ES2631032T5 - Polipéptido aislado de las proteínas toxina A y toxina B de C. Difficile y sus usos - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido aislado de las proteínas toxina A y toxina B de C. Difficile y sus usos

Campo de la invención

En la presente memoria se describe un polipéptido aislado que contiene los dominios de unión al receptor de la toxina A y la toxina B de Clostridium difficile y su uso como vacuna. Este polipéptido aislado proporciona inmunidad antitoxina contra ambas toxinas.

Antecedentes de la invención

Clostridium difficile es la principal causa de diarrea intrahospitalaria asociada a antibióticos y se ha convertido en un problema sanitario considerable en hospitales, residencias de ancianos y otros centros de asistencia sanitaria. El costo para los hospitales se ha estimado en 2 mil millones de dólares en Europa y 3,2 mil millones de dólares en Estados Unidos.

El agente causal es una bacteria gram positiva anaerobia, formadora de esporas, que se encuentra comúnmente en el ambiente, pero que también está presente en el tubo intestinal del 2 al 3 % de la población adulta sana. La enfermedad asociada a C. difficile (EACD) se induce por medio de la alteración de la flora normal del colon, generalmente como resultado de la administración de antibióticos. Tras la exposición a las esporas de C. difficile en el ambiente, el organismo puede colonizar la mucosa intestinal, donde la producción de toxinas que causan la enfermedad puede resultar en una EACD. La enfermedad puede presentarse como una diarrea leve, sin complicaciones, a una colitis pseudomembranosa y megacolon tóxico graves.

La EACD se ha vuelto cada vez más problemática en entornos de asistencia sanitaria. Un estudio reciente informó que el 31 % de los pacientes hospitalizados que reciben antibióticos es colonizado por C. difficile y el 56 % de dichos pacientes colonizados desarrolla posteriormente una EACD. En general, C. difficile es responsable de 10 a 25 % de todas las diarreas asociadas a antibióticos, 50 a 75 % de las colitis relacionadas con antibióticos y 90 a 100% de las colitis pseudomembranosas relacionadas con antibióticos. El tratamiento de la EACD implica suspender el antibiótico causal y posteriormente tratar con metronidazol o vancomicina. La recurrencia tras la suspensión del tratamiento con el antibiótico se produce en aproximadamente 20 % de los pacientes, a menudo como resultado de la recolonización por C. difficile.

En 2003, un brote de C. difficile en Quebec, Canadá indicó la aparición de una cepa más virulenta de C. difficile conocida como North American Phenotype 1/027 (NAP1). NAP1 se ha asociado con una mayor virulencia, respuestas deficientes y tasas de morbilidad y mortalidad más altas en comparación con las cepas anteriores. La aparición de esta cepa se suma a los problemas ya encontrados para intentar detener la incidencia de la EACD.

La fidaxomicina (Dificid©) para la prevención de la enfermedad recurrente es el primero de una nueva clase de fármacos antibióticos macrocíclicos de espectro reducido (Revill, P.; Serradell, N.; Bolos, J. (2006). "Tiacumicin B: macrolide antibiotic treatment of C. difficile-associated diarrhea". Drugs of the Future 31 (6): 494-497). Es un producto de fermentación obtenido del actinomiceto Dactylosporangium aurantiacum subespecie hamdenesis. La fidaxomicina es no sistémica, es decir, que se absorbe mínimamente en el torrente sanguíneo, es bactericida y ha exhibido una erradicación selectiva de Clostridium difficile patógena con alteración mínima de las múltiples especies de bacterias que conforman la flora intestinal sana, normal. Mantener condiciones fisiológicas normales en el colon puede reducir la probabilidad de recurrencia de la infección por Clostridium difficile (Johnson, Stuart (2009-06). "Recurrent Clostridium difficile infection: a review of risk factors, treatments, and outcomes". Journal of Infection 58 (6): 403-410). Aunque se cree que la introducción de esta nueva clase de fármaco antibiótico mejorará el tratamiento de EACD, existe todavía la necesidad médica de un fármaco preventivo, en especial, para pacientes de alto riesgo tales como ancianos y pacientes inmunodeprimidos.

La EACD es el resultado de las acciones de dos exotoxinas producidas por C. difficile, la toxina A y la toxina B (también denominadas CTA y CTB, respectivamente). Ambas toxinas son proteínas secretadas de alto peso molecular (~300 kDa) que poseen múltiples dominios funcionales (Voth DE y Ballard JD, Clinical Microbiology Reviews 18:247-263 (2005)). El dominio del extremo N de ambas toxinas contiene actividad de ADP-glucosiltransferasa que modifica las GTPases similares a Rho. Esta modificación provoca una pérdida de polimerización de actina y cambios citoesqueléticos que resultan en la alteración de las uniones estrechas epiteliales del colon. Esto conduce a una exudación excesiva de fluido hacia el colon y a la diarrea resultante. El dominio central contiene un dominio hidrófobo y se prevé que participe en el transporte a través de la membrana. El dominio en el extremo C de ambas toxinas contiene múltiples regiones homólogas denominadas unidades repetitivas (UR) que participan en la unión de la toxina a células objetivo (Ho et al, PNAS 102:18373-18378 (2005)). Las unidades repetitivas se clasifican en cortas (21-30 aminoácidos) o largas (~50 aminoácidos). Las unidades repetitivas se combinan para formar aglomeraciones, donde cada uno contiene generalmente una unidad repetitiva larga y de 3 a 5 cortas. La toxina A de longitud completa posee 39 unidades repetitivas (URA) organizadas en 8 aglomeraciones (Dove et al. Infect. Immun. 58:480-488 (1990), mientras que la toxina B de longitud completa contiene 24 unidades repetitivas (URB) organizadas en 5 aglomeraciones (Barroso et al, Nucleic Acids Res. 18:4004 (1990); Eichel-Streiber et al, Gene 96:107-113 (1992)).

Diversos estudios, con modelos animales y en clínica, han indicado que un anticuerpo antitoxina participa en la protección contra la enfermedad asociada a C. difficile. Hámsteres inmunizados con toxina A y toxina B inactivada con formalina generaron niveles elevados de anticuerpo antitoxina y fueron protegidos contra una exposición letal a bacterias C. difficile (Giannasca PJ y Warny M, Vaccine 22:848-856 (2004)). Además, la transferencia pasiva de anticuerpo antitoxina de ratón protegió a los hámsteres de un modo dependiente de la dosis. Kyne L et al. (The Lancet 357:189-193 (2001)) informaron que el desarrollo de una respuesta de anticuerpo antitoxina A durante un episodio inicial de CDAD se correlacionó con la protección contra la recurrencia de la enfermedad.

Los determinantes reconocidos por los anticuerpos antitoxina protectores se localizaron en el dominio del extremo C que contenía las unidades repetitivas que funcionan como el dominio de unión al receptor. Inicialmente, Lyerly et al. (Current Microbiology 21:29-32 (1990)) revelaron que el dominio del extremo C de la toxina A que contiene 33 unidades repetitivas es capaz de inducir la producción de anticuerpo antitoxina neutralizante y puede proteger contra la infección por C. difficile. En este estudio, los hámsteres recibieron múltiples inyecciones subcutáneas con el polipéptido recombinante purificado antes de la exposición a las bacterias, sin embargo, solamente se logró una protección parcial. Otro estudio (Ryan et al., Infect. Immun. 65:2941-49 (1997)) exhibió que el polipéptido aislado del extremo C de CTA que contiene 720 residuos de aminoácidos y la señal de secreción de hemolisina A de E. coli (expresada en Vibrio cholerae) indujeron inmunidad protectora sistémica y en la mucosa contra una dosis pequeña de CTA en el modelo de EACD en conejo.

También se informó que la respuesta de anticuerpo contra el dominio del extremo C de ambas toxinas A y B fue necesario para lograr una protección completa (Kink y Williams, Infect. Immun. 66:2018-25 (1998), patente estadounidense N. ° 5.736.139, 1998)). Este estudio reveló que el dominio del extremo C de cada toxina era el más eficaz para generar anticuerpos neutralizantes de toxinas. Demostró la eficacia de los anticuerpos aviarios administrados por vía oral (antitoxina) generados contra el dominio del extremo C de CTA y CTB en el modelo letal en hámster. Estos resultados también indican que la antitoxina puede ser eficaz para el tratamiento y la atención del paciente con EACD en humanos. En otro estudio, se informó que los anticuerpos monoclonales antitoxina A y B humanos confieren protección contra la mortalidad inducida por C. difficile en hámsteres (Babcock et al., Infect. Immun.

74:6339-6347 (2006)). La protección solo se observó en anticuerpos dirigidos directamente contra el dominio de unión al receptor de cualquiera de las dos toxinas y se observó una protección potenciada tras el tratamiento con anticuerpos antitoxina para ambas A y B.

Por otro lado, Ward et al. (Infect. Immun. 67: 5124-32 (1999)) consideraron 14 unidades repetitivas de la toxina A de C. difficile (14 CTA) para el estudio de la actividad adyuvante. Se clonaron las unidades repetitivas y se expresaron con una etiqueta de polihistidina en el extremo N (14 CTA-HIS) o fusionadas al dominio de unión no tóxico de la toxina tetánica (14 CTA-TETC). Ambas proteínas de fusión administradas por vía intranasal generaron anticuerpos antitoxina A en suero, pero no hubo respuesta en la superficie de las mucosas en ratones. Se observaron respuestas antitoxina A sistémicas y en las mucosas tras la coadministración con la toxina termolábil (TL) de E. coli o su forma mutada LTR72. En función de estos datos, Ward et al. sugirieron el uso de la fusión 14 CTA-TETC no tóxica como adyuvante mucosal para la vacuna humana dirigida contra patógenos clostridiales.

Los estudios bioquímicos recientes sobre los dominios de unidades repetitivas de las toxinas de C. difficile han examinado los requisitos de secuencia mínimos para la formación de una estructura terciaria estable (Demarest SJ et al., J. Mol. Bio.

346:1197-1206 (2005)). Se halló un péptido de 11 unidades repetitivas derivado de la toxina A que presentaba una estructura terciaria correcta, pero 6 y 7 unidades repetitivas de las toxinas A y B no la presentaban. Se halló que el segmento de 11 unidades repetitivas correctamente plegado conservaba la propiedad de unión al receptor. Un segundo estudio examinó las propiedades funcionales de los fragmentos de toxina A que contenían 6, 11 o 15 unidades repetitivas (Dingle T, Glycobiology 18:698-706 (2008)). Solo las 11 y 15 unidades repetitivas fueron capaces de inhibir de forma competitiva la capacidad de neutralización de toxina del anticuerpo antitoxina A. Aunque se halló que los 3 fragmentos presentaban actividad hemoaglutinante, los fragmentos más largos exhibieron actividad hemoaglutinante más elevada que los fragmentos más cortos. Los datos indican que la estructura de dominio de unión al receptor y la inmunogenicidad de la toxina se conservan en los fragmentos de dominio que contienen más de 11 a 14 repeticiones.

Thomas et al. (WO97/02836, patente estadounidense N. ° 5.919.463 (1999)) también describieron la toxina A y toxina B de C. difficile y determinados fragmentos de las mismas (p. ej., el dominio del extremo C que contiene algunas o todas las unidades repetitivas) como adyuvantes mucosales. Mostraron que la administración intranasal de CTA o CTB potenció de forma significativa la respuesta inmunitaria en las mucosas a un antígeno heterólogo tal como ureasa de Helicobacter pylori, ovalbúmina o hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés) en múltiples compartimentos de ratón y se asoció con la protección contra la exposición a Helicobacter. Además, se evaluó la actividad adyuvante de una proteína de fusión de toxina A: se fusionaron 794 residuos de aminoácidos del extremo C de CTA que comprendían URA (unidades repetitivas de toxina A) con glutatión-S-transferasa (GST) y el polipéptido GST-URA resultante se expresó en E. coli. Este estudio demostró una mejora significativa en la respuesta inmunitaria mediante GST-URA a antígenos coadministrados en suero y secreciones mucosales.

Todos estos estudios sugieren el uso potencial de una proteína recombinante no tóxica que comprende la toxina A o la toxina B de C. difficile, o fragmentos de las mismas, o sus combinaciones para producir una vacuna activa contra EACD. Actualmente, no existe en el mercado una vacuna contra C. difficile, aunque se ha evaluado una vacuna candidata que consiste en toxinas A y B enteras destoxificadas con formalina en estudios en fase I y IIa con humanos. Se ha informado que la inmunización por vía parenteral con esta vacuna induce respuestas de IgG antitoxina y anticuerpo neutralizante de toxina (Kotloff KL et al., Infect. Immun. 69:988-995 (2001); Aboudola S et al., Infect. Immun. 71:1608-1610(2003)).

La bibliografía además indica que la construcción de una proteína de fusión recombinante que contiene dominios de unión al receptor de las toxinas A y B de C. difficile, ya sean completas o con fragmentos de las mismas, sería un estrategia eficaz y comercialmente viable para el desarrollo de una vacuna. Varfolomeeva et al. intentaron aplicar esta estrategia como una proteína de fusión de dos partes con un fragmento de 700 pares de bases de la toxina A y un fragmento de 1.300 pares de bases de la toxina B (Mol. Genetics, Microb. and Virol. 3:6-10 (2003)). Esta estrategia también ha sido descrita por Belyi y Varfolomeeva (FEMS Letters 225:325-9 (2003)) quienes demostraron la construcción de la proteína de fusión recombinante que consistía en tres partes: dos dominios de extremo C compuestos por unidades repetitivas de la toxina A y la toxina B de C. difficile y a continuación el fragmento de la enterotoxina Cpe de Clostridium perfringens. La proteína de fusión se expresó en E. coli pero el producto se acumuló en cuerpos de inclusión y no era estable. Además, se consideró bajo el rendimiento de producto puro logrado en este estudio (50 pg por 100 ml de cultivo).

Wilkins et al. (WO 00/61762, patente estadounidense N.° 6.733.760 (2004)) también describieron el uso de unidades repetitivas de la toxina A y B de C. difficile recombinantes (URA recombinante y URB recombinante) y sus conjugados de polisacáridos para la preparación de una vacuna contra EACD. La proteína URA recombinante resultante comprendía 867 residuos de aminoácidos mientras que la proteína URB recombinante contenía 622 aminoácidos de longitud. A diferencia de los estudios mencionados anteriormente, este trabajo demostró una expresión de nivel elevado de las proteínas solubles URA y URB recombinantes en E. coli. Los ratones vacunados con u Ra recombinante y con URA recombinante conjugada con polisacárido exhibieron un nivel elevado de anticuerpos antitoxina A neutralizantes en ambos casos y exhibieron una protección elevada contra la exposición letal a la toxina A de C. difficile. Adicionalmente, Wilkins et al. sugirieron el uso de una proteína de fusión recombinante que consiste en URA y URB para la preparación de una vacuna.

Existe interés en el desarrollo de una vacuna contra EACD. Una proteína de fusión recombinante que consiste en URA y URB puede ser potencialmente útil como vacuna.

Telfer et al. (WO 2010/017383) propusieron el uso de microorganismos atenuados, tales como Salmonella; que expresan en su superficie un polipéptido inmunógeno que comprende unidades repetitivas del extremo C de la toxina A y/o unidades repetitivas del extremo C de la toxina B de C. difficile para la vacunación contra EACD por medio de administración oral a un sujeto humano. El polipéptido recombinante incluía al menos 20 repeticiones de la toxina A y/o 15 repeticiones de la toxina B y además incluía una señal de secreción, p. ej., la etiqueta ClyA de S. typhimurium.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona una composición inmunógena o para vacuna, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En la presente memoria se describen nuevas herramientas y métodos para el diseño, producción y uso de la toxina A y la toxina B de C. difficile. En la presente memoria se describe un polipéptido aislado C-TAB que comprende la SEQ ID N. °:2 (C-TAB.G5) o un derivado de la misma, SEQ ID N. °: 4 (C-tAb .G5.1). C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprende 19 unidades repetitivas del dominio del extremo C de la toxina A fusionadas con 23 unidades repetitivas del dominio del extremo C de la toxina B. En la presente memoria se describen composiciones y formulaciones que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Las composiciones o formulaciones pueden contener el polipéptido aislado, un antígeno adicional, un adyuvante y/o un excipiente. Alternativamente, las composiciones o formulaciones pueden consistir esencialmente en el polipéptido aislado sin un adyuvante ni otros ingredientes activos (pero opcionalmente comprenden un excipiente tal como un vehículo, tampón y/o estabilizante). Además, las composiciones o formulaciones de la invención se pueden administrar simultáneamente con otros fármacos tales como un antibiótico en particular, p. ej., en sujetos con EACD recurrente o en sujetos que requieren un uso de antibiótico frecuente y/o prolongado.

En la presente memoria se describe una vacuna que comprende el polipéptido aislado descrito en la presente. La vacuna puede comprender además un adyuvante, tal como alumbre, un adyuvante derivado de una exotoxina ADP-ribosilante u otros. La vacuna se puede administrar en un régimen de una dosis, un régimen de dos dosis (administradas, p. ej., dentro de 3 a 20 días, p. ej., de 10 a 15 días después de la primera dosis), un régimen de tres dosis (administradas, p. ej., alrededor de 7 días y alrededor de 21 días después de la primera dosis) o más extenso que un régimen de tres dosis, preferiblemente en un régimen de dos a tres dosis, en el que la dosis comprende una cantidad de 20 pg a 200 pg del polipéptido de la invención.

En la presente memoria se describe un método para prevenir, tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad, tal como EACD, mediante la administración del polipéptido aislado descrito en la presente memoria a un sujeto que lo necesita. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede administrarse al sujeto por vía intramuscular o por otras vías de administración.

En la presente memoria se describe un método para prevenir una enfermedad, tal como EACD, mediante la administración del polipéptido aislado descrito en la presente memoria o una composición que comprende dicho polipéptido a un sujeto en riesgo de padecer una EACD, tal como, p. ej., un sujeto con el siguiente perfil: i) un sujeto con un sistema inmunitario más débil, tal como, p. ej., un sujeto anciano (p. ej., un sujeto con más de 65 años de edad) o un sujeto con menos de 2 años de edad; ii) un sujeto inmunodeprimido, tal como, p. ej., un sujeto con SIDA; iii) un sujeto que toma o planea tomar fármacos inmunosupresores; iv) un sujeto con una hospitalización planeada o un sujeto que está en un hospital; v) un sujeto que está o se espera que vaya a una unidad de cuidados intensivos (UCI); vi) un sujeto que se está sometiendo o planea someterse a cirugía gastrointestinal; vii) un sujeto que está o planea ir a un centro de asistencia para una estancia prologada, tal como, una residencia de ancianos; viii) un sujeto con comorbilidades que requiere un uso frecuente y/o prolongado de antibióticos; ix) un sujeto que es un sujeto con dos o más de los perfiles mencionados anteriormente, tal como, p. ej., un sujeto anciano que planea someterse a una cirugía gastrointestinal; x) un sujeto con enfermedad inflamatoria intestinal; y/o xi) un sujeto con EACD recurrente, tal como, p. ej., un sujeto que ha sufrido uno o más episodios de EACD.

En la presente memoria se describen métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se puede producir a partir de un ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 utilizando un sistema de expresión bacteriano, tal como un sistema de expresión en E. coli.

En la presente memoria se describe el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en el que las 19 unidades repetitivas de la toxina A están conectadas a las 23 unidades repetitivas de la toxina B a través de un enlazador que consiste en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos. A modo de ejemplo, el enlazador de la presente invención puede comprender la secuencia RSMH (Arg-Ser-Met-His) (aminoácidos 439-442 de la SEQ ID N. °:2 o la SEQ ID N. °:4).

En la presente memoria se describe una variante del polipéptido aislado que comprende al menos una mutación (por ejemplo, inserción, sustitución o supresión), por ejemplo, en URA y/o URB. La secuencia de la variante puede tener 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con respecto a la SEQ ID N. °:2.

En la presente memoria se describen métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 o variantes del mismo a través de ingeniería de ADN recombinante, fermentación bacteriana y purificación proteica. En la presente memoria se describen métodos para construir el ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En la presente memoria se describen métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 utilizando un sistema de expresión bacteriano, tal como un sistema de expresión en E. coli.

En la presente memoria se describen métodos para prevenir y tratar un EACD en sujetos que lo necesitan, tales como humanos. En este método el C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se administra a un sujeto ya sea solo o coadministrado con uno o más adyuvantes tales como alumbre u otros. Los sujetos pueden ser individuos sanos que están en riesgo de exposición a C. difficile, sujetos humanos que han sido tratados y se recuperaron de una infección por C. difficile y que están en riesgo de volver a infectarse con C. difficile, o sujetos humanos que están actualmente infectados con C. difficile y cuya condición se puede mejorar mediante la inducción de un anticuerpo neutralizante de la toxina de C. difficile.

En la presente memoria se describe una composición inmunógena que comprende C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La composición inmunógena puede incluir además un adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria específico para el antígeno y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otros componentes en una formulación adecuada para aplicación en un sujeto que la necesita. La composición inmunógena puede administrarse por medio de administración intramuscular (IM), administración intradérmica (ID), administración subcutánea (SC), administración intraperitoneal (IP), administración oral, administración, nasal, administración bucal o administración rectal.

En la presente memoria se describe una composición inmunógena que desencadena la producción de anticuerpos que se unen a las toxinas de C. difficile naturales y neutralizan su actividad citotóxica, proporcionado así una protección activa y/o tratamiento a largo plazo contra la enfermedad asociada a C.difficile (EACD).

En la presente memoria se describen composiciones inmunógenas útiles para la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada a C.difficile en sujetos que lo necesitan.

En la presente memoria se describen ácidos nucleicos y fragmentos o variantes de los mismos que codifican para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En la presente memoria se describen vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico que codifica para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En la presente memoria se describen anticuerpos y fragmentos de los mismos, tales como anticuerpos neutralizantes, humanizados, monoclonales, quiméricos y policlonales específicos para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden reconocer la toxina A y/o la toxina B.

En la presente memoria se describe una vacuna que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N. °:2 o SEQ ID N. °:4.

En la presente memoria se describen kits de diagnóstico que comprenden los ácidos nucleicos, polipéptidos y/o anticuerpos descritos en la presente memoria.

Otras realizaciones y ventajas de la invención se presentan en parte en la descripción a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 A muestra el ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 (SEQ ID N. °: 1). La Figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido aislado C-TAB.G5 (SEQ ID N. °: 2). El enlazador de aminoácidos entre el dominio de toxina A y el dominio de toxina B está subrayado.

La Figura 2A muestra el ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5.1 (SEQ ID N. °: 3). La Figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido aislado C-TAB.G5.1 (SEQ ID N. °: 4). El enlazador de aminoácidos entre el dominio de toxina A y el dominio de toxina B está subrayado.

La Figura 3 muestra la mejora de la producción de anticuerpos en ratones vacunados con C-TAB.G5 con dosis en aumento de C-TAB.G5 y coadministración con el adyuvante alumbre. Los ratones recibieron dos vacunaciones por medio de inyección IM. Los títulos de IgG para los anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la primera y segunda inyección.

La Figura 4 muestra una representación gráfica de la inducción de IgG anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B en ratones que recibieron dosis en aumento de C-TAB.G5 con y sin alumbre por medio de dos inyecciones IM.

La Figura 5 muestra los títulos de anticuerpo en un intervalo de logaritmo de dosis en ratones inmunizados con C-TAB.G5 en presencia o ausencia de alumbre. Los títulos de IgG se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inmunización. Los datos demuestran que el alumbre aumente de forma significativa la producción de anticuerpos en ratones vacunados.

La Figura 6 muestra el efecto protector en ratones vacunados con C-TAB.G5 (con y sin alumbre) y después expuestos a una dosis letal de toxina A o toxina B. Los ratones que recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas se expusieron (IP) tres semanas después. Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y toxina B (ANT) se evaluaron dos semanas después de la segunda inyección y se determinó el porcentaje de animales que sobrevivieron a la exposición letal. Las dosis incrementadas de C-TAB.G5 confirieron una producción mayor de ANT, así como también una protección mayor contra la exposición letal. La presencia de alumbre aumentó adicionalmente la producción de ANT y también confirió una supervivencia más elevada con dosis más bajas.

La Figura 7 muestra una comparación de la respuesta de anticuerpo y la eficacia de la protección de C-TAB.G5 en ratones vacunados jóvenes (6 a 7 semanas) y adultos (18 meses). Los ratones que recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas se expusieron (IP) tres semanas después. Se evaluaron los títulos de IgG determinados por ELISA para los anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B, la producción de ANT así como también la supervivencia general. Los ratones jóvenes demostraron una respuesta de anticuerpo más elevada incluso sin alumbre y ambos grupos exhibieron una supervivencia mejorada cuando se vacunaron en presencia de alumbre.

La Figura 8 muestra una comparación de la cinética del desarrollo de anticuerpos IgG anti-C-TAB en ratones vacunados jóvenes y adultos. Los ratones jóvenes demostraron tasas mayores y una producción de IgG más temprana y ambos grupos exhibieron respuestas mejoradas cuando se vacunaron en presencia de alumbre.

La Figura 9 muestra una comparación entre la producción de anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 o mezcla de anatoxina A y B (1:1). Los ratones recibieron dos vacunaciones por medio de inyección IM. Los títulos de IgG para los anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inyección. La inmunización con anatoxina induces anticuerpos para la porción del extremo N de la molécula de toxina mientras que la inmunización con C-TAB induce anticuerpos para la porción del extremo C de la molécula de toxina.

La Figura 10 muestra una comparación entre la producción de ANT y la protección contra la exposición a la toxina A o B en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 o mezcla de anatoxina A y B. Los ratones que recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas se expusieron (IP) tres semanas después a una dosis letal de toxina A o toxina B.

La Figura 11 muestra la producción de IgG anti-C-TAB (A), antitoxina A (B) y antitoxina B (C) en hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 con y sin alumbre. Los hámsteres recibieron tres vacunaciones por medio de inyección IM el día 0 y el día 14. Los títulos de IgG para los anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B se evaluaron ^{mediante e}LⁱSA ^{a los 14, 28 y 35 días.}

La Figura 12 muestra una representación gráfica del desarrollo de anticuerpo IgG anti-C-TAB en hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 con o sin alumbre.

La Figura 13 muestra una comparación de ANT y la protección en hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 con o sin alumbre. Dos semanas después de la tercera vacunación, los hámsteres recibieron una dosis letal de toxina A o toxina B por medio de inyección iP.

La Figura 14 muestra la supervivencia de hámsteres vacunados con C-TAB.G5.1 tras la administración intragástrica de una dosis letal de esporas de C. difficile. Los datos de supervivencia se graficaron como curvas de Kaplan-Meier ajustadas a la supervivencia y se llevó a cabo un análisis estadístico utilizando un análisis logarítmico-ordinal. En todas las dosis de esporas (102, 103 y 104), se observó un 100 % de supervivencia de hámsteres en el grupo vacunado y las supervivencia mejoró de forma significativa cuando se comparó con el grupo con placebo.

La Figura 15 muestra la producción de anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B en monos cangrejeros inmunizados con C-TAB.G5.1 en presencia o ausencia de alumbre. Dos grupos de monos (tres por grupos, 4 a 6 años) recibieron 200 pg de C-TAB.G5.1 con o sin 250 pg de alumbre. Se tomaron muestras de sangre en los días 0, 14, 28 y 42 del estudio. Se utilizó el método ELISA para evaluar los títulos de IgG anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B.

La Figura 16 muestra una comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1 administrados en un intervalo de dosis de 1 pg a 30 pg en PBS o tampón de histidina. Los ratones recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas. Los títulos de IgG para los anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inyección. Los tres títulos de anticuerpo no fueron significativamente diferentes (análisis de prueba de la T) entre C-TAB.G5 administrado en PBS o tampón de histidina y C-TAB.G5.1 administrado en tampón de histidina.

La Figura 17 muestra una comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5, C-TABNCTB y C-TADCTB en ratones. Los ratones recibieron dos vacunaciones de cada proteína recombinante en un intervalo de dos semanas por medio de inyección IM. Todas las inmunizaciones se llevaron a cabo en ausencia del adyuvante alumbre. Los títulos de IgG para los anticuerpos anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inyección. Las tres proteínas de fusión demostraron inmunogenicidad elevada.

La Figura 18 muestra la protección contra la exposición a toxina B natural en ratones. Los ratones se inmunizaron tal como se indicó para la Figura 17 y tres semanas después se expusieron mediante inyección IP a una dosis letal de toxina B natural.

La Figura 19 muestra una comparación de ANT y la protección en hámsteres vacunados con C-TAB.G5.1 o C-TADCTB en ausencia o presencia de alumbre. Dos semanas después de la tercera vacunación, los hámsteres recibieron una dosis letal de toxina A o toxina B por medio de inyección IP.

La Figura 20 muestra la producción de ANT y la protección contra la exposición a la toxina A o a la toxina B en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 en diferentes regímenes. Comparación de la producción de ANT y la protección entre grupos de ratones vacunados por medio de inyección IM tres veces en los días 0, 3 y 14, o en los días 0, 7 y 21, o en los días 0, 14 y 28. Tres semanas después de la última inyección, los ratones se expusieron a una dosis letal de toxina A o toxina B (el panel A está en forma de tabla y el panel B está en forma de gráfica).

La Figura 21 muestra la protección (supervivencia) contra la exposición a la toxina A de C. difficile (55 ng/mouse) en ratones inmunizados con un única inyección de 10 pg de C-TAB.G5.1 y 12,5 pg de alumbre (en 100 pl). Dicha exposición se llevó a cabo a los 21 días, 35 días o 49 días tras la inmunización.

Descripción detallada

Descripción general

En la presente memoria se describe una composición inmunógena para inducir respuestas inmunitarias protectoras y/o terapéuticas a las toxinas A y B de C. difficile que comprende el uso de un polipéptido aislado C-TAB.G5 (SEQ ID N. °: 2) o a un derivado del mismo, C-TAB.G5.1 (SEQ ID N. °: 4), que comprende 19 unidades repetitivas (UR) de la toxina A y 23 unidades repetitivas (UR) de la toxina B o fragmentos peptídicos, o variantes de las mismas.

En la presente memoria se describen métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el método para preparar la composición (p. ej., una vacuna) útil para la prevención y/o el tratamiento de una EACD en mamíferos. La siguiente descripción proporciona más detalles y ejemplos para la construcción, expresión y purificación de los polipéptidos aislados recombinantes, su uso como antígenos para inducir una respuesta inmunitaria específica, así como también para la evaluación de la protección en sujetos. Los sujetos pueden ser animales o humanos.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 para uso en los métodos y composiciones descritas en la presente memoria se pueden preparar utilizando cualquiera de diversos métodos estándares. Por ejemplo, se puede producir C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 utilizando técnicas de ADN recombinante estándares, en las que una célula hospedante adecuada se transforma con un vector de expresión apropiado que contiene una parte de una fragmento de ácido nucleico que codifica para la toxina (véase, p. ej., Dove et al., Infect. Immun. 58:480-8 (1990) y Barroso et al., Nucleic Acids Research 18:4004 (1990). Se puede utilizar cualquiera de una amplia variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos recombinantes. Se puede producir C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en un hospedante procarionte (p. ej., una bacteria, tal como E.coli o Bacillus) o en un hospedante eucarionte (p. ej., células de levadura, células de mamífero (p. ej., células COS1, NIH3T3 o JEG3) o células de insectos (p. ej., células de Spodotera frugiperda (SF9))). Dichas células están disponibles, por ejemplo, en la Colección estadounidense de cultivos tipos (ATCC, por sus siglas en inglés). El método de transformación y transfección y la elección del vector de expresión dependerán del sistema hospedante seleccionado. Los métodos de transformación y transfección se describen, p. ej., en Ausubel et al. ISBM: 047132938X C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, en particular los fragmentos cortos, se pueden producir también mediante síntesis química, p. ej., mediante métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, 2a ed., Stewart and Young, Eds., Pierce Chemical Co., Rockford, III, o mediante métodos de traducción in vitro estándares.

Además de las secuencias de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, en la presente memoria se describen variantes de las mismas que son funcionalmente activas e inmunógenas. Las variantes pueden tener el mismo nivel de inmunogenicidad que C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La variante puede tener sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácido en comparación con la SEQ ID N. °: 2 o la SEQ ID N. °: 4. Los genes que codifican para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 o una variantes de los mismos pueden producirse utilizando métodos estándares (véase más adelante; véase también, p. ej., Ausubel et al., supra).

Además de las secuencias de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, en la presente memoria se describen más derivados de C-TAB.G5 que comprenden repeticiones adicionales. A modo de ejemplo, una proteína de fusión, C-TABNCTB (SEQ ID N.°: 18, codificada por SEQ ID N.°: 17), comprende, al igual que C-TAB.G5, 19 unidades repetitivas de CTA (aminoácidos 2272-2710), 23 unidades repetitivas de CTB (aminoácidos 1850-2366) y 10 repeticiones más adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2057) fusionadas con el extremo C de CTB. Una variante adicional, la proteína de fusión C-TADCTB (SEQ ID N. °: 20, codificada por SEQ ID N. °: 19) comprende C-TAB.G5 (19 repeticiones de CTA y 23 repeticiones de CTB) más 24 unidades repetitivas adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2366) fusionadas con el extremo C de C-TAB.G5. Una variante también puede comprender copias adicionales de C-TAB.G5 o porciones del mismo. Por ejemplo, C-TADCTB comprende una porción doble de las unidades repetitivas de CTB presentes en C-TAB.G5.

En la presente memoria se describen métodos para la expresión elevada de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en un sistema bacteriano tal como E. coli que comprenden introducir un ácido nucleico que codifica para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en una célula hospedante bacteriana y expresar C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

Además, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente memoria se puede acoplar covalentemente o reticular con adyuvantes (véase, por ejemplo, Cryz et al., Vaccine 13:67-71(1994); Liang et al., J. Immunology 141:1495-501 (1988) y Czerkinsky et al., Infect. Immun. 57:1072-77(1989)).

En la presente memoria se describe una vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que puede proteger y proporcionar terapia contra ^eA^c D. La vacuna descrita en la presente memoria comprende un antígeno nuevo que puede administrarse por vía intramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutánea (SC), oral, nasal, bucal o rectal. La vacuna puede proporcionar protección inmunitaria o inducir anticuerpos para inmunización pasiva.

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente memoria proporciona una vacuna para inmunizar contra EACD. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente memoria o variantes del mismo, es un candidato de vacuna combinada orientado a ampliar la cobertura protectora contra enfermedades asociadas a C. difficile, tal como EACD, hasta un nivel desconocido o no publicado hasta ahora. Este concepto de una única vacuna que ofrece protección o una disminución de la gravedad de enfermedades asociadas a C. difficile representa un paso único hacia la gestión de la salud pública a nivel mundial y especialmente hacia la reducción de la gravedad de las epidemias (p. ej., residencias de ancianos, cruceros).

Tal como se emplea en la presente memoria, «proteína toxina A» o «proteína toxina B» hace referencia a proteínas tóxicas de C. difficile que son las principales responsables de EACD. La toxina A y la toxina B comprenden múltiples unidades repetitivas responsables de la inmunogenicidad en dominios de unión en el extremo C.

Tal como se emplea en la presente memoria, «natural» hace referencia a una proteína de longitud completa que consta de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos tal como se encontraría endógenamente en una célula hospedante.

Tal como se emplean en la presente memoria, los términos «enfermedad asociada a Clostridium difficile», «enfermedad relacionada con Clostridium difficile», «enfermedad medida por toxina de Clostridium difficile», «infección por Clostridium difficile» y «EACD» hacen referencia a enfermedades causadas, de forma directa o indirecta, por infección con Clostridium difficile.

«Antígeno» hace referencia a una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica cuando se presenta a células inmunitarias de un organismo. Por ejemplo, un antígeno puede ser un ácido nucleico, una proteína, un polipéptido, un péptido, una glicoproteína, un carbohidrato, un lípido, un glicolípido, una lipoproteína, una proteína de fusión, un fosfolípido o un conjugado de una combinación de los mismos. Un antígeno puede comprender un único epítopo inmunógeno, o una multiplicidad de epítopos inmunógenos reconocidos por un receptor de linfocito B (es decir, anticuerpo sobre la membrana del linfocito B) o un receptor de linfocito T. El antígeno puede proporcionarse como una partícula similar a virus (VLP, por sus siglas en inglés) o un microbio o microorganismo entero tal como, por ejemplo, una bacteria o virión. El antígeno puede ser un virus vivo desactivado o atenuado. El antígeno puede obtenerse de un extracto o lisado, de células enteras o de la membrana sola; o el antígeno puede sintetizarse químicamente o producirse por medios recombinantes. Un antígeno se puede administrar solo o con un adyuvante. Una molécula de antígeno simple puede tener propiedades de antígeno y adyuvante.

«Adyuvante» significa cualquier sustancia que se emplea para potenciar de forma específica o no específica una respuesta inmunitaria específica para un antígeno, tal vez a través de la activación de células que presentan antígeno. Los ejemplos de adyuvantes incluyen una emulsión oleosa (p. ej., adyuvante de Freund completo o incompleto), adyuvante Montanide incompleto de Seppic tal como ISA, adyuvantes de emulsión de aceite en agua tales como el sistema adyuvante Ribi, formulación adyuvante syntax que contiene dipéptido de muramilo, adyuvante de sal de aluminio (ALUM), polímero policatiónico, especialmente péptido policatiónico, especialmente poliarginina o un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleótido (ODN) inmunoestimulador que contiene dinucleótidos de citosina-guanina no metilados (CpG) en un contexto de bases definido (p. ej., tal como se describe en WO 96/02555) o ODN basados en inosina y citidina (p. ej., tales como se describen en WO 01/93903), o ácido desoxinucleico que contiene residuos desoxi-inosina y/o desoxiuridina (tales como se describen en WO 01/93905 y WO 02/095027), especialmente Oligo(dIdC)13 (tal como se describe en WO 01/93903 y WO 01/93905), compuesto neuroactivo, especialmente hormona de crecimiento humana (descrita en WO 01/24822), o combinaciones de estos, una quimiocina (p. ej., defensinas 1 o 2, RANTES, MlP1-a, MIP-2, interleucina-8, o una citocina (p. ej., interleucina-1p, -2, -6, -10 o -12; interferón-Y; factor de necrosis tumoral-a; o factor estimulador de colonias de granulocitos-monocitos) (descrito en Nohria and Rubin, 1994), una variante dipeptídica de muramilo (p. ej., murabutida, treonil-MDP o tripéptido de muramilo), variantes sintéticas de MDP, una proteína de choque térmico o una variante, una variante del LeIF principal de Leishmaniasis (Skeiky et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 1527-1537), variantes no tóxicas de exotoxinas ADP-ribosilantes bacterianas (bARE, por sus siglas en inglés) incluidas variantes en el sitio de escisión por tripsina (Dickenson and Clements, (1995) Infection and Immunity 63 (5): 1617-1623) y/o bARE que afectan la ADP-ribosilación (Douce et al., 1997) o químicamente destoxificadas (anatoxinas), QS21, Quill A, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-s-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida (MTP-PE) y composiciones que contienen un aceite metabolizable y un agente emulsionante. Un adyuvante se puede administrar con un antígeno o se puede administrar solo, ya sea por la misma vía que el antígeno o por una vía diferente a la del antígeno. Una molécula de adyuvante simple puede tener propiedades de adyuvante y antígeno.

«Cantidad eficaz» significa una cantidad de un agente terapéutico suficiente para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria específica para antígeno, para un antígeno, o tratar o diagnosticar una afección, para un fármaco. Dicha inducción de una respuesta inmunitaria puede proporcionar un tratamiento tal como, por ejemplo, inmunoprotección, desensibilización, inmunosupresión, modulación de una enfermedad autoinmunitaria, potenciación de inmunovigilancia del cáncer o vacunación terapéutica contra una enfermedad infecciosa establecida. El tratamiento incluye cura, mejora o prevención.

«Ácido nucleico» significa una base de ácido desoxirribonucleico simple o un ácido ribonucleico o una secuencia de los mismos unidos mediante enlaces fosfodiéster.

«Agente terapéutico» significa cualquier molécula que se puede utilizar para tratar una enfermedad, aliviar los síntomas de una enfermedad, prevenir una enfermedad o diagnosticar una enfermedad. Por ejemplo, un agente terapéutico puede ser un antígeno o un fármaco.

«Sujeto» significa un animal. El sujeto puede ser cualquier animal, incluido cualquier vertebrado. El sujeto puede ser ganado doméstico, animales de laboratorio (incluidos, pero sin limitarse a, roedores tales como una rata, hámster, jerbo o ratón) o un animales de compañía. En una realización, el animal puede ser un mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen humanos, primates, marsupiales, caninos, monos, roedores, felinos, simios, ballenas, delfines, vacas, cerdos y caballos. El sujeto puede necesitar tratamiento para una enfermedad o puede necesitar un tratamiento profiláctico.

Como se emplea en la presente memoria, el término «anticuerpo» significa una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de una molécula de inmunoglobulina que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno específico. Estos anticuerpos son conocidos por los expertos en la ciencia de la inmunología. Como se emplea en la presente memoria, el término «anticuerpo» significa no solo moléculas de anticuerpo de longitud completa sino también fragmentos de moléculas de anticuerpo que conservan la capacidad de unirse al antígeno. Dichos fragmentos también son conocidos en la técnica y se emplean con regularidad in vitro e in vivo. En particular, como se emplea en la presente memoria, el término «anticuerpo» significa no solo moléculas de inmunoglobulina de longitud completa sino también fragmentos activos de unión a antígeno tales como los conocidos fragmentos activos F(ab')2, Fab, Fv, y Fd.

Como se emplea en la presente memoria, el término «variantes» puede incluir proteínas y/o polipéptidos y/o péptidos que son diferentes con respecto a un polipéptido natural, en el que uno o más residuos han sido sustituidos de forma conservadora por un residuo funcionalmente similar y que además exhibe propiedades funcionales sustancialmente idénticas a las del polipéptido natural. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) por otro (p. ej., isoleucina, valina, leucina o metionina), sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro (p. ej., entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina), sustitución de un residuo básico por otro (p. ej., lisina, arginina o histidina), o sustitución de un residuo ácido por otro (p. ej., ácido aspártico o ácido glutámico). Una variante puede incluir cualquier polipéptido que tiene una estructura terciaria sustancialmente idéntica a la de un polipéptido de la invención, que también exhibe las propiedades funcionales de los polipéptidos tales como se describen en la presente memoria. Una variante puede ser un mutante de un polipéptido natural.

Como se usa en la presente memoria, «tratamiento» puede incluir cualquier tipo de intervención empleada en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula. El tratamiento puede incluir, pero no se limita a, administración de p. ej., una composición farmacéutica, sola o en combinación con otras modalidades de tratamiento conocidas en general en la técnica. El «tratamiento» puede realizarse de forma profiláctica o después del inicio de un evento patológico.

Como se emplea en la presente memoria, «vehículo farmacéuticamente aceptable» puede incluir cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve la actividad biológica y no es reactivo con el sistema inmunitario del sujeto. Los vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y solubilizantes. En general, la naturaleza del vehículo o excipiente dependerá del modo de administración específico que se empleará. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden normalmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como el agua, disolución salina isotónica, disoluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (p. ej. en forma de polvo, pastilla, comprimido o cápsula), los vehículos sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los vehículos biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se administrarán pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tampón de pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Como se emplea en la presente memoria, «fusión» puede hacer referencia a ácidos nucleicos y polipéptidos que comprenden secuencias que no se encuentran asociadas naturalmente entre sí en el orden o contexto en el que se colocan según la presente invención. Un ácido nucleico o polipéptido de fusión no comprende necesariamente la secuencia natural del ácido nucleico o polipéptido en su totalidad. Las proteínas de fusión tienen los dos o más segmentos ligados entre sí a través de enlaces peptídicos normales. Los ácidos nucleicos de fusión tienen los dos o más segmentos ligados entre sí a través de enlaces fosfodiéster normales.

Polipéptidos aislados

En la presente memoria se describen los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 tales como se establecen en SEQ ID N. °: 2 y SEQ ID N. °: 4, respectivamente, que comprende 19 unidades repetitivas de la toxina A de C. difficile y 23 unidades repetitivas de la toxina B de C. difficile. Un homólogo de C-TAB.G5, tal como C-TAB.G5.1, puede diferir respecto a C-TAB.G5 en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. El polipéptido C-TAB.G5.1 es una proteína de fusión que contiene el mismo dominio de extremo C de la toxina B que C-TAB.G5, pero el dominio de extremo C de la toxina A derivado de la cepa VPl-10463 de C. difficile que es un homólogo del correspondiente al polipéptido C-TAB.G5 derivado de la cepa 630 de C. difficile y difiere en dos aminoácidos en las posiciones 155-156. La secuencia codificante de C-TAB.G5.1, tal como se establece en SEQ ID N. °: 3, se optimizó por medio de codones para obtener una expresión mejorada dentro de una célula hospedante E. coli. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente pueden ser eficaces para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. difficile.

La toxina A y la toxina B son codificadas por los genes trdA (SEQ ID N. °: 5) y trdB (SEQ ID N. °: 7) de la cepa 630 de C. difficile, respectivamente. Estructuralmente, las toxinas de C. difficile comprenden un dominio de ADP-glucosiltransferasa, un dominio de cisteína proteasa, una región hidrófoba y una región de unión a receptor. El dominio del extremo C contiene unidades altamente repetitivas (UR) (también conocidas como oligopéptidos repetitivos combinados (CROPS, por sus siglas en inglés)). Las UR pueden ser oligopéptidos largos o cortos y pueden comprender 20 a 50 aminoácidos con un motivo YYF consenso que está repetido. Las UR están agrupadas en aglomeraciones. A modo de ejemplo, la toxina A, de la cepa 630 (SEQ ID N. °: 6) codificada por el gen trdA natural (SEQ ID N. °: 5) contiene 39 UR. Las 39 UR están agrupadas en 8 aglomeraciones. La toxina B, de la cepa 630 (SEQ ID N. °: 8) codificada por el gen trdB natural (SEQ ID N. °: 7) contiene 24 UR que están agrupadas en 5 aglomeraciones. Las Tablas 1 y 2 a continuación muestran las posiciones de aminoácido de cada una de las UR en la toxina A y la toxina B de C. difficile codificadas por el gen trdA y el gen trdB.

Tabla 1: Unidades repetitivas de la toxina A (URA)

S: indica una unidad repetitiva corta

L: indica una unidad repetitiva larga

Tabla 2: Unidades repetitivas de la toxina B (URB)

S: indica una unidad repetitiva corta

L: indica una unidad repetitiva larga

Por consiguiente, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1 comprenden 19 UR del dominio del extremo C de la toxina A de C. difficile y 23 RU del dominio del extremo C de la toxina B de C. difficile, respectivamente. C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprende los aminoácidos de la toxina A 2272-2710 de SEQ ID N. °: 6 fusionados con los aminoácidos de la toxina B 1850-2366 de SEQ ID N. °: 8. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprende la secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID N. °: 2 y SEQ ID N. °: 4, respectivamente.

Las UR respectivas en el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 también puede ser de variantes de la toxina A o la toxina B de C. difficile. Estas UR en el polipéptido aislado C-TAB también pueden ser una combinación de la toxina A o la toxina B de origen natural de C. difficile o variantes de las mismas.

Las UR en los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprenden UR largas y UR cortas, y las UR largas y las UR cortas están dispuestas en una aglomeración. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención comprenden 4 aglomeraciones de 3 a 5 UR cortas seguidas de una UR larga de la toxina A de C. difficile y 5 aglomeraciones de 3 a 5 UR cortas seguidas de una UR larga de la toxina B de C. difficile.

Las UR cortas y largas contienen motivos conservados. La unidad repetitiva corta puede comprender 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 aminoácidos. Cada unidad repetitiva corta puede comprender motivos de tirosina conservados tales como YYF, FYF, YFF, FYT o HYF. Una unidad repetitiva corta puede comprender además un residuo de aspartato/histidina antes del motivo de tirosina si la unidad repetitiva siguiente es una unidad repetitiva larga. La unidad repetitiva larga puede comprender 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 aminoácidos. Cada unidad repetitiva larga puede comprender un motivo repetido de tirosina tal como FEYF, FKYF o YKYF.

En la presente invención, las porciones de toxina A y toxina B de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden estar fusionadas directamente entre sí. Las porciones de toxina A y toxina B pueden estar separadas por una región enlazadora. Una región enlazadora puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 a 15, 20 a 30, 40, 45 o 50 aminoácidos. Los expertos en la técnica reconocerán que se puede adaptar la región enlazadora para alterar el posicionamiento de las porciones de la toxina A y la toxina B, de tal modo que cada unidad repetitiva de toxina, en sus formas expresada y plegada, en los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se posicione para exponer los epítopos potenciales de forma óptima y para conservar su inmunogenicidad. Las UR y las aglomeraciones en los polipéptidos aislados C-TAB también pueden estar separadas por enlazadores. En una realización, el enlazador comprende el péptido RSMH (439-442 de SEQ ID N. °: 2 o SEQ ID N. °: 4).

Los polipéptidos aislados C-TAB descritos en la presente pueden tener al menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia o similitud de secuencia con la SEQ ID N.°: 2 o la SEQ ID N.°: 4. Como se conoce en la técnica, la «similitud» entre dos polipéptidos o polinucleótidos se determina al comparar la secuencia de aminoácidos o nucleótidos y sus sustituciones conservadoras de nucleótidos o aminoácidos de un polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido. También se conoce en la técnica la «identidad» que significa el grado de relación de secuencia entre dos secuencias de polipéptidos o dos secuencias de polinucleótidos que se determina por la identidad de la coincidencia entre dos cadenas de dichas secuencias. Tanto la identidad como la similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad y la similitud entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, los términos «identidad» y «similitud» son conocidos por los expertos en la técnica (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988).

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente memoria son inmunógenos. Por ejemplo, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente memoria pueden tener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la actividad inmunológica de la toxina A bacteriana correspondiente y los polipéptidos aislados C-TAB .G5 o C-TAB.G5.1 pueden tener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la actividad inmunológica de la toxina B bacteriana correspondiente. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente pueden utilizarse como vacunas para tratar, prevenir o aliviar los síntomas de EACD.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente también incluyen variantes del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que tienen la SEQ ID N.°: 2 o la SEQ ID N.°: 4, respectivamente. Las variantes pueden tener inserciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácidos que tienen un efecto mínimo o nulo sobre la actividad, función o forma del polipéptido aislado. Los ejemplos de dichas sustituciones incluyen la sustitución de un residuo no polar por otro, la sustitución de un residuo polar por otro, la sustitución de un residuo básico por otro o la sustitución de un residuo ácido por otro. Las variantes de polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden incluir además inserciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la toxina A o la toxina B natural que proporcionan un efecto mínimo sobre la actividad, función y/o estructura del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerán que también se pueden utilizar aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales incluyen, por ejemplo, beta-alanina (beta-Ala) u otros omega-aminoácidos, tales como 3-amino propiónico, 2,3-diamino propiónico (2,3-diaP), 4-amino butírico, entre otros, ácido alfa-aminisobutírico (Aib), sarcosina (Sat), ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-metilisoleucina (N-MeIle), fenilglicina (Phg) y ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cisteico (Cya), 2-naftilalanina (2-Nal); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); beta-2-tienilalanina (Thi); y sulfóxido de metionina (MSO).

Las secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente se pueden optimizar por medio de codones para potenciar la expresión en diversas células hospedantes. La optimización por medio de codones hace referencia a la modificación de la secuencia de nucleótidos a efectos de potenciar la expresión proteica en una célula hospedante de interés mediante el reemplazo de uno o más codones de la secuencia natural por codones que se utilizan de forma más frecuente en los genes de dicha célula hospedante o en los genes del hospedante del cual deriva la célula. Diversas especies exhiben una preferencia específica por determinados codones de un aminoácido específico. En la presente se describe una secuencia de nucleótidos optimizada por medio de codones que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5.1 para una expresión potenciada en E. coli.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente se pueden preparar mediante cualquier técnica conocida. Por ejemplo, los polipéptidos aislados se pueden expresar a través de ingeniería genética. A modo de ejemplo, la traducción de ADN recombinante. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 también se pueden preparar sintéticamente. A modo de ejemplo, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se pueden sintetizar utilizando la técnica sintética en fase sólida descrita inicialmente por Merrifield (J. Am Chem. Soc. 85:2149-2154). Se pueden encontrar otras técnicas de síntesis de polipéptidos, por ejemplo, en Kent et al. (1985) en Synthetic Peptides in Biology and Medicine, eds. Alitalo et al., Elsevier Science Publishers, 295-358.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente se pueden aislar u obtener en forma sustancialmente pura. Sustancialmente pura significa que las proteínas y/o polipéptidos y/o péptidos están esencialmente libres de otras sustancias con las cuales se pueden encontrar en la naturaleza o en sistemas in vivo en una medida práctica y adecuada para su uso previsto. En particular, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 son suficientemente puros y están suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de sus células hospedantes de forma tal que son útiles, por ejemplo, para generar anticuerpos, para secuenciación o para producir preparaciones farmacéuticas. Por medio de técnicas conocidas en la materia, se pueden producir polipéptidos sustancialmente puros teniendo en cuenta las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos descritas en la presente memoria. Dado que un polipéptido aislado sustancialmente purificado de la invención se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el polipéptido aislado puede constituir solo un porcentaje determinado en peso de la preparación. Sin embargo, el polipéptido aislado es sustancialmente puro porque ha sido separado sustancialmente de las sustancias con las cuales puede estar asociado en sistemas vivientes.

En la presente memoria se describen polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 aislados que comprenden polipéptidos adicionales. Los polipéptidos adicionales pueden ser fragmentos de un polipéptido más grande. En una realización, hay uno, dos, tres, cuatro o más polipéptidos adicionales fusionados con los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas realizaciones, los polipéptidos adicionales están fusionados en dirección al extremo amínico de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras realizaciones, los polipéptidos adicionales están fusionados en dirección al extremo carboxílico de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En realizaciones adicionales, los polipéptidos adicionales flanquean los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras realizaciones adicionales, los polipéptidos adicionales están dispersados entre la porción de toxina A y la porción de toxina B de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En algunas realizaciones, los polipéptidos adicionales auxilian a orientar la secreción o localización subcelular de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Dichos polipéptidos se denominan «secuencia señal». Se describe una señal secretora, por ejemplo, en la patente estadounidense 6.291.212 y la patente estadounidense 5.547.871. La secuencia señal secretora codifica para péptidos secretores. Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para orientar la secreción de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 desde una célula. Los péptidos secretores en general se caracterizan por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran típicamente (pero no exclusivamente) en los extremos amínicos de las proteínas recientemente sintetizadas. El péptido secretor se puede escindir del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener sitios de procesamiento que permiten la escisión del péptido señal de la proteína madura a medida que pasa a través de la vía secretora. Los sitios de procesamiento se pueden codificar dentro del péptido señal o se puede agregar al péptido señal mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro. Las secuencias señal secretoras pueden ser necesarias para una serie compleja de etapas de procesamiento postranslacionales para permitir la secreción de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La secuencia señal puede estar inmediatamente después del codón de iniciación y codifica para un péptido señal en el extremo amínico de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La secuencia señal puede preceder al codón de terminación y codifica para un péptido señal en el extremo carboxílico de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En la mayoría de los casos, la secuencia señal se extrae por escisión mediante una proteasa específica, denominada peptidasa señal. Los ejemplos de secuencias señal secretoras incluyen, pero no se limitan a, ompA, pelB y ST pre-pro.

En algunas realizaciones, los polipéptidos adicionales auxilian en la estabilización, estructura y/o purificación de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas realizaciones, los polipéptidos adicionales pueden comprender un epítopo. En otras realizaciones, los polipéptidos adicionales pueden comprender una etiqueta de afinidad. A modo de ejemplo, la fusión de un polipéptido que comprende un epítopo y/o una etiqueta de afinidad con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede auxiliar en la purificación y/o identificación del polipéptido. A modo de ejemplo, el segmento de polipéptido puede ser una etiqueta His, una etiqueta myc, una etiqueta S-péptido, una etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa), una etiqueta GST (glutatión S-transferasa), una etiqueta FLAG, una etiqueta tiorredoxina, una etiqueta GFP (proteína verde fluorescente), una BCCP (proteína transportadora de biotina carboxilada), una etiqueta calmodulina, una etiqueta Strep, una etiqueta epítopo h Sv , una etiqueta epítopo V5 y una etiqueta CBP. El empleo de dichos epítopos y etiquetas de afinidad es conocido por los expertos en la técnica.

En realizaciones adicionales, los polipéptidos adicionales pueden proporcionar un polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que comprende sitios para la escisión del polipéptido. Como ejemplo, un polipéptido se pueden escindir por medio de hidrólisis del enlace peptídico. En algunas realizaciones, la escisión se lleva a cabo por medio de un enzima. En algunas realizaciones, la escisión se produce en la célula. En otras realizaciones, la escisión se produce a través de manipulación artificial y/o introducción artificial de una enzima de escisión. A modo de ejemplo, las enzimas de escisión pueden incluir pepsina, tripsina, quimotripsina, trombina y/o Factor Xa. La escisión facilita el aislamiento de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de los polipéptidos. La escisión también puede permitir la separación de la porción de toxina A de la porción de toxina B. La escisión también puede permitir el aislamiento de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 fusionados con polipéptidos de otros polipéptidos, tal como a través de escisión de un epítopo utilizado para purificar la proteína expresada.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden poseer además modificaciones estructurales adicionales no compartidas con el mismo péptido sintetizado orgánicamente, tal como adenilación, carboxilación, glicosilación, hidroxilación, metilación, fosforilación o miristilación. Estas modificaciones estructurales agregadas se pueden seleccionar o preferir adicionalmente a partir de la elección adecuada del sistema de expresión recombinante. Por otro lado, se puede extender la secuencia de los polipéptidos de fusión por medios de los principios y la práctica de la síntesis orgánica.

En la presente memoria se describen ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que comprenden un porción de polipéptido obtenida de la toxina A de C. difficile y una porción de polipéptido obtenida de la toxina B de C. difficile. Los ácidos nucleicos pueden incluir formas mono o bicatenarias de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o polímeros de los mismos. En la presente memoria se describen ácidos ribonucleicos que codifican para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En la presente memoria se describen ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el complemento del mismo. Condiciones rigurosas hace referencia al grado de homología entre una sonda y un ácido nucleico unido al filtro; cuanto mayor es la rigurosidad, más alto es el porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. La temperatura para un lavado rigurosa se puede determinar en función de la Tm del ácido nucleico (basada en el contenido de G/C). Las condiciones rigurosas también pueden ser afectadas por la concentración de sal en un tampón, tal como citrato de sodio estándar (SSC, por sus siglas en inglés). La presente invención proporcionar ácidos nucleicos que tienen alrededor de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de similitud de secuencia o identidad de secuencia con SEQ ID N.°: 1.

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede comprender además una región enlazadora, por ejemplo, un enlazadores con menos de alrededor de 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de aminoácido. El enlazador puede enlazarse covalentemente con y entre la porción de polipéptido derivada de la toxina A o una porción de la misma y la porción de polipéptido derivada de la toxina B.

En la presente memoria se describen ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que son redundantes con respecto a SEQ ID N.°: 1 o SEQ ID N.°: 3, respectivamente. La redundancia del código genético permite variaciones en la secuencia de nucleótidos de una proteína toxina A, una proteína toxina B y/o un polipéptido aislado de interés, mientras se sigue produciendo un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido codificado por la secuencia de ADN natural. El procedimiento, conocido como «optimización codónica» (descrito en la patente estadounidense 5.547.871) proporciona un medio para diseñar dicha secuencia de ADN alterada. El diseño de genes optimizados por medio de codones debe tener en cuenta diversos factores, incluida la frecuencia de uso de codones en un organismo, las frecuencias aledañas más próximas, la estabilidad del ARN, el potencial para la formación de la estructura secundaria, la vía de síntesis y las futuras manipulaciones de ADN previstas de dicho gen. En particular, se pueden utilizar métodos disponibles para alterar los codones que codifican para un polipéptido aislado dado con aquellos más fácilmente reconocidos por levaduras cuando se utilizan sistemas de expresión en levadura o por células de insectos cuando se utiliza el sistema de expresión en células de insectos. La redundancia del código genético también permite que la misma secuencia de aminoácidos sea codificada y traducida de muchas formas diferentes. Por ejemplo, cada una de leucina, serina y arginina se codifica mediante seis codones diferentes, mientras que cada una de valina, prolina, treonina, alanina y glicina se codifica mediante cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de uso de dichos codones sinónimos varía de genoma a genoma entre eucariontes y procariontes. Por ejemplo, los patrones de elección de codones sinónimos entre mamíferos son muy similares, mientras que los organismos distantes a nivel evolutivo tales como levaduras (tales como S. cerevisiae), bacterias (tales como E. coli) e insectos (tales como D. melanogaster) revelan un patrón claramente diferente de frecuencias de uso de codones genómicos (Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 8, 49-62 (1980); Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 9, 43-74 (1981); Maroyama, T., et al., Nucl. Acid Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., et al., Nucl. Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., et al., Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981­ 1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)). Estas diferencias en los patrones de elección de codones parecen contribuir a los niveles de expresión generales de genes individuales al modular las tasas de elongación peptídica. (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol, 207, 365-377 (1989); Randall, L. L., et al., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F. y Yarus, M., J. Mol. Biol, 209, 65-77 (1989); Varenne, S., et al., J. Mol. Biol, 180, 549-576 (1984), Varenne, S., et al., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol, 43, 211-225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol, 146, 1­ 21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol, 151, 389-409 (1981)).

Las frecuencias de uso de codones preferidas para un gen sintético deben reflejar los usos de codones de genes nucleares derivados del genoma exacto (o lo más estrechamente relacionado posible) de la célula/organismo que se pretende utilizar para la expresión proteica recombinante.

Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, et al., Nucl. Acid Res. 12(1 ):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)). El grado de similitud o identidad mencionado anteriormente se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias y a menudo indica que la primera secuencia deriva de la segunda. El grado de identidad entre dos ácidos nucleicos puede determinarse mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionada en el paquete de programas GCG (Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)). A los efectos de determinar el grado de identidad entre dos ácidos nucleicos para la presente invención, se utiliza GAP con la siguiente configuración: Penalización por creación de GAP (espacio) de 5,0 y penalización por extensión de GAP de 0,3.

En la presente memoria se describe un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Un vector puede ser cualquiera de varios ácidos nucleicos en los cuales se puede insertar una secuencia deseada mediante restricción y ligación para transporte entre diferentes entornos genéticos o para expresión en una célula hospedante. Los vectores están constituidos típicamente por ADN, aunque también hay vectores de ARN disponibles. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y fagémidos. Un vector de clonación es uno que es capaz de replicarse en una célula hospedante y que se caracteriza además por uno o más sitios de restricción por endonucleasa en los cuales el vector se puede cortar de una forma determinable y en los cuales se puede ligar una secuencia de ADN de forma tal que el nuevo vector recombinante conserve su capacidad para replicarse en la célula hospedante. En el caso de los plásmidos, la replicación de la secuencia deseada se puede producir muchas veces a medida que el plásmido aumenta en cantidad de copias dentro de la bacteria hospedante o solo una única vez por hospedante antes de que el hospedante se reproduzca por mitosis. En el caso de un fago, la replicación se puede producir activamente durante una fase lítica o pasivamente durante una fase lisógena.

Los vectores pueden contener además una secuencia promotora. Un promotor puede incluir un ácido nucleico no traducido generalmente ubicado antes de la región codifican que contiene el sitio para iniciar la transcripción del ácido nucleico. La región promotora también puede incluir otros elementos que actúan como reguladores de la expresión génica. En realizaciones adicionales de la invención, el vector de expresión contiene una región adicional para auxiliar en la selección de células que tienen el vector de expresión incorporado. La secuencia promotora está a menudo delimitada (inclusivamente) en su extremo en dirección a 3' por el sitio de iniciación de la transcripción y se extiende hacia atrás (en dirección 5') para incluir la cantidad mínima de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en niveles detectables por encima del valor registrado. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos a menudo, pero no siempre, contendrán «secuencias TATA» y «secuencias CAT».

Los vectores pueden contener además una o más secuencias marcadoras adecuadas para uso en la identificación y selección de células que han sido transformadas o transfectadas con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican para proteínas que aumentan o disminuyen la resistencia o sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican para enzimas cuyas actividades son detectables mediante ensayos estándares conocidos en la técnica (p. ej., p-galactosidasa o fosfatasa alcalina) y genes que afectan visiblemente el fenotipo de las células, hospedantes, colonias o calvas transformadas o transfectadas. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación y expresión autónomas de los productos génicos estructurales presentes en los segmentos de ^a Dⁿ a los cuales están unidos funcionalmente.

Un vector de expresión es uno en el que se puede insertar un ácido nucleico deseado mediante restricción y ligación de forma tal que se una funcionalmente a las secuencias reguladoras y pueda expresarse como un transcrito de ARN. La expresión hace referencia a la transcripción y/o traducción de un gen, transgén o región codificante endógeno en una célula.

Una secuencia codificante está unida a secuencias reguladoras cuando las mismas están unidas covalentemente de modo tal que se coloca la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas funcionalmente si la inducción de un promotor en la secuencia reguladoras en dirección 5' resulta en la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza de la ligadura entre las dos secuencias de ADN no (1) resulta en la introducción de una mutación con desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora de orientar la transcripción de la secuencias codificantes ni (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente de traducirse en una proteína. Por consiguiente, una región promotora se uniría funcionalmente a una secuencia codificante si la región promotora fuera capaz efectuar la transcripción de dicha secuencia de ADN de forma tal que el transcrito resultante se tradujera en la proteína o el polipéptido deseado.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente pueden producirse mediante la expresión del ácido nucleico codificante en células hospedantes. El ácido nucleico puede transformarse o transfectarse en células hospedantes. Por consiguiente, algunos aspectos descritos en la presente incluyen la transformación y/o transfección de ácido nucleico que codifica para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La transformación es la introducción de ácido nucleico exógeno o heterólogo en el interior de una célula procarionte. La transfección es la introducción de ácido nucleico exógeno o heterólogo en el interior de una célula eucarionte. El ácido nucleico que se transforma o transfecta puede o no estar integrado (unido covalentemente) dentro del ADN cromosómico formando parte del genoma de la célula. En células procariontes, por ejemplo, el ácido nucleico que se transforma puede mantenerse en un elemento episómico tal como un plásmido o vector vírico. Con respecto a las célula eucariontes, una célula transfectada de manera estable es una en la cual el ácido nucleico que se transfecta se ha integrado dentro el cromosoma de manera que este sea heredado por células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucarionte para establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ácido nucleico transfectado.

Los cultivos de células eucariontes superiores se pueden utilizar para expresar las proteínas de la presente invención, ya sea de células de vertebrados o invertebrados, incluidos insectos, y los procedimientos de propagación de los mismos son conocidos (véase, por ejemplo, Kruse et al. (1973) Tissue Culture, Academic Press).

También se proporcionan células hospedantes y vectores para replicar los ácidos nucleicos y para expresar los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 codificados. Se puede utilizar cualquier vector o célula hospedante, ya sean procariontes o eucariontes. Muchos vectores y células hospedantes son conocidos en la técnica para dichos fines. La experiencia en la técnica conlleva el saber seleccionar un conjunto adecuado para la aplicación deseada.

Las secuencias de ADN que codifican para la toxina A y la toxina B, o porciones de las mismas, se pueden clonar a partir de una variedad de bibliotecas genómicas o de ADNc derivadas de C. difficile y otros procariontes conocidos en la técnica que expresan la toxina A y la toxina B. Las técnicas para aislar dichas secuencias de ADN utilizando métodos basados en sondas son técnicas convencionales y son conocidas por los expertos en la técnica. Las sondas para aislar dichas secuencias de ADN pueden basarse en secuencias de ADN o proteínas publicadas. Alternativamente, se puede utilizar el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) descrito por Mullis et al. (patente estadounidense N.° 4.683.195) y Mullis (patente estadounidense N.° 4.683.202). La elección de la biblioteca y la selección de sondas para el aislamiento de dichas secuencias de ADN se encuentran dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica.

Las células hospedantes adecuadas pueden derivar de procariontes o eucariontes. Los hospedantes procariontes adecuados incluyen: Pseudomonas tales como P. aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus tales como S. aureus y S. epidermidis, Serratia marcescens, Bacillus tales como B. subtillis y B. megaterium, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Micrococcus tales como M. luteus y M. roseus y Proteus vulgaris. Las células hospedantes adecuadas para expresar los polipéptidos de la presente invención en eucariontes superiores incluyen: levaduras tales como Saccharomyces (p. ej. S. cerevisiae); 293 (riñón embrionario humano) (ATCC CRL-1573); 293F (Invitrogen, Carlsbad, CA); 293^t y la variante 293T/17 (293tsA1609neo y la variante ATCC ^c R^l-11268) (riñón embrionario humano transformado con antígeno T de SV40); COS-7 (línea CVI de riñón de mono transformada con SV40)(ATCC CRL1651); BHK (células de riñón de hámster bebé) (ATCC CRL10); CHO (células de ovario de hámster chino); células de Sertoli de ratón; CVI (células de riñón de mono) (ATCC CCL70); VERO76 (células de riñón de mono verde africano) (ATCC CRL1587); HeLa (células de carcinoma cervical humano) (ATCC Cc L2); MDCK (células de riñón canino) (ATCC CCL34); BRL3A (células de hígado de rata búfalo) (ATCC CRL1442); W138 (células de pulmón humano) (ATCC CCL75); HepG2 (células de hígado humano) (HB8065); y Mm T 060652 (tumor mamario de ratón) (ATCC CCL51).

En la presente memoria se describen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido aislado que comprende los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y polipéptidos adicionales. Los vectores útiles para construir sistemas de expresión eucarióticos para la producción de polipéptidos de fusión comprenden ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado unido funcionalmente con una secuencia de activación de la transcripción adecuada, tal como un promotor y/u operador. Otras características típicas pueden incluir sitios de unión a ribosoma adecuados, codones de terminaciones, potenciadores, terminadores o elementos replicón. Estas características adicionales se pueden insertar en el vector en el sitio o sitios adecuados mediante técnicas de empalme convencionales tales como digestión y ligación por endonucleasa de restricción.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos adicionales pueden fusionarse con el ácido nucleico que codifica para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. El ácido nucleico fusionado puede codificar para polipéptidos que pueden auxiliar en la purificación y/o inmunogenicidad y/o estabilidad sin desplazar el marco de lectura codónica del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar para una secuencia secretora, que puede o no escindirse de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los ácidos nucleicos fusionados pueden no elongar de forma significativa el polipéptido expresado. Los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar para menos de sesenta aminoácidos adicionales para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos fusionados están a continuación del ácido nucleico que codifica para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos fusionados preceden al ácido nucleico que codifica para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos fusionados flanquean al ácido nucleico que codifica para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar para un polipéptido que auxilia en la purificación de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico fusionado codificará para un epítopo y/o etiqueta de afinidad. Los ejemplos de polipéptidos que auxilian en la purificación incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta His, una etiqueta myc, una etiqueta S-péptido, una etiqueta MBP, una etiqueta GST, una etiqueta FLAG, una etiqueta tiorredoxina, una etiqueta GFP, una BCCP, una etiqueta calmodulina, una etiqueta Strep, una etiqueta epítopo HSV, una etiqueta epítopo v 5 y una etiqueta CBP. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar para un polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que tiene un sitio orientado o propenso a la escisión. En una realización, el ácido nucleico fusionado puede codificar para polipéptidos que comprenden sitios de escisión enzimática. En realizaciones adicionales, la escisión enzimática puede auxiliar a aislar los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, así como también otros segmentos polipeptídicos fusionados, de otros polipéptidos adicionales. A modo de ejemplo, un ácido nucleico intermediario que codifica para un sitio de escisión enzimática colocado entre ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y un epítopo puede permitir la separación posterior de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 expresados y el epítopo. Dichos sitios también pueden estar presentes entre la porción de toxina A y la porción de toxina B.

En la presente memoria se describen sistemas de expresión diseñados para auxiliar a expresar y proporcionar los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. El sistema de expresión puede comprender una célula hospedante transformada o transfectada con un ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La célula hospedante puede ser un procarionte. El procarionte puede ser E. coli. La célula hospedante puede ser una célula eucarionte.

El sistema de expresión puede comprender además agentes que ayudan en la selección de las células hospedantes transformadas o transfectadas de forma exitosa con un ácido nucleico que codifica para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede expresar además un gen que ayuda a la célula hospedante en la resistencia a antibióticos, tales como genes para resistir a la kanamicina o gentamicina o ampicilina o penicilina. Dichos genes resistentes permitirán la selección de células hospedantes que tienen incorporado de forma adecuada el ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, tal como lo saben los expertos en la técnica.

Otro aspecto descrito en la presente está dirigido a la generación de anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos producidos mediante la inmunización de un sujeto con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los anticuerpos generados mediante la inmunización con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se pueden unir específicamente a la toxina A o la toxina B, o pueden hacer reacción cruzada con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los anticuerpos producidos por los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente memoria pueden caracterizarse utilizando métodos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos producidos utilizando el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpo (p. ej., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de cadena pesada solo, anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de cadena simple (scFv), anticuerpos de dominio simple, variantes de los mismos, polipéptidos aislados que comprende una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina molécula que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno con la especificidad requerida, incluidas variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos preferidos derivan de ratón, rata, humano, conejo, canino, porcino, dromedario, camello, llama, felino, primate o cualquier otro origen (incluidos anticuerpos quiméricos, fragmentos y/o anticuerpos humanizados).

En otras realizaciones, los anticuerpos producidos mediante inmunización con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 después se humanizan mediante métodos conocidos en la técnica. Un anticuerpo humanizado es una molécula de inmunoglobulina que contiene una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En otras realizaciones adicionales, se obtienen anticuerpos completamente humanos utilizando ratones disponibles en el mercado que se han genomanipulado para expresar proteínas inmunoglobulinas humanas específicas. En otras realizaciones, los anticuerpos son quiméricos. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo que combina características de dos anticuerpos diferentes. Los métodos para preparar anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica.

En otras realizaciones, se obtiene la secuencia nucleotídica que codifica para los anticuerpos y después se clona en un vector para expresión o propagación. En otra realización, los anticuerpos se producen de forma recombinante y se expresan utilizando métodos conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede utilizarse como antígeno a los efectos de aislar anticuerpos recombinantes por medio de estas técnicas. Los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante mediante el uso de secuencias génicas para expresar el anticuerpo de forma recombinante en células hospedantes. Los métodos para producir variantes de anticuerpos y anticuerpos recombinantes se conocen en la técnica.

En otras realizaciones, los anticuerpos se unen a un vehículo mediante métodos convencionales en la técnica, para uso, por ejemplo, para aislar o purificar toxina A o toxina B natural o detectar toxina A o toxina B natural o C. difficile en una muestra biológica o espécimen.

Composiciones y formulaciones

En la presente memoria se describen composiciones que comprenden los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones utilizadas en los métodos descritos en la presente generalmente comprende, a modo de ejemplo y no como limitación, una cantidad eficaz del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 (p. ej., una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria) descrito en la presente o un anticuerpo contra los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 (p. ej., una cantidad de un anticuerpo neutralizante suficiente para mitigar la infección, aliviar un síntoma de la infección y/o prevenir la infección). La composición farmacéutica puede comprender además vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica (véase, en general, Remington, (2005) The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams and Wilkins).

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente memoria se puede utilizar en métodos para inmunizar o tratar humanos y/o animales con la EACD. Por lo tanto, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se pueden utilizar en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden comprender además vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención son convenciones y pueden incluir tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y solubilizantes. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15a Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de los polipéptidos descritos en la presente memoria. En general, la naturaleza del vehículo o excipiente dependerá del modo de administración específico que se empleará. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden normalmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como el agua, disolución salina isotónica, disoluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (p. ej. en forma de polvo, pastilla, comprimido o cápsula), los vehículos sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los vehículos biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se administrarán pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tampón de pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

En una realización, la composición farmacéutica puede comprender además una sustancia inmunoestimulante, tal como un adyuvante. El adyuvante se puede seleccionar en función del método de administración y pueden incluir adyuvantes basados en aceite mineral tales como el adyuvante de Freund completo o incompleto, adyuvante Montanide incompleto de Seppic tal como ISA, adyuvantes de emulsión de aceite en agua tales como el sistema adyuvante Ribi, formulación adyuvante syntax que contiene dipéptido de muramilo, hidróxido de aluminio o adyuvante de sal de aluminio (alumbre), polímero policatiónico, especialmente péptido policatiónico, especialmente poliarginina o un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleótido (ODN) inmunoestimulador que contiene dinucleótidos de citosina-guanina no metilados (CpG) en un contexto de bases definido (p. ej., tal como se describe en WO 96/02555) o ODN basados en inosina y citidina (p. ej., tales como se describen en WO 01/93903), o ácido desoxinucleico que contiene residuos desoxi-inosina y/o desoxiuridina (tales como se describen en WO 01/93905 y WO 02/095027), especialmente Oligo(dIdC)13 (tal como se describe en WO 01/93903 y WO 01/93905), compuesto neuroactivo, especialmente hormona de crecimiento humana (descrita en WO 01/24822) o combinaciones de estos. Dichas combinaciones se hacen según las descritas, por ejemplo, en WO 01/93905, WO 02/32451, WO 01/54720, WO 01/93903, WO 02/13857, WO 02/095027 y WO 03/047602. Preferiblemente, el adyuvante es un adyuvante de hidróxido de aluminio.

Los vehículos, excipientes o estabilizadores son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones que se administran. Los vehículos, excipientes o estabilizadores pueden comprender además tampones. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos (tales como monosacáridos y disacáridos), azúcares (tales como sacarosa, manitol y sorbitol), fosfato, citrato, antioxidantes (tales como ácido ascórbico y metionina), conservantes (tales como fenol, butamol, benzanol; aquilparabenos, catecol, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio y mcresol), polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas (tales como seroalbúmina o inmunoglobulinas), aminoácidos poliméricos hidrófilos, agentes quelantes (tales como EDTA), contraiones formadores de sales, complejos metálicos (tales como complejos Zn-proteína) y tensioactivos no iónicos (tales como TWEEN™ y polietilenglicol).

La composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede comprender además agentes adicionales que sirven para potenciar y/o complementar el efecto deseado. A modo de ejemplo, para potenciar la inmunogenicidad del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la invención que se administra como una vacuna de subunidades, la composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante.

Un ejemplo de una composición farmacéutica puede ser una composición inmunógena. En la presente memoria se describen composiciones inmunógenas que comprenden los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La composición inmunógena puede incluir además un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otros vehículos y/o excipientes en una formulación adecuada para inyección en un mamífero. Una composición inmunógena es cualquier composición de material que desencadena una respuesta inmunitaria en un hospedante mamífero cuando la composición inmunógena se inyecta o se introduce de otra forma. La respuesta inmunitaria puede ser humoral, celular o ambas. Un efecto de refuerzo hace referencia a una respuesta inmunitaria aumentada a una composición inmunógena tras la exposición posterior del hospedante mamífero a la misma composición inmunógena. Una respuesta humoral resultada en la producción de anticuerpos por parte del hospedante mamífero tras la exposición a la composición inmunógena.

Las composiciones inmunógenas descritas en la presente memoria desencadenan una respuesta inmunitaria en un hospedante mamífero, incluidos humanos y otros animales. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta dependiente de la célula o una respuesta dependiente del anticuerpo o ambas; y además la respuesta puede proporcionar memoria inmunológica o un efecto de refuerzo o ambos en el hospedante mamífero. Estas composiciones inmunógenas son útiles como vacunas y pueden proporcionar una respuesta protectora por parte del sujeto u hospedante mamífero a la infección por cepas de C. difficile.

En la presente memoria se describen métodos para producir una composición inmunógena mediante la construcción de un ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y la expresión del componente de polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en un hospedante microbiano; recuperar el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de un cultivo del hospedante; conjugar el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 con un segundo componente proteico y recuperar la proteína conjugada y el componente polisacárido. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede mantenerse a lo largo del crecimiento del hospedante mediante presión selectiva constante y estable. Se puede conferir el mantenimiento del vector de expresión mediante la incorporación en el vector de expresión de una secuencia genética que codifica para un genotipo selectivo, cuya expresión en la célula hospedante microbiana resulta en un fenotipo selectivo. Una secuencia de genotipo selectivo también puede incluir un gen que complementa una mutación letal condicional. Se pueden incorporar otras secuencias genéticas en el vector de expresión, tales como otros genes de resistencia a fármacos o genes que complementan mutaciones letales. Los hospedantes microbianos pueden incluir: bacterias gram positivas; bacterias gram negativas, tales como E. coli; levaduras; hongos filamentosos; células de mamíferos; células de insectos; o células vegetales.

Los métodos descritos en la presente memoria también proporcionan un nivel de expresión del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en el hospedante a un nivel mayor que alrededor de 50 mg/litro del cultivo, un nivel mayor que alrededor de 100 mg/litro, un nivel mayor que alrededor de 500 mg/litro o un nivel mayor que alrededor de 1 g/litro. La proteína puede recuperarse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica para el aislamiento y la recuperación de proteínas, tales como precipitación en sulfato de amonio y posteriormente cromatografía de intercambio iónico.

En la presente memoria se describen métodos para preparar la composición inmunógena que proporciona que el componente de proteína se conjugue con un segundo componente de proteína mediante uno de varios medios conocidos por los expertos en la técnica, tal como una reacción de amidización.

En la presente memoria se describen formulaciones que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 para tratar y prevenir EACD. En una realización, la formulación puede incluir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente, un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la formulación incluye el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente o consiste esencialmente en uno o más polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente. La formulación puede comprender el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente y un adyuvante. La formulación puede incluir además un antígeno o un fármaco adicional. Además, la formulación puede incluir uno o más fármacos y puede incluir además del polipéptido aislado y/o adyuvante, uno o más fármacos.

La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede estar en forma líquida o seca. Una formulación seca se puede almacenar y transportar fácilmente. Las formulaciones secas prescinden de la cadena de frío requerida desde el lugar de fabricación de la vacuna hasta el local donde se lleva a cabo la vacunación. Alternativamente, el ingrediente activo seco de la formulación puede ser de por sí una mejora al proporcionar una forma en partículas sólidas que las células que presentan antígenos absorben y procesan. Estos posibles mecanismos no se describen para limitar el alcance de la invención o sus equivalentes, sino para facilitar el entendimiento del funcionamiento de la invención y guiar el uso de la formulación en la inmunización y vacunación.

Las formulaciones secas del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se pueden proporcionar en varias formas, por ejemplo, polvos finos o granulados, polvo liofilizado, películas uniformes, sedimentos o comprimidos. Se pueden secar al aire, secar a temperatura elevada, liofilizar, congelar o secar por pulverización, recubrir o pulverizar sobre un sustrato sólido y después secar, espolvorear sobre un sustrato sólido, congelar rápidamente y después secar lentamente al vacío o combinaciones de estas. Si diferentes moléculas conforman los ingredientes activos de la formulación, las mismas se pueden mezclar en disolución y después secar, o se pueden mezclar solo en forma seca.

Las formulaciones que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en forma líquida o sólida, tal como una forma sólida, se pueden aplicar con uno o más adyuvantes en el mismo o en sitios separados o simultáneamente o en aplicaciones repetidas frecuentes. La formulación puede incluir otros antígenos de forma tal que la administración de la formulación induzca una respuesta inmunitaria contra múltiples antígenos. En tal caso, los otros antígenos pueden tener estructuras químicas diferentes a efectos de inducir una respuesta inmunitaria específica para diferentes antígenos. Al menos un antígeno y/o adyuvante se puede conservar en forma seca antes de la administración. La liberación posterior de líquido desde un reservorio o entrada de líquido hacia un reservorio que contiene el ingrediente seco de la formulación disolverá al menos parcialmente dicho ingrediente.

También se pueden incorporar sólidos (p. ej., partículas en dimensiones de nanómetros o micrómetros) en la formulación. Las formas sólidas (p. ej., nanopartículas o micropartículas) pueden auxiliar en la dispersión o solubilización de ingredientes activos; proporcionar un punto de acoplamiento para el adyuvante, polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, o ambos con un sustrato que se puede opsonizar mediante células que presentan antígeno, o combinaciones de estos. La liberación prolongada de la formulación desde un sólido poroso con forma de lámina, varilla o perla actúa como un depósito.

Al menos un ingrediente o componente de la formulación (es decir, polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, adyuvante o fármaco) se puede proporcionar en forma seca antes de la administración de la formulación. Esta formulación también se puede usar conjuntamente con técnicas de inmunización entéricas, mucosales o parenterales convencionales.

La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se puede fabricar en condiciones asépticas aceptables para las agencias reguladoras apropiadas (p. ej., la Dirección de Fármacos y Alimentos, EMEA (siglas en inglés para Agencia Europea de Medicamentos) para productos biológicos y vacunas). Opcionalmente, se pueden incluir componentes tales como desecantes, excipientes, estabilizadores, humectantes, conservantes o combinaciones de estos en la formulación aunque sean inmunológicamente inactivos. Sin embargo, pueden tener otras propiedades o características deseables.

Los procesos para la fabricación de una formulación farmacéutica son conocidos. Los componentes de la formulación se pueden combinar con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable, así como también con cualquier combinación de aditivos opcionales (p. ej., diluyentes, aglutinantes, excipientes, estabilizadores, desecantes, conservantes, colorantes). El uso de vehículos sólidos y la adición de excipientes para auxiliar en la solubilización de componentes secos o estabilizadores de la actividad inmunógena o adyuvante representan realizaciones preferidas. Véase, en general, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a Ed. (edición electrónica, 2003); Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a (Gennaro, 2005, Mack Publishing); Pharmaceutical Dosage Forms, 2a Ed. (diversos editores, 1989-1998, Marcel Dekker); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Ansel et al., 2005, Williams & Wilkins).

Las buenas prácticas de fabricación son conocidas en la industria farmacéutica y reguladas por las agencias gubernamentales (p. ej., la Dirección de Fármacos y Alimentos, la EMEA). Se pueden preparar formulaciones líquidas estériles al disolver un componente previsto de la formulación en una cantidad suficiente de un disolvente adecuado y posteriormente esterilizar mediante filtración para extraer los microbios contaminantes. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos componentes esterilizados de la formulación en un portador estéril que contiene el medio de dispersión básico. Para la producción de formas sólidas que debe ser estériles se puede utilizar secada al vacío o secado por congelamiento.

En general, las formas de dosificación sólidas (p. ej., polvos, gránulos, sedimentos, comprimidos) se pueden producir con al menos un ingrediente activo o componente de la formulación.

Los procedimientos adecuados para la formación de comprimidos son conocidos. La formulación también se puede producir al encapsular formas sólida de al menos un ingrediente activo, o mantenerlas separadas de los líquidos en compartimientos o cámaras. Se pueden utilizar el tamaño de cada dosis y el intervalo de dosificación para el sujeto para determinar el tamaño y la forma adecuados del comprimido, cápsula, compartimiento o cámara.

Las formulaciones contendrán una cantidad eficaz de ingredientes activos (p. ej., fármaco, antígeno y adyuvante) junto con un vehículo o cantidades adecuadas de portador a efectos de proporcionar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración a un humano o animal.

Las cantidades relativas de ingredientes activos, tales como las cantidades de polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, dentro de una dosis y el régimen de dosificación se pueden ajustar según sea adecuado para la administración eficaz a una sujeto (p. ej., animal o humano). Este ajuste también puede depender de la enfermedad o afección específica del sujeto y de se pretende brindar tratamiento o profilaxis. Para simplificar la administración de la formulación al sujeto, cada dosis unitaria contiene los ingredientes activos en cantidades predeterminadas para una única instancia de inmunización.

Existen numerosas causas de la inestabilidad o degradación del polipéptido, incluidas la hidrólisis y la desnaturalización. En el caso de la desnaturalización, se altera la conformación o estructura tridimensional de la proteína y la proteína se despliega y pierde su estructura globular habitual. En lugar de volver a plegarse en su conformación natural, la interacción hidrófoba puede provocar que las moléculas se acumulen (es decir, aglomeración) o que se vuelvan a plegar en una conformación no natural. Cualquiera de estos resultados pueden conducir a la disminución o pérdida de la actividad inmunógena o adyuvante. Se pueden agregar estabilizadores para reducir o prevenir dichos problemas.

La formulación, o cualquier intermediario en su producción, se puede pretratar con agentes protectores (es decir, crioprotectores y estabilizadores secos) y después someterse a tasas de enfriamiento y temperaturas finales que minimizan la formación de cristales de hielo. Mediante la selección adecuada de agentes crioprotectores y el uso de parámetros de secado preseleccionados, casi cualquier formulación podría crioprepararse para un uso final deseado adecuado.

Se ha de entender en la siguiente descripción de aditivos opcionales como excipientes, estabilizadores, desecantes y conservantes, que se describen por su función. Por consiguiente, una sustancia química específica puede actuar como una combinación de receptor, estabilizador, desecante y/o conservante. Dicha sustancia química sería inmunológicamente inactiva porque no induce de forma directa una respuesta inmunitaria, pero aumenta la respuesta al potenciar la actividad inmunológica del antígeno o adyuvante: por ejemplo, al reducir la modificación del antígeno o adyuvante o la desnaturalización durante el secado y los ciclos de disolución.

Los estabilizadores incluyen ciclodextrina y variantes de la misma (véase la patente estadounidense N.° 5.730.969). Se pueden agregar también conservantes adecuados tales como sacarosa, manitol, sorbitol, trehalosa, dextrano y glicerina para estabilizar la formulación final (Howell y Miller, 1983). Se puede agregar a la formulación un estabilizador seleccionado de tensioactivos no iónicos, D-glucosa, D-galactosa, D-xilosa, ácido D-glucurónico, sales de ácido D-glucurónico, trehalosa, dextranos, almidones hidroxietílicos y mezclas de los mismos. La adición de una sal de metal alcalino o cloruro de magnesio puede estabilizar el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, y se puede incluir opcionalmente seroalbúmina y secar por congelamiento para potenciar adicionalmente la estabilidad. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 también se puede estabilizar al ponerlo en contacto con un sacárido seleccionado del grupo que consiste en dextrano, ácido condroitinosulfúrico, almidón, glicógeno, insulina, dextrina y sal de ácido algínico. Otros azúcares que se pueden agregar incluyen monosacáridos, disacáridos, alcoholes de azúcar y mezclas de estos (p. ej., glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, manitol, xilitol). Los polioles pueden estabilizar un polipéptido y son miscibles con agua o solubles en agua. Los polioles adecuados pueden ser alcoholes polihidroxi, monosacáridos y disacáridos que incluyen manitol, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, trimetilglicol, pirrolidona vinílica, glucosa, fructosa, arabinosa, manosa, maltosa, sacarosa y polímeros de estos. Varios excipientes también pueden estabilizar a los polipéptidos, incluidos seroalbúmina, aminoácidos, heparina, ácidos grasos y fosfolípidos, tensioactivos, metales, polioles, agentes reductores, agentes quelantes metálicos, pirrolidona polivinílica, gelatina hidrolizada y sulfato de amonio.

A modo de ejemplo, la formulación de polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se puede estabilizar en sacarosa, trehalosa, poli(ácido láctico) (PLA) y microesferas de ácido poli(láctico-co-glicólido) (PLGA) mediante la elección adecuada del excipiente o estabilizador (Sanchez et al., 1999). La sacarosa o trehalosa se puede utilizar de forma ventajosa como un aditivo porque es un sacárido no reductor y, por lo tanto, no provoca reacciones amino-carbonilo con sustancias que contienen grupos amino tales como proteínas. La sacarosa o trehalosa se puede combinar con otros estabilizadores tales como sacáridos.

Además, la formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede incluir agentes terapéuticos tales como, p. ej., anestésicos, analgésicos, antiinflamatorios, esteroides, antibióticos, antiartríticos, anorexígenos, antihistamínicos y antineoplásicos. Los ejemplos de dichos agentes terapéuticos incluyen lidocaína y fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE). En otra realización, los agentes terapéuticos son antígenos y adyuvantes. En otra realización adicional, la formulación que comprenden antígeno y/o adyuvante puede aplicarse por separado pero junto con otros agentes terapéuticos, tales como, p. ej., anestésicos, analgésicos, antiinflamatorios, esteroides, antibióticos, antiartríticos, anorexígenos, antihistamínicos y antineoplásicos. En una realización preferida, los antibióticos son fidaxomicina, metronidazol o vancomicina.

La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se puede administrar a través de diversas vía de administración tales como, p. ej., intramuscular.

Se pueden agregar polímeros a la formulación y pueden actuar como excipiente, estabilizador y/o conservante de un ingrediente activo así como también reducir la concentración de ingrediente activo que satura una disolución utilizada para disolver la forma seca del ingrediente activo. Dicha reducción se produce porque el polímero reduce el volumen efectivo de la disolución al llenar el espacio «vacío». Por consiguiente, se pueden conservar las cantidades de antígeno/adyuvante sin reducir la cantidad de disolución saturada. Una consideración termodinámica importantes es que se «impulsará» un ingrediente activo en la disolución saturada hacia regiones de concentración más baja. En disolución, los polímeros también pueden estabilizar y/o conservar la actividad de antígeno/adyuvante de ingredientes solubilizados de la formulación. Dichos polímeros incluyen polímeros y copolímeros de etileno o propilenglicol, pirrolidona vinílica y 0-ciclodextrina.

Se proporciona una dosis simple o unitaria de la formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 adecuada para administración. La cantidad de adyuvante y/o polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en la dosis unitaria puede estar en cualquier punto de un intervalo amplio de alrededor de 0,001 pg a alrededor de 10 mg. Este intervalo puede ser de alrededor de 0,1 pg a alrededor 1 mg; un intervalo menor es de alrededor de 5 pg a alrededor de 500 pg. Otros intervalos adecuados están entre alrededor de 20 pg y alrededor de 200 pg, tales como, p. ej., alrededor de 20 pg, alrededor de 75 pg o alrededor de 200 pg. Una dosis preferida de un polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 es de alrededor de 20 pg o 200 pg o menos. La relación entre el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el adyuvante puede ser de alrededor de 1:1 o alrededor de 1:1,25, pero también se pueden utilizar relaciones más elevadas (p. ej., alrededor de 1:10 o menor), o se pueden utilizar también relaciones más bajas entre el polipéptido aislado C-TAb y el adyuvante (p. ej., alrededor de 10:1 o mayor).

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se puede utilizar como antígeno y se puede presentar a células inmunitarias e inducir una respuesta inmunitaria específica para el antígeno. Esto se puede producir antes, durante o después de la infección por un patógeno, tal como, C. difficile. Solo el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede ser necesario, sin ningún adyuvante adicional, si la inmunogenicidad de la formulación es suficiente para que no sea necesaria una actividad adyuvante. La formulación puede incluir un antígeno adicional de forma tal que la aplicación de la formulación induzca una respuesta inmunitaria contra múltiples antígenos (es decir, polivalente). En la respuesta inmunitaria pueden participar linfocitos específicos para el antígeno y, en caso de que participen linfocitos B, anticuerpos específicos para el antígeno pueden formar parte de la respuesta inmunitaria. Las formulaciones descritas anteriormente pueden incluir desecantes, excipientes, humectantes, estabilizadores y conservantes conocidos en la técnica.

La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente memoria se puede utilizar para tratar a un sujeto (p. ej., un humano o animal que necesita tratamiento tal como prevención de una enfermedad, protección contra efectos de la infección, reducción o alivio de los síntomas de una enfermedad, tal como EACD o combinaciones de estos). Por ejemplo, la formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descrito en la presente memoria se puede utilizar para tratar a un sujeto en riesgo de padecer una EACD, tal como, p. ej., un sujeto con el siguiente perfil: i) un sujeto con un sistema inmunitario más débil, tal como, p. ej., un sujeto anciano (p. ej., un sujeto con más de 65 años de edad) o un sujeto con menos de 2 años de edad; ii) un sujeto inmunodeprimido, tal como, p. ej., un sujeto con SIDA; iii) un sujeto que toma o planea tomar fármacos inmunosupresores; iv) un sujeto con una hospitalización planeada o un sujeto que está en un hospital; v) un sujeto que está o se espera que vaya a una unidad de cuidados intensivos (UCI); vi) un sujeto que se está sometiendo o planea someterse a cirugía gastrointestinal; vii) un sujeto que está o planea ir a un centro de asistencia para una estancia prologada, tal como, una residencia de ancianos; viii) un sujeto con comorbilidades que requiere un uso frecuente y/o prolongado de antibióticos; ix) un sujeto que es un sujeto con dos o más de los perfiles mencionados anteriormente, tal como, p. ej., un sujeto anciano que planea someterse a una cirugía gastrointestinal; x) un sujeto con enfermedad inflamatoria intestinal; y/o xi) un sujeto con EACD recurrente, tal como, p. ej., un sujeto que ha sufrido uno o más episodios de EACD.

El tratamiento puede vacunar al sujeto contra la infección por el patógeno o contra sus efectos patógenos, tales como aquellos causados por la secreción de toxina. La formulación se puede utilizar de forma terapéutica para tratar una enfermedad existente, de forma protectora para prevenir una enfermedad, para reducir la gravedad y/o duración de una enfermedad, para mejorar los síntomas de la enfermedad, o combinaciones de estos.

Las formulaciones que comprenden los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se pueden administrar por diversas vías de administración que incluyen, pero no se limitan a, vía oral, subcutánea, intradérmica, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intracardíaca, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular y/o sublingual.

La formulación puede comprender también uno o más adyuvantes o combinaciones de adyuvantes. Normalmente, el adyuvante y la formulación se mezclan antes de la presentación del antígeno pero, alternativamente, pueden presentarse por separado en un intervalo de tiempo corto.

Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, una emulsión oleosa (p. ej., adyuvante de Freund completo o incompleto), adyuvante Montanide incompleto de Seppic tal como ISA, adyuvantes de emulsión de aceite en agua tales como el sistema adyuvante Ribi, formulación adyuvante syntax que contiene dipéptido de muramilo, adyuvante de hidróxido o sal de aluminio (ALUM), polímero policatiónico, especialmente péptido policatiónico, especialmente poliarginina o un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleótido (ODN) inmunoestimulador que contiene dinucleótidos de citosina-guanina no metilados (CpG) en un contexto de bases definido (p. ej., tal como se describe en WO 96/02555) o ODN basados en inosina y citidina (p. ej., tales como se describen en WO 01/93903), o ácido desoxinucleico que contiene residuos desoxi-inosina y/o desoxiuridina (tales como se describen en WO 01/93905 y WO 02/095027), especialmente Oligo(dIdC)13 (tal como se describe en WO 01/93903 y WO 01/93905), compuesto neuroactivo, especialmente hormona de crecimiento humana (descrita en WO 01/24822), o combinaciones de estos, una quimiocina (p. ej., defensinas 1 o 2, RANTES, MlP1-a, MIP-2, interleucina-8, o una citocina (p. ej., interleucina-1p, -2, -6, -10 o -12; interferón-Y; factor de necrosis tumoral-a; o factor estimulador de colonias de granulocitos-monocitos) (descrito en Nohria and Rubin, 1994), una variante dipeptídica de muramilo (p. ej., murabutida, treonil-MDP o tripéptido de muramilo), variantes sintéticas de MDP, una proteína de choque térmico o una variante, una variante del LeIF principal de Leishmaniasis (Skeiky et al., 1995), variantes no tóxicas de exotoxinas ADP-ribosilantes bacterianas (bARE, por sus siglas en inglés) incluidas variantes en el sitio de escisión por tripsina (Dickenson and Clements, 1995) y/o bARE que afectan la ADP-ribosilación (Douce et al., 1997) o químicamente destoxificadas (anatoxinas), QS21, Quill A, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-sglicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida (MTP-PE) y composiciones que contienen un aceite metabolizable y un agente emulsionante, donde el aceite y el agente emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de aceite y todas tienen sustancialmente menos de un micrón de diámetro (véase, por ejemplo, EP 0399843). Además, véase Richards et al. (1995) donde se indican otros adyuvantes útiles en la inmunización.

Se puede elegir un adyuvante para inducir preferentemente anticuerpos o efectores celulares, isotipos de anticuerpo específicos (p. ej., IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4), o subconjuntos de linfocitos T específicos (p. ej., CTL, Th1, Th2 y/o T^dth) (véase, por ejemplo, Munoz et al., 1990; Glenn et al., 1995).

Se sabe que los dinucleótidos CpG o motivos no metilados activan los linfocitos B y macrófagos (Stacey et al., 1996). Otras formas de ADN se pueden utilizar como adyuvantes. Los ADN bacterianos están entre una clase de estructuras que tienen patrones que permiten que el sistema inmunitario reconozca sus orígenes patógenos para estimular la respuesta inmunitaria innata que conduce a respuestas inmunitarias adaptativas (Medzhitov and Janeway, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9(1): 4-9). Estas estructuras se denominan patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) e incluyen lipopolisacáridos, ácidos teicoicos, motivos CpG no metilados, ARN bicatenario y maninas. Los PAMP inducen señales endógenas que pueden mediar la respuesta inflamatoria, actuar como coestimuladores de la función de los linfocitos T y controlar la función efectora. La capacidad de los PAMP para inducir estas respuestas tiene un papel en su potencial como adyuvantes y sus objetivos son CPA (células presentadoras de antígenos) tales como macrófagos y células dendríticas. Los PAMP también podrían utilizarse conjuntamente con otros adyuvantes para inducir diferentes moléculas coestimuladoras y controlar diferentes funciones efectoras para guiar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, de una respuesta Th2 a una Th1.

En la presente memoria se describe el uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 como agente de vacunación. Las vacunas o composiciones inmunógenas descritas en la presente puede emplear una cantidad eficaz de antígeno. Se incluirá una cantidad de antígeno que provocará que el sujeto produzca una respuesta inmunitaria específica y suficiente a efectos de impartir protección al sujeto contra la exposición posterior a C. difficile. El antígeno puede ser el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En una realización, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se administra solo o en combinación con un adyuvante.

En la presente memoria se describe el uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 como vacuna de subunidades. Una vacuna de subunidades hace referencia al uso de un fragmento de un patógeno como agente inoculante. Los expertos en la técnica sabrán que las vacunas de subunidades ofrecen un medio para generar anticuerpos para una parte o región específica de un patógeno.

El régimen de dosificación de la administración y eficacia de la vacuna se pueden determinar mediante métodos conocidos en la técnica. La cantidad de vacuna y el régimen de inmunización puede depender del antígeno específico y el adyuvante empleado, el modo y la frecuencia de administración y el efecto deseado (p. ej., protección y/o tratamiento). En general, la vacuna descrita en la presente memoria se puede administrar en cantidades que varían entre 1 pg y 100 mg, tales como, p. ej. entre 60 pg y 600 pg. Una dosis simple de la vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede estar en el intervalo de alrededor de 1 pg a alrededor 1 mg, preferiblemente de alrededor de 5 pg a alrededor de 500 pg, más preferiblemente de alrededor de 20 pg a alrededor de 200 |jg. La relación entre el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el adyuvante, tal como alumbre, puede ser de alrededor de 1:1, tal como, p. ej. 1:1,25, pero también se pueden utilizar relaciones más elevadas (p. ej., alrededor de 1:10 o menor), o se pueden utilizar también relaciones más bajas (p. ej., alrededor de 10:1 o mayor). En una realización, en la vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, se utilizará el adyuvante hidróxido de aluminio en un intervalo de alrededor de 50 jg/m L a alrededor de 200 jg/mL, preferiblemente en la cantidad de alrededor de 125 jg/m L de la formulación final.

La vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se puede administrar por vía oral, intravenosa, subcutánea, intraarterial, intramuscular, intracardíaca, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular y/o sublingual.

El régimen de inmunización se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica. La administración de la vacuna se puede repetir si un experto en la técnica determina que es necesario hacerlo. Por ejemplo, tras una dosis inicial se pueden administrar 1, 2, 3 o más dosis de refuerzo en intervalos semanales, bisemanales o mensuales. En una realización de la presente, invención, después de la dosis inicial se administran uno o dos refuerzos en intervalos de alrededor de 7 a alrededor de 14 días, tal como, p. ej., a los 7 días y 21 días después de la dosis inicial. En una realización preferida, la cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna se administra dos o tres veces en intervalos de 14 días /- 1, 2 o 3 días (bisemanal) a un sujeto. En una realización de la presente invención, la cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna se administra una vez.

Otro aspecto adicional se dirige a la población que se puede tratar según la presente invención. En una realización, la población incluye individuos sanos que están en riesgo de exposición a C. difficile, especialmente, los individuos con una hospitalización inminente o que residen en un centro de asistencia sanitaria, así como también el personal de hospitales, residencias de ancianos y otros centros de asistencia sanitaria. En otra realización, la población incluye pacientes infectados anteriormente que sufrieron una recaída tras suspender el tratamiento con antibióticos o pacientes para quienes el tratamiento con antibióticos no es eficaz.

En una realización adicional de la invención, la población incluye individuos que tienen al menos 18 años o más. En una realización preferida, el sujeto humano tiene entre 18 y 65 años. En otra realización preferida, el sujeto humano es individuos ancianos con más de 65 años. El último grupo etario representa la población más vulnerable a padecer infecciones por C. difficile. En algunas realizaciones adicionales, el sujeto humano tiene menos de 18 años.

Métodos para utilizar el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En la presente memoria se describen métodos para utilizar el polipéptido aislado. Por ejemplo, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede utilizarse para prevenir o tratar enfermedades asociadas con C. difficile. A modo de ejemplo, la introducción de los polipéptidos aislados de la presente invención en el sistema inmunitario de un sujeto puede inducir una respuesta inmunitaria que incluye que el sujeto produzca anticuerpos dirigidos contra el polipéptido aislado. Dichos anticuerpos son útiles para reconocer a C. difficile.

En la presente memoria se describen métodos de administración de los polipéptidos aislados a un sujeto, que comprenden administrar el polipéptido aislado a un sujeto. El polipéptido aislado se puede administrar como un líquido o un sólido. El polipéptido aislado puede incluir además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente memoria se describen métodos para identificar y aislar dominios variables de un anticuerpo que reconocen y se unen a la toxina A y/o la toxina B, que comprenden el uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 para producir una respuesta inmunitaria, purificar y después caracterizar los anticuerpos producidos en respuesta al polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los epítopos identificados se pueden utilizar para clonar adicionalmente anticuerpos o sus fragmentos.

Un aspecto de la presente descripción se dirige en pare al tratamiento, la prevención y la detección de C. difficile. En algunas realizaciones, un sujeto, tal como un animal, recibe tratamiento y/o prevención y/o detección de C. difficile. En otras realizaciones, el animal es un humano. Por ejemplo, los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para producir anticuerpos contra C. difficile in vivo. Como ejemplo adicional, los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para determinar si un sujeto produce anticuerpos contra C. difficile. En algunas realizaciones, el polipéptido se utiliza para aislar anticuerpos. A modo de ejemplo, los polipéptidos pueden estar unidos a una matriz de afinidad.

A modo de ejemplo adicional, el ácido nucleico descrito en la presente se puede utilizarse para transformar y/o transfectar para producir de forma recombinante los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención. Los ácidos nucleicos descritos en la presente también se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar si un sujeto está infectado con C. difficile. A modo de ejemplo, esto se puede lograr utilizando métodos de hibridación radioetiquetada.

Como ejemplo adicional, los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para reconocer una infección por C. difficile. A modo de ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer la toxina A y/o la toxina B natural como un antígeno. Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden utilizar para combatir una infección por C. difficile. A modo de ejemplo, los anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo o anticuerpos monoclonales pueden emplear la propia respuesta inmunitaria del sujeto contra una infección por C. difficile. A modo de ejemplo adicional, los anticuerpos descritos en la presente pueden acoplarse a un citocina o una toxina o una enzima o un marcador para auxiliar en el tratamiento y detección de una infección.

Aspectos adicionales de la presente descripción se relacionan con ensayos de diagnóstico. La presente descripción es útil con muchos ensayos conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán la amplia gama de usos basados en la investigación para los polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos descritos en la presente memoria. Los polipéptidos, anticuerpos y ácidos nucleicos descritos en la presente se pueden, por ejemplo, etiquetar, tal como con moléculas radioactivas, quimioluminiscentes, fluorescentes y/o de tinte. Los anticuerpos, ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la presente son útiles para ensayos de uso, por ejemplo, ensayos de ADN (tales como transferencia southern), ensayos de ARN (tales como transferencia northern), ensayos proteicos (tales como transferencia western), ensayos cromatográficos (tales como gaseosa, líquida, HPLC, de exclusión por tamaño), inmunoanálisis (tales como ELISA) y ensayos estructurales (tales como cristalografía y espectroscopía RMN). Los anticuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos descritos en la presente se pueden utilizar además como sondas. Los ensayos que amplifican las señales desde una sonda también son conocidos por los expertos en la técnica.

Kits

En la presente memoria se describen kits que comprenden, a modo de ejemplo y no como limitación, ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y/o anticuerpos contra el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los kits pueden incluir uno o más contenedores e instrucciones de uso según cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y/o anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden utilizar en una variedad de ensayos que incluyen inmunoensayos para detectar C. difficile. En una realización, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 sirve para funcionar como un antígeno a los efectos de detectar anticuerpos en muestras biológicas. Los contenedores pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes de múltiples dosis) o dosis de subunidades. Los kits de la presente invención están en un envase adecuado. También se contemplan envases para uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal o un dispositivo de infusión. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril. El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril. Los kits opcionalmente pueden proporcionar componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa.

Los kits se pueden utilizar para detectar la presencia de C. difficile o detectar una enfermedad asociada a C. difficile tal como EACD. Los kits se pueden utilizar para prevenir o tratar enfermedades asociadas a C. difficile. Los kits descritos en la presente memoria también se pueden utilizar para aliviar los síntomas de una enfermedad asociada a C. difficile.

Se cree que sin una descripción adicional un experto en la técnica puede, utilizando las descripciones precedentes y los siguientes ejemplos ilustrativos, producir y utilizar la invención reivindicada. Los siguientes ejemplos prácticos señalan, por lo tanto, las realizaciones específicamente preferidas de la presente invención y no se deben interpretar como una limitación en ningún sentido del resto de la descripción.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

El presente ejemplo describe la preparación de polipéptidos aislados que comprenden porciones de las toxinas A (CTA) y B (CTB) de C. difficile para expresión en células de E. coli. El método descrito a continuación se puede utilizar para producir diversos polipéptidos aislados que comprenden CTA y CTB. Como ejemplo, se describe un polipéptido aislado que comprende una porción del dominio del extremo C de CTA y una porción del dominio del extremo C de CTB.

Ejemplo 1.1: Clonación de las construcciones génicas C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

La porción del gen de CTA (N.° de acceso YP-001087137) que codifica para los aminoácidos 2026 a 2710 del dominio del extremo C se amplificó mediante PCR a partir del Ad N genómico de la cepa 630 de C. difficile (ATCC BAA-1382) utilizando los siguientes cebadores:

directo: 5'- caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc -3'(SEQ ID N.°: 9) e

inverso: 5'- CTCGAGttagccatatatcccaggggc -3' (SEQ ID N.°: 10).

La amplificación con el cebador directo creó un sitio Spel y la amplificación con el cebador inverso creó un sitio Xhol.

La porción del gen de CTB (N.° de acceso: YP-00108735) que codifica para los aminoácidos 1850 a 2366 del dominio del extremo C se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:

directo: 5'- caccATGCATatgagtttagttaatag 3' (SEQ ID N.°: 11) e

inverso: 5'- ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc -3' (SEQ ID N.°: 12).

La amplificación con el cebador directo creó un sitio Nsil y la amplificación con el cebador inverso creó un sitio Xhol.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando PCR Super-Mix (Invitrogen). Las condiciones de ciclo fueron 95 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 50 segundos, 68 °C durante 8 minutos (30 ciclos) y 72 °C durante 10 minutos. Los productos de PCR se purificaron con el kit de extracción génica Quick (Invitrogen) y se ligaron con el vector PCR 2.1 TOPO (Invitrogen). Las mezclas de ligación se utilizaron para transformar las células Mech-1 de E. coli mediante choque térmico. Los transformantes se colocaron sobre placas de ImMedia Amp Blue (Invitrogen). Se recogieron colonias blancas y se cultivaron en tubos de 15 ml con 4 ml de medio LB que contenía 100 |jg/ml de ampicilina. Los cultivos se incubaron durante toda la noche a 37 °C y los plásmidos se extrajeron con el kit Quick plasmid miniprep (Invitrogen).

El fragmento del gen de CTA en el vector PCR 2.1 -TOPO/TA se digirió con Spel y Xhol y el fragmento se clonó en un vector intermediario, también digerido con Spel y Xhol, utilizando T4 ADN Ligasa. A continuación se insertó un enlazador que contenía tres sitios de restricción (BgLII-NsiI-SacI) en el extremo 3' del fragmento del gen de CTA mediante PCR utilizando el siguiente conjunto de cebadores sintéticos:

directo: 5'- AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacgaaaggctcagc -3' (SEQ ID N.°: 13)

inverso: 5'- cggtccggggccatatatcccaggggcttttactcc -3' (SEQ ID N.°: 14).

El fragmento del gen de CTB en PCR 2.1 -TOPO/TB se digirió con Nsil y Xhol, y el fragmento de gen de CTB digerido se ligó con el vector intermediario que contenía el gen de CTA y el enlazador, que también se digirió con Nsil y Xhol. El gen de CTB se insertó en dirección a 3' con respecto al enlazador proporcionando la secuencia de construcción 5'-CTA-enlazador-CTB-3'. Esta construcción de fusión se denomina vector intermediario C-TAB.V1.

El gen de C-TAB.G5 se amplificó mediante PCR del vector intermediario C-TAB.V1 utilizando los cebadores:

directo: 5'- caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagga (SEQ ID N.°: 15)

inverso: 5' - CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg (SEQ ID N.°: 16).

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando PCR Super mix (Invitrogen). Las condiciones de ciclo fueron 95 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 50 segundos, 68 °C durante 4 minutos (30 ciclos) y 72 °C durante 10 minutos. Los productos de PCR se purificaron con el kit de extracción génica Quick (Invitrogen) y se ligaron con el vector PCR2.1 TOPO (Invitrogen). Las mezclas de ligación se utilizaron para transformar las células Mech-1 de E. coli mediante choque térmico. Los transformantes se colocaron sobre placas de ImMedia Amp Blue (Invitrogen). Se recogieron colonias blancas y se cultivaron en tubos de 15 ml con 4 ml de medio LB que contenía 100 jg/m l de ampicilina. Los cultivos se incubaron durante toda la noche a 37 °C y los plásmidos se extrajeron con el kit Quick plasmid miniprep (Invitrogen). El gen de fusión de C-TAB.G5 en el vector PCR 2.1 -TOPOTA se digirió con las enzimas de restricción Ncol y Xhol. Estos fragmentos de C-TAB de ligaron con el vector de expresión pET28 digerido con las mismas enzimas de restricción. Esta construcción resultante codifica para el dominio del extremo C de la toxina A de los aminoácidos 2272 a 2710 fusionados con el dominio del extremo C de la toxina B de los aminoácidos 1851 a 2366. La construcción pET28/C-TAB.G5 se transformó BL21 (DE3) de E. coli para expresión. Se seleccionaron cinco colonias que contenían el gen de fusión C-TAB.G5 para análisis.

La secuencia codificante de C-TAB.G5.1 se obtuvo mediante optimización codónica para una expresión mejorada en células hospedantes de E. coli. El uso de los codones se adaptó a la preferencia codónica de los genes de E. coli. Además, se ajustó el contenido de GC para prolongar la semivida del ARNm; se evitó una región con un contenido de GC muy elevado (>80 %) o muy bajo (<30 %). Por lo tanto, el gen optimizado posibilita tasas de expresión elevadas y estables en E. coli. El gen de C-TAB.G5.1 optimizado por codones se sintetizó in situ y se subclonó en el vector de expresión pET-28b(+).

Secuenciación de ADN: Las secuencias de ADN plasmídico se confirmaron utilizando química de secuenciación de terminador de ciclo en tinte con tintes de d-Rodamina. Los datos de la secuenciación se analizaron utilizando el programa informático Jellyfish.

Ejemplo 1.2: Expresión de las proteínas de fusión C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 recombinantes en E. coli.

La expresión de las construcciones génicas C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1 se puede lograr utilizando un procedimiento estándar para expresión en E. coli.

Barrido de colonias para determinar la expresión de la proteína de fusión C-TAB recombinante: A los efectos del barrido, se recogieron colonias y se cultivaron en tubos Falcon de 15 ml con 4 ml de medio LB que contenía 50 jg/ml de kanamicina. Los tubos se cultivaron durante toda la noche a 37 °C con mezcla a 250 rpm. Tras la fase de crecimiento inicial, se transfirió 1 ml de cultivo de cada tubo a una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y se indujo la expresión con 1 mM isopropil-p-D-1-tiogalacto-piranósido (IPTG) durante 3 h a 30 °C. Se recogieron los sedimentos celulares mediante centrifugación a 12.000 g durante 1 min en microcentrífuga. Se prepararon lisados de sedimento celular y la fracción soluble se sometió a ensayo mediante DT-PAGE y análisis de transferencia western para determinar la expresión de la proteína de fusión C-TAB. Los colones positivos se seleccionaron para evaluación adicional.

Fermentación por lotes para la expresión de C-TAB.G5: Se cultivaron cultivos de siempre en cinco matraces de agitación de 500 ml que contenían cada uno 150 ml de medio Super Broth complementado con 30 pg/ml de kanamicina. Los cultivos se cultivaron durante 12 h a 28 °C con agitación continua a 275 rpm hasta que la DO⁶⁰⁰ alcanzó 2 a 2,5. Los matraces de agitación se utilizaron para inocular un fermentador que contenía 10 L de Super Broth. El cultivo se cultivó alrededor de 4,5 h a 37 °C hasta DO⁶⁰⁰ = 3,5 a 4. Para la inducción de la expresión del producto se agregó 0,1 mM de IPTG y el cultivo continuó durante 4 h más a 25 °C. A continuación las células se cosecharon mediante centrifugación y la pasta celular se almacenó congelada a -70 °C. Un tasa de expresión específica del producto típica mediante este proceso de fermentación fue de alrededor de 200 mg/ml.

Fermentación con alimentación en lotes para la preparación de C-TAB.G5.1: Se utilizó una alícuota de 500 pl de concentrado de glicerol de un banco de cultivo (almacenado a -75°C) para inocular 100 ml de medio de precultivo complementado con 30 pg/ml de kanamicina en un matraz de agitación de 1 L. El precultivo se incubó a 37 °C con agitación constante ~150 rpm durante alrededor de 7 h hasta que alcanzó una DO⁶⁰⁰ = 1,0 a 2,0. Se utilizaron 25 mL de precultivo para inocular 7 L de medio de fermentación por lotes en un termentador de 15 L estándar en la industria equipado con un sistema de control del proceso capaz de llevar a cabo fermentaciones con alimentación por lotes. La fase de cultivo en lote de 7 L se llevó a cabo durante 12 h a 37 °C (DO⁶⁰⁰ = 12 a 15) hasta que se agotó la glucosa. La fase libre de glucosa (producción de biomasa) a continuación se inició mediante un modo de alimentación exponencial a una constante de tasa de cultivo específica p = 0,25/h a 37 °C durante 6 h (DO⁶⁰⁰ = 40 a 50). Una hora antes de cambiar a una fase de alimentación constante e inducción con una concentración final de 1 mM IPTG (producción de producto), la temperatura se redujo hasta alcanzar 30 °C para reducir el riesgo de formación de cuerpos de inclusión. La fase de expresión de producto continuó durante otras 5 h con alimentación constante a 30 °C (DO⁶⁰⁰ = ~100) que resultaron en un tiempo de proceso de fermentación total de 23 h y un volumen de cultivo final de ~8,2 L. Se cosechó una biomasa celular húmeda de alrededor de 1,2 kg mediante centrifugación y se almacenó a < -70 °C. Un tasa de expresión específica del producto típica alcanzada mediante la fermentación con alimentación por lotes fue de hasta 1,3 g/L.

Ejemplo 1.3: Purificación de las proteínas de fusión C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 recombinantes.

Purificación de muestra analítica de C-TAB.G5: La pasta celular congelada se descongeló y se volvió a suspender en 10 mM de tampón ácido cítrico/NaOH a pH 5,6, y la suspensión celular se pasó dos veces a través de un homogeneizador (homogeneizador GEA Niro Soavi) a 550 bar. La suspensión se centrifugó dos veces: una vez a 13500 rpm durante 30 minutos y la segunda vez a 18000 rpm en una ultracentrífuga durante una hora. Los sobrenadantes se concentraron y se ajustó el pH hasta alcanzar 5,6 con 50 mM de tampón de ácido cítrico pH 3. Los lisados celulares clarificados se pasaron por una columna de flujo rápido SP con 10 mM de tampón ácido cítrico/NaOH a pH 5,6. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de cloruro de sodio con aumento de 0 a 500 mM en 20 mM de NaPi. Las fracciones que contenían C-TAB.G5 se concentraron. La conductividad se ajustó hasta 5 mS/cm con H²O destilado. Se agregó Tris hasta una concentración final de 25 mM. Las fracciones concentradas se pasaron por una columna de flujo rápido DEAE. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio con aumento de 50 a 500 mM en 25 mM de Tris. Nuevamente, las fracciones que contenían C-TAB.G5 se concentraron y se agregó 1,5 M Na-Citrato, pH 7,5 hasta una concentración final de 0,4 M. El concentrado de C-TAB. V1 se cargó en una columna de Sepharose HP fenol equilibrada con 25 mM de Tris, 0,4 M Na-Citrate, pH 7,5. La proteína de fusión C-TAB.G5 se eluyó con una reducción de concentración de sal en un gradiente lineal utilizando 5 mM de TRIS, pH 7,5. Todas las columnas se monitorizaron mediante un sistema de cromatografía AKTA Prime. Se intercambió el tampón de proteína de fusión C-TAB a PBS utilizando una membrana de 50 K.

Purificación de la preparación a granel de C-TAB.G5.1: La biomasa se almacenó a -80 °C hasta el procesamiento. Se diluyen 450 g de pasta celular congelada (equivalente a 2,90 L del fermentador) con 4 volúmenes de tampón de lisis (20 mM de Hepes, pH 7,5, ~0,6 mS/cm) (p. ej., 450 g de pasta 1800 mL de tampón) y se descongelan de esta forma durante ~1 h±0,5 h con agitación mecánica. Opcionalmente, las aglomeraciones restantes se pueden volver a suspender utilizando Ultraturrax (p. ej., 5 min a 8000 rpm). La lisis celular se lleva a cabo en un homogeneizador de alta presión Niro Soavi Panda (640±25 bar, 3 ciclos). El lisado se enfría hasta alcanzar <10 °C utilizando un intercambiador térmico y se mantiene a esta temperatura durante la centrifugación. El lisado celular bruto se somete a una etapa de centrifugación por lotes (Beckmann Avanti JLA 60.25) operada a 14000 rpm (30000 g) a 4 °C durante 30 min. Los sobrenadantes se recogen y se concentran. La parte semilíquida del sedimento se descarta también, para reducir el riesgo de obstrucción en la etapa de filtración. Los sobrenadantes concentrados a continuación se filtran a través de una cápsula de filtro de profundidad Supercap PDH4 100/12,7 cm (5 pulgadas) (Pall) (área de filtración efectiva de 250 cm2). El lisado restante en el alojamiento del filtro se extrajo por enjuague con tampón de lisis. Después de la clarificación, se agrega una alícuota de 1M de disolución concentrada de Tris, pH 7,5, al lisado hasta una concentración final de 25 mM. La composición de tampón del lisado final es 20 mM de Hepes, 25 mM de Tris, pH 7m5, conductividad ~6 mS/cm). El lisado puede estar todavía ligeramente turbio después de la filtración, pero esto no afecta la etapa de captura posterior. La etapa de captura se lleva a cabo a temperatura ambiente con DEAE Sepharose FF (GE Healthcare) en una columna XK50/30 (GE Healthcare) con las siguientes dimensiones: diámetro de 50 mm, altura de lecho fijo 20 cm, volumen de lecho fijo ~400 mL. La densidad de carga es de alrededor de 0,8 a 1,2 g de biomasa/mL de gel. El proceso se lleva a cabo mediante un sistema Akta Explorer (GE Healthcare) y se monitoriza a 280 nm. El equilibrio se lleva a cabo a 100 cm/h con alrededor de 5 VC (volúmenes de columna) de 25 mM de Tris, 20 mM de Hepes, 25 mM de NaCl, pH 7,5, conductividad ~5 mS/cm hasta que el pH, la conductividad y la absorbancia a 280 nm estén estables. El lisado se carga sobre la columna a 75 cm/h y el flujo continuo se descarta. Después de cargar todo el lisado filtrado, el flujo se reanuda con alrededor de 5 VC de tampón de equilibrio hasta que la absorbancia a 280nm se estabiliza. Las impurezas se extraen de la columna durante la etapa de lavado 2 con 5 VC de 25 mM de TRIS, 175 mM de NaCl, pH 7,5, conductividad 19 mS/cm. La proteína C-TAB se eluye de la columna mediante la etapa de elución con 3 VC de 25 mM de TRIS, 375 mM de NaCl, pH 7,5, conductividad 36 mS/cm. La recolección de las fracciones que contienen C-TAB comienza cuando la absorbancia a 280 nm comienza a aumentar (generalmente después de 1 VC) y dura alrededor de 0,5 a 1,0 VC. Las fracciones concentradas que contienen C-TAB se pueden almacenar 2 a 8 °C durante toda la noche. La etapa de purificación intermedia se lleva a cabo con SP-Sepharose FF (GE Healthcare) en una columna XK50/30 (GE Healthcare) a temperatura ambiente con las siguientes dimensiones: diámetro de 50 mm, altura de lecho fijo 20 cm, volumen de lecho fijo ~400 mL. La densidad de carga máxima es de alrededor de 4 a 5 mg de C-TAB/mL de gel. El proceso se lleva a cabo mediante un sistema Akta Explorer (GE Healthcare) y se monitoriza a 280 nm. Las etapas de equilibrio, lavado y elución con gradiente lineal se llevan a cabo a un caudal máximo de 200 cm/h (65 mL/min) a menos que la contrapresión excesiva (>4 bar) lo impida. El equilibrio se lleva a cabo con alrededor de 5 a 10 VC de tampón G a 200 cm/h hasta que el pH, la conductividad y la absorbancia a 280 nm estén estables. Antes de la carga, el concentrado de DEAE debe ajustarse para permitir la unión de C-TAB a la resina SP-FF. El concentrado de DEAE se diluye 25 veces con tampón de equilibrio SP-FF (10 mM de ácido cítrico, 2 mM de EDTA, pH 5,5±0,1, conductividad ~2 mS/cm) hasta una conductividad final de no más de 3,5 mS/cm, pH 5,5 ± 0,1. Si es necesario se agrega agua MilliQ adicional hasta alcanzar la conductividad deseada. Obsérvese que la baja conductividad es esencial para permitir la unión de C-TAB a SP-FF. La muestra se carga sobre la columna a 150 cm/h y el flujo continuo se descarta. Después de cargar la muestra, el flujo se reanuda con alrededor de 5 VC de tampón de equilibrio a 200 cm/h hasta que la absorbancia a 280nm se estabiliza. La elución se lleva a cabo con un gradiente lineal a 100 cm/h de 0 % de tampón de equilibrio hasta 30 % de 20 mM de fosfato de sodio, 500 mM de NaCl, pH 7,0 en 10 VC. Se recogen las fracciones y la concentración se lleva a cabo mediante absorbancia a UV 280 nm. La concentración comienza a 15 % del pico máximo y termina a 15 % del pico máximo. El concentrado inmediatamente se ajusta hasta 400 mM de citrato (pH final 7, alrededor de 49 mS/cm) utilizando una disolución concentrada de citrato 1,5 M, pH 8,0. El concentrado de SPFF ajustado debería tener pH 7 y alrededor de 49 mS/cm y se almacena a 2 a 8 °C durante toda la noche.

La etapa de cromatografía de pulido se lleva a cabo con Phenyl-Sepharose HP (GE Healthcare) en una columna XK50/30 (GE Healthcare) a temperatura ambiente con las siguientes dimensiones: diámetro 50mm, altura del lecho fijo 15 cm, volumen de lecho fijo ~300 mL. La densidad de carga es de alrededor de 4 a 5 mg de C-TAB/mL de gel. El proceso se lleva a cabo mediante un sistema Akta Explorer (GE Healthcare) y se monitoriza a 280 nm. Las etapas de equilibrio, lavado y elución se llevan a cabo a un caudal máximo de 100 cm/h (33 mL/min) a menos que la contrapresión excesiva (>4 bar) lo impida. En tal caso, se debe reducir el caudal. El equilibrio se lleva a cabo con alrededor de 5 a 10 VC de 25 mM de Tris, 400 mM de citrato de sodio, pH 7,5, 46 mS/cm a 100 cm/h hasta que el pH, la conductividad y la absorbancia a 280 nm estén estables. La muestra se carga sobre la columna a 100 cm/h y el flujo continuo se descarta. Después de cargar la muestra, el flujo se reanuda con alrededor de 5 VC de tampón de equilibrio a 100 cm/h hasta que la absorbancia a 280nm se estabiliza. La elución se lleva a cabo con un gradiente lineal a 100 cm/h de 100 % de tampón de equilibrio / 0 % de 5 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mS/cm hasta 100 % de 5 mM Tris, pH 7,5, 0,5 mS/cm en 20 VC. Se recogen las fracciones y la concentración se lleva a cabo mediante absorbancia a UV 280 nm. La concentración comienza a alrededor de 10 a 15 % del pico máximo y termina a alrededor de 20 % del pico máximo. El concentrado ajustado se almacena a 2 a 8 °C durante toda la noche. La preparación de disolución proteica de sustancia medicamentosa de C-TAB final se logra mediante filtración de flujo tangencial de corte 30 kDa (TFF, membrana Pellicon 2, Millipore) operada a temperatura ambiente. La disolución proteica se diafiltra contra el tampón de formulación (20 mM de Histidina, 75 mM de NaCl, 5 % de Sacarosa, 0,025 % de Tween®80, pH 6,5) hasta que el pH del permeado es igual a 6,5±0,2).

La concentración proteica final se ajusta a 2 mg/mL según la medición de UV a 280 nm utilizando 1566 como el coeficiente de extinción específico a 280 nm para C-TAB (conc. proteica 1 mg/mL, cubeta de 1 cm).

SDS-PAGE y análisis de transferencia Western: Los lisados celulares enteros y la proteína de fusión C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 purificada se volvieron a suspender en tampón de muestra Nu-Page que contenía beta-mercaptoetanol y se hirvieron durante 10 min. Las muestras (25 pl) se cargaron en gel Tris-Acetato al 3 a 8 %. Después de la electroforesis (150 V durante 1 h), las proteínas se visualizaron mediante tinción de los geles con tinte Simply Blue o se utilizaron para el análisis de transferencia Western.

La expresión específica de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se determinó mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos específicos para las toxinas. Las proteínas se transfirieron a 23 V durante 60 min sobre una membrana de PVDF utilizando 1x de tampón de transferencia en metanol al 10 %. Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con 0,5 % de caseína en solución salina tampón fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). Las membranas de transferencia se incubaron durante 2 hrs a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal contra la Toxina B (GenWay; clon B426M) o un anticuerpo policlonal de cobaya derivado internamente contra la Toxina A (List Biological Labs). Las membranas lavadas se incubaron con IgG anticobaya o IgG antirratón conjugada con peroxidasa de rábano. Las transferencias se lavaron y se agregaron sustratos AEC. Las transferencias se incubaron con mezcla suave durante 5 a 10 minutos. Las transferencias se enjuagaron con agua para detener el desarrollo de color.

Hemoaglutinación de RBC: Se ha demostrado que el dominio de unión celular de la toxina A es capaz de aglutinar eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés) de conejo, pero no el de la toxina B. El proceso de aglutinación es el resultado de la unión de la toxina A con una secuencia de glicano que se encuentra en los antígenos sanguíneos de RBC de conejo. Las muestras (C-TAB.G5 y toxina A natural) se diluyen hasta 100 pg/ml en PBS. En una placa de microtitulación con fondo en V, se preparan diluciones en serie dobles a lo largo de la placa por duplicado, comenzando a 100 pg/ml y dejando 50 pl de la dilución en cada pocillo. Se agregan cincuenta microlitros de una suspensión al 0,75 % de RBC de conejo/PBS a cada pocillo de la placa de microtitulación y la placa se incuba durante 1 h a temperatura ambiente. La hemoaglutinación se indica por la incapacidad para formar un sedimento de RBC en el fondo de la placa. El título de hemoaglutinación de una muestra se representa mediante la concentración de la proteína presente en el pocillo con la dilución de muestra más alta en la que no se ha observado sedimento de RBC.

Ejemplo 2: Titulación de dosis de la proteína de fusión C-TAB.G5 en presencia y ausencia de alumbre en ratones.

Este estudio se llevó a cabo para determinar la viabilidad de una titulación de dosis in vivo de C-TAB.G5 con y sin adyuvante de alumbre como un ensayo de potencia de C-TAB. El alumbre utilizado fue Hydragel, (hidróxido de alumbre, Brenntag). Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con entre 8 y 9 semanas para la inmunización. Todos los animales recibieron una primera inmunización mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda inmunización se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Un total de 72 ratones se dividieron en 12 grupos vacunados de la siguiente forma:

Grupo 1: Solo PBS

Grupo 2: 100 (154) ng de C-TAB.G5

Grupo 3: 300 (462) ng de C-TAB.G5

Grupo 4: 1.000 (1.540) ng de C-TAB.G5

Grupo 5: 3.000 (4.620) ng de C-TAB.G5

Grupo 6: 10.000 (15.400) ng de C-TAB.G5

Grupo 7: PBS con 50 pg de alumbre

Grupo 8: 10.0 (15.4) ng de C-TAB.G5 con 50 pg de alumbre OH

Grupo 9: 30.0 (46.2) ng de C-TAB.G5 con 50 pg de alumbre OH

Grupo 10: 100 (154) ng de C-TAB.G5 con 50 pg de alumbre OH

Grupo 11: 300 (462) ng de C-TAB.G5 con 50 pg de alumbre OH

Grupo 12: 1.000 (1.540) ng de C-TAB.G5 con 50 pg de alumbre OH

En este estudio se determinó la concentración proteica en primer lugar según el protocolo estándar Quick Start™ Bradford Protein Assay (Bio-Rad). En última instancia, la concentración proteica (se muestra entre paréntesis) se volvió a determinar mediante medición de UV a 280 nm según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.3. En todos los estudios de seguimiento la concentración proteica se midió mediante el método de UV.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día de estudio 14) y dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis.

ELISA de IgG sérica: Los anticuerpos séricos producidos para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 (denominado C-TAB), toxina A y toxina B o sus anatoxinas se evaluaron en un enzimoinmunoensayo de adsorción (ELISA, por sus siglas en inglés). En síntesis, se prepararon disoluciones concentradas de 1,0 pg/ml de toxina A, toxina B o el polipéptido aislado C-TAB.G5 en PBS y se agregaron 100 pl a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de la incubación durante toda la noche a 4 °C, las placas se lavaron y se bloquearon con tampón de bloqueo de caseína al 0,5 %. Las placas se volvieron a lavar y se agregaron diluciones en serie dobles de suero de prueba a las placas. Después de una segunda incubación durante toda la noche a 4°C, las placas se lavaron y se incubaron con IgG antirratón conjugada con peroxidasa (H L). Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se volvieron a lavar, se agregó sustrato de peroxidasa (2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolina-6-sulfonato) y se dejó que el color se desarrollara durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de SDS al 2 % en los pocillos. Se leyeron las placas con un lector de placas de ELISA a una absorbancia de 405 nm. Los títulos de anticuerpos séricos se indican como la media geométrica de unidades de ELISA, que son las diluciones en suero que resultan en una lectura de DO a 405 nm de 1,0. Como testigo negativo se utilizó una muestra concentrada de suero previo a la inmunización obtenida de animales de los que se tomó sangre antes de la primera inmunización para evaluar una respuesta de anticuerpos.

Los animales que recibieron C-TAB.G5 demostraron un aumento en los títulos de anticuerpo dependiente de la dosis y el adyuvante alumbre permitió una mejora significativa en los títulos de anticuerpo a dosis más bajas de C-TAB.G5. La Figura 3 muestra los títulos para IgG anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B. La Figura 4 muestra una comparación gráfica de los títulos de anticuerpo en presencia o ausencia de alumbre.

Ejemplo 3: Inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones.

Este estudio se llevó a cabo para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones vacunados que recibieron una exposición letal de toxina A o toxina A de C. difficile. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con 6 a 7 semanas para este estudio. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. 116 ratones se dividieron en grupos vacunados de la siguiente forma:

• Grupo 1: Solo PBS

• Grupo 2: 3 pg de C-TAB.G5

• Grupo 3: 10 pg de C-TAB.G5

• Grupo 4: 30 pg de C-TAB.G5

• Grupo 5: 3 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH

• Grupo 6: 10 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH

• Grupo 7: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH

• Grupo 8: Solo PBS

• Grupo 9: 3 pg de C-TAB.G5

• Grupo 10: 10 pg de C-TAB.G5

• Grupo 11: 30 pg de C-TAB.G5

• Grupo 12: 3 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH

• Grupo 13: 10 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH

• Grupo 14: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. A continuación se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA (UE).

La Figura 5 muestra títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B en ratones evaluados dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). Este estudio demostró que la proteína de fusión C-TAB.G5 es altamente inmunógena en ratones y es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos fuerte contra la toxina A y la toxina B incluso sin agregar un adyuvante. La inmunogenicidad de C-TAB.G5 se aumentar de manera significativa (más de un logaritmo) mediante la coadministración con hidróxido de alumbre. Los animales que recibieron C-TAB.G5 con o sin alumbre demostraron un aumento de 2 veces en la respuesta de anticuerpos en un intervalo de logaritmo de dosis. Además de evaluar los títulos de anticuerpos, los anticuerpos generados por la inmunización con C-TAB.G5 se evaluaron para determinar su capacidad para neutralizar la toxina A y B natural en un ensayo de neutralización de toxina in vitro (TNA, por sus siglas en inglés).

Ensayo de anticuerpo neutralizador de toxina (ANT). Para el análisis in vitro, se incubaron 125 pl de la toxina A (5 ng/ml) o toxina B (1 ng/ml) con 125 pl de diluciones en serie de anti-suero obtenido de ratones inmunizados. Después de una hora de incubación a 37 °C, la mezcla de toxina:suero se agregó a pocillos de microtitulación que contenían células Vero (células de riñón de mono) y las placas de microtitulación se incubaron durante 18 hr. La incubación de la toxina A o B con las células Vero resultó en un cambio en la morfología celular y una pérdida de la adherencia celular que se midió mediante tinción con rojo neutro de las células tratadas con toxina después de la extracción de las células no adherentes. El título de neutralización de toxina de un suero se indica como la dilución de suero que proporciona un 50 % de reducción en la actividad de la toxina.

Los resultados del ensayo ANT se muestran en la Figura 6. Los datos indican que los anticuerpos generados después de la inmunización con C-TAB.G5 solo son capaces de neutralizar la actividad tóxica de la toxina A natural pero no de la toxina B. Cuando se coadministró C-TAB.G5 con alumbre, los títulos de ANT aumentaron con un aumento de alrededor de 6 veces en los ANT antitoxina A y solo títulos 2 veces más bajos para ANT antitoxina B. Estos datos indican que el polipéptido aislado C-TAB.G5 no solo conserva los epítopos antigénicos de reconocimiento de anticuerpo presentes en las toxinas naturales, sino que también comprende epítopos antigénicos esenciales necesarios para la generación de anticuerpos neutralizantes de toxina funcionales. Por consiguiente, C-TAB.G5 es eficaz para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. difficile, por lo tanto, es útil en la vacunación. Además de evaluar la respuesta de anticuerpos, se determinó la capacidad de la inmunización con C-TAB.G5 para proteger a los ratones contra una exposición letal de toxinas naturales. Tres semanas después de la segunda vacunación (día de estudio 35) los animales en los grupos vacunados y no vacunados (N=8) recibieron por vía intraperitoneal (IP) una dosis letal de 25 ng de toxina A o 50 ng de toxina B. La supervivencia de los animales se monitorizó en los 9 días posteriores y los resultados se muestran en la Figura 6. Este experimento demostró que la inmunización de ratones con C-TAB.G5 en ausencia del adyuvante alumbre fue capaz de conferir un 100 % de protección contra una exposición letal con toxina A natural y un 50 % de protección contra la exposición a la toxina B. La coadministración de C-TAB.G5 con alumbre potenció la inmunidad protectora contra la toxina B en hasta un 100 % de protección. Estos datos indican que la vacunación con C-TAB.G5 induce una respuesta inmunitaria suficiente para proteger a los ratones de los efectos tóxicos de las toxinas A y B en el modelo de exposición letal.

Ejemplo 4: Evaluación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones jóvenes y adultos. Este estudio se llevó a cabo para comparar la respuesta inmunitaria desencadenada contra C-TAB.G5 en ratones jóvenes y adultos. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con 6 a 7 semanas y 18 meses, respectivamente, para este estudio. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. 192 ratones se dividieron en grupos vacunados de la siguiente forma:

Grupo 1: PBS a ratones jóvenes

Grupo 2: PBS a ratones adultos

Grupo ratones jóvenes

Grupo ratones jóvenes

Grupo ratones adultos

Grupo ratones adultos

Grupo 7: 50 pg de alumbre OH a ratones jóvenes

Grupo 8: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH a ratones jóvenes

Grupo 9: 50 pg de alumbre OH a ratones adultos

Grupo 10: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH a ratones adultos

Grupo 11: PBS a ratones jóvenes

Grupo 12: PBS a ratones adultos

Grupo 13: 10 pg de C-TAB.G5 a ratones jóvenes

Grupo 14: 30 pg de C-TAB.G5 a ratones jóvenes

Grupo 15: 10 pg de C-TAB.G5 a ratones adultos

Grupo 16: 30 pg de C-TAB 5° a ratones ancianos

Grupo 17: 10 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH a ratones jóvenes

Grupo 18: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH a ratones jóvenes

Grupo 19: 10 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH a ratones adultos

Grupo 20: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de alumbre OH a ratones adultos

Tres semanas después de la segunda vacunación (día de estudio 35) los animales en los grupos vacunados y no vacunados (N=6) recibieron una exposición letal por vía intraperitoneal (IP) de 25 ng de toxina A o 50 ng de toxina B. La supervivencia de los animales se monitorizó en los 9 días posteriores.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día de estudio 14) y dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. A continuación se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA (UE). Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (ANT) se determinaron utilizando células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de toxina A y toxina B recombinantes.

Los animales jóvenes que recibieron la vacuna de C-TAB.G5 exhibieron niveles significativamente más altos de todos los anticuerpos evaluados, en comparación con los animales adultos. Se obtuvieron títulos de anticuerpos especialmente elevados en ratones jóvenes vacunados con C-TAB.G5 en presencia de hidróxido de alumbre (Figura 7). Se logró una mejora particularmente significativa en el título de ANT de toxina B. Al mismo tiempo, no hubo una diferencia grande entre los ratones jóvenes y adultos en la capacidad para soportar las exposiciones a la toxina A y la toxina B. Sin embargo, ambos grupos exhibieron una tasa de protección mejorada cuando se vacunaron en presencia de alumbre. La Figura 7 muestra una comparación de la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones jóvenes con respecto a ratones adultos. La Figura 8 muestra la cinética del desarrollo de anticuerpos anti-C-TAB en ratones jóvenes y adultos.

Ejemplo 5: Comparación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5.1 y anatoxina A y B.

Este estudio se llevó a cabo para comparar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 con respecto a la anatoxina A/B. La anatoxina A/B utilizada fue la mezcla de partes iguales (1:1) de anatoxina A (lote N.° 1009132) y anatoxina B (lote N.° 1009133). La anatoxina se preparó mediante fijación en formalina y se adquirió a TechLab. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con 6 a 7 semanas para este estudio. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Se dividieron 180 ratones vacunados en grupos de la siguiente forma:

Grupo 1: Solo PBS

Grupo 2: 10 pg de C-TAB.G5.1

Grupo 3: 30 pg de C-TAB.G5.1

Grupo 4: 10 pg de C-TAB.G5.1 50 pg de alumbre OH

Grupo 5: 10 pg de C-TAB.G5.1 50 pg de alumbre OH

Grupo 6: 30 pg de anatoxina A/B

Grupo 7: 10 pg de anatoxina A/B

Grupo 8: 30 pg de anatoxina A/B 50 pg de alumbre OH

Grupo 9: 30 pg de anatoxina A/B 50 pg de alumbre OH

Grupo 10: PBS

Grupo 11: 10 pg de C-TAB.G5.1

Grupo 12: 30 pg de C-TAB.G5.1

Grupo 13: 10 pg de C-TAB.G5.1 50 pg de alumbre OH

Grupo 14: 30 pg de C-TAB.G5.1 50 pg de alumbre OH

Grupo 15: 10 pg de anatoxina A/B

Grupo 16: 30 pg de anatoxina A/B

Grupo 17: 10 pg de anatoxina A/B 50 pg de alumbre OH

Grupo 18: 30 pg de anatoxina A/B 50 pg de alumbre OH

Tres semanas después de la segunda vacunación (día de estudio 35) los animales en los grupos vacunados y no vacunados (N=6) recibieron una exposición letal por inyección intraperitoneal (IP) de 28 ng de toxina A o 50 ng de toxina B. La supervivencia de los ratones se monitorizó en los 9 días posteriores.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día de estudio 14) y dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. A continuación se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA (UE). Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (ANT) se determinaron utilizando células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de toxina A y toxina B recombinantes.

Este estudio demuestra la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 y la anatoxina A/B en ratones después de dos vacunaciones. Los animales que recibieron C-TAB.G5.1 exhibieron títulos de anticuerpo anti-C-TAB más bajos pero significativos en comparación con animales que recibieron la anatoxina A/B. Además, la coadministración con alumbre aumentó en gran medida todas las respuestas de anticuerpo evaluadas. Como resultado, los niveles de los anticuerpos anti-C-TAB y antitoxina A logrados en animales inmunizados con C-TAB.G5.1 o con anatoxina A/B en presencia de alumbre son similares. El único título de anticuerpo más bajo se observó para el anticuerpo antitoxina B cuando los ratones se inmunizaron con C-TAB.G5.1, en comparación con ratones inmunizados con anatoxina A/B. Cabe señalar que a diferencia de los anticuerpos generados contra C-TAB.G5.1 que reconocen epítopos en la porción del extremo C de las moléculas de toxina, los anticuerpos inducidos por inmunización con anatoxina eran específicos para la porción del extremo N de las moléculas de toxina, que se recogió en el ELISA antitoxina. Por consiguiente, los anticuerpos antitoxina A y antitoxina B generados en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 y anatoxina A/B eran anticuerpos de diferente especificidad y, por lo tanto, no se pueden comparar directamente. Sin embargo, los datos indican que la respuesta de anticuerpo a la inmunización con C-TAB.G5.1 es significativamente alta, al igual que con la inmunización con anatoxinas. Además, el estudio de exposición a toxina demostró que la capacidad de la inmunización con C-TAB.G5.1 para proteger a los ratones contra una exposición letal es comparable a la eficacia protectora de la anatoxina A y B. La Figura 9 muestra una comparación de la inmunogenicidad C-TAB.G5.1 y la anatoxina A/B. La Figura 10 muestra los datos de neutralización de toxina y protección para ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 en comparación con aquellos inmunizados con la anatoxina A/B.

Ejemplo 5.1: Comparación de títulos de anticuerpo y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 en diferentes regímenes de inmunización.

Este estudio se llevó a cabo para comparar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 en ratones que recibieron tres dosis de la vacuna en diferentes regímenes de inmunización. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con 6 a 7 semanas para este estudio. 135 ratones se dividieron en 14 grupos. Todos los animales en los grupos números 2 a 13 tres vacunaciones mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho o en el músculo del muslo izquierdo en los días indicados más adelante. Los ratones en grupos 1 y 8 no recibieron vacunación; sirvieron como testigo negativo. La inmunización se llevó a cabo de la siguiente forma:

(D) = músculo del muslo derecho (I) = músculo del muslo izquierdo

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales en los días de estudio 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35 y 42. El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TA^b , toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA (UE). Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (ANT) se determinaron el día 42 del estudio utilizando células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de toxina A y toxina B recombinantes.

Tres semanas después de la última vacunación (día de estudio 49) los animales en los grupos vacunados y no vacunados (N=8) recibieron una exposición letal por vía intraperitoneal (IP) de 28 ng de toxina A o 50 ng de toxina B. La supervivencia de los ratones se monitorizó en los 9 días posteriores.

Este estudio demuestra que todos los títulos de anticuerpo medidos dos semanas después de la tercera vacunación o en el día 35 y 42 del estudio son comparables en todos los regímenes de inmunización, aunque el régimen de inmunización de 0/14/28 exhibe las mejores respuestas de anticuerpos. Si se comparan los títulos de anticuerpo medidos dos semanas después de la segunda vacunación, entonces el régimen de vacunación de 0/14/28 es mejor que el régimen de vacunación de 0/7/21 y mucho mejor que el régimen de inmunización de 0/3/14. Este estudio confirmó que los títulos de anticuerpo antitoxina A/B se potencian significativamente cuando el antígeno se coinyecta con hidróxido de aluminio (no se muestran los datos). Este estudio también muestra que incluso dos dosis de la vacuna con alumbre administradas en un intervalo de dos semanas pueden desencadenar un nivel elevado de anticuerpo, comparable con el nivel obtenido después de tres vacunaciones de dosis.

El nivel de anticuerpos neutralizantes de toxina A/B es mucho más alto en el régimen de inmunización de 0/7/21 y 0/14/28 que en el régimen de inmunización de 0/3/14.

La protección completa contra la exposición a la toxina A no requiere alumbre en el régimen de inmunización de 0/7/21 y 0/14/28 pero no en 0/3/14. El régimen de inmunización de 0/14/28/ con alumbre indujo el nivel de protección más alto (87,5 %) contra la exposición a la toxina B, mientras que el régimen de inmunización de 0/7/21 proporciona un 37,5 % de protección y 0/3/14 exhibe un 28,6 % de protección. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 20.

Ejemplo 6: Evaluación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de la proteína de fusión C-TAB.G5.1 recombinante en hámsteres.

Este estudio se llevó a cabo para evaluar adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína de fusión C-TAB.G5.1 recombinante administrada con o sin adyuvante en un modelo de animal diferente.

Se utilizaron hámsteres hembra (Harlan), con 7 semanas y con pesos entre 80 y 90 g para este estudio. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección de bolo intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14 y la tercera vacunación se hizo mediante inyección IM el día 28. Los hámsteres se dividieron en grupos (N=6) y se vacunaron de la siguiente forma:

• Grupo 1: Solo tampón de formulación

• Grupo 2: 10 pg de C-TAB.G5.1

• Grupo 3: 10 pg de C-TAB.G5.1 100 pg de alumbre OH

• Grupo 4: 30 pg de C-TAB.G5.1

• Grupo 5: 30 pg de C-TAB.G5.1 100 pg de alumbre OH

• Grupo 6: 100 pg de C-TAB.G5.1

• Grupo 7: 100 pg de C-TAB.G5.1 100 pg de alumbre OH

• Grupo 10: Solo tampón de formulación

• Grupo 11: 10 pg de C-TAB.G5.1

• Grupo 12: 10 pg de C-TAB.G5.1 100 pg de alumbre OH

• Grupo 13: 30 pg de C-TAB.G5.1

• Grupo 14: 30 pg de C-TAB.G5.1 100 pg de alumbre OH

• Grupo 15: 100 pg de C-TAB.G5.1

• Grupo 16: 100 pg de C-TAB.G5.1 100 pg de alumbre OH

Dos semanas después de la tercera vacunación (día de estudio 42) los animales en los grupos vacunados y no vacunados (N=6) recibieron una exposición letal por inyección intraperitoneal (IP) de 75 ng de toxina A o 125 ng de toxina B. Se utilizaron 12 hámsteres adicionales para una titulación de dosis de la exposición a la toxina A o la toxina B el día 44. La supervivencia de los hámsteres se monitorizó en los 8 días posteriores.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día de estudio 14), después de la segunda inmunización (día de estudio 28) y la tercera inmunización (día de estudio 35). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. A continuación se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA (UE). Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (ANT) se determinaron utilizando células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de toxina A y toxina B recombinantes.

Este estudio demostró que los hámsteres, de forma similar a los ratones, fueron capaces de responder positivamente a la vacunación con C-TAB.G5.1. Los animales que recibieron C-TAB.G5.1 demostraron un aumento dependiente de la dosis en todos los títulos de anticuerpo evaluados, mientras que el adyuvante alumbre mejoró significativamente los títulos de anticuerpo en todas las dosis de C-TAB.G5. Los títulos de anticuerpo más altos se observaron dos semanas después de la segunda inyección (día de estudio 28). La Figura 11 (A-C) muestra títulos de anticuerpo para cada grupo de hámsteres inmunizados. La Figura 12 muestra la cinética del desarrollo de anticuerpos anti-C-TAB en hámsteres inmunizados con C-TAB.G5 en presencia o ausencia de hidróxido de alumbre.

Los resultados del ensayo ANT se muestran en la Figura 13. Estos ratones son similares a los obtenidos para ratones e indican que el anticuerpo generado contra la proteína de fusión C-TAB.G5.1 en hámsteres es eficaz para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. difficile.

La Figura 13 también muestra los datos de protección para hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 después de una exposición letal a toxina. Se logró una protección alta incluso con la vacunación con C-TAB.G5.1 en ausencia del adyuvante. El nivel de protección se mejoró hasta el 100 % mediante la adición de alumbre a la vacuna.

Ejemplo 7: La eficacia protectora de la proteína de fusión C-TAB.G5.1 contra una exposición a esporas de C. difficile en hámsteres tratados con clindamicina.

Después del tratamiento con antibiótico, C. difficile puede colonizar el intestino y, si es toxígeno, puede provocar diarrea asociada al antibiótico. La enfermedad asociada a C. difficile (EACD) en humanos se modela en hámsteres utilizando clindamicina para hacer que los animales sean susceptibles a la colonización, diarrea y muerte, normalmente pocos días después de la siembra con la cepa toxígena. Para evaluar la eficacia de la vacuna de C-TAB.G5.1, los hámsteres vacunados y no vacunados se expusieron a clindamicina y a la cepa 630 de C. difficile. Se mezclaron 100 pg de C-TAB.G5.1 con 125 pg de adyuvante hidróxido de alumbre. Los hámsteres hembra adultos que pesaban ~100 g recibieron 3 vacunaciones mediante inyección intramuscular (IM) en los días 0, 14 y 28. El placebo fue PBS. 48 hámsteres se dividieron en grupos de 8 y se vacunaron de la siguiente forma:

Grupo 1: Solo PBS exposición a 102 de esporas

Grupo 2: C-TAB.G5.1 exposición a 102 de esporas

Grupo 3: Solo PBS exposición a 103 de esporas

Grupo 4: C-TAB.G5.1 exposición a 102 de esporas

Grupo 5: Solo PBS exposición a 104 de esporas

Grupo 6: C-TAB.G5.1 exposición a 104 de esporas

El día 42 todos los animales en todos los grupos recibieron una dosis oral de 10 mg de fosfato de clindamicina/ kg de peso corporal. El día 43 todos los animales en todos los grupos se dosificaron mediante sonda oral con esporas de la cepa 630 de C. difficile lavadas. Se utilizaron tres niveles de exposición a esporas (~102, 103 y 104). La observación, pero no el tratamiento, continuó hasta el día 54. Al finalizar el estudio, todos los animales sobrevivientes estuvieron sin enfermedad durante > 5 días.

Se tomaran muestras de sangre para obtener suero para estudios serológicos los días 0, 14, 28, 42 y el día 54 (fin del estudio). Se recogieron las heces los días 1 y 42, directamente del ano de los hámsteres, o si fuese necesario, del lecho.

Los resultados se muestran en la Figura 14 y exhiben las curvas de supervivencia después de la exposición a las esporas en hámsteres. Los datos de supervivencia se graficaron como curvas de Kaplan-Meier ajustadas a la supervivencia y se llevó a cabo un análisis estadístico utilizando un análisis logarítmico-ordinal. En todas las dosis de esporas, se observó un 100 % de supervivencia de hámsteres en el grupo vacunado y las supervivencia mejoró de forma significativa en comparación con el grupo con placebo: p=0,0245 a 102 de esporas, p=0,0006 a 103 de esporas, p<0,0001 a 104 de esporas.

Ejemplo 8: Inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5.1 en monos.

Este estudio se llevó a cabo para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 en monos cangrejeros. Se utilizaron seis monos cangrejeros hembra con entre 4 y 6 años y con pesos entre 2 y 4 kg para este estudio. Se dispusieron dos grupos de tres monos, el primer grupo (Grupo 1) recibió 200 pg de C-TAB.G5.1 y el segundo (Grupo 2) recibió 200 pg de C-TAB.G5.1 y 250 pg de alumbre. Como adyuvante alumbre se utilizó Rehydragel (Reheis, lote N.° 534401, diluido en PBS hasta 2 mg/ml). Antes de la recolección de sangre o la inmunización se rasuró a los animales (de ser necesario).

La 1a (día de ensayo 0) y la 3a (día de ensayo: 28) inmunización se inyectaron el brazo izquierdo (deltoides), la 2a inmunización (día de ensayo: 14) se inyectó en el brazo derecho (deltoides). El Grupo 1 recibió 200 pg de C-TAB.G5.1 solo en 0,5 ml de 1xPBS mediante inyección IM y el Grupo 2 recibió 200 pg de C-TAB.G5.1 con 250 pg de alumbre en 0,5ml de 1xPBS mediante inyección IM.

En los puntos de tiempo establecidos (días de estudio 0, 14, 28 y 42) se obtuvieron 2 a 3 mL de sangre entera mediante métodos estándares en tubos separadores de suero. Las muestras de suero se congelaron a alrededor de -20 °C. Después se utilizó el método ELISA para evaluar los títulos de IgG anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B. Los títulos de anticuerpo se presentaron en unidades de ELISA (UE).

La Figura 15 muestra que dosis en aumento de C-TAB.G5.1 conducen a una producción de anticuerpo aumentada conociendo las tres proteínas, mientras que la presencia de alumbre mejoró significativamente los niveles de anticuerpo. Los títulos de anticuerpo más altos se observaron con dos vacunaciones el día 42. Estos datos indican de forma clara la viabilidad del uso de las proteínas de fusión C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 recombinantes para la vacunación de sujetos que lo necesitan.

Ejemplo 9: Comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

Este estudio se llevó a cabo para comparar la inmunogenicidad de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1, así como también el efecto de dos tampones diferentes en los que se administró C-TAB dentro. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con entre 8 y 9 semanas para la inmunización. Todos los animales recibieron la primera inmunización mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda inmunización se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Un total de 72 ratones se dividieron en 12 grupos vacunados de la siguiente forma:

Grupo 1: 1 pg de C-TAB.G5 en PBS

Grupo 2: 3 pg de C-TAB.G5 en PBS

Grupo 3: 10 pg de C-TAB.G5 en PBS

Grupo 4: 30 pg de C-TAB.G5 en PBS

Grupo 5: 1 pg de C-TAB.G5 en tampón histidina

Grupo 6: 3 pg de C-TAB.G5 en tampón histidina

Grupo 7: 10 pg de C-TAB.G5 en tampón histidina

Grupo 8: 30 pg de C-TAB.G5 en tampón histidina

Grupo 9: 1 pg de C-TAB.G5.1 en tampón histidina

Grupo 10: 3 pg de C-TAB.G5.1 en tampón histidina

Grupo 11: 10 pg de C-TAB.G5.1 en tampón histidina

Grupo 12: 30 pg de C-TAB.G5.1 en tampón histidina

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA.

La Figura 16 muestra que todos los títulos de anticuerpo (anti-C-TAB, antitoxina A y antitoxina B) no fueron significativamente diferentes (tal como se revela por la prueba de la T) en el intervalo de dosis 1 a 30 pg para las tres formulaciones de vacuna. Se logró una producción de anticuerpo ligeramente más alta con la formulación de C-TAB.G5 en tampón histidina, en comparación con PBS. No se observó una diferencia significativa entre la inmunización con las formulaciones en histidina de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1. Por consiguiente, este estudio demuestra una inmunogenicidad igual de las construcciones C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

Ejemplo 10: Preparación y evaluación de las proteínas de fusión C-TABNCTB y C-TADCTB alternativas.

Este ejemplo describe la preparación de otras dos proteínas de fusión que comprenden una porción de dominio del extremo C de CTA y dos porciones del dominio del extremo C dominio de CTB derivada de la cepa VPI-10463 de C. difficile. La proteína de fusión C-TABNCTB (SEQ ID N.°: 18) comprende, al igual que C-TAB.G5, 19 unidades repetitivas de CTA (aminoácidos 2272-2710), 23 unidades repetitivas de CTB (aminoácidos 1850-2366) y 10 repeticiones más adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2057) fusionadas con el extremo C de CTB. La proteína de fusión C-TADCTB (SEQ ID N.°: 20) comprende la secuencia de C-TAB.G5 (19 repeticiones de CTA y 23 repeticiones de CTB) más 24 unidades repetitivas adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2366) fusionadas con el extremo C de C-TAB.G5. Por consiguiente, C-TADCTB comprende una porción doble de las unidades repetitivas de CTB. La clonación de las construcciones génicas C-TABNCTB y C-TADCTB se llevó a cabo de forma similar a la descrita en el Ejemplo 1.1. Las proteínas de fusión recombinantes se expresaron en células de in E. coli y se purificaron utilizando un procedimiento estándar tal como se describió en el Ejemplo 1.2. Los polipéptidos aislados se evaluaron en los estudios de inmunogenicidad y protección en animales.

Ejemplo 10.1: Comparación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5, C-TABNCTB y C-TADCTB en ratones.

Este estudio se llevó a cabo para comparar la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5, C-TABNCTB y C-TADCTB en ratones vacunados con cinco dosis de antígeno en dos intervalos logarítmicos. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.) con 6 a 7 semanas para este estudio. Todos los animales recibieron dos vacunaciones: la primera mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se llevó a cabo mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Todas las inmunizaciones se llevaron a cabo en ausencia de alumbre. Se recogieron muestras de sangre dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA y se indicaron como unidades de ELISA (UE) que se muestran en la Figura 17.

Este estudio demostró que las proteínas de fusión C-TADCTB y C-TABNCTB alternativas, así como también C-TAB.G5 son altamente inmunógenas y capaces de inducir una respuesta de anticuerpos fuerte contra la toxina A y la toxina B incluso sin agregar un adyuvante.

Además de evaluar la respuesta de anticuerpos, se determinó la capacidad de la inmunización con C-TADCTB y C-TABNCTB para proteger a los ratones contra una exposición letal a la toxina B natural. Tres semanas después de la segunda vacunación (día de estudio 35) los animales en los grupos vacunados y no vacunados (N=6) recibieron por vía intraperitoneal (IP) una dosis letal de 50 ng de toxina B. La supervivencia de los animales se monitorizó en los 9 días posteriores y los resultados se muestran en la Figura 18. Este experimento demostró que la inmunización de ratones con 33 pg de C-TADCTB en ausencia de alumbre fue capaz de conferir un 100 % de protección contra una exposición letal a la toxina B natural, mientras que la misma dosis de C-TAB.G5 y C-TABNCTB solo induce una protección parcial. Estos datos indican que, de forma similar a C-TAB.G5, otras dos proteínas de fusión C-TADCTB y C-TABNCTB pueden ser protectoras contra la exposición letal a la toxina natural.

Ejemplo 10.2: Comparación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5.1 y C-TADCTB en hámsteres.

Este estudio se llevó a cabo para evaluar adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína de fusión C-TADCTB alternativa administrada con o sin adyuvante alumbre en un modelo de animal diferente.

Este estudio se diseñó tal como se describe en el Ejemplo 6: se vacunaron hámsteres hembra tres veces mediante inyección IM (días de estudio 0, 14 y 28) en presencia o ausencia de 100 pg de hidróxido de alumbre. Dos semanas después de la tercera vacunación (día de estudio 42) todos los animales recibieron una exposición letal por inyección intraperitoneal (IP) de 75 ng de toxina A o 125 ng de toxina B. Se recogieron muestras de sangre en los días de estudio 14, 28 y 35 y se determinaron los títulos de anticuerpos séricos para C-TAB, toxina A y toxina B mediante ELISA. Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (ANT) se midieron en sueros del día 35. La supervivencia de los hámsteres se monitorizó y se informó como un % de protección.

Este estudio demostró que la proteína de fusión C-TADCTB puede inducir una respuesta de anticuerpos antitoxina en hámsteres, de forma similar a con ratones. El adyuvante alumbre mejoró significativamente todos los títulos de anticuerpo evaluados. Los resultados del ensayo ANT que se muestran en la Figura 19 indican que el anticuerpo generado contra C-TADCTB es eficaz para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. difficile. La Figura 19 también muestra la comparación de datos de protección para hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 o con C-TADCTB. Se logró una protección elevada mediante vacunación con ambas proteínas de fusión recombinantes.

Ejemplo 11: Un estudio en fase 1 sin ocultación para evaluar la seguridad, inmunogenicidad y respuesta a la dosis de una composición farmacéutica que comprende C-TAB.G5.1.

La composición farmacéutica que comprende C-TAB.G5.1, una proteína de fusión recombinante que consiste en la Toxina A y la Toxina B truncadas de Clostridium difficile (C. difficile), que se administrará en tres dosis diferentes: 20 pg con Al(OH)3 (alumbre), 75 y 200 pg con y sin Al(OH)3, respectivamente, por inyección intramuscular (IM) en tres vacunaciones los días 0,7 y 21.

Objetivos del estudio:

Primarios:

■ Investigar la seguridad y tolerabilidad de una composición farmacéutica que comprende C-TAB.G5.1 hasta 6 meses después de la tercera vacunación.

Secundarios:

■ Investigar la respuesta inmunitaria medida contra el antígeno de vacuna C-TAB.G5.1 y las toxinas A y B naturales de C. difficile para tres dosis diferentes y dos formulaciones en los días 0, 7, 14, 21, 28, 113, 201 después de la primera vacunación para obtener una primera indicación de la dosis y formulación óptimas.

■ Investigar la capacidad de los anticuerpos IgG inducidos por la vacuna de C-TAB.G5.1 para neutralizar las toxinas A y B de C. difficile in vitro.

Diseño del estudio

Se trata de un estudio en fase 1, sin ocultamiento, parcialmente aleatorizado, de dosis escalonadas que consistirá en una parte A en adultos sanos con edades entre >18 y <65 años y una parte B en ancianos sanos >65 años, el último grupo etario representa la población más vulnerable a padecer infecciones por C. difficile. La parte A se llevará a cabo con un régimen de vacunación en los días 0, 7 y 21 en cinco grupos de tratamiento de 12 sujetos adultos sanos para estudiar la seguridad y la respuesta a la dosis para 20 pg de vacuna de C-TAB.G5.1 con adyuvante y para 75 pg y 200 pg de vacuna de C-TAB.G5.1 con o sin adyuvante, respectivamente. La seguridad y la inmunogenicidad se analizarán después de que todos los sujetos adultos de la parte A hayan recibido la tercera vacunación, todos los datos de seguridad serán revisados por una Junta de Vigilancia de Datos de Seguridad (DSMB, por sus siglas en inglés) antes de la inclusión de sujetos de la parte B. En caso de identificar grupos de tratamiento no seguros o en vano (es decir, dosis que no inducen respuestas de IgG considerables) durante el análisis provisional, estos grupos de tratamiento se suspenderán y no se continuarán en la parte B.

La parte B del estudio buscará la confirmación de la dosis en la población anciana. Por consiguiente, la parte B se llevará a cabo en 5 grupos de tratamiento de 20 sujetos ancianos sanos por grupo. Se aplicará el régimen de vacunación de los días 0, 7 y 21. Este diseño de estudio permitirá comparar respuestas a dosis en adultos y ancianos. El último grupo etario será la población objetivo principal para una vacua para C. difficile, ya que representa la población más vulnerable para las dos indicaciones objetivo en la vía de desarrollo de una vacuna para C. difficile, es decir, la prevención de la diarrea por C. difficile recurrente y la prevención de la infección primaria por C. difficile en una estrategia de vacunación preventiva basada en la edad o en el riesgo por edad. Sin embargo, los sujetos ancianos podrían responder menos a la vacunación que los adultos jóvenes, por consiguiente, la confirmación de la dosis en la población objetivo de ancianos es necesaria desde una etapa de desarrollo temprana. Un análisis provisional después de que todos los adultos de la parte A hayan sido vacunados permitirá descartar dosis/formulaciones no seguras que no inducen respuestas de IgG considerables en adultos a efectos de mitigar el resigo de exponer a los sujetos en el grupo de ancianos a dosis potencialmente inseguras o en vano (p. ej., la dosis más baja) y/o formulaciones (p. ej., formulación sin adyuvante) de la vacuna.

La vacuna de C-TAB.G5.1 es una disolución acuosa de C-TAB.G5.1 en 20 mM de L-Histidina, 75mM de NaCl, sacarosa al 5 %, Tween®80 al 0,025 %; pH6,5 producida mediante métodos estándares.

Secuencias

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunógena o de vacuna que comprende un polipéptido aislado que tiene al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID N.°: 4 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido proporciona 100 % de supervivencia de hámsteres vacunados con dicho polipéptido tras administración intragástrica de una dosis de 102, 103 y 104 de esporas de Clostridium difficile.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que el polipéptido comprende 19 unidades repetitivas derivadas del dominio del extremo C de la toxina A de Clostridium difficile.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido comprende 23 unidades repetitivas derivadas del dominio del extremo C de la toxina B de Clostridium difficile.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido tiene al menos 90 %, más preferiblemente 95 %, lo más preferiblemente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID N.°: 4.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polipéptido tiene la secuencia establecida en la SEQ ID N.°: 2 o la SEQ ID N.°: 4.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende un adyuvante.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el adyuvante comprende alumbre.

9. Un polipéptido aislado que tiene al menos 86 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID N.°: 4, o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad asociada a C. difficile (EACD).

10. El polipéptido o composición para uso de la reivindicación 9, para uso en la prevención de EACD en un sujeto en riesgo de padecer una EACD.

11. El polipéptido o composición para uso en la reivindicación 10, en el que dicho sujeto en riesgo de padecer una EACD es: i) un sujeto anciano; ii) un sujeto con SIDA; iii) un sujeto que toma o planea tomar fármacos inmunosupresores; iv) un sujeto con una hospitalización planeada o un sujeto que está en un hospital; v) un sujeto que está o se espera que vaya a una unidad de cuidados intensivos; vi) un sujeto que se está sometiendo o planea someterse a cirugía gastrointestinal; vii) un sujeto que está o planea ir a un centro de asistencia para una estancia prologada, tal como una residencia de ancianos; viii) un sujeto con comorbilidades que requiere un uso frecuente y/o prolongado de antibióticos; ix) un sujeto con EACD recurrente; x) un sujeto menor de 18 años; xi) un sujeto de 18 a 65 años; o xii) un sujeto mayor de 65 años.

12. El polipéptido o composición para uso de la reivindicación 10, en el que dicho sujeto en riesgo de padecer una EACD es mayor de 65 años.

13. El polipéptido o composición para uso de la reivindicación 9, en el que el tratamiento de EACD incluye reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad, mejorar los síntomas de la enfermedad o sus combinaciones.

14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además un antígeno adicional.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en anestésicos, analgésicos, antiinflamatorios, esteroides, antibióticos, antiartríticos, anorexígenos, antihistamínicos y antineoplásicos.