de ELISA (EU).

A Figura 15 mostra que doses aumentadas de C-TAB.G5.1 levam ao aumento da produção de anticorpo que reconhece todas as três proteínas, enquanto a presença de alum melhorou significativamente os níveis de anticorpos. Os maiores títulos de anticorpos foram observados com duas vacinações no dia 42. Estes dados indicam claramente a viabilidade de utilizar as proteínas de fusão C-TAB.G5 ou C-TAB.G5.1 recombinantes para vacinação de indivíduos em necessidade do mesmo.

Exemplo 9: Comparação da imunogenicidade de C-TAB.GS e C-TAB.G5.1.

Este estudo foi para comparar a imunogenicidade de C- TAB.GS e C-TAB.G5.1, bem como o efeito dos dois tampões diferentes em que o C-TAB foi liberado. Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles Rio Labs.), com idade entre 8 e 9 semanas, foram utilizados para imunização. Todos os animais receberam a primeira imunização através de injeção intramuscular (IM) (50 dal) no músculo da coxa direita no dia 0. A segunda imunização foi realizada por injeçãolM no músculo da coxa esquerda no dia 14. Um total de 72 camundongos foi dividido em 12 grupos de vacinados como se segue: Grupo 1: 1 pg C-TAB.G5 em PBS Grupo 2: 3 pg C-TAB.G5 em PBS 15 Grupo 3: 10 pg C-TAB.GS em PBS Grupo 4: 30 pg C-TAB.GS em PBS Grupo 5: 1 pg C-TAB.G5 em tampão histidina Grupo 6: 3 pg C-TAB.G5 em tampão histidina Grupo 7: 10 pg C-TAB.GS em tampão histidina 20 Grupo 8: 30 pg C-TAB.G5 em tampão histidina Grupo 9: 1 pg C-TAB.G5.1 em tampão histidina Grupo 10: 3 pg C-TAB.G5.1 em tampão histidina Grupo 11: 10 pg de C-TAB.G5.1 em tampão histidina Grupo 12: 30 pg C-TAB.G5.1 em tampão histidina

As amostras de sangue foram coletadas de todos os animais duas semanas depois da segunda imunização (dia de estudo 28). O soro foi armazenado a -20°C até serem analisadas. Títulos de anticorpos no soro para C -TAB, a toxina A e toxina B foram determinadas por ELISA e reportados como Unidades ELISA.

A Figura 16 mostra que todos os títulos de anticorpos (anti-C-TAB, antitoxina A e antitoxina B) não foram significativamente diferentes (como revelado por análise de teste-T) ao longo de 1-30 pg intervalo de dose para três formulações da vacina. Produção de anticorpos ligeiramente maior foi alcançada com formulação de C-TAB.G5 em tampão de histidina, como comparar com PBS. Não foi observada diferença significativa entre a imunização com C-TAB.G5 e C-TAB.G5.1 em formulações de histidina. Assim, este estudo demonstra a imunogenicidade igual de construções C-TAB.GS e C-TAB.G5.1.

Exemplo 10: Preparação e avaliação das proteínas de fusão alternativas C-TABNCTB e C-TADCTB.

Este exemplo descreve a preparação de duas outras proteínas de fusão compreendendo uma porção do domínio C- terminal de CTA e duas porções do domínio C-terminal da CTS derivadas de C. difficilecepa VPI-10463. A proteína de fusão C-TABNCTB (SEQ ID NO:18) compreende, como C-TAB.G5, 19 unidades de repetição de CTA (aminoácidos 2272-2710), 23 unidades de repetição de CTB (aminoácidos 1850-2366), mais 10 repetições adicionais de CTB (aminoácidos 1834-2057) fundidas com o C-terminal da CTB. A proteína de fusão C- TADCTB (SEQ ID NO:20)compreende a sequência C-TAB.G5 (19 repetições de CTA e 23 repetições de CTB) mais 24 unidades de repetição adicionais de CTB (aminoácidos 1834-2366) fundidos com o C-terminal do C-TAB.GS. Assim, C-TADCTB compreende uma porção dupla de unidades de repetição de CTB.

Clonagem das construções de genes de C-TABNCTB e C-TADCTB foirealizada de uma maneira semelhante à descrita no Exemplo

1.1. As proteínas de fusão recombinantes foram expressas em células de E. coil e purificadas utilizando um processo padronizado, como descrito no Exemplo 1.2. Os polipeptideos isolados foram avaliados em estudos de imunogenicidade e proteção em animais.

Exemplo 10.1: Comparação da imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5, C-TABNCTB e C-TADCTB em camundongos.

Este estudo foi para comparar a imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5, C-TABNCTB e C-TADCTB em camundongos vacinados com cinco doses de antígeno em uma faixa de dois log. Camundongos C57BL/6 fêmeas (Charles River Labs.), com idade entre 6-7 semanas, foram utilizados para este estudo. Todos os animais receberam duas vacinas: a primeira por injeção intramuscular (IM) (50 pl) no músculo da coxa direita no dia 0. A segunda vacinação foi feita por injeção IM no músculo da coxa esquerda no dia 14. Todas as imunizações foram realizadas na ausência de alum. Amostras de sangue foram coletadas duas semanas depois da segunda 5 imunização (dia de estudo 28). 0 soro foi armazenado a -20°C até seranalisado. Os títulos de anticorpos no soro para C- TAB, toxina A e toxina B foram determinados por ELISA e reportados como unidades de ELISA (EU) mostrados na Figura

17.

10 Este estudo demonstrou que as proteínas de fusão alternativa C-TADCTB e C-TABNCTB, assim como C-TAB.G5, são altamente imunogênicas e capazes de induzir forte resposta de anticorpos contra ambos toxina A e toxina B, mesmo sem a adição de um adjuvante.

15 Além de avaliar a resposta do anticorpo, a capacidade de imunização de C-TADCTB e C-TABNCTB para proteger os camundongos de um desafio letal da toxina nativa B foi determinada. Três semanas após a segunda vacinação (dia de estudo 35), os animais nos grupos vacinados e não vacinados 20 (n = 6) receberam por via intraperitoneal (IP) uma dose letal de 50 ng da toxina B. A sobrevivência dos camundongos foi monitorada ao longo dos 9 dias seguintes e os resultados são mostrados na Figura 18. Este experimento demonstrou que a imunização de camundongos com 33 ig de C-TADCTB na ausência de alum foi capaz de conferir proteção de 100% contra um desafio letal com toxina nativa B, enquanto que a mesma dose de C-TAB.GS e C-TABNCTB induz apenas proteção parcial. Estes dados indicam que, de modo semelhante ao C-TAB.GS, duas outras proteínas de fusão C-TADCTB e C-TABNCTB podem ser protetoras contra o desafio letal com a toxina nativa.

Exemplo 10.2: Comparação da imunogenicidade e eficácia protetora de C-TAB.G5.1 e C-TADCTB em hamsters.

Este estudo foi para avaliar ainda mais a imunogenicidade da proteína de fusão alternativa C-TADCTB administrada com ou sem adjuvante alum em um modelo animal diferente.

O estudo foi concebido como descrito no Exemplo 6: hamsters fêmeas foram vacinados três vezes por injeçãolM 15 (dia do estudo 0, 14 e 28) na presença ou ausência de 100 pg de hidróxido de alum. Duas semanas depois da terceira vacinação (dia do estudo 42), todos os animais receberam um desafio letal por injeção intraperitoneal (IP) com 75 ng de toxina A ou 125 ng da toxina B. Amostras de sangue foram novamente coletadas no dia de estudo 14, 28 e 35 e os títulos de anticorpo no soro para C-TAB, toxina A e toxina B foram determinados por ELISA. Anticorpos neutralizantes para toxina A e toxina B (TNA) foram medidos no soro do dia 35.

Sobrevivência dos hamsters foi monitorada e reportada como%

de proteção.

Este estudo demonstrou que a proteína de fusão C-TADCTB pode induzir a resposta de anticorpo antitoxina em hamsters, de forma semelhante aos camundongos. O adjuvante alum 5 melhorou significativamente todos os títulos de anticorpos testados. Os resultados do ensaio do TNA mostrado na Figura 19 indicam que os anticorpos gerados contra o C-TADCTB são eficazes na neutralização de efeitos tóxicos de toxina A e toxina Bde C. difficile. A Figura 19 também mostra a 10 comparação dos dados de proteção para os hamsters imunizados com o C-TAB.G5.1 ou com C-TADCTB. Alta proteção foi conseguida por vacinação com ambas as proteínas de fusão recombinantes.

Exemplo 11: Estudo de fase 1 aberto para avaliando 15 segurança, imunogenicidade e dose-resposta de uma composição farmacêutica compreendendo C-TAB.G5.1 A composição farmacêutica que compreende C-TAB.G5.1, uma proteína de fusão recombinante que consiste em toxina A e toxina B truncadas de Clostridium difficile (C. difficile) 20 B, que serão administradas em três doses diferentes:20pg com o A1(OH) 3(alum), 75 e 200 pg, sem ou com o A1(OH)3, respectivamente, por injeção intramuscular (IM), três vacinações nos dias 0, 7 e 21.

OBJETIVOS DO ESTUDO

Primário: Investigar a segurança e tolerabilidade de uma composição farmacêutica que compreende C-TAB.G5.1 até 6 meses após a terceira vacinação.

5 Secundário: Investigar a resposta imunológica medida contra o antígenoda vacina C-TAB.G5.1 e as Toxinas nativas A e B de C. difficile para três diferentes doses e duas formulações nos Dias 0, 7, 14, 21, 28, 113, 201 após a primeira vacinação para se obter uma primeira indicação da dose e da formulação ideais.

Investigar a capacidade dos anticorpos IgG induzidos por vacina C-TAB.G5.1 para neutralizar toxinas A e B de C.

difficilein vitro. 15 DESENHO DO ESTUDO Este é um estudo aberto, parcialmente randomizado, de escalonamento de dose de Fase 1, que será composto de uma parte A, em adultos saudáveis com idade entre> 18 e <65 anos e uma parte B em idosos saudáveis> 65 anos, o últimogrupo de 20 idade sendo a população mais vulnerável a sofrer de infeções por C. difficile. A parte A será conduzida com calendário de vacinação Dia 0, 7 e 21, em cinco grupos de tratamento de 12 indivíduos adultos saudáveis para estudar a segurança e a dose de resposta para20pg a vacina C-TAB.G5.1 com adjuvante,

e 75 pg e 200 jig de vacina C-TAB.G5.1 com ou sem adjuvante, respectivamente. Segurança e imunogenicidade serão analisados depois de todos os indivíduos adultos da parte A receberem a terceira vacinação, todos os dados de segurança serão analisados por um Comitê de Monitoramento de Dados de Segurança (DSMB) antes da inclusão de indivíduos da parte B.

No caso de grupos de tratamento não seguros ou inúteis (ou seja, doses que não induzem respostas IgG consideráveis) são identificados durante a análise interina, esses grupos de 10 tratamento serão descartados e não transportados para a parte ko A Parte B do estudo irá buscar a confirmação dose na população idosa. Por conseguinte, a parte B do estudo será realizada em cinco grupos de tratamento de20indivíduos idosos saudáveis por grupo. Cronograma de vacinação Dia 0, 7 e 21 será aplicado. Este desenho do estudo permitirá comparar as respostas de dose em adultos e idosos. O grupo da última faixa etária será a grande população-alvo para a vacina contra C. difficile, representando a população mais vulnerável para as duas indicações alvo no caminho do desenvolvimento de uma vacina contra C. difficile, ou seja, a prevenção da diarreia por C. difficilerecorrente e prevenção de infecção primária por C. difficileem uma abordagem de vacinação preventiva baseada na idade ou na idade de risco. No entanto, os idosos podem ser menos sensíveis à vacinação de jovens adultos; assim, a confirmação da dose na população-alvo de idosos a partir de um estágio inicial de desenvolvimento é necessária. Uma análise interina após todos os adultos da parte A foram vacinados permitirá uma queda não segura ou doses/formulações que não induzem respostas de IgG consideráveis em adultos, a fim de mitigar o risco de expor indivíduos no grupo de idosos à doses potencialmente inseguros ou inúteis (por exemplo, a dose mais baixa) e/ou formulações (por exemplo, formulação sem adjuvante) da vacina.

A vacina C-TAB.G5.1 é uma solução aquosa de C-TAB.G5.1 em20mM de L-histidina, 75 mM de NaCl, 5% de sacarose, 0,025% de Tween~80, pH 6,5 produzido por métodos convencionais.

15 SEQUÊNCIAS: Nome SE Sequências Q ID NOs: C- 1 ATGGTAACAGGAGTATTTAAAGGACCTAATGGATTTGAGT TAB.G5 ATTTTGCACCTGCTAATACTCACAATAATAACATAGAAGGTCAG (sequência GCTATAGTTTACCAGAACAAATTCTTAACTTTGAATGGCA.AAAA de ácido ATATTATTTTGATAATGACTCAAAAGCAGTTACTGGATGGCAAA nucleico) CCATTGATGGTAAAAAATATTACTTTAATCTTAACACTGCTGAA

GCAGCTACTGGATGGCAAACTATTGATGGTA.A.AAAATATTACTT TAATCTTAACACTGCTGAAGCAGCTACTGGATGGCAAACTATTG ATGGTAAAAAATATTACTTTAATACTAACACTTTCATAGCCTCA ACTGGTTATACAAGTATTAATGGTAAACATTTTTATTTTAATAC TGATGGTATTATGCAGATAGGAGTGTTTAAAGGACCTAATGGAT TTGAATACTTTGCACCTGCTAATACTCATAATAACAACATAGAA GGTCAAGCTATACTTTACCAAAATAAATTCTTAACTTTGAATGG TAAAAAATATTACTTTGGTAGTGACTCAAAAGCAGTTACCGGAT TGCGAACTATTGATGGTAA.A.AAATATTACTTTAATACTAACACT GCTGTTGCAGTTACTGGATGGCAAACTATTAATGGTAAAAAATA CTACTTTAATACTAACACTTCTATAGCTTCAACTGGTTATACAA TTATTAGTGGTAAACATTTTTATTTTAATACTGATGGTATTATG CAGATAGGAGTGTTTAAAGGACCTGATGGATTTGAATACTTTGC ACCTGCTAATACAGATGCTAACAATATAGAAGGTCAAGCTATAC GTTATCAAAATAGATTCCTATATTTACATGACAATATATATTAT TTTGGTAATAATTCAAAAGCAGCTACTGGTTGGGTAACTATTGA TGGTAATAGATATTACTTCGAGCCTAATACAGCTATGGGTGCGA ATGGTTATAAAACTATTGATAATAAAAATTTTTACTTTAGAAAT GGTTTACCTCAGATAGGAGTGTTTAAAGGGTCTAATGGATTTGA ATACTTTGCACCTGCTAATACGGATGCTAACAATATAGAAGGTC AAGCTATACGTTATCAAAATAGATTCCTACATTTACTTGGAAAA ATATATTACTTTGGTAATAATTCAAAAGCAGTTACTGGATGGCA AACTATTAATGGTAAAGTATATTACTTTATGCCTGATACTGCTA TGGCTGCAGCTGGTGGACTTTTCGAGATTGATGGTGTTATATAT TTCTTTGGTGTTGATGGAGTAAAAGCCCCTGGGATATATGGCAG ATCTATGCATAATTTGATAACTGGATTTGTGACTGTAGGCGATG ATAAATACTACTTTAATCCAATTAATGGTGGAGCTGCTTCAATT GGAGAGACAATAATTGATGACAAAAATTATTATTTCAACCAAAG TGGAGTGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTA AATATTTTGCCCCAGCTAATACACTTGATGAAAACCTAGAAGGA GAAGCAATTGATTTTACTGGAAAATTAATTATTGACGAAAATAT TTATTATTTTGATGATAATTATAGAGGAGCTGTAGAATGGAAAG AATTAGATGGTGAAATGCACTATTTTAGCCCAGAAACAGGTAAA GCTTTTAAAGGTCTAAATCAAATAGGTGATTATAAATACTATTT CAATTCTGATGGAGTTATGCAAAAAGGATTTGTTAGTATAAATG ATAATAAACACTATTTTGATGATTCTGGTGTTATGAAAGTAGGT TACACTGAAATAGATGGCAAGCATTTCTACTTTGCTGAAAACGG AGAAATGCAAATAGGAGTATTTAATACAGAAGATGGATTTAAAT ATTTTGCTCATCATAATGAAGATTTAGGAAATGAAGAAGGTGAA GAAATCTCATATTCTGGTATATTAAATTTCAATAATAAAATTTA CTATTTTGATGATTCATTTACAGCTGTAGTTGGATGGAAAGATT TAGAGGATGGTTCAAAGTATTATTTTGATGAAGATACAGCAGAA GCATATATAGGTTTGTCATTAATAAATGATGGTCAATATTATTT TAATGATGATGGAATTATGCAAGTTGGATTTGTCACTATAAATG ATAAAGTCTTCTACTTCTCTGACTCTGGAATTATAGAATCTGGA GTACAAAACATAGATGACAATTATTTCTATATAGATGATAATGG TATAGTTCAAATTGGTGTATTTGATACTTCAGATGGATATAA.AT ATTTTGCACCTGCTAATACTGTAAATGATAATATTTACGGACAA GCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTGGGGAAGATGTATA TTATTTTGGAGAAACATATACAATTGAGACTGGATGGATATATG ATATGGAAAATGAAAGTGATAAATATTATTTCAATCCAGAAACT AAAAAAGCATGCAAAGGTATTAATTTAATTGATGATATAAAATA TTATTTTGATGAGAAGGGCATAATGAGAACGGGTCTTATATCAT TTGAAA.ATAATAATTATTACTTTAATGAGAATGGTGAAATGCAA TTTGGTTATATAAATATAGAAGATAAGATGTTCTATTTTGGTGA AGATGGTGTCATGCAGATTGGAGTATTTAATACACCAGATGGAT TTAAATACTTTGCACATCA.AAATACTTTGGATGAGAATTTTGAG GGAGAATCAATAAACTATACTGGTTGGTTAGATTTAGATGAAAA GAGATATTATTTTACAGATGAATATATTGCAGCAACTGGTTCAG TTATTATTGATGGTGAGGAGTATTATTTTGATCCTGATACAGCT

CAATTAGTGATTAGTGAATAG C- 2 MVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLN

TAB GS GKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKK (sequência YYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFY de FNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLT aminoácido LNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTING

KKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFE YFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWV TIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSN GFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVT GWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGI YGRSMHNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYF NQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIID ENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYK YYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFA ENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNN KIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQ YYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYID DNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGE DVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDD IKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFY FGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDL

DEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE C- 3 CCATGGTTACAGGTGTTTTCAAAGGTCCGAACGGCTTTGA TAB.G5.1 ATATTTTGCACCGGCAAATACCCACA.ATAATAATATTGAAGGCC (sequência AGGCCATCGTGTATCAGAATAAATTTCTGACCCTGAACGGCAAA de ácido AAATACTATTTCGATAACGATAGCAAAGCAGTTACCGGTTGGCA nucleico) AACCATTGATGGCAAA.AAATATTACTTCAACCTGAATACCGCAG AAGCAGCAACCGGCTGGCAGACGATCGACGGTA 3 AAGTACTAT

TTTAACCTGAACACAGCCGAAGCCGCTACAGGCTGGCAGACAAT AGATGGGAAGAAGTATTATTTTAATACCAATACCTTTATTGCCA GCACCGGCTATACCAGCATTAATGGCAAACACTTCTATTTTAAC ACCGATGGTATTATGCAGATCGGTGTGTTTAAGGGCCCTAATGG TTTTGAGTACTTCGCTCCGGCTAATACCGATGCAAATAACATCG AAGGTCAGGCAATTCTGTACCAGAACAAATTTTTAACGCTGAAC GGTAAGAAATATTACTTTGGTAGCGATTCAAAAGCCGTTACCGG TCTGCGTACGATCGACGGCAAGAAA.TATTATTTCAATACAAACA CCGCAGTTGCCGTGACAGGTTGGCAGACGATAAATGGTAAGAAG TACTACTTCAACACCAATACCAGCATTGCAAGTACCGGTTATAC CATTATCAGCGGCAAACACTTTTACTTCAATACAGACGGCATTA TGCAGATTGGCGTTTTCAAAGGTCCGGATGGTTTCGAGTACTTT GCCCCTGCAAATACAGATGCAAACAATATTGAGGGACAGGCAAT TCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAACATCTATT ACTTCGGCAATAATTCAAAAGCAGCCACCGGTTGGGTTACAATT GATGGTAATCGTTATTACTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGC AAATGGTTATAAAACCATCGATAACAAAAATTTTTATTTCCGCA ACGGTCTGCCGCAGATTGGTGTTTTTAAGGGTAGCAATGGCTTC GAGTATTTTGCGCCAGCCAACACCGATGCCAACAACATTGAAGG CCAAGCGATTCGTTATCAAAACCGCTTTCTGCATCTGCTGGGCA AAATTTATTACTTTGGCAACAATAGCAAAGCGGTGACGGGCTGG CAAACCATTAACGGTAAAGTTTATTATTTCATGCCGGATACCGC TATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGCGTGATTT ATTTTTTTGGCGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGT CGTAGCATGCATAATCTGATTACCGGTTTTGTTACCGTGGGCGA CGATAAATACTACTTTAATCCGATTAATGGTGGTGCAGCAAGCA TTGGTGAAACCATTATCGATGACAAAAACTATTATTTTAACCAG AGCGGTGTTCTGCAGACAGGTGTTTTTAGCACCGAAGATGGCTT CAAATATTTTGCTCCTGCGAATACACTGGATGAAAATCTGGAAG GTGAAGCAATTGATTTTACCGGCAAACTGATCATCGACGAGAAC ATCTACTATTTTGATGATAATTATCGCGGTGCCGTGGAATGGAA AGAACTGGATGGTGAAATGCACTATTTTAGTCCGGAAACCGGTA AAGCCTTTAAAGGTCTGAATCAGATCGGCGATTACAAGTATTAC TTTAATTCAGATGGCGTGATGCAGAAAGGCTTTGTGAGCATTAA CGACAACAAACACTATTTTGACGACAGCGGTGTGATGAAAGTGG GTTATACCGAAATCGACGGGAAACATTTTTATTTTGCCGAAAAC GGCGAAATGCAGATTGGAGTATTTAATACCGAGGACGGCTTTAA ATACTTTGCCCATCATAATGAAGATCTGGGTAATGAAGAAGGCG AAGAAATTAGCTATAGCGGCATTCTGAATTTTAATAACAAGATC TATTATTTCGATGATAGCTTCACCGCAGTTGTTGGTTGGAAAGA TCTGGAAGATGGCAGCAAATATTATTTTGATGAAGATACCGCAG AGGCCTATATTGGTCTGAGCCTGATTAATGATGGCCAGTATTAT TTCAACGATGATGGTATCATGCAGGTTGGTTTTGTGACCATCAA CGATAAAGTGTTCTATTTCAGCGATAGCGGCATTATTGAAAGCG GTGTTCAGAACATCGACGATAACTATTTCTACATCGATGATAAC GGTATTGTTCAGATTGGCGTGTTTGATACCTCCGATGGTTATAA ATATTTCGCACCAGCCAATACCGTGAACGATAATATTTATGGTC AGGCAGTTGAATATTCAGGTCTGGTTCGTGTTGGCGAAGATGTT TATTATTTTGGCGAAACCTATACCATTGAAACCGGCTGGATCTA TGATATGGAAAACGAGAGCGACAAGTACTATTTCAATCCGGAAA CGAA.A,AAAGCCTGCAAAGGCATTAATCTGATCGACGATATTAAG TACTACTTTGACGAAAAAGGCATTATGCGTACCGGTCTGATTAG CTTTGAGAACAA.CAACTATTACTTCAATGAGAACGGTGAGATGC AGTTTGGCTATATCAACATCGAGGACAP.AATGTTTTATTTTGGT GAGGACGGTGTGATGCAGATAGGGGTTTTTAATACACCGGATGG GTTTAAGTATTTTGCACATCAGAACACCCTGGATGAAAACTTTG AAGGCGAAAGCATTAATTATACCGGTTGGCTGGATCTGGATGAG AAACGTTATTATTTCACCGACGAATACATTGCAGCAACCGGTAG CGTTATTATTGATGGTGAGGAATATTACTTCGATCCGGATACAG

CACAGCTGGTTATTAGCGAATAACTCGAG C- 4 VTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNG TAB.G5.1 KKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKY (sequência YFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYF de NTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTL aminoácido NGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGK

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EIDELNTYIEESLNKITQNSGNDVRNFEEFKNGESFNLYEQELV ERWNLAAASDILRISALKEIGGMYLDVDMLPGIQPDLFESIEKP SSVTVDFWEMTKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVQSSFES VLASKSDKSEIFSSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKD SYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISEDNDFNTTTNTFIDSIM AEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQD LLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDD ARAKAQFEEYKRNYFEGSLGEDDNLDFSQNIVVDKEYLLEKISS LARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAKTPYDSVLFQKNI EDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKD EFNTDIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNM FSYSINVEETYPGKLLLKVKDKISELMPSISQDSIIVSANQYEV RINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISFNPKENKIT VKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNI DTQIVEERIEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQN ELEDSHFISFEDISETDEGFSIRFINKETGESIFVETEKTIFSE YANHITEEISKIKGTIFDTVNGKLVKKVNLDTTHEVNTLNAAFF IQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKW ELVSTALDETIDLLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETS DPLLRQEIEAKIGIMAVNLTTATTAIITSSLGIASGFSILLVPL AGI SAGIPSLVNNELVLRDKATKVVDYFKHVSLVETEGVFTLLD DKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDI DHFFSAPS ITYREPHLS IYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNR VFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEGEFYWRYFAFIAD ALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSF YGSGGTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNWRDVTIESD KIKKGDLIEGILSTLSIEENKIILNSHEINFSGEVNGSNGFVSL TFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNSNHIQQKID YIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDVV LISKVYMDDSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNVNILTGYYLKDDI KISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDESGVAEILKFMNRKGNTNTSDS LMSFLESMNIKS IFVNFLQSNIKFILDANFI ISGTTS IGQFEFI CDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGD ISSTVINFSQKYLYGIDSCVNKVVISPNIYTDEINITPVYETNN TYPEVIVLDANYINEKINVNINDLSIRYVWSNDGNDFILMSTSE ENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFT PSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYY FKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYF NQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIID ENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYK YYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFA ENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNN KIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQ YYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYID DNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGE DVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDD IKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFY FGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDL

DEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE Inici 9 caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc ador direto Inici 10 CTCGAGttagccatatatcccaggggc ador reverso Inici 11 caccATGCATatgagtttagttaatagaaaacag ador direto Inici 12 ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc ador reverso

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TADCTB attttgcacctgctaatactcacaataataacatagaaggtcag

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TADCTB GKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKK (sequência YYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFY de FNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLT aminoácido LNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTING

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E C- 19 atggtaacaggagtatttaaaggacctaatggatttgagt TANCTS attttgcacctgctaatactcacaataataacatagaaggtcag gctatagtttaccagaacaaattcttaactttgaatggcaaaaa (sequência atattattttgataatgactcaaaagcagttactggatggcaaa de ácido ccattgatggtaaaaaatattactttaatcttaacactgctgaa nucleico) gcagctactggatggcaaactattgatggtaaaaaatattactt taatcttaacactgctgaagcagctactggatggcaaactattg atggtaaaaaatattactttaatactaacactttcatagcctca actggttatacaagtattaatggtaaacatttttattttaatac tgatggtattatgcagataggagtgtttaaaggacctaatggat ttgaatactttgcacctgctaatacggatgctaacaacatagaa ggtcaagctatactttaccaaaataaattcttaactttgaatgg taaaaaatattactttggtagtgactcaaaagcagttaccggac tgcgaactattgatggtaaaaaatattactttaatactaacact gctgttgcagttactggatggcaaactattaatggtaaaaaata ctactttaatactaacacttctatagcttcaactggttatacaa ttattagtggtaaacatttttattttaatactgatggtattatg cagataggagtgtttaaaggacctgatggatttgaatactttgc acctgctaatacagatgctaacaatatagaaggtcaagctatac gttatcaaaatagattcctatatttacatgacaatatatattat tttggtaataattcaaaagcggctactggttgggtaactattga tggtaatagatattacttcgagcctaatacagctatgggtgcga atggttataaaactattgataataaaaatttttactttagaaat ggtttacctcagataggagtgtttaaagggtctaatggatttga atactttgcacctgctaatacggatgctaacaatatagaaggtc aagctatacgttatcaaaatagattcctacatttacttggaaaa atatattactttggtaataattcaaaagcagttactggatggca aactattaatggtaaagtatattactttatgcctgatactgcta tggctgcagctggtggacttttcgagattgatggtgttatatat ttctttggtgttgatggagtaaaagcccctgggatatatggcAG ATCTATGCATaatttgataactggatttgtgactgtaggcgatg ataaatactactttaatccaattaatggtggagctgcttcaatt ggagagacaataattgatgacaaaaattattatttcaaccaaag tggagtgttacaaacaggtgtatttagtacagaagatggattta aatattttgccccagctaatacacttgatgaaaacctagaagga gaagcaattgattttactggaaaattaattattgacgaaaatat ttattattttgatgataattatagaggagctgtagaatggaaag aattagatggtgaaatgcactattttagcccagaaacaggtaaa gcttttaaaggtctaaatcaaataggtgattataaatactattt caattctgatggagttatgcaaaaaggatttgttagtataaatg ataataaacactattttgatgattctggtgttatgaaagtaggt tacactgaaatagatggcaagcatttctactttgctgaaaacgg agaaatgcaaataggagtatttaatacagaagatggatttaaat attttgctcatcataatgaagatttaggaaatgaagaaggtgaa gaaatctcatattctggtatattaaatttcaataataaaattta ctattttgatgattcatttacagctgtagttggatggaaagatt tagaggatggttcaaagtattattttgatgaagatacagcagaa gcatatataggtttgtcattaataaatgatggtcaatattattt taatgatgatggaattatgcaagttggatttgtcactataaatg ataaagtcttctacttctctgactctggaattatagaatctgga gtacaaaacatagatgacaattatttctatatagatgataatgg tatagttcaaattggtgtatttgatacttcagatggatataaat attttgcacctgctaatactgtaaatgataatatttacggacaa gcagttgaatatagtggtttagttagagttggggaagatgtata ttattttggagaaacatatacaattgagactggatggatatatg atatggaaaatgaaagtgataaatattatttcaatccagaaact aaaaaagcatgcaaaggtattaatttaattgatgatataaaata ttattttgatgagaagggcataatgagaacgggtcttatatcat ttgaaaataataattattactttaatgagaatggtgaaatgcaa tttggttatataaatatagaagataagatgttctattttggtga agatggtgtcatgcagattggagtatttaatacaccagatggat ttaaatactttgcacatcaaaatactttggatgagaattttgag ggagaatcaataaactatactggttggttagatttagatgaaaa gagatattattttacagatgaatatattgcagcaactggttcag ttattattgatggtgaggagtattattttgatcctgatacagct caattagtgattagtgaaCTCGAGggattaatatatattaatga ttcattatattattttaaaccaccagtaaataatttgataactg gatttgtgactgtaggcgatgataaatactactttaatccaatt aatggtggagctgcttcaattggagagacaataattgatgacaa aaattattatttcaaccaaagtggagtgttacaaacaggtgtat ttagtacagaagatggatttaaatattttgccccagctaataca cttgatgaaaacctagaaggagaagcaattgattttactggaaa attaattattgacgaaaatatttattattttgatgataattata gaggagctgtagaatggaaagaattagatggtgaaatgcactat tttagcccagaaacaggtaaagcttttaaaggtctaaatcaaat aggtgattataaatactatttcaattctgatggagttatgcaaa aaggatttgttagtataaatgataataaacactattttgatgat tctggtgttatgaaagtaggttacactgaaatagatggcaagca tttctactttgctgaaaacggagaaatgcaaataggagtattta atacagaagatggatttaaatattttgctcatcataatgaagat ttaggaaatgaagaaggtgaagaaatctcatattct C- 20 MVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLN TANCTB(seq GKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKK uência de YYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFY aminoácido FNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLT

LNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTING KKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFE YFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWV TIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSN GFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVT GWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGI YGRSMHNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYF NQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIID ENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYK YYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFA ENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNN KIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQ YYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYID DNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGE DVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDD IKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFY FGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDL DEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISELEGLIY INDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETII DDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDF TGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGL NQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEID

GKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYS Aspectos preferenciais: Polipeptideos preferidos e usos dos mesmos:

1. Um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente, pelo menos, 95%, mais preferencial 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2.

2. Um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos, 95%, mais preferencial 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 4.

15 3. O polipeptídeo isolado do aspecto 1 ou 2, em que o polipeptídeo é composto por 19 unidades de repetição derivadas a partir do domínio C-terminal da toxina A de Clostridium difficile e 23 unidades de repetição derivadas k a partir do domínio C-terminal da toxina B da Clostridium difficile.

4. O polipeptideo isolado do aspecto 1, em que o polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos conforme 5 estabelecido na SEQ ID NO:2.

5. O polipeptídeo isolado do aspecto 1, em que o polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:4.

6. Um polipeptídeo compreendendo uma sequência de 10 aminoácidos tendo pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencial 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 4.

15 7. 0 polipeptídeo do aspecto 6, em que um hamster vacinados com dito polipeptídeo isolado sobrevive à administração intragástrica de uma dose letal de esporos de C. difficile em todas as doses de esporos (102, 103e 104 )

8. O polipeptídeo de aspecto 6 ou 7, em que o 20 polipeptídeo é composto por 19 unidades de repetição derivadas a partir do domínio C-terminal da toxina A de Clostridium difficile.

9. 0 polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 6 a 8, em que o polipeptídeo compreende 23, 33 ou 47 unidades de repetição derivadas a partir do domínio C-terminal da toxina B da Clostridium difficile.

10. 0 polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 6 a 9, em que o polipeptídeo é selecionadodo grupo que consiste em 5 SEQ ID: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO:20e um polipeptídeo que é 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntico a qualquer uma das SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20.

11. O polipeptideo de qualquer um dos aspectos 6 a 10, 10 em que o polipeptídeo é isolado.

12. O polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 6 a 11 para utilização em medicina.

13. O polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para a prevenção e tratamento de CDAD.

15 14. O polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para prevenir CDAD em um indivíduo em risco de uma CDAD.

15. O polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para a prevenção da CDADem um indivíduo em risco de CDAD, em que dito indivíduo em risco de CDAD é: i) um indivíduo 20 com mais de 65 anos de idade ou um indivíduo abaixo de 2 anos de idade; ii) um indivíduo com AIDS; iii) um indivíduo tomando ou planejando tomar medicamentos imunossupressores; iv) um indivíduo com hospitalização planejada ou um indivíduo que está no hospital, v) um indivíduo em ou esperando para ir para uma unidade de cuidados intensivos; vi) um indivíduo que está passando ou está planejando fazer uma cirurgia gastrointestinal; vii) um indivíduo que está dentro ou planejando ir para uma assistência a longo prazo, como uma casa de enfermagem; viii) um indivíduo com comorbidades que exige uso de antibióticos frequente e/ou prolongado, ou ix) um indivíduo com CDAD recorrente.

16. A utilização do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para a fabricação de um medicamento para uso na medicina.

17. A utilização do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para a fabricação de um medicamento para a prevenção e tratamento de CDAD.

18. A utilização do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para a fabricação de um medicamento para prevenir CDADem um indivíduo em risco de CDAD.

19. A utilização do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos de 6 a 11 para a fabricação de um medicamento para prevenir CDADem um indivíduo em risco de CDAD, em que dito indivíduo em risco de CDAD é: i) um indivíduo acima 65 anos de idade ou um indivíduo abaixo de 2 anos de idade; ii) um indivíduo com AIDS; iii) um indivíduo tomando ou planejando tomar medicamentos imunossupressores; iv) um indivíduo com hospitalização planejada ou um indivíduo que está no hospital, v) um indivíduo em ou esperando para ir para uma unidade de terapia intensiva; vi) um indivíduo que está passando ou está planejando fazer uma cirurgia gastrointestinal; vii) um indivíduo que está dentro ou planejando ir para a cuidados de longa duração, como uma casa de enfermagem; viii) um indivíduo com co-morbidades que requerem o uso de antibióticos frequente e/ou prolongada, ou ix) um indivíduo com CDAD recorrente.

20. Um kit de diagnóstico para a deteção de uma infeção por C. difficileem um indivíduo, que compreende o polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11.

Ácidos nucleicos preferenciais: la.Um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para qualquer dos polipeptideos de qualquer um dos aspectos 1 a 11.

2a.O ácido nucleico de aspecto essencialmente consistindo de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11.

3a.O ácido nucleico do aspecto la ou 2a, compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:19.

4a.O ácido nucleico do aspecto la ou 2a, essencialmente constituído por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17 e SEQ ID

NO: 19.

Composições farmacêuticas preferenciais: 1c. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11 ou um ácido nucleico de qualquer um dos aspectos ia a 4a e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

2c. A composição farmacêutica do aspecto lc, em que dita composição induz anticorpos neutralizantes de ambas toxina A e B de C. difficile.

10 3c. A composição farmacêutica do aspecto lc ou aspecto 2c, em que dita composição induz resposta imune protetora em um paciente contra a toxina A e B de C. difficile.

4c. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos lc a 3c, que compreende ainda um adjuvante.

15 5c. A composição farmacêutica do aspecto 4c, em que o adjuvante compreende alum.

6c. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos lc a 5c, compreendendo ainda um antígeno ou umadroga adicional.

20 Anticorpos preferenciais: ld. Um anticorpo direcionado contra um polipeptïdeo de qualquer dos aspectos 1 a 11, mas que não reconhece qualquer uma ou ambas de toxina A (SEQ ID NO:6) e B (SEQ ID NO:8) de C. difficile.

Métodos preferenciais le. Um método para a produção do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 10, que compreende a introdução em uma célula hospedeira de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo, e isolar o polipeptídeo.

2e. O método do aspecto 1 e, em que a célula hospedeira é E. coil.

3e. Um método para tratar e/ou prevenirdoença associada a C. difficile (CDAD) em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo o polipeptídeo isolado de qualquer um dos aspectos 1 a 11 4e. Um método para induzir uma resposta imune específica contra ambas as toxinas A e B de C. difficiie em um indivíduo que compreende administrar o polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11 a um indivíduo ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos is a 6c Se. Um método para prevenir uma doença primária causada por infeção por C. difficiieem um indivíduo compreendendo a administração do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11 a um indivíduo ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos lc a 6c.

Ge. Um método para prevenir uma doença primária provocada por infeção por C. difficileem um indivíduo em risco de doença associada a C. difficile (CDAD), em que dito indivíduo em risco de CDAD é: i) um indivíduo com mais de 65 anos de idade ou um indivíduo abaixo de 2 anos de idade; ii) um indivíduo com AIDS; iii) um indivíduo tomando ou planejando tomar medicamentos imunossupressores; iv) um indivíduo com hospitalização planejada ou um indivíduo que está no hospital, v) um indivíduo em ou esperando para ir em unidade de terapia intensiva; vi) um indivíduo que está passando ou está planejando fazer uma cirurgia gastrointestinal; vii) um indivíduo que está dentro ou planejando ir para uma assistência a longo prazo, como uma casa de enfermagem; viii) um indivíduo com co-morbidades que requerem o uso de antibióticos frequente e/ou ou prolongado; ou ix) um indivíduo com CDAD recorrente; compreendendo a administração do polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11 adito indivíduo ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos lc a 6c. 7e. O método de qualquer um dos aspectos le a 6e, em que o polipeptídeo ou a composição farmacêutica é administradaao indivíduo por via intramuscular, intradérmica, subcutânea, oral, nasal ou retal, preferencialmente por via intramuscular.

8e. O método de qualquer um das aspectos le a 7e, em que o polipeptídeo ou a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo em pelo menos duas doses em um intervalo de tempo curto (quinzenal ou semanal).

9e. Um método de deteção de C. difficile em uma amostra biológica compreendendo contatar a amostra biológica com o polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 11 e detectar a ligação do polipeptídeo com a amostra biológica, em que a ligação do polipeptídeo é indicativa da presença do C.

difficile na amostra biológica.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencial 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme estabelecidaem SEQ ID NO:4.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um hamster vacinado com dito polipeptídeo isolado sobrevive a administração intragástrica de uma dose letal de esporos de C. difficile em todas as doses de esporos (102, 103 e 104).

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é composto por 19 unidades de repetição derivadas a partir do domínio C-terminal da toxina A de Clostridium difficile.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende 23, 33 ou 47 unidades de repetição derivadas do domínio C-terminal da toxina B de Clostridium difficile.

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID

NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO:20 e um polipeptídeo que é 95% idêntico a qualquer uma das SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO:20.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é isolado.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para utilização em medicina.

8. Uso de um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenção e tratamento de uma doença associada a C. difficile (CDAD).

9. Uso de um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenção de CDAD em um indivíduo em risco de uma CDAD.

10. Uso de um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenção de CDAD em um indivíduo em risco de uma CDAD, em que dito indivíduo em risco de CDAD é: i) um indivíduo com mais de 65 anos de idade ou um indivíduo abaixo de 2 anos de idade, ii) um indivíduo com AIDS, iii) um indivíduo tomando ou planejando tomar drogas imunossupressoras; iv) um indivíduo com hospitalização planejada ou um indivíduo que está no hospital; v) um indivíduo em ou esperando para ir para uma unidade de terapia intensiva; vi) um indivíduo que está passando ou está planejando passar por uma cirurgia gastrointestinal; vii) um indivíduo que está em ou planejando ir para cuidados de longa duração, tal como uma casa de enfermagem; viii) um indivíduo com comorbidades requerendo uso de antibiótico frequente e/ou prolongado, ou ix) um indivíduo com uma CDAD recorrente.

11. Kit de diagnóstico para detectar uma infeção por C. difficile em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

12. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos polipeptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

13. Método para produzir o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma célula hospedeira um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem expressão do polipeptídeo, e isolar o polipeptídeo.

14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 12 e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Anticorpo direcionado contra um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que não reconhece toxina A de C.

difficile (SEQ ID NO:6) ou a toxina B de C. difficile (SEQ ID NO:8).

16. Anticorpo caracterizado pelo fato de ter a habilidade de se ligar especificamente a um polipeptídeo contrário a um polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.