KR101907434B1 - C. 디피실의 a 독소 및 b 독소 단백질의 분리된 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열 번호 2 및 서열 번호 4의 아미노산 서열에 기재된 C. 디피실 A 독소 및 B 독소의 수용체 결합 도메인을 포함하는 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. C. 디피실 A 독소 및/또는 B 독소의 독성 효과를 중화시키기 위해 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 클로스트리디윰 디피실(Clostridium difficile) A 독소 및 B 독소의 수용체 결합 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩타이드 및 백신으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 이 분리된 폴리펩타이드는 독소 둘 다에 항독소 면역력을 제공한다.
클로스트리디윰 디피실은 병원내 항생제 관련 설사의 주원인이고, 병원, 요양원 및 다른 관리 시설에서 주요한 건강 문제가 된다. 입원 비용은 유럽에서는 2십억 달러로 추산되고, 미국에서는 3.2십억 달러로 추산된다.
병인은 환경에서도 흔히 발견되기는 하지만, 건강한 성인 집단의 2% 내지 3%의 장관에도 존재하는 그람 양성, 포자 형성 혐기성 박테리아이다. C. 디피실(C. difficile) 관련 질환(C. difficile associated disease: CDAD)은 일반적으로 항생제 투여의 결과인 정상 결장 세균총(flora)의 파괴에 의해 유도된다. 환경에서 C. 디피실 포자에 노출된 후, 유기체는 장점막에 콜로니화될 수 있고, 여기서 질환 유발 독소가 생성되어 CDAD를 야기할 수 있다. 질환은 경증의 단순 설사로부터 중증의 가막성 대장염 및 독성 거대결장에 이를 수 있다.
CDAD는 건강 관리 환경에서 더욱 더 문제가 된다. 최근 연구는 항생제를 투여받은 입원 환자 중 31%가 C. 디피실로 콜로니화되고, 이 콜로니화된 환자 중 56%가 CDAD로 진행한다고 보고하고 있다. 대체로, 모든 항생제 관련 설사 중 10% 내지 25%, 항생제 관련 대장염 중 50% 내지 75% 및 항생제 관련 가막성대장염 대장염 중 90% 내지 100%의 원인은 C. 디피실이다. CDAD의 치료는 원인 항생제를 중단한 후, 메트로니다졸 또는 반코마이신 중 어느 하나로 치료하는 것을 수반한다. 항생제 치료 중단 후 대략 20%의 환자에서 재발하였고, 이는 대개는 C. 디피실에 의한 재콜로니화의 결과이다.
2003년에, 캐나다 퀘벡주에서의 C. 디피실 발생은 북미 표현형 1/027(North American Phenotype 1/027: NAP1)로 공지된 C. 디피실의 더 맹독인 균주의 출현을 나타낸다. NAP1은 이전의 균주와 비교하여 더 높은 독성, 나쁜 결과, 더 높은 이환율 및 사망률과 관련된다. 이 균주의 출현은 CDAD의 발병을 포함하도록 노력하는 중에 이미 접한 문제점을 부가한다.
재발성 질환의 예방을 위한 피닥소마이신(디피시드(Dificid)(카피라이트))은 새로운 유형의 협영역 거대고리 항생제 약물의 1세대이다(Revill, P.; Serradell, N.; Bolos, J. (2006). "Tiacumicin B: macrolide antibiotic treatment of C. difficile-associated diarrhea". Drugs of the Future 31 (6): 494-497). 이는 액티노마이세트 닥틸로스포랑기움 아우란티아쿰(actinomycete Dactylosporangium aurantiacum) 아종 함데네시스(hamdenesis)로부터 얻은 발효 생성물이다. 피닥소마이신은 비전신성이고, 이는 피닥소마이신이 혈류로 최소로 흡수되고, 살균성이며, 건강한 정상 장내 세균총을 구성하는 여러 박테리아 종을 최소로 파괴하면서 병원성 클로스트리디윰 디피실의 선택적 구제를 입증한다. 대장에서 정상 생리학적 조건의 유지는 클로스트리디윰 디피실 감염 재발 확률을 감소시킬 수 있다(Johnson, Stuart (2009-06). "Recurrent Clostridium difficile infection: a review of risk factors, treatments, and outcomes". Journal of Infection 58 (6): 403-410). 이러한 새로운 유형의 항생제 약물의 도입으로 CDAD의 치료가 개선된다고 생각되지만, 노인 및 면역 손상 환자와 같은 고위험 환자에 대해 예방 약물의 의학적 수요가 여전히 존재한다.
CDAD는 C. 디피실에 의해 생성된 A 독소 및 B 독소(또한 각각 CTA 및 CTB라 칭함)의 2종의 외독소의 작용의 결과이다. 독소 둘 다 복수의 기능성 도메인을 보유하는 고분자량(약 300kDa) 분비 단백질이다(Voth DE and Ballard JD, Clinical Microbiology Reviews 18:247-263 (2005)). 독소 둘 다의 N 말단 도메인은 로 유사(Rho-like) GTPase를 변형하는 ADP-글루코실트랜스페라아제 활성을 포함한다. 이러한 변형은 악틴 중합 손실 및 세포골격 변화를 발생시켜 결장 상피 밀착 연접을 파괴한다. 이는 결장으로 유체 삼출을 과도하게 발생시켜 설사를 발생시킨다. 중앙 도메인은 소수성 도메인을 포함하고 막 전달에 관여하는 것으로 예상된다. 독소 둘 다의 C 말단 도메인은 세포를 표적화하는 독소 결합에 관여하는 반복 단위(repeating unit: RU)라 불리는 복수의 상동성 영역을 포함한다(Ho et al, PNAS 102:18373-18378 (2005)). 반복 단위는 짧은 반복 단위(21개 내지 30개의 아미노산) 또는 긴 반복 단위(약 50개의 아미노산)로 분류된다. 반복 단위는 합쳐져 클러스터를 형성하고, 각각 일반적으로 1개의 긴 반복 단위 및 3개 내지 5개의 짧은 반복 단위를 포함한다. 전장 A 독소는 8개의 클러스터로 조직화되는 39개의 반복 단위(ARU)를 보유하고(Dove et al. Infect. Immun. 58:480-488 (1990)), 전장 B 독소는 5개의 클러스터로 조직화되는 24개의 반복 단위(BRU)를 포함한다(Barroso et al., Nucleic Acids Res. 18:4004 (1990); Eichel-Streiber et al., Gene 96:107-113 (1992)).
동물 모델 및 임상 둘 다로부터 얻은 여러 연구는 C. 디피실 관련 질환으로부터 보호하는 데 있어서 항독소 항체에 대한 역할을 나타낸다. 포르말린 불활화 A 독소 및 B 독소로 면역화된 햄스터는 높은 수준의 항독소 항체를 생성하였고 C. 디피실 박테리아의 치사 항원공격으로부터 보호되었다(Giannasca PJ and Warny M, Vaccine 22:848-856 (2004)). 또한, 마우스 항독소 항체의 수동 전달은 용량 의존 방식으로 햄스터를 보호하였다. 킨 엘(Kyne L) 등(The Lancet 357:189-193 (2001))은 CDAD의 초기 에피소드 동안 항-A 독소 항체 반응의 전개는 질환 재발에 의한 보호와 상관된다는 것을 보고하고 있다.
보호 항독소 항체에 의해 인식된 결정부위는 수용체 결합 도메인으로서 작용하는 반복 단위를 포함하는 C 말단 도메인에 국재화된다. 초기에, 라이얼리(Lyerly) 등(Current Microbiology 21:29-32 (1990))은 33개의 반복 단위를 포함하는 A 독소 C 말단 도메인이 중화 항독소 항체의 생성을 유도할 수 있고 C. 디피실 감염으로부터 보호할 수 있다는 것을 밝혔다. 이 연구에서, 박테리아의 항원공격 전에 수회 정제된 재조합 폴리펩타이드를 햄스터에 피하로 주사하였지만, 부분 보호만이 성취되었다. 다른 연구(Ryan et al., Infect. Immun. 65:2941-49 (1997))는 CTA의 C 말단으로부터의 720개의 아미노산 잔기 및 이. 콜라이(E. coli) 용혈소 A(비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에서 발현됨)의 분비 신호를 포함하는 분리된 폴리펩타이드가 래빗 CDAD 모델에서 적은 용량의 CTA에 대해 보호성 전신 및 점막 면역력을 유발한다는 것을 나타낸다.
A 독소 및 B 독소 둘 다의 C 말단 도메인에 대한 항체 반응이 완전 보호를 성취하기 위해 필요하다는 것이 또한 보고되었다(Kink and Williams, Infect. Immun. 66:2018-25 (1998), 미국 특허 제5,736,139호(1998)). 이 연구는 각각의 독소의 C 말단 도메인이 독소 중화 항체를 생성하는 데 있어서 가장 효과적이라는 것을 밝혔다. 이는 햄스터 치사 모델에서 CTA 및 CTB의 C 말단 도메인에 대해 얻은 경구로 전달된 조류 항체(항독소)의 유효성을 나타낸다. 그 결과는 또한 인간에서 CDAD의 치료 및 관리에서 항독소가 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 다른 연구에서, 인간 항-A 독소 및 항-B 독소 단일클론 항체는 햄스터에서 C. 디피실 유발 사망률에 보호를 부여한다고 보고되었다(Babcock et al., Infect. Immun. 74:6339-6347 (2006)). 독소 중 어느 하나의 수용체 결합 도메인을 겨냥한(directed against) 항체에 의해서만 보호가 관찰되었고, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체 둘 다에 의한 치료 후 보호 증대가 관찰되었다.
반면, 워드(Ward) 등(Infect. Immun. 67: 5124-32 (1999))은 면역보강제 활성의 연구를 위해 C. 디피실 A 독소로부터의 14개의 반복 단위(14개의 CTA)를 고려하였다. 반복 단위를 클로닝하고, N 말단 폴리히스티딘 태그에 의해 발현(14개의 CTA-HIS)시키거나, 파상풍 독소로부터의 비독성 결합 도메인에 융합(14개의 CTA-TETC)하였다. 비강내 투여된 융합 단백질 둘 다 마우스에서 항-A 독소 혈청 항체를 생성시켰지만 점막 표면에서 반응을 생성시키지 않았다. 이. 콜라이 열 불안정 독소(labile toxin: LT) 또는 이의 돌연변이 형태 LTR72와의 동시투여 후 증대된 전신 및 점막 항-A 독소 반응이 관찰되었다. 데이터에 기초하여, 워드 등은 클로스트리디아 병원균을 겨냥한 인간 백신에서 점막 면역보강제로서 비독성 14개의 CTA-TETC 융합을 이용하는 것을 제시하였다.
C. 디피실 독소의 반복 단위 도메인에 대한 최근의 생화학적 연구는 안정한 3차 구조를 형성하기 위한 최소 서열 요건을 검토하였다(Demarest SJ et al., J. Mol. Bio. 346:1197-1206 (2005)). A 독소 유래의 11개의 반복 단위 펩타이드는 정확한 3차 구조로 관찰되지만 A 독소 및 B 독소 유래의 6개 및 7개의 반복 단위는 그렇지 않았다. 정확하게 폴딩된 11개의 반복 단위 분절은 수용체 결합 특성을 유지하는 것으로 발견되었다. 제2 연구는 6개, 11개 또는 15개의 반복 단위를 포함하는 A 독소 단편의 기능 특성을 검토하였다(Dingle T, Glycobiology 18:698-706 (2008)). 오직 11개 및 15개의 반복 단위가 항-A 독소 항체의 독소 중화 항체를 경쟁적으로 억제할 수 있다. 모든 3개의 단편이 혈구응집 활성을 갖는 것으로 밝혀졌지만, 더 긴 단편은 더 짧은 단편보다 더 높은 혈구응집 활성을 나타낸다. 데이터는 11개 내지 14개 초과의 반복부를 포함하는 도메인 단편에서 독소 수용체 결합 도메인 구조 및 면역원성이 보유된다는 것을 나타낸다.
토마스(Thomas) 등(WO 제97/02836호, 미국 특허 제5,919,463호(1999))은 또한 점막 면역보강제로서 C. 디피실 A 독소, B 독소 및 특정한 이의 단편(예를 들면, 반복 단위의 일부 또는 전부를 포함하는 C 말단 도메인)을 개시하였다. 토마스 등은 CTA 또는 CTB의 비강내 투여는 복수의 마우스 구획에서 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유레아제, 난알부민 또는 키홀 림페트 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH)과 같은 비상동성 항원에 대한 점막 면역 반응을 유의적으로 증대시키고, 헬리코박터의 항원공격에 대한 보호와 관련된다는 것을 나타낸다. 추가로, A 독소 융합 단백질의 면역보강제 활성을 평가하였다: ARU(A 독소 반복 단위)를 포함하는 CTA의 794개의 C 말단 아미노산 잔기를 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)에 융합하였고, 생성된 폴리펩타이드 GST-ARU를 이. 콜라이에서 발현시켰다. 이 연구는 혈청 및 점막 분비에서 동시투여된 항원에 대한 GST-ARU에 의한 유의적인 면역 반응 증대를 나타낸다.
모든 이 연구는 CDAD에 대한 활성 백신을 생성하기 위해 C. 디피실 A 독소 또는 B 독소 중 어느 하나 또는 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 비독성, 재조합 단백질의 잠재적 용도를 제시한다. 현재, C. 디피실에 대한 백신이 상업적으로 구입 가능하더라도, 인간 I상 및 IIa상 연구에서 포르말린 해독 전체 A 독소 및 B 독소로 이루어진 후보물질 백신이 평가되고 있다. 이 백신에 의한 비경구 면역화가 항독소 IgG 및 독소 중화 항체 반응을 유도한다고 보고되었다(Kotloff KL et al., Infect. Immun. 69:988-995 (2001); Aboudola S et al., Infect. Immun. 71:1608-1610 (2003)).
문헌은 추가로 그 전체 또는 이의 단편으로 C. 디피실의 A 독소 및 B 독소 수용체 결합 도메인 둘 다를 포함하는 재조합 융합 단백질의 구성이 백신 개발에 대한 효과적이고 상업적으로 실행 가능한 접근법이라는 것을 나타낸다. 이러한 접근법이 바르폴로미에바(Varfolomeeva) 등에 의해 A 독소의 700개의 염기쌍 단편 및 B 독소의 1300개의 염기쌍 단편의 2부분 융합 단백질로서 시도되었다(Mol. Genetics, Microb. and Virol. 3:6-10 (2003)). 벨리(Belyi) 및 바르폴로미에바가 이러한 접근법을 또한 기술하였고(FEMS Letters 225:325-9 (2003)), 이는 C. 디피실 A 독소 및 B 독소의 반복 단위로 이루어진 2개의 C 말단 도메인, 이어서 클로스트리디윰 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 내독소 Cpe의 단편의 3부로 이루어진 재조합 융합 단백질의 구성을 나타낸다. 융합 단백질은 이. 콜라이에서 발현되었지만, 생성물은 봉입체에서 축적되었고, 안정하지 않았다. 더구나, 이 연구에서 성취된 순수한 생성물의 수율(100㎖의 배양물당 50㎍)은 상당히 낮았다.
윌킨스(Wilkins) 등(WO 제00/61762호, 미국 특허 제6,733,760호(2004))은 또한 CDAD에 대한 백신의 제제를 위한 재조합 C. 디피실 A 독소 및 B 독소 반복 단위(재조합 ARU 및 재조합 BRU) 및 이의 폴리사카라이드 접합체의 용도를 기술하였다. 생성된 재조합 ARU 단백질은 867개의 아미노산 잔기를 포함하고, 재조합 BRU 단백질은 622개 길이의 아미노산을 포함한다. 이전에 언급된 연구와 달리, 이러한 업적은 이. 콜라이 중에 고수준 발현의 재조합 ARU 및 BRU 가용성 단백질을 나타낸다. 재조합 ARU 및 폴리사카라이드 접합 재조합 ARU 둘 다로 백신접종된 마우스는 고수준의 중화 항-A 독소 항체를 증가시키고, C. 디피실 A 독소의 치사 항원공격에 매우 보호되었다. 또한, 윌킨스 등은 백신의 제제를 위해 ARU 및 BRU 둘 다로 이루어진 재조합 융합 단백질을 사용하는 것을 제안하였다.
CDAD에 대해 백신을 개발하는 데 관심이 있다. 백신으로서 ARU 및 BRU로 이루어진 재조합 융합 단백질이 잠재적으로 유용할 수 있다.
본 발명은 C. 디피실로부터 A 독소 및 B 독소의 설계, 제조 및 사용을 위한 새로운 도구 및 방법을 제공한다. 본 발명은 서열 번호 2(C-TAB.G5) 또는 이의 유도체, 서열 번호 4(C-TAB.G5.1)를 포함하는 분리된 폴리펩타이드 C-TAB을 제공한다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1은 B 독소의 C 말단 도메인의 23개의 반복 단위에 융합된 A 독소의 C 말단 도메인의 19개의 반복 단위를 포함한다. 본 발명은 또한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 제제를 포함한다. 상기 조성물은 또는 제제는 분리된 폴리펩타이드, 추가의 항원, 면역보강제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물 또는 제제는 면역보강제 또는 다른 활성 성분(그러나 임의로 담체, 완충제 및/또는 안정화제와 같은 부형제를 포함함) 없이 분리된 폴리펩타이드로 실질적으로 이루어질 수 있다. 더구나, 특히, 예를 들면 재발성 CDAD를 앓고 있는 피험체 또는 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 피험체에서 다른 약물, 예컨대 항생제와 동시에 본 발명의 조성물 또는 제제를 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 제공한다. 백신은 면역보강제, 예컨대 명반, ADP-리보실화 외독소 유래의 면역보강제 또는 다른 것 등을 추가로 포함할 수 있다. 1 용량 섭생, 2 용량 섭생(예를 들면, 제1 용량의 10일 내지 15일 후, 예를 들면 3일 내지 20일 내 투여), 3 용량 섭생(예를 들면, 제1 용량의 약 7일 및 약 21일 후 투여) 또는 3 초과의 용량 섭생, 바람직하게는 2 또는 3의 용량 섭생으로 백신을 투여할 수 있고, 이 용량은 20㎍ 내지 200㎍의 양의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 분리된 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하여 CDAD와 같은 질환의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 근육내 또는 다른 전달 경로에 의해 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 피험체에게 투여할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기 프로필을 갖는 피험체 등과 같은 CDAD의 위험이 있는 피험체에게 본 발명의 분리된 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 투여하여 CDAD와 같은 질환을 예방하는 방법을 제공한다: ⅰ) 노인 피험체(예를 들면, 65세보다 많은 피험체) 또는 2세보다 어린 피험체 등과 같은 면역계가 약한 피험체; ⅱ) AIDS를 앓고 있는 피험체 등과 같은 면역 손상 피험체; ⅲ) 면역억제 약물을 섭취하거나 섭취할 계획이 있는 피험체; ⅳ) 입원 계획이 있는 피험체 또는 입원 중인 피험체; ⅴ) 중환자실(ICU)에 있거나 중환자실로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅵ) 위장관 수술을 받거나 받을 계획이 있는 피험체; ⅶ) 요양원과 같은 장기간 치료시설에 있거나 이 치료시설로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅷ) 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 병존질환을 앓고 있는 피험체; ⅸ) 위장관 수술을 받을 계획이 있는 노인 피험체 등과 같은 상기 언급된 프로필 중 2개 이상에 속하는 피험체; ⅹ) 염증성 장 질환을 앓고 있는 피험체; 및/또는 xi) CDAD의 하나 이상의 에피소드를 경험한 피험체 등과 같은 재발성 CDAD를 앓고 있는 피험체.
일 실시형태에서, 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 이. 콜라이 발현 시스템과 같은 박테리아 발현 시스템을 이용하여 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산으로부터 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 A 독소의 19개의 반복 단위는 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 링커를 통해 B 독소의 23개의 반복 단위에 연결된다. 예의 방식으로, 본 발명의 링커는 서열 RSMH(Arg-Ser-Met-His)(서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 439번 내지 442번 아미노산)를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 예를 들면 ARU 및/또는 BRU에서 적어도 하나의 돌연변이(예를 들면, 삽입, 치환 또는 결실)를 포함하는 분리된 폴리펩타이드의 변이체를 제공한다. 변이체의 서열은 서열 번호 2와 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 재조합 DNA 조작, 박테리아 발효 및 단백질 정제를 통해 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 또는 이들의 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 구성하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 박테리아 발현 시스템, 예컨대 이. 콜라이 발현 시스템을 이용하여 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간과 같은 이를 필요로 하는 피험체에서 CDAD를 예방하거나 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 이 방법에서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 피험체에게 단독으로 투여하거나 명반 또는 다른 것과 같은 1종 이상의 면역보강제와 함께 동시투여하다. 피험체는 C. 디피실에 노출될 위험이 있는 건강한 개인, C. 디피실 감염으로부터 치료되거나 회복된 인간 피험체 및 C. 디피실에 의한 재감염의 위험이 있는 인간 피험체 또는 현재 C. 디피실로 감염되고 이 병증이 C. 디피실 독소 중화 항체의 유도에 의해 개선될 수 있는 인간 피험체일 수 있다.
본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 피험체에게 적용하기에 적합한 제제 내에 항원 특이적 면역 반응을 증대시키기 위한 면역보강제 및/또는 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 근육내(IM) 전달, 피내(ID) 전달, 피하(SC) 전달, 복강내(IP) 전달, 경구 전달, 비강 전달, 협측 전달 또는 직장 전달에 의해 면역원성 조성물을 전달할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 면역원성 조성물은 천연 C. 디피실 독소에 결합하여 이의 세포독성 활성을 중화시켜 C. 디피실 관련 질환(CDAD)에 장기간, 활성 보호 및/또는 치료를 제공하는 항체를 발생시킨다.
따라서, 본 발명은 이를 필요로 하는 피험체에서 C. 디피실 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용한 면역원성 조성물을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 코딩하는 핵산 및 이의 단편 또는 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는 항체 및 이의 단편, 예컨대 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1에 특이적인 중화, 인간화, 단일클론, 키메라 및 다중클론 항체를 제공한다. 항체 또는 이의 단편은 A 독소 및/또는 B 독소를 인식할 수 있다.
다른 실시형태는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 핵산, 폴리펩타이드 및/또는 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태 및 이점은 부분적으로 하기 상세한 설명에 기재되어 있고, 부분적으로 이 상세한 설명으로부터 명확할 수 있거나, 본 발명의 실행으로부터 배울 수 있다.
도 1a는 C-TAB.G5 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(서열 번호 1)을 보여준다. 도 1b는 C-TAB.G5 분리된 폴리펩타이드의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 보여준다. A 독소 도메인과 B 독소 도메인 사이의 아미노산 링커는 밑줄쳐 있다.
도 2a는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(서열 번호 3)을 보여준다. 도 2b는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 아미노산 서열 (서열 번호 4)을 보여준다. A 독소 도메인과 B 독소 도메인 사이의 아미노산 링커는 밑줄쳐 있다.
도 3은 C-TAB.G5의 용량 증가 및 명반 면역보강제와의 동시전달에 의해 C-TAB.G5 백신접종된 마우스의 항체 생성의 증대효과를 보여준다. 마우스는 IM 주사로 2회 백신접종을 투여받았다. 제1 및 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다.
도 4는 2회 IM 주사에 의해 명반과 함께 및 명반과 없이 증가하는 용량의 C-TAB.G5를 투여받은 마우스에서 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 IgG 유도의 그래프 표현을 보여준다.
도 5는 명반의 존재 또는 부재 하의 C-TAB.G5로 면역화된 마우스에서 1 로그 용량 범위에 걸친 항체 역가를 보여준다. 제2 면역화 2주 후 ELISA에 의해 IgG 역가를 평가하였다. 데이터는 백신접종된 마우스에서 명반이 항체 생성을 유의적으로 증대시킨다는 것을 보여준다.
도 6은 (명반과 함께 및 명반 없이) C-TAB.G5로 백신접종된 후 치사량의 A 독소 또는 B 독소에 노출된 마우스에서의 보호 효과를 보여준다. 3주 후 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받은 마우스를 항원공격(IP)하였다. 제2 주사 2주 후 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 평가하고, 치사 항원공격에 생존한 동물의 백분율을 결정하였다. C-TAB.G5의 용량 증가는 TNA 생성을 더 증가시키고 치사 항원공격에 대한 보호를 증가시켰다. 명반의 존재는 TNA 생성을 추가로 증가시키고 더 낮은 용량에서 생존율을 더 높였다.
도 7은 백신접종된 어린 마우스(6주령 내지 7주령) 및 늙은 마우스(18월령)에서 C-TAB.G5의 항체 반응 및 보호 효율의 비교를 보여준다. 3주 후 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받은 마우스를 항원공격(IP)하였다. 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 ELISA IgG 역가, TNA 생성 및 전체 생존율을 평가하였다. 어린 마우스는 명반없이도 더 높은 항체 반응을 나타내고, 그룹 둘 다 명반의 존재 하에 백신접종될 때 생존율이 개선됨을 나타낸다.
도 8은 백신접종된 어린 마우스 및 늙은 마우스에서 항-C-TAB IgG 항체 발생의 동역학의 비교를 보여준다. 어린 마우스는 IgG 생성률이 더 높고 이를 더 일찍 생성시킨다는 것을 나타내고, 그룹 둘 다 명반의 존재 하에 백신접종될 때 반응이 개선된다는 것을 나타낸다.
도 9는 C-TAB.G5.1 또는 A 및 B 톡소이드 혼합물(1:1) 중 어느 하나로 면역화된 마우스에서 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체 생성의 비교를 보여준다. 마우스는 2회 백신접종 IM 주사를 투여받았다. 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다. 톡소이드에 의한 면역화는 독소 분자의 N 말단 부분에 항체를 유도하고, C-TAB에 의한 면역화는 독소 분자의 C 말단 부분에 항체를 유도하였다.
도 10은 C-TAB.G5.1 또는 A 및 B 톡소이드 혼합물 중 어느 하나로 면역화된 마우스에서 A 독소 또는 B 독소의 항원공격에 대한 TNA 생성 및 보호의 비교를 보여준다. 3주 후 치사량의 A 독소 또는 B 독소에 의해 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받은 마우스를 항원공격(IP)하였다.
도 11은 명반과 함께 및 명반 없이 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에서 항-C-TAB(A), 항-A 독소(B) 및 항-B 독소(C) IgG 생성을 보여준다. 햄스터는 0일 및 14일에 IM 주사에 의해 3회 백신접종을 투여받았다. 14일, 28일 및 35일에 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다.
도 12는 명반과 함께 또는 명반 없이 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에서 항-C-TAB IgG 항체 진행의 그래프 표현을 보여준다.
도 13은 명반과 함께 또는 명반 없이 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에서 TNA 및 보호의 비교를 보여준다. 제3 백신접종 2주 후 햄스터는 IP 주사에 의해 치사량의 A 독소 또는 B 독소를 투여받았다.
도 14는 치사량의 C. 디피실 포자의 위내 투여 후 C-TAB.G5.1로 백신접종된 햄스터의 생존율을 보여준다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존율 맞춤 곡선으로 생존율 데이터를 좌표화하고, 로그 랭크 분석을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 포자 용량(102, 103 및 104)에서, 백신접종된 그룹에서 100%의 햄스터 생존율이 관찰되었고, 위약 그룹에 비해 생존율이 유의적으로 증대되었다.
도 15는 명반의 존재 또는 부재 하에 C-TAB.G5.1로 면역화된 사이노몰거스 원숭이에서 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체 생성을 보여준다. 원숭이의 2개 그룹(그룹당 3마리, 4년령 내지 6년령)은 250㎍의 명반과 함께 또는 명반 없이 200㎍의 C-TAB.G5.1을 투여받았다. 연구 0일, 14일, 28일 및 42일에 혈액 샘플 취했다. 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 IgG 역가를 평가하기 위해 ELISA 방법을 이용하였다.
도 16은 PBS 또는 히스티딘 완충제 중에 1㎍ 내지 30㎍의 용량 범위에 걸쳐 전달된 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1의 면역원성의 비교를 보여준다. 마우스는 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받았다. 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다. PBS 또는 히스티딘 완충제 중에 전달된 C-TAB.G5와 히스티딘 완충제 중에 전달된 C-TAB.G5.1 사이에 모든 3종의 항체 역가는 유의적으로 다르지 않았다(T 시험 분석).
도 17은 마우스에서 C-TAB.G5, C-TABNCTB 및 C-TADCTB의 면역원성의 비교를 보여준다. 2주 간격으로 IM 주사에 의해 마우스는 각각의 재조합 단백질의 2회 백신접종을 투여받았다. 명반 면역보강제의 부재 하에 모든 면역화를 수행하였다. 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다. 모든 3종의 융합 단백질은 고면역원성을 나타낸다.
도 18은 마우스에서 천연 B 독소의 항원공격에 대한 보호를 보여준다. 도 17에 도시된 바대로 마우스를 면역화하고, 3주 후 치사량의 천연 B 독소로 IP 주사로 이 마우스를 항원공격하였다.
도 19는 명반의 부재 또는 존재 하에 C-TAB.G5.1 또는 C-TADCTB 중 어느 하나로 백신접종된 햄스터에서 TNA 및 보호의 비교를 보여준다. 제3 백신접종 2주 후 햄스터는 IP 주사에 의해 치사량의 A 독소 또는 B 독소를 투여받았다.
도 20은 상이한 섭생에서 C-TAB.G5.1로 면역화된 마우스에서 A 독소 또는 B 독소의 항원공격에 대한 TNA 생성 및 보호를 보여준다. 0일, 3일 및 14일에 또는 0일, 7일 및 21일에 또는 0일, 14일 및 28일에 IM 주사에 의해 3회 백신접종된 마우스의 그룹 간 TNA 생성 및 보호의 비교. 마지막 주사 3주 후 마우스를 치사량의 A 독소 또는 B 독소로 항원공격하였다(A 패널은 표 형태이고, B 패널은 그래프 형태임).
도 21은 (100㎕ 중의) 10㎍의 C-TAB.G5.1 및 12.5㎍의 명반의 단일 주사로 면역화된 마우스에서 C. 디피실 A 독소(55ng/마우스)의 항원공격에 대한 보호(생존율)를 보여준다. 21일, 35일 또는 49일 면역화 후 상기 항원공격을 수행하였다.
도 2a는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(서열 번호 3)을 보여준다. 도 2b는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 아미노산 서열 (서열 번호 4)을 보여준다. A 독소 도메인과 B 독소 도메인 사이의 아미노산 링커는 밑줄쳐 있다.
도 3은 C-TAB.G5의 용량 증가 및 명반 면역보강제와의 동시전달에 의해 C-TAB.G5 백신접종된 마우스의 항체 생성의 증대효과를 보여준다. 마우스는 IM 주사로 2회 백신접종을 투여받았다. 제1 및 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다.
도 4는 2회 IM 주사에 의해 명반과 함께 및 명반과 없이 증가하는 용량의 C-TAB.G5를 투여받은 마우스에서 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 IgG 유도의 그래프 표현을 보여준다.
도 5는 명반의 존재 또는 부재 하의 C-TAB.G5로 면역화된 마우스에서 1 로그 용량 범위에 걸친 항체 역가를 보여준다. 제2 면역화 2주 후 ELISA에 의해 IgG 역가를 평가하였다. 데이터는 백신접종된 마우스에서 명반이 항체 생성을 유의적으로 증대시킨다는 것을 보여준다.
도 6은 (명반과 함께 및 명반 없이) C-TAB.G5로 백신접종된 후 치사량의 A 독소 또는 B 독소에 노출된 마우스에서의 보호 효과를 보여준다. 3주 후 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받은 마우스를 항원공격(IP)하였다. 제2 주사 2주 후 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 평가하고, 치사 항원공격에 생존한 동물의 백분율을 결정하였다. C-TAB.G5의 용량 증가는 TNA 생성을 더 증가시키고 치사 항원공격에 대한 보호를 증가시켰다. 명반의 존재는 TNA 생성을 추가로 증가시키고 더 낮은 용량에서 생존율을 더 높였다.
도 7은 백신접종된 어린 마우스(6주령 내지 7주령) 및 늙은 마우스(18월령)에서 C-TAB.G5의 항체 반응 및 보호 효율의 비교를 보여준다. 3주 후 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받은 마우스를 항원공격(IP)하였다. 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 ELISA IgG 역가, TNA 생성 및 전체 생존율을 평가하였다. 어린 마우스는 명반없이도 더 높은 항체 반응을 나타내고, 그룹 둘 다 명반의 존재 하에 백신접종될 때 생존율이 개선됨을 나타낸다.
도 8은 백신접종된 어린 마우스 및 늙은 마우스에서 항-C-TAB IgG 항체 발생의 동역학의 비교를 보여준다. 어린 마우스는 IgG 생성률이 더 높고 이를 더 일찍 생성시킨다는 것을 나타내고, 그룹 둘 다 명반의 존재 하에 백신접종될 때 반응이 개선된다는 것을 나타낸다.
도 9는 C-TAB.G5.1 또는 A 및 B 톡소이드 혼합물(1:1) 중 어느 하나로 면역화된 마우스에서 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체 생성의 비교를 보여준다. 마우스는 2회 백신접종 IM 주사를 투여받았다. 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다. 톡소이드에 의한 면역화는 독소 분자의 N 말단 부분에 항체를 유도하고, C-TAB에 의한 면역화는 독소 분자의 C 말단 부분에 항체를 유도하였다.
도 10은 C-TAB.G5.1 또는 A 및 B 톡소이드 혼합물 중 어느 하나로 면역화된 마우스에서 A 독소 또는 B 독소의 항원공격에 대한 TNA 생성 및 보호의 비교를 보여준다. 3주 후 치사량의 A 독소 또는 B 독소에 의해 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받은 마우스를 항원공격(IP)하였다.
도 11은 명반과 함께 및 명반 없이 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에서 항-C-TAB(A), 항-A 독소(B) 및 항-B 독소(C) IgG 생성을 보여준다. 햄스터는 0일 및 14일에 IM 주사에 의해 3회 백신접종을 투여받았다. 14일, 28일 및 35일에 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다.
도 12는 명반과 함께 또는 명반 없이 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에서 항-C-TAB IgG 항체 진행의 그래프 표현을 보여준다.
도 13은 명반과 함께 또는 명반 없이 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에서 TNA 및 보호의 비교를 보여준다. 제3 백신접종 2주 후 햄스터는 IP 주사에 의해 치사량의 A 독소 또는 B 독소를 투여받았다.
도 14는 치사량의 C. 디피실 포자의 위내 투여 후 C-TAB.G5.1로 백신접종된 햄스터의 생존율을 보여준다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존율 맞춤 곡선으로 생존율 데이터를 좌표화하고, 로그 랭크 분석을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 포자 용량(102, 103 및 104)에서, 백신접종된 그룹에서 100%의 햄스터 생존율이 관찰되었고, 위약 그룹에 비해 생존율이 유의적으로 증대되었다.
도 15는 명반의 존재 또는 부재 하에 C-TAB.G5.1로 면역화된 사이노몰거스 원숭이에서 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체 생성을 보여준다. 원숭이의 2개 그룹(그룹당 3마리, 4년령 내지 6년령)은 250㎍의 명반과 함께 또는 명반 없이 200㎍의 C-TAB.G5.1을 투여받았다. 연구 0일, 14일, 28일 및 42일에 혈액 샘플 취했다. 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 IgG 역가를 평가하기 위해 ELISA 방법을 이용하였다.
도 16은 PBS 또는 히스티딘 완충제 중에 1㎍ 내지 30㎍의 용량 범위에 걸쳐 전달된 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1의 면역원성의 비교를 보여준다. 마우스는 2주 간격으로 2회 백신접종(IM)을 투여받았다. 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다. PBS 또는 히스티딘 완충제 중에 전달된 C-TAB.G5와 히스티딘 완충제 중에 전달된 C-TAB.G5.1 사이에 모든 3종의 항체 역가는 유의적으로 다르지 않았다(T 시험 분석).
도 17은 마우스에서 C-TAB.G5, C-TABNCTB 및 C-TADCTB의 면역원성의 비교를 보여준다. 2주 간격으로 IM 주사에 의해 마우스는 각각의 재조합 단백질의 2회 백신접종을 투여받았다. 명반 면역보강제의 부재 하에 모든 면역화를 수행하였다. 제2 주사 2주 후 ELISA에 의해 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 항체에 대한 IgG 역가를 평가하였다. 모든 3종의 융합 단백질은 고면역원성을 나타낸다.
도 18은 마우스에서 천연 B 독소의 항원공격에 대한 보호를 보여준다. 도 17에 도시된 바대로 마우스를 면역화하고, 3주 후 치사량의 천연 B 독소로 IP 주사로 이 마우스를 항원공격하였다.
도 19는 명반의 부재 또는 존재 하에 C-TAB.G5.1 또는 C-TADCTB 중 어느 하나로 백신접종된 햄스터에서 TNA 및 보호의 비교를 보여준다. 제3 백신접종 2주 후 햄스터는 IP 주사에 의해 치사량의 A 독소 또는 B 독소를 투여받았다.
도 20은 상이한 섭생에서 C-TAB.G5.1로 면역화된 마우스에서 A 독소 또는 B 독소의 항원공격에 대한 TNA 생성 및 보호를 보여준다. 0일, 3일 및 14일에 또는 0일, 7일 및 21일에 또는 0일, 14일 및 28일에 IM 주사에 의해 3회 백신접종된 마우스의 그룹 간 TNA 생성 및 보호의 비교. 마지막 주사 3주 후 마우스를 치사량의 A 독소 또는 B 독소로 항원공격하였다(A 패널은 표 형태이고, B 패널은 그래프 형태임).
도 21은 (100㎕ 중의) 10㎍의 C-TAB.G5.1 및 12.5㎍의 명반의 단일 주사로 면역화된 마우스에서 C. 디피실 A 독소(55ng/마우스)의 항원공격에 대한 보호(생존율)를 보여준다. 21일, 35일 또는 49일 면역화 후 상기 항원공격을 수행하였다.
일반적인 설명
본 발명은, A 독소의 19개의 반복 단위(RU) 및 B 독소의 23개의 반복 단위(RU) 또는 펩타이드 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 분리된 폴리펩타이드 C-TAB.G5(서열 번호 2) 또는 이의 유도체, C-TAB.G5.1(서열 번호 4)의 사용을 포함하는, C. 디피실 A 독소 및 B 독소에 대한 보호 및/또는 치료학적 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제조하는 방법 및 포유동물에서 CDAD의 예방 및/또는 치료에 유용한 조성물(예를 들면, 백신)을 제조하는 방법을 제공한다. 하기 설명은 재조합 분리된 폴리펩타이드의 구성, 발현 및 정제, 피험체에서 특이적 면역 반응을 유도하고 보호를 평가하기 위한 항원으로서의 이의 용도에 대한 더 많은 상세내용 및 예를 제공한다. 피험체는 동물 또는 인간일 수 있다.
임의의 여러 표준 방법을 이용하여 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 제조할 수 있고, 독소 코딩 핵산 단편의 일부를 포함하는 적절한 발현 벡터로 적합한 숙주 세포를 형질전환한다(예를 들면, 문헌[Dove et al., Infect. Immun. 58:480-8 (1990) 및 Barroso et al., Nucleic Acids Research 18:4004 (1990)] 참조). 재조합 폴리펩타이드를 제조하기 위해 임의의 광범위한 발현 시스템을 사용할 수 있다. 원핵생물 숙주(예를 들면, 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 또는 바실러스(Bacillus)) 또는 진핵생물 숙주(예를 들면, 효모 세포, 포유동물 세포(예를 들면, COS1, NIH3T3 또는 JEG3 세포) 또는 곤충 세포(예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda: SF9) 세포))에서 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 제조할 수 있다. 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)로부터 이러한 세포를 입수할 수 있다. 형질전환 및 형질감염의 방법 및 발현 벡터의 선택은 선택된 숙주 시스템에 따라 달라진다. 형질전환 및 형질감염 방법은 예를 들면 문헌[Ausubel et al., ISBN: 047132938X C-TAB.G5 or C-TAB.G5.1]에 기재되어 있고, 화학 합성, 예를 들면 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, 2nd ed., Stewart and Young, Eds., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill]에 기재된 방법 또는 표준 실험실내 번역 방법에 의해 특히 짧은 단편을 또한 제조할 수 있다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 서열 이외에, 본 발명은 기능적으로 활성이고 면역원성인 이들의 변이체를 제공한다. 변이체는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1과 동일한 수준의 면역원성을 가질 수 있다. 변이체는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 비교하여 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가질 수 있다. 표준 방법을 이용하여 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 코딩하는 유전자 또는 이들의 변이체를 만들 수 있다(하기 참조; 또한, 예를 들면 상기 문헌[Ausubel et al.] 참조).
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 서열 이외에, 본 발명은 추가의 반복부를 포함하는 C-TAB.G5의 유도체를 추가로 제공한다. 예의 방식으로, 융합 단백질, C-TABNCTB(서열 번호 18, 서열 번호 17에 의해 코딩됨)는, C-TAB.G5와 같이, CTA의 19개의 반복 단위(2272번 내지 2710번 아미노산), CTB의 23개의 반복 단위(1850번 내지 2366번 아미노산) 및 추가로 CTB의 C 말단에 융합된 CTB의 추가의 10개의 반복부(1834번 내지 2057번 아미노산)를 포함한다. 추가의 변이체, C-TADCTB 융합 단백질(서열 번호 20, 서열 번호 19에 의해 코딩됨)은 C-TAB.G5(CTA의 19개의 반복부 및 CTB의 23개의 반복부)와 C-TAB.G5의 C 말단에 융합된 CTB의 추가의 24개의 반복 단위(1834번 내지 2366번 아미노산)를 포함한다. 변이체는 또한 C-TAB.G5의 추가의 카피 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들면, C-TADCTB는 C-TAB.G5에 존재하는 CTB의 반복 단위의 이중 부분을 포함한다.
본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 코딩하는 핵산을 박테리아 숙주 세포로 도입하는 단계 및 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 발현시키는 단계를 포함하는 이. 콜라이와 같은 박테리아 시스템에서 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 고수준으로 발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 면역보강제에 공유 결합 또는 가교결합될 수 있다(예를 들면, 문헌[Cryz et al., Vaccine 13:67-71(1994); Liang et al., J. Immunology 141:1495-501 (1988) 및 Czerkinsky et al., Infect. Immun. 57:1072-77 (1989)] 참조).
본 발명은 CDAD를 보호하고 이에 대한 치료를 제공할 수 있는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 제공한다. 본 발명의 백신은 근육내(IM), 피내(ID), 피하(SC), 경구, 비강, 협측 또는 직장 경로로 투여될 수 있는 신규한 항원을 포함한다. 백신은 면역 보호를 제공하거나 수동 면역화를 위한 항체를 유도할 수 있다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 CDAD를 면역화하기 위한 백신을 제공한다. 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 또는 이들의 변이체는 지금까지 공지되거나 공개되지 않은 수준으로 CDAD와 같은 C. 디피실 관련 질환에 대한 보호 커버리지(coverage)를 넓히도록 표적화된 복합 백신 후보물질이다. C. 디피실 관련 질환의 보호 또는 중증도 감소를 제공하는 단일 백신의 이러한 개념은 전세계 수준의 공중 보건을 관리하고, 특히 전염병(예를 들면, 요양원, 크루즈 선박)의 중등도를 감소시키는 데 있어서 앞선 독특한 단계를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 "A 독소 단백질" 또는 "B 독소 단백질"은 주로 CDAD의 원인인 C. 디피실의 독성 단백질을 의미한다. A 독소 및 B 독소는 C 말단 결합 도메인에서 면역원성의 원인인 복수의 반복 단위를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "야생형" 또는 "천연"은 숙주 세포에서 내인성으로 발견되는 핵산 또는 아미노산 서열로 이루어진 전장 단백질을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "클로스트리디윰 디피실 관련 질환", "클로스트리디윰 디피실 관련된 질환", "클로스트리디윰 디피실 연관 질환", "클로스트리디윰 디피실 독소 매개 질환", "클로스트리디윰 디피실 감염" 및 "CDAD"는 클로스트리디윰 디피실의 감염에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 야기된 질환을 의미한다.
"항원"은 유기체의 면역 세포에 제시될 때 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 예를 들면, 항원은 핵산, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 당단백질, 탄수화물, 지질, 당지질, 지단백질, 융합 단백질, 인지질 또는 이들의 조합의 접합체일 수 있다. 항원은 B 세포 수용체(즉, B 세포의 막 위의 항체) 또는 T 세포 수용체가 인식하는 단일 면역원성 에피토프 또는 다중도의 면역원성 에피토프를 포함할 수 있다. 항원은 바이러스 유사 입자(virus-like-particle: VLP) 또는 전체 미생물 또는 미세유기체, 예를 들면 박테리아 또는 비리온 등으로서 제공될 수 있다. 항원은 불활화 또는 약독화 생 바이러스일 수 있다. 항원은 추출물 또는 용해물, 전세포 또는 막 단독으로부터 얻을 수 있거나; 항원은 화학적으로 합성되거나 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 항원을 그 자체로 또는 면역보강제와 함께 투여할 수 있다. 단일 항원 분자는 항원 및 면역보강제 특성 둘 다를 가질 수 있다.
"면역보강제"란 항원 제시 세포의 활성화를 통해 항원 특이적 면역 반응을 특이적으로 또는 비특이적으로 강화시키기 위해 사용되는 임의의 물질을 의미한다. 면역보강제의 예로는 유성 에멀션(예를 들면, 완전 또는 불완전 프로인트 면역보강제), ISA와 같은 몬타나이드(Montanide) 불완전 셉픽(Seppic) 면역보강제, 수중유 에멀션 면역보강제, 예컨대 리비(Ribi) 면역보강제 시스템, 무라밀 다이펩타이드를 포함하는 신택스(syntax) 면역보강제 제제, 알루미늄염 면역보강제(ALUM), 적어도 2개의 LysLeuLys 모티브, 특히 KLKLLLLLKLK를 포함하는 다중양이온 중합체, 특히 다중양이온 펩타이드, 특히 폴리아르기닌 또는 펩타이드, 한정된 염기 상황에서 비메틸화 사이토신-구아닌 다이뉴클레오타이드(CpG)를 포함하는 면역자극 올리고데옥시뉴클레오타이드(oligodeoxynucleotide: ODN)(예를 들면, WO 제96/02555호에 기재됨) 또는 이노신 및 사이티딘에 기초한 ODN(예를 들면, WO 제01/93903호에 기재됨), 또는 데옥시-이노신 및/또는 데옥시유리딘 잔기를 포함하는 데옥시핵산(WO 제01/93905호 및 WO 제02/095027호에 기재됨), 특히 올리고(dIdC)13(WO 제01/93903호 및 WO 제01/93905호에 기재됨), 신경활성 화합물, 특히 인간 성장 호르몬(WO 제01/24822호에 기재됨) 또는 이들의 조합, 케모카인(예를 들면, 디펜신 1 또는 2, RANTES, MIP1-α, MIP-2, 인터류킨-8 또는 사이토카인(예를 들면, 인터류킨-1β, -2, -6, -10 또는 -12; 인터페론-γ; 종양 괴사 인자-α; 또는 과립구-단핵구-콜로니 자극 인자)(문헌[Nohria and Rubin, 1994] 참조), 무라밀 다이펩타이드 변이체(예를 들면, 뮤라부타이드, 트레오닐-MDP 또는 무라밀 트라이펩타이드), MDP의 합성 변이체, 열 충격 단백질 또는 변이체, 레슈마니아 메이져(Leishmania major) LeIF의 변이체(Skeiky et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 1527-1537), 트립신 절단 부위에서의 변이체를 비롯하여 박테리아 ADP-리보실화 외독소(bARE)의 비독성 변이체(Dickenson and Clements, (1995) Infection and Immunity 63 (5): 1617-1623) 및/또는 영향을 미치는 ADP-리보실화(Douce et al., 1997) 또는 화학적으로 해독된 bARE(톡소이드), QS21, 퀼 A(Quill A), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타밀-L-알라닌-2-[1,2-다이팔미토일-s-글라이세로-3-(하이드록시포스포릴옥시)]에틸아마이드(MTP-PE) 및 대사성 오일 및 유화제를 포함하는 조성물을 들 수 있다. 면역보강제를, 항원의 경로와 동일한 경로 또는 항원의 경로와 상이한 경로로, 항원과 투여할 수 있거나, 그 자체만 투여할 수 있다. 단일의 면역보강제 분자는 면역보강제 및 항원 특성 둘 다를 가질 수 있다.
"유효량"이란 항원에 대해 항원 특이적 면역 반응을 유도하거나 증대시키기에 또는 약물에 대해 병증을 치료하거나 진단하기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 이러한 면역 반응의 유도는 확립된 감염 질환에 대해 면역보호, 탈감작, 면역억제, 자가면역 질환 조절, 암 면역감시 강화 또는 치료학적 백신접종 등과 같은 치료를 제공할 수 있다. 치료는 경화, 경감 또는 예방을 포함한다.
"핵산"이란 포스포다이에스터 결합에 의해 결합된 단일 데옥시리보핵산 염기 또는 리보핵산 또는 이의 서열을 의미한다.
"치료제"란 질환을 치료하거나, 질환의 증상을 경감시키거나, 질환을 예방하거나, 질환을 진단하는 데 사용될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 예를 들면, 치료제는 항원 또는 약물일 수 있다.
"피험체"란 동물을 의미한다. 피험체는 임의의 척추동물을 포함하는 임의의 동물일 수 있다. 피험체는 가정용 가축, 실험실 동물(설치류, 예컨대 랫트, 햄스터, 모래쥐 또는 마우스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음) 또는 애완 동물일 수 있다. 일 실시형태에서, 동물은 포유동물일 수 있다. 포유동물의 예로는 인간, 영장류, 유대류, 개과, 원숭이, 설치류, 고양이과, 유인원, 고래, 돌고래, 소, 돼지 및 말을 들 수 있다. 피험체는 질환의 치료를 필요로 하거나, 예방학적 치료를 필요로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "항체"는 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자의 면역글로불린 분자 또는 단편을 의미한다. 항체는 면역 과학의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "항체"는 전장 항체 분자뿐만 아니라 항원 결합 능력을 보유하는 항체 분자의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 실험실내 및 생체내 둘 다에서 규칙적으로 사용된다. 특히, 본 명세서에 사용되는 용어 "항체"는 전장 면역글로불린 분자뿐만 아니라 널리 공지된 활성 단편 F(ab')2, Fab, Fv 및 Fd와 같은 항원 결합 활성 단편을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "변이체"는 야생형 폴리펩타이드와 다른 단백질 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 포함할 수 있고, 하나 이상의 잔기는 기능적으로 유사한 잔기로 보존적으로 치환되고 야생형 폴리펩타이드의 실질적으로 동일한 기능 특성을 추가로 나타낸다. 보존적 치환의 예로는 1개의 비극성(소수성) 잔기의 다른 잔기(예를 들면, 아이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌)로의 치환, 1개의 극성(친수성) 잔기의 다른 잔기(예를 들면, 아르기닌과 라이신 간, 글루타민과 아스파라긴 간, 글라이신과 세린 간)로의 치환, 1개의 염기성 잔기의 다른 잔기(예를 들면, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘)로의 치환 또는 1개의 산성 잔기의 다른 잔기(예를 들면, 아스파르트산 또는 글루탐산)로의 치환을 들 수 있다. 변이체는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 기능 특성을 또한 나타내는 본 발명의 폴리펩타이드와 실질적으로 유사한 3차 구조를 갖는 임의의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 변이체는 야생형 폴리펩타이드의 돌연변이체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "치료"는 개인 또는 세포의 자연 과정을 변화시키기 위한 시도에서 이용되는 임의의 유형의 중재를 포함할 수 있다. 치료는 당해 분야에 일반적으로 공지된, 예를 들면 단독의 또는 다른 치료 양상과 조합된 약제학적 조성물의 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예방학적으로 또는 병리학적 사건의 개시에 후속하여 "치료"를 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는, 활성 성분과 조합될 때, 성분이 생물학적 활성을 보유하고 피험체의 면역계과 비반응성이 되도록 하는 임의의 재료를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제는 완충제, 안정화제, 희석제, 보존제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 담체 또는 부형제의 성질은 이용되는 특정한 투여 방식에 따라 달라진다. 예를 들면, 비경구 제제는 일반적으로 비히클로서 물, 생리학적 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글라이세롤 등과 같은 약학적으로 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사용 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들면, 산제, 환제, 정제 또는 캡슐제 형태)의 경우, 전통적인 비독성 고체 담체는 예를 들면 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적 천연 담체 이외에, 투여되는 약제학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예를 들면 아세트산나트륨 또는 솔비탄 모노라우레이트를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "융합"은 핵산 및 폴리펩타이드가 본 발명에 따라 위치한 순서 또는 맥락에서 서로 천연상 관련된 것으로 발견되지 않은 서열을 포함하는 핵산 및 폴리펩타이드를 의미할 수 있다. 융합 핵산 또는 폴리펩타이드는 핵산 또는 폴리펩타이드의 천연 서열을 반드시 그 전체로 포함할 필요는 없다. 융합 단백질은 일반 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 2개 이상의 분절을 갖는다. 융합 핵산은 일반 포스포다이에스터 결합을 통해 함께 연결된 2개 이상 분절을 갖는다.
분리된
폴리펩타이드
본 발명은 C. 디피실 A 독소의 19개의 반복 단위 및 C. 디피실 B 독소의 23개의 반복 단위를 포함하는 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 기재된 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제공한다. C-TAB.G5의 동족체, 예컨대 C-TAB.G5.1은 C-TAB.G5와 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 다를 수 있다. C-TAB.G5.1 폴리펩타이드는 C-TAB.G5와 B 독소의 동일한 C 말단 도메인(155번 내지 156번 위치에서 2개의 아미노산이 다름)도 포함하지만, C. 디피실 630 균주 유래의 C-TAB.G5 폴리펩타이드에 따른 동족체인 C. 디피실 VPI-10463 균주 유래의 A 독소의 C 말단 도메인도 포함하는 융합 단백질이다. 서열 번호 3에 기재된 C-TAB.G5.1 코딩 서열은 이. 콜라이 숙주 세포 내에 개선된 발현을 위해 코돈 최적화된다. 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 C. 디피실 A 독소 및 B 독소의 독성 효과를 중화시키는 데 있어서 효과적일 수 있다.
A 독소 및 B 독소는 각각 C. 디피실 균주 630의 trdA(서열 번호 5) 및 trdB(서열 번호 7) 유전자에 의해 코딩된다. 구조적으로, C. 디피실 독소는 ADP-글루코실 트랜스퍼라제 도메인, 시스테인 프로테아제 도메인, 소수성 영역 및 수용체 결합 영역을 포함한다. C 말단 도메인은 고도 반복 단위(RU)(또한 조합된 반복 올리고펩타이드(CROPS)로도 공지됨)를 포함한다. RU는 긴 또는 짧은 올리고펩타이드일 수 있고 반복된 공통 YYF 모티브를 갖는 20개 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. RU는 클러스터로 그룹화된다. 예로서, 야생형 trdA 유전자(서열 번호 5)에 의해 코딩된 균주 630(서열 번호 6)인 A 독소는 39개의 RU를 포함한다. 39개의 RU는 8개의 클러스터로 그룹화된다. 야생형 trdB 유전자(서열 번호 7)에 의해 코딩된 균주 630(서열 번호 8)인 B 독소는 5개의 클러스터로 그룹화된 24개의 RU를 포함한다. 하기 표 1, 표 2 및 표 3은 trdA 유전자 및 trdB 유전자에 의해 코딩된 C. 디피실 A 독소 및 B 독소에서 각각의 RU의 아미노산 위치를 보여준다.
따라서, C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 각각 C. 디피실 A 독소의 C 말단 도메인으로부터 19개의 RU 및 C. 디피실 B 독소의 C 말단 도메인으로부터 23개의 RU를 포함한다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1은 서열 번호 8의 B 독소 1850번 내지 2366번 아미노산에 융합된 서열 번호 6의 A 독소 2272번 내지 2710번 아미노산을 포함한다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 내의 각각의 RU는 또한 C. 디피실 A 독소 또는 B 독소의 변이체 유래일 수 있다. C-TAB 분리된 폴리펩타이드 내의 이 RU는 또한 C. 천연 디피실 A 독소 또는 B 독소 또는 이의 변이체의 조합일 수 있다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 내의 RU는 긴 RU 및 짧은 RU를 포함하고, 긴 RU 및 짧은 RU는 클러스터로 배열된다. 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 3개 내지 5개의 짧은 RU에 이어서 C. 디피실 A 독소의 1개의 긴 RU의 4개의 클러스터 및 3개 내지 5개의 짧은 RU에 이어서 C. 디피실 B 독소의 1개의 긴 RU의 5개의 클러스터를 포함한다.
짧은 RU 및 긴 RU는 보존된 모티브를 포함한다. 짧은 반복 단위는 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 아미노산을 포함할 수 있다. 각각의 짧은 반복 단위는 보존된 티로신 모티브, 예컨대 YYF, FYF, YFF, FYI 또는 HYF를 포함할 수 있다. 짧은 반복 단위는 다음의 반복 단위가 긴 반복 단위인 경우 티로신 모티브 전에 아스파테이트/히스티딘 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 긴 반복 단위는 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개 또는 35개의 아미노산을 포함할 수 있다. 각각의 긴 반복 단위는 티로신 반복 모티브, 예컨대 FEYF, FKYF 또는 YKYF를 포함할 수 있다.
본 발명에서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 A 독소 및 B 독소 부분은 함께 직접 융합될 수 있다. A 독소 및 B 독소 부분은 링커 영역에 의해 떨어질 수 있다. 링커 영역은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 내지 15개, 20개 내지 30개, 40개, 45개 또는 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 당업자는, A 독소 및 B 독소 부분의 발현되고 폴딩된 형상에서 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 내의 각각의 독소 반복 단위가 가능한 에피토프를 최적으로 노출하고 이의 면역원성을 보유하게 위치하도록, 이들 독소 부분의 위치를 변경하도록 링커 영역이 적합할 수 있다는 것을 인식할 것이다. C-TAB 분리된 폴리펩타이드 내의 RU 및 클러스터는 또한 링커에 의해 분리될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 펩타이드 RSMH(서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 439번 내지 442번)를 포함한다.
본 발명의 C-TAB 분리된 폴리펩타이드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성 또는 서열 유사성을 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 바대로, 1개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 및 이의 보존된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환기를 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열과 비교하여 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 "유사성"을 결정한다. 이러한 서열의 2개의 스트링 사이의 일치의 동일성에 의해 결정되는 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련도를 의미하는 "동일성"이 당해 분야에 또한 공지되어 있다. 동일성 및 유사성 둘 다 쉽게 계산할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 여러 방법이 존재하지만, "동일성" 및 "유사성"의 용어는 당업자에게 널리 공지되어 있다(Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)). 2개의 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 결정하기 위해 보통 이용되는 방법은 문헌[Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)]에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 면역원성이다. 예를 들면, 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 상응하는 박테리아 A 독소의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 면역학적 활성을 가질 수 있고, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 상응하는 박테리아 B 독소의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 면역학적 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 CDAD의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 경감시키기 위한 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 또한 각각 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 변이체를 포함한다. 변이체는 분리된 폴리펩타이드의 활성, 기능 또는 형상에 최소의 영향을 미치거나 영향을 미치지 않는 아미노산 삽입, 치환 및/또는 결실을 가질 수 있다. 이러한 치환의 예로는 1개의 비극성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 1개의 극성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 1개의 염기성 잔기의 다른 잔기로의 치환 또는 1개의 산성 잔기의 다른 잔기로의 치환을 들 수 있다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 변이체는 폴리펩타이드의 활성, 기능 및/또는 구조에 최소의 영향을 미치는 천연 A 독소 또는 B 독소의 세포외 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산의 삽입, 치환 및/또는 결실을 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 비천연 아미노산을 또한 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 비천연 아미노산은 예를 들면 베타-알라닌(베타-Ala) 또는 다른 오메가-아미노산, 예컨대 3-아미노 프로피온산, 2,3-다이아미노 프로피온산(2,3-diaP), 4-아미노 부티르산 등, 알파-아미노아이소부티르산(Aib), 사르코신(Sat), 오르니틴(Orn), 시트룰린(Cit), t-뷰틸알라닌(t-BuA), t-뷰틸글라이신(t-BuG), N-메틸아이소류신(N-MeIle), 페닐글라이신(Phg) 및 사이클로헥실알라닌(Cha), 노르류신(Nle), 시스테산(Cya) 2-나프틸알라닌(2-Nal); 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카복실산(Tic); 베타-2-티에닐알라닌(Thi); 및 메티오닌 설폭사이드(MSO)를 포함한다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 다양한 숙주 세포에서 발현을 증대시키도록 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 관심 대상의 숙주 세포의 유전자에서 또는 세포가 유래한 숙주의 유전자에서 천연 서열의 1개 이상의 코돈을 더 흔히 사용되는 코돈으로 대체함으로써 그 숙주 세포에서 단백질 발현을 증대시키기 위해 뉴클레오타이드 서열을 변형하는 것을 의미한다. 다양한 종은 특정한 아미노산의 특정한 코돈에 대한 특정한 바이어스를 나타낸다. 본 발명은 이. 콜라이에서 발현 증대를 위해 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 임의의 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 분리된 폴리펩타이드는 유전자 조작, 예의 방식으로, 재조합 DNA의 번역을 통해 발현될 수 있다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 또한 합성으로 제조될 수 있다. 예의 방식으로, 메리필드의 문헌[J. Am Chem. Soc. 85:2149-2154](본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 처음 기재된 고상 합성 기술을 이용하여 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kent et al. (1985) in Synthetic Peptides in Biology and Medicine, eds. Alitalo et al., Elsevier Science Publishers, 295-358]에서 다른 폴리펩타이드 합성 기술을 확인할 수 있다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 실질적으로 순수한 형태로 분리시키거나 얻을 수 있다. 실질적으로 순수한은 단백질 및/또는 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드가 이의 의도하는 용도를 위해 실질적이고 적절한 정도로 이것과 함께 자연에서 또는 생체내 시스템에서 발견될 수 있는 다른 물질을 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 특히, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 충분히 순수하고, 예를 들면 항체를 생성하거나, 약제학적 제제를 서열분석하거나, 제조하는 데 있어서 유용하도록 이의 숙주 세포의 다른 생물학적 성분을 충분히 포함하지 않는다. 당해 분야에 널리 공지된 기술에 의해, 본 명세서에 개시된 핵산 및 아미노산 서열의 견지에서 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 실질적으로 순수한 분리된 본 발명의 폴리펩타이드가 약제학적 제제에서 약학적으로 허용되는 담체와 혼합될 수 있으므로, 분리된 폴리펩타이드는 제제 중 오직 특정한 중량 백분율을 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 분리된 폴리펩타이드는 살아 있는 시스템에서 이것이 관련될 수 있는 물질로부터 실질적으로 분리된다는 점에서 실질적으로 순수하다.
본 발명은 추가의 폴리펩타이드를 포함하는 분리된 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 추가의 폴리펩타이드는 더 큰 폴리펩타이드의 단편일 수 있다. 일 실시형태에서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 융합된 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 추가의 폴리펩타이드가 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 향해 융합된다. 다른 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 카복실 말단을 향해 융합된다. 추가의 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 플랭킹한다. 다른 추가의 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 A 독소 부분과 B 독소 부분 사이에 분산된다.
몇몇 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 분비 또는 세포 이하의 편재화를 지시하는 것을 돕는다. 이러한 폴리펩타이드를 "신호 서열"이라 칭한다. 분비 신호는, 예를 들면 미국 특허 제6,291,212호 및 미국 특허 제5,547,871호(둘 다 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 분비 신호 서열은 분비 펩타이드를 코딩한다. 분비 펩타이드는 세포로부터 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1의 분비를 지시하도록 작용하는 아미노산 서열이다. 분비 펩타이드는 일반적으로 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 하고, 새로 합성된 단백질의 아미노 말단에서 통상적으로(그러나 배타적인 것은 아님) 발견된다. 분비 펩타이드는 분비 동안 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드로부터 절단될 수 있다. 분비 펩타이드는 분비 경로를 통과하면서 성숙 단백질로부터 신호 펩타이드를 절단하는 프로세싱 부위를 포함할 수 있다. 프로세싱 부위는 신호 펩타이드 내에 코딩될 수 있거나, 예를 들면 실험실내 돌연변이에 의해 신호 펩타이드에 첨가될 수 있다. 분비 신호 서열은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 분비시키는 복잡한 일련의 번역 후 프로세싱 단계에 필요할 수 있다. 신호 서열은 즉시 개시 코돈을 후행할 수 있고 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1의 아미노 말단 끝에서 신호 펩타이드를 코딩한다. 신호 서열은 중지 코돈에 선행할 수 있고 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1의 카복시 말단 끝에서 신호 펩타이드를 코딩한다. 대부분의 경우, 신호 서열은 신호 펩티다제라 불리는 특이적 프로테아제에 의해 절단된다. 분비 신호 서열의 예는 ompA, pelB 및 ST pre-pro를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 안정화, 구조 및/또는 정제를 돕는다. 몇몇 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 에피토프를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 친화도 태그를 포함할 수 있다. 예의 방식으로, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 대한 에피토프 및/또는 친화도 태그를 포함하는 폴리펩타이드의 융합은 폴리펩타이드의 정제 및/또는 동정을 도울 수 있다. 예의 방식으로, 폴리펩타이드 분절은 His-태그, myc-태그, S-펩타이드 태그, MBP 태그(말토스 결합 단백질), GST 태그(글루타티온 S-트랜스퍼라제), FLAG 태그, 티오레독신 태그, GFP 태그(비소성 형광 단백질), BCCP(바이오틴 카복실 운반 단백질), 칼모듈린 태그, 스트렙 태그, HSV-에피토프 태그, V5-에피토프 태그 및 CBP 태그일 수 있다. 이러한 에피토프 및 친화도 태그의 사용은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
추가의 실시형태에서, 추가의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 절단을 위한 부위를 포함하는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 예로서, 폴리펩타이드는 펩타이드 결합의 가수분해에 의해 절단될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 효소에 의해 절단을 수행한다. 몇몇 실시형태에서, 세포에서 절단이 일어난다. 다른 실시형태에서, 인공 조작 및/또는 절단 효소의 인공 도입을 통해 절단이 일어난다. 예의 방식으로, 절단 효소는 펩신, 트립신, 키모트립신, 트롬빈 및/또는 Xa 인자를 포함할 수 있다. 절단은 폴리펩타이드로부터 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드가 쉽게 분리되게 한다. 절단은 추가로 B 독소 부분으로부터 A 독소 부분이 분리되게 할 수 있다. 절단은 또한, 예컨대 발현된 단백질을 정제하기 위해 사용되는 에피토프의 절단을 통해, 폴리펩타이드에 융합된 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드가 다른 폴리펩타이드로부터 분리되게 할 수 있다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 아데닐화, 카복실화, 글라이코실화, 하이드록실화, 메틸화, 포스포릴화 또는 미리스틸화와 같은 동일한 유기적으로 합성된 펩타이드와 공유되지 않은 추가의 구조 변형을 추가로 보유할 수 있다. 재조합 발현 시스템의 적절한 선택에 의해 이러한 첨가된 구조 변형이 추가로 선택되거나 바람직할 수 있다. 반면, 융합 폴리펩타이드는 유기 합성의 원칙 및 실행에 의해 연장된 이의 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 C. 디피실 A 독소로부터 얻은 폴리펩타이드 부분 및 C. 디피실 B 독소로부터 얻은 폴리펩타이드 부분을 포함하는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이의 중합체의 단일 또는 이중 가닥 형태를 포함할 수 있다. 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 리보핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 엄격한 조건 하에 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 이의 보체를 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 핵산을 제공한다. 엄격한 조건은 프로브와 필터 결합 핵산 사이의 상동성 정도를 의미하고; 엄격도가 더 높을수록, 프로브와 필터 결합 핵산 사이의 상동성(%)이 더 높다. 엄격한 세척에 대한 온도를 핵산(G/C 함량에 기초함)의 Tm에 기초하여 결정할 수 있다. 엄격한 조건은 표준 시트르산나트륨(SSC)과 같은 완충제 중의 염 농도에 의해 추가로 영향을 받을 수 있다. 본 발명은 서열 번호 1과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산을 제공한다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 링커 영역, 예를 들면 약 50개, 40개, 30개, 20개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 미만의 아미노산 잔기의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 링커는 A 독소 유래의 폴리펩타이드 부분 또는 이의 일부와 B 독소 유래의 폴리펩타이드 부분에도 이들 사이에도 공유 결합될 수 있다.
본 발명은 각각 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로 축퇴되는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 유전자 코드의 축퇴성은 관심 대상의 A 독소 단백질, B 독소 단백질 및/또는 분리된 폴리펩타이드의 뉴클레오타이드 서열의 변이를 허용하지만, 천연 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 여전히 생성한다. "코돈 최적화"(미국 특허 제5,547,871호(그 전문이 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재됨)로 공지된 절차는 이러한 변경된 DNA 서열을 설계하는 수단을 제공한다. 코돈 최적화 유전자의 설계는 유기체에서 코돈 출현 빈도, 가장 가까운 이웃 빈도, RNA 안정성, 제2 구조 형성에 대한 가능성, 합성 경로 및 그 유전자의 의도되는 미래의 DNA 조작을 비롯한 다양한 인자를 고려해야 한다. 특히, 소정의 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 코돈을 효모 발현 시스템이 사용될 때 효모에 의해 가장 쉽게 인식되는 코돈 또는 곤충 세포 발현 시스템이 사용될 때 곤충 세포에 의해 가장 쉽게 인식되는 코돈으로 변경하기 위해 이용 가능한 방법이 이용될 수 있다. 유전자 코드의 축퇴성은 또한 동일한 아미노산 서열이 많은 상이한 방식으로 코딩되고 번역되게 한다. 예를 들면, 류신, 세린 및 아르기닌을 각각 6개의 상이한 코돈으로 코딩하고, 발린, 프롤린, 트레오닌, 알라닌 및 글라이신은 각각 4개의 상이한 코돈에 의해 코딩된다. 그러나, 이러한 동의 코돈의 사용 빈도는 진핵생물 및 원핵생물 사이에 게놈마다 변한다. 예를 들면, 포유동물 사이의 동의 코돈 선택 패턴은 매우 유사하지만, 환경적으로 구별되는 유기체, 예컨대 효모(예컨대, S. 세레비시아에(S. cerevisiae)), 박테리아(예컨대, 이. 콜라이) 및 곤충(예컨대, D. 멜라노가스터(D. melanogaster))은 게놈 코돈 사용 빈도의 명확히 상이한 패턴을 나타낸다(Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 8, 49-62 (1980); Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 9, 43-74 (1981); Maroyama, T., et al., Nucl. Acid Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S., et al., Nucl. Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K., et al., Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)). 코돈 선택 패턴의 이러한 차이는 펩타이드 신장율을 조절하여 개별 유전자의 전체 발현 수준에 기여하는 것으로 보인다(Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989); Randall, L. L., et al., Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F., and Yarus, M., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S., et al., J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S., et al., J. Mol, Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).
합성 유전자에 바람직한 코돈 출현 빈도는 재조합 단백질 발현에 사용되도록 의도되는 세포/유기체의 정확한(또는 가능한 밀접히 관련된) 게놈 유래의 핵 유전자의 코돈 출현을 반영해야 한다.
시험된 2개의 서열 사이의 더 큰 일치성을 제공하도록 동일성을 결정하는 바람직한 방법이 설계된다. 컴퓨터 프로그램에서 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 코드화된다. 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, et al., Nucl. Acid Res. 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 언급된 유사성 또는 동일성의 정도를 2개의 서열 사이의 동일성의 정도로서 결정하고, 이는 대개 제2 서열로부터 제1 서열의 편차를 나타낸다. 2개의 핵산 사이의 동일성의 정도를 GCG 프로그램 패키지에 제공된 GAP와 같은 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램에 의해 결정할 수 있다(Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)). 본 발명에 대한 2개의 핵산 사이의 동일성의 정도를 결정할 목적으로, 하기의 세팅에서 GAP를 이용한다: 5.0의 GAP 생성 패널티 및 0.3의 GAP 연장 패널티.
본 발명은 또한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 상이한 유전 환경 사이의 수송 또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 원하는 서열이 제한 및 결찰에 의해 삽입될 수 있는 임의의 여러 핵산일 수 있다. 벡터는 통상적으로 DNA로 이루어지지만, RNA 벡터가 또한 이용 가능하다. 벡터는 플라스미드 및 파지미드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 클로닝 벡터는 숙주 세포에서 복제될 수 있으면서, 새로운 재조합 벡터가 숙주 세포에서 복제하는 이의 능력을 보유하도록, 벡터가 결정 가능한 방식으로 절단될 수 있고 원하는 DNA 서열이 결찰될 수 있는 1개 이상의 엔도뉴클라제 제한 부위를 추가로 특징으로 하는 것이다. 플라스미드의 경우, 플라스미드가 숙주 박테리아 내에 카피수를 증가시키면서 원하는 서열의 복제가 수회 일어날 수 있거나, 숙주가 유사분열에 의해 재생하기 전에 복제가 숙주마다 단지 일회 일어날 수 있다. 파지의 경우, 능동적으로 용해성 단계 동안 또는 수동적으로 용원성 단계 동안 복제가 일어날 수 있다.
벡터는 프로모터 서열을 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 핵산의 전사를 개시하기 위한 부위를 포함하는 코딩 영역의 상류에 일반적으로 위치한 비번역 핵산을 포함할 수 있다. 프로모터 영역은 또한 유전자 발현의 조절요소로서 작용하는 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시형태에서, 발현 벡터는 도입된 발현 벡터를 갖는 세포의 선택을 돕는 추가의 영역을 포함한다. 프로모터 서열은 대개 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 (전면적으로) 결합되고, 상류(5' 방향)로 연장되어 배경 위의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하는 데 필요한 최소 수의 염기 또는 구성요소를 포함한다. 프로모터 서열은 RNA 중합효소의 결합을 책임지는 단백질 결합 도메인 및 전사 개시 부위가 발견된다. 진핵생물 프로모터는 항상은 아니지만 대개 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 포함한다.
벡터는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포의 동정 및 선택에 사용하기에 적합한 1개 이상의 마커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 마커는 예를 들면 항생제 또는 다른 화합물에 대한 저항 또는 감수성을 증가시키거나 감소시키는 유전자 코딩 단백질, 당해 분야에서 공지된 표준 검정(예를 들면, β-갈락토시다제 또는 알칼리 포스파타제)에 의해 활성이 검출 가능한 효소를 코딩하는 유전자, 및 형질전환되거나 형질감염된 세포, 숙주, 콜로니 또는 플라크의 표현형에 가시적으로 영향을 미치는 유전자를 포함한다. 바람직한 벡터는 이 벡터가 작동적으로 연결된 DNA 분절에 존재하는 구조적 유전자 생성물을 자율 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.
발현 벡터는 이 벡터가 조절 서열에 작동적으로 연결되고 RNA 전사체로서 발현될 수 있도록 제한 및 결찰에 의해 원하는 핵산이 삽입될 수 있는 것이다. 발현은 세포 내의 내인성 유전자, 전이유전자 또는 코딩 영역의 전사 및/또는 번역을 의미한다.
코딩 서열 및 조절 서열은 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 이것이 코딩 서열을 발현 또는 전사시키는 방식으로 공유 결합될 때 작동적으로 연결된다. 코딩 서열이 기능적 단백질로 번역되는 것이 바람직할 때, 2개의 DNA 서열은 5' 조절 서열 내의 프로모터의 유도로 코딩 서열이 전사하고 2개의 DNA 서열 사이의 결합의 특성이 (1) 프레임 쉬프트 돌연변이를 도입하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는 경우 작동적으로 연결된다고 말한다. 따라서, 프로모터 영역은 생성된 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되도록 프로모터 영역이 그 DNA 서열의 전사를 수행할 수 있을 때 코딩 서열에 작동적으로 연결된다.
숙주 세포에서 코딩 핵산을 발현시켜 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 핵산을 숙주 세포로 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 몇몇 형태는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 형질전환 및/또는 형질감염을 포함한다. 형질전환은 원핵생물 세포의 내부로의 외인성 또는 비상동성 핵산의 도입이다. 형질감염은 진핵생물 세포의 내부로의 외인성 또는 비상동성 핵산의 도입이다. 형질전환 또는 형질감염 핵산은 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA로 통합(공유 결합)될 수 있거나 되지 않을 수 있다. 원핵생물에서, 예를 들면 형질전환 핵산은 에피솜 구성요소, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서 유지될 수 있다. 진핵생물 세포와 관련하여, 안정하게 형질감염된 세포는 형질감염 핵산이 염색체 복제를 통해 딸세포에 의해 유전되도록 형질감염 핵산이 염색체로 통합된 것이다. 이 안정성은 형질감염된 핵산을 포함하는 딸세포 집단으로 이루어진 세포주 또는 클론을 확립하는 진핵생물 세포의 능력에 의해 입증된다.
더 고등의 진핵생물 세포 배양물은, 곤충을 비롯하여 척추동물 또는 비척추동물 세포이든, 이 세포 유래의 본 발명의 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있고, 이의 전파 절차가 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Kruse et al. (1973) Tissue Culture, Academic Press] 참조).
핵산을 복제하고 코딩된 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 숙주 세포 및 벡터가 또한 제공된다. 원핵생물 또는 진핵생물이든, 임의의 벡터 또는 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 목적에 많은 벡터 및 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있다. 원하는 용도에 적절한 세트를 선택하는 것이 당해 분야의 기술 범위 내에 있다.
C. 디피실 및 당해 분야에 공지된 다른 공지된 A 독소 및 B 독소를 발현하는 원핵생물 유래의 다양한 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 A 독소 및 B 독소 또는 이의 일부를 코딩하는 DNA 서열을 클로닝할 수 있다. 프로브 기반 방법을 이용하는 이러한 DNA 서열을 분리하는 기술은 전통적인 기술이고, 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 DNA 서열을 분리하기 위한 프로브는 공개된 DNA 또는 단백질 서열에 기초할 수 있다. 대안적으로, 멀리스(Mullis) 등(미국 특허 제4,683,195호) 및 멀리스(미국 특허 제4,683,202호)(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 개시된 중합효소 사슬 반응(polymerase chain reaction: PCR) 방법을 이용할 수 있다. 라이브러리의 선택 및 이러한 DNA 서열의 분리를 위한 프로브의 선택은 당해 분야의 당업자의 수준 내에 있다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 유래일 수 있다. 적합한 원핵생물 숙주는 슈도모나스, 예컨대 P. 에루지노사, 에스체리치아 콜라이, 스타필로코커스, 예컨대 S. 아우레우스 및 S. 에피더미디스, 세라티아 마르세센스, 바실러스, 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 메가테리움, 클로스트리디윰 스포로진스, 엔테로코커스 패칼리스, 마이크로코커스, 예컨대 M. 루테우스 및 M. 로제우스, 및 프로테우스 불가리스를 포함한다. 더 고등의 진핵생물에서 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 효모, 예컨대 사카로마이세스(예를 들면, S. 세레비시아에); 293(인간 배아 신장)(ATCC CRL-1573); 293F(캘리포니아주 칼스바드 소재하는 인비트로겐(Invitrogen)); 293T 및 변이체 293T/17(293tsA1609neo 및 변이체 ATCC CRL-11268)(SV40 T 항원에 의해 형질전환된 인간 배아 신장); COS-7(SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포주)(ATCC CRL1651); BHK(베이비 햄스터 신장 세포)(ATCC CRL10); CHO(중국 햄스터 난소 세포); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포; CVI(원숭이 신장 세포)(ATCC CCL70); VERO76(아프리카 푸른 원숭이 신장 세포)(ATCC CRL1587); HeLa(인간 자궁경부암 세포)(ATCC CCL2); MDCK(개과 신장 세포)(ATCC CCL34); BRL3A(버팔로 래트 간 세포)(ATCC CRL1442); W138(인간 폐 세포)(ATCC CCL75); HepG2(인간 간 세포)(HB8065); 및 MMT 060652(마우스 유방 종양)(ATCC CCL51)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 추가의 폴리펩타이드를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 융합 폴리펩타이드의 생성을 위한 진핵생물 발현 시스템을 구성하는 데 유용한 벡터는 적절한 전사 활성화 서열, 예컨대 프로모터 및/또는 오퍼레이터(operator)에 작동적으로 연결된 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 다른 통상적인 특징은 적절한 리보솜 결합 부위, 종결 코돈, 인핸서, 터미네이터 또는 복제 구성요소를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 특징은 전통적인 스플라이싱(splicing) 기술, 예컨대 제한 엔도뉴클라제 소화 및 결찰에 의해 적절한 부위 또는 부위들에서 벡터에 삽입될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 추가의 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 융합될 수 있다. 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 코돈 리딩 프레임을 쉬프팅함이 없이 정제 및/또는 면역원성 및/또는 안정성을 도울 수 있는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드로부터 절단되거나 절단되지 않을 수 있는 분비 서열을 코딩할 수 있다. 융합된 핵산은 발현된 폴리펩타이드를 유의적으로 신장시키지 않을 수 있다. 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 60개 미만의 초과의 아미노산을 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 후 후행한다. 다른 실시형태에서, 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 선행한다. 다른 실시형태에서, 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 플랭킹한다.
몇몇 실시형태에서, 융합된 핵산은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 정제를 돕기 위해 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 융합된 핵산은 에피토프 및/또는 친화도 태그를 코딩한다. 정제를 돕는 폴리펩타이드의 예는 His-태그, myc-태그, S-펩타이드 태그, MBP 태그, GST 태그, FLAG 태그, 티오레독신 태그, GFP 태그, BCCP, 칼모듈린 태그, 스트렙 태그, HSV-에피토프 태그, V5-에피토프 태그 및 CBP 태그를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 실시형태에서, 융합된 핵산은 절단에 지시되거나 쉽게 절단되는 부위를 갖는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 융합된 핵산은 효소 절단의 부위를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 효소 절단은 또 다른 폴리펩타이드로부터 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 다른 융합된 폴리펩타이드 분절을 분리하는 것을 도울 수 있다. 예의 방식으로, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 에피토프 사이에 위치한 효소 절단 부위를 코딩하는 중재 핵산은 발현된 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 에피토프의 이후의 분리를 허용할 수 있다. 이러한 부위는 또한 A 독소 부분과 B 독소 부분 사이에 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 발현시키고 제공하는 것을 돕도록 설계된 발현 시스템을 제공한다. 발현 시스템은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 숙주 세포는 원핵생물일 수 있다. 원핵생물은 이. 콜라이일 수 있다. 숙주 세포는 진핵생물 세포일 수 있다.
발현 시스템은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산으로 성공적으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 돕는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 항생제에 대한 내성에서 숙주 세포를 돕는 유전자, 예컨대 카나마이신 또는 젠타마이신 또는 암피실린 또는 페니실린에 내성을 나타내는 유전자를 추가로 발현할 수 있다. 이러한 내성 유전자는 당해 분야의 당업자에게 공지된 바대로 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산이 적절히 도입된 숙주 세포의 선택을 허용한다.
본 발명의 다른 형태는 항체의 생성에 관한 것이다. 본 발명에 의해 포함된 항체의 예는 피험체를 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드로 면역화하여 제조된 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드로 면역화하여 생성된 항체는 A 독소 또는 B 독소에 특이적으로 결합할 수 있거나, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드와 교차 반응할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 의해 제조된 항체를 규명할 수 있다.
본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 이용하여 제조된 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 2중 특이적 항체, 중쇄로만 된 항체, 이종 접합 항체, 단일 사슬(ScFv), 단일 도메인 항체, 이들의 변이체, 항체 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드, 인간화 항체, 및 항체의 글라이코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유 변형된 항체를 포함하는 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함할 수 있다. 바람직한 항체는 쥣과, 래트, 인간, 래빗, 개과, 돼지, 단봉 낙타, 낙타, 라마, 고양이과, 영장류 유래이거나, 임의의 다른 기원(키메라, 단편 및/또는 인간화 항체 포함) 유래이다.
다른 실시형태에서, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드로 면역화하여 제조된 항체를 이후 인간화한다. 인간화 항체는 비인간 면역글로불린 유래의 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 분자이다. 또 다른 실시형태에서, 특이적 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 구입 가능한 마우스를 이용하여 완전 인간 항체를 얻는다. 다른 실시형태에서, 항체는 키메라이다. 키메라 항체는 2개의 상이한 항체로부터의 특성을 조합하는 항체이다. 키메라 항체를 제조하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
다른 실시형태에서, 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 얻고, 이후 발현 또는 전파를 위해 벡터에 클로닝한다. 다른 실시형태에서, 항체를 재조합으로 만들고 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 발현시킨다. 예의 방식으로, 이 기술에 의해 재조합 항체를 분리시킬 목적으로 항원으로서 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 숙주 세포에서 항체를 재조합으로 발현시키기 위해 유전자 서열을 사용하여 재조합으로 항체를 만들 수 있다. 항체의 변이체 및 재조합 항체를 제조하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
다른 실시형태에서, 예를 들면 생물학적 샘플 또는 견본에서 천연 A 독소 또는 B 독소를 분리시키거나 정제하거나, 천연 A 독소 또는 B 독소 또는 C. 디피실을 검출하는 데 사용하기 위해 당해 분야의 전통적인 방법에 의해 항체는 담체에 결합된다.
조성물 및 제제
본 발명은 또한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 일반적으로 예의 방식으로 비제한적으로 본 발명의 유효량(예를 들면, 면역 반응을 유도하기에 충분한 양)의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 또는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 대한 유효량(예를 들면, 감염을 이동시키고/시키거나, 감염의 증상을 경감시키고/시키거나, 감염을 예방하기에 충분한 중화 항체의 양)의 항체를 포함한다. 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다(일반적으로 문헌[Remington, (2005) The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams and Wilkins] 참조).
CDAD을 앓고 있는 인간 및/또는 동물을 면역화하거나 치료하는 방법에 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물 내에 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제는 전통적이고, 완충제, 안정화제, 희석제, 보존제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제제를 기술한다. 일반적으로, 담체 또는 부형제의 성질은 투여되는 특정한 투여 방식에 따라 달라진다. 예를 들면, 비경구 제제는 일반적으로 비히클로서 약학적으로 및 생리학적으로 허용되는 유체, 예컨대 물, 생리학적 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글라이세롤 등을 포함하는 주사용 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들면, 산제, 환제, 정제 또는 캡슐제 형태)의 경우, 전통적인 비독성 고체 담체는 예를 들면 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적 천연 담체 이외에, 투여되는 약제학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예를 들면 아세트산나트륨 또는 솔비탄 모노라우레이트를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 면역보강제와 같은 면역자극 물질을 추가로 포함할 수 있다. 면역보강제는 투여 방법에 따라 달라질 수 있고, 미네랄 유성 면역보강제, 예컨대 프로인트 완전 및 불완전 면역보강제, ISA와 같은 몬타나이드 불완전 셉픽 면역보강제, 수중유 에멀션 면역보강제, 예컨대 리비 면역보강제 시스템, 무라밀 다이펩타이드를 포함하는 신택스 면역보강제 제제, 수산화알루미늄 또는 알루미늄염 면역보강제(명반), 적어도 2개의 LysLeuLys 모티브, 특히 KLKLLLLLKLK를 포함하는 다중양이온 중합체, 특히 다중양이온 펩타이드, 특히 폴리아르기닌 또는 펩타이드, 한정된 염기 상황에서 비메틸화 사이토신-구아닌 다이뉴클레오타이드(CpG)를 포함하는 면역자극 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)(예를 들면, WO 제96/02555호에 기재됨) 또는 이노신 및 사이티딘에 기초한 ODN(예를 들면, WO 제01/93903호에 기재됨), 또는 데옥시-이노신 및/또는 데옥시유리딘 잔기를 포함하는 데옥시핵산(WO 제01/93905호 및 WO 제02/095027호에 기재됨), 특히 올리고(dIdC)13(WO 제01/93903호 및 WO 제01/93905호에 기재됨), 신경활성 화합물, 특히 인간 성장 호르몬(WO 제01/24822호에 기재됨) 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조합은 예를 들면 WO 제01/93905호, WO 제02/32451호, WO 제01/54720호, WO 제01/93903호, WO 제02/13857호, WO 제02/095027호 및 WO 제03/047602호에 기재된 것에 따른다. 바람직하게는, 면역보강제는 수산화알루미늄 면역보강제이다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여되는 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이다. 담체, 부형제 또는 안정화제는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 탄수화물(예컨대, 단당류 및 이당류), 당(예컨대, 수크로스, 만니톨 및 솔비톨), 인산염, 시트르산염, 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌), 보존제(예컨대, 페놀, 부탄올, 벤자놀; 알킬 파라벤, 카테콜, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올, 염화벤즈알코늄, 염화벤제토늄 및 m-크레솔), 저분자량 폴리펩타이드, 단백질(예컨대, 혈청 알부민 또는 면역글로불린), 친수성 중합체 아미노산, 킬레이트화제(예컨대, EDTA), 염 형성 반대이온, 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물) 및 비이온성 계면활성제(예컨대, 트윈(TWEEN)(상표명) 및 폴리에틸렌 글라이콜)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 원하는 효과를 증대시키고/시키거나 보충하도록 작용하는 추가의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예의 방식으로, 아단위 백신으로 투여되는 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 면역원성을 증대시키기 위해, 약제학적 조성물은 면역보강제를 추가로 포함할 수 있다.
약제학적 조성물의 예는 면역원성 조성물일 수 있다. 본 발명은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 면역원성 조성물은 포유동물에서 주사하기에 적합한 제제 내에 약학적으로 허용되는 담체 또는 다른 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 주사되거나 그렇지 않고 도입될 때 포유동물 숙주에서 면역 반응을 유발하는 물질의 임의의 조성물이다. 면역 반응은 체액성, 세포성 또는 둘 다일 수 있다. 부스터(booster) 효과는 동일한 면역원성 조성물에 대한 포유동물 숙주의 후속 노출 시 면역원성 조성물에 증가된 면역 반응을 의미한다. 체액성 반응은 면역원성 조성물에 대한 노출 시 포유동물 숙주에 의해 항체를 생성한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 인간 및 다른 동물을 비롯하여 포유동물 숙주에서 면역 반응을 유발한다. 면역 반응은 세포내 독립 반응 또는 항체 의존 반응 또는 둘 다일 수 있고; 추가로 반응은 포유동물 숙주에서 면역학적 기억 또는 부스터 효과 또는 둘 다를 제공할 수 있다. 이 면역원성 조성물은 백신으로서 유용하고, C. 디피실의 균주에 의한 감염에 대해 포유동물 피험체 또는 숙주에 의한 보호 반응을 제공할 수 있다.
본 발명은 추가로 미생물 숙주에서 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 구성하고 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 성분을 발현시키는 단계; 숙주의 배양물로부터 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 회수하는 단계; C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 제2 단백질 성분에 접합하는 단계 및 접합된 단백질 및 폴리사카라이드 성분을 회수하는 단계에 의해 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 일정하고 안정한 선택적 압력에 의해 숙주의 성장에 걸쳐 유지될 수 있다. 발현 벡터의 유지는 선택적 유전자형을 코딩하는 유전자 서열의 발현 벡터에서의 도입에 의해 부여될 수 있고, 이 발현은 미생물 숙주 세포에서 선택적 표현형을 생성시킨다. 선택적 유전자형 서열은 또한 조건 치사 돌연변이를 보완하는 유전자를 포함할 수 있다. 다른 유전자 서열은 발현 벡터, 예컨대 다른 내약물성 유전자 또는 치사 돌연변이를 보완하는 유전자에 도입될 수 있다. 미생물 숙주는 그람 양성 박테리아; 그람 음성 박테리아, 예컨대 이. 콜라이; 효모; 곰팡이; 포유동물 세포; 곤충 세포; 또는 식물 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 배양물의 약 50㎎/리터 초과의 수준, 약 100㎎/리터 초과의 수준, 약 500㎎/리터 초과의 수준 또는 약 1g/리터 초과의 수준으로 숙주에서 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 발현의 수준을 제공한다. 본 발명은 또한 예컨대 황산암모늄 침전, 이후 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질의 분리 및 회수를 위해 당업자에게 공지된 임의의 수의 방법에 의해 단백질이 회수될 수 있다는 것을 제공한다.
본 발명은 아미드화(amidization) 반응과 같은 당업자에게 공지된 여러 수단 중 하나에 의해 제2 단백질 성분에 접합된 단백질 성분을 제공하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 CDAD를 치료하고 예방하기 위한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 제제는 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드, 면역보강제 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 제제는 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하거나, 본 발명의 1종 이상의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드로 실질적으로 이루어진다. 상기 제제는 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 면역보강제를 포함할 수 있다. 상기 제제는 추가의 항원 또는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 더구나, 상기 제제는 1종 이상의 약물을 포함할 수 있고, 분리된 폴리펩타이드 및/또는 면역보강제 이외에 1종 이상의 약물을 포함할 수 있다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제는 액체 또는 건조 형태일 수 있다. 건조 제제는 쉽게 저장하고 운송될 수 있다. 건조 제제는 백신의 제조 장소로부터 백신접종이 일어난 지역으로 운송하는 데 필요한 저온 유통체계에서 벗어난다. 대안적으로, 특히 상기 제제의 건조 활성 성분은, 항원 제시 세포에 의해 시작되고 처리된 고체 미립자 형태를 제공하여, 개량품일 수 있다. 이러한 가능한 기전은 본 발명 또는 이의 균등물의 범위를 제한하지는 않지만, 본 발명의 조작의 이해를 제공하고 면역화 및 백신접종에서 이 제제의 용도를 안내하기 위해 기재되어 있다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 건조 제제는 다양한 형태로 제공될 수 있다: 예를 들면, 미세 또는 과립화 분말, 동결건조 분말, 균일 필름, 펠렛 및 정제. 이것은 공기 건조되거나, 승온에서 건조되거나, 동결건조되거나, 동결되거나, 분무 건조되거나, 코팅되거나, 고체 기질에 분무되고, 이후 고체 기질에 건조 더스팅(dusted)되고, 신속히 동결되고 이후 진공 하에 건조되거나 이들의 조합일 수 있다. 상이한 분자가 제제의 활성 성분인 경우, 이것을 용액 중에 혼합한 후 오직 건조 형태로 건조시키거나 혼합할 수 있다.
액체 또는 고체 형태, 예컨대 건조 형태의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제는 동일한 또는 별도의 부위에서 또는 동시에 또는 빈번한 반복 적용으로 1종 이상의 면역보강제와 함께 적용될 수 있다. 상기 제제는 제제의 투여가 복수의 항원에 대한 면역 반응을 유발하도록 다른 항원을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 다른 항원은 상이한 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하도록 상이한 화학 구조를 가질 수 있다. 적어도 1종의 항원 및/또는 면역보강제는 투여 전에 건조 형태로 유지될 수 있다. 저장소로부터의 액체의 후속 방출 또는 상기 제제의 건조 성분을 포함하는 저장소로의 액체의 진입은 그 성분을 적어도 부분적으로 용해시킨다.
고체(예를 들면, 나노미터 또는 마이크로 치수의 입자)는 또한 상기 제제에 도입될 수 있다. 고체 형태(예를 들면, 나노입자 또는 마이크로입자)는 활성 성분의 분산 또는 용매화를 도울 수 있고; 항원 제시 세포에 의해 옵소닌화될 수 있는 기질에 대해 면역보강제, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 또는 둘 다에 대한 부착점을 제공하거나 이들의 조합이다. 시트, 봉 또는 비드로서 형성된 다공성 고체로부터 상기 제제의 방출 연장은 데포로서 작용한다.
상기 제제의 적어도 1종의 성분 또는 구성성분(즉, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드, 면역보강제 또는 약물)은 상기 제제의 투여 전에 건조 형태로 제공될 수 있다. 이 제제는 또한 전통적인 경장, 점막 또는 비경구 면역화 기술과 조합되어 사용될 수 있다.
생물학적 제제 및 백신의 적절한 관리 기관(예를 들면, 식약청, EMEA)에 허용되는 무균 조건 하에 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제를 제조할 수 있다. 임의로, 건조제, 부형제, 안정화제, 습윤제, 보존제 또는 이들의 조합과 같은 성분은 면역학적으로 불활성이더라도 상기 제제에 포함될 수 있다. 그러나, 이 성분은 다른 바람직한 특성 또는 특징을 가질 수 있다.
약제학적 제제를 제조하는 공정은 널리 공지되어 있다. 상기 제제의 성분은 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클, 및 임의의 첨가제(예를 들면, 희석제, 결합제, 부형제, 안정화제, 건조제, 보존제, 착색제)의 임의의 조합과 배합될 수 있다. 고체 담체의 사용, 및 건조 성분의 용매화를 돕는 부형제 또는 면역원성 또는 면역보강제 활성의 안정화제의 첨가는 바람직한 실시형태이다. 일반적으로, 문헌[Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (electronic edition, 2003); Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd (Gennaro, 2005, Mack Publishing); Pharmaceutical Dosage Forms, 2nd Ed. (다양한 편저자, 1989-1998, Marcel Dekker); 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Ansel et al., 2005, Williams & Wilkins)]을 참조하다.
우수 제조 관리 기준이 약제학적 산업에 공지되어 있고 정부 기관(예를 들면, 식약청, EMEA)에 의해 규제된다. 상기 제제의 의도하는 성분을 충분한 양의 적절한 용매 중에 용해시킨 후, 무균 여과하여 오염 미생물을 제거하여 무균 액체 제제를 제조할 수 있다. 일반적으로, 상기 제제의 다양한 무균 성분을 염기성 분산 매질을 포함하는 무균 비히클에 도입하여 분산액을 제조한다. 무균일 것이 요구되는 고체 형태의 생성을 위해, 진공 건조 또는 동결 건조를 이용할 수 있다.
일반적으로, 상기 제제의 적어도 1종의 활성 성분 또는 구성성분으로부터 고체 제형(예를 들면, 산제, 과립제, 펠렛, 정제)을 만들 수 있다.
적합한 타정 절차가 공지되어 있다. 적어도 1종의 활성 성분의 고체 형태를 캡슐화하거나 구획 또는 챔버에서 액체로부터 이의 분리를 유지시켜 상기 제제를 또한 제조할 수 있다. 정제, 캡슐제, 구획 또는 챔버의 적합한 크기 및 형상을 결정하기 위해 각각의 용량의 크기 및 피험체에 대한 투약 간격을 이용할 수 있다.
상기 제제는 유효량의 활성 성분(예를 들면, 약물, 항원 및 면역보강제)을 담체 또는 적합한 양의 비히클과 함께 포함하여 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합한 약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다.
피험체(예를 들면, 동물 또는 인간)에 대한 효율적 투여에 적절하게 용량 및 투약 스케줄 내의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 양과 같은 활성 성분의 상대량을 조정할 수 있다. 이러한 조정은 또한 피험체의 특정한 질환 또는 병증, 및 치료 또는 예방이 의도되는지의 여부에 따라 달라진다. 피험체에 대한 상기 제제의 투여를 단순화하기 위해, 각각의 단위 용량은 단일 면역화 회수에 대해 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함한다.
가수분해 및 변성을 비롯한 폴리펩타이드 불안정성 또는 분해의 다양한 원인이 존재한다. 변성의 경우, 단백질의 입체형태 또는 3차원 구조가 파괴되고 단백질은 이의 일반적인 구형 구조로부터 폴딩되지 않는다. 이의 천연 입체형태로 다시 폴딩되기보다는, 소수성 상호작용은 분자 덩어리가 함께 형성(즉, 응집)되게 하거나 비천연 입체형태로 다시 폴딩되게 할 수 있다. 이러한 결과 중 어느 것도 면역원성 또는 면역보강제 활성의 축소 또는 손실을 수반할 수 있다. 안정화제를 첨가하여 이러한 문제점을 감소시키거나 예방할 수 있다.
상기 제제 또는 이의 생성에서의 임의의 중간체를 보호제(즉, 저온보호물질 및 건조 안정화제)로 전처리한 후 얼음 결정 형성을 최소화하는 냉각률 및 최종 온도로 처리할 수 있다. 저온보호제의 적절한 선택 및 미리 선택된 건조 매개변수의 사용에 의해, 임의의 대부분의 제제를 적합한 원하는 최종 용도에 저온제조할 수 있다.
부형제, 안정화제, 건조제 및 보존제와 같은 임의의 첨가제의 하기 설명은 이의 기능에 의해 기재되어 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 특정한 화학물질은 수용제(recipient), 안정화제, 건조제 및/또는 보존제의 몇몇 조합으로서 작용할 수 있다. 이러한 화학물질은 면역 반응을 직접 유발하지 않으므로 면역학적으로 불활성이지만, 항원 또는 면역보강제의 면역학적 활성을 증대시켜, 예를 들면 항원 또는 면역보강제의 변형 또는 건조 및 용해 사이클 동안의 변성을 감소시켜 그 면역 반응을 증가시킨다.
안정화제는 사이클로덱스트린 및 이들의 변이체(미국 특허 제5,730,969호 참조)를 포함한다. 최종 제제를 안정화시키기 위해 적합한 보존제, 예컨대 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 트레할로스, 덱스트란 및 글라이세린을 또한 첨가할 수 있다(Howell and Miller, 1983). 비이온성 계면활성제, D-글루코스, D-갈락토스, D-자일로스, D-글루쿠론산, D-글루쿠론산의 염, 트레할로스, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 및 이들의 혼합물로부터 선택된 안정화제를 상기 제제에 첨가할 수 있다. 알칼리 금속염 또는 염화마그네슘의 첨가는, 임의로 혈청 알부민을 포함하고 안정성을 추가로 증대시키기 위해 냉동 건조를 수반하여, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 안정화시킬 수 있다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 덱스트란, 황산콘드로친, 전분, 글라이코겐, 인슐린, 덱스트린 및 알긴산염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사카라이드와 접촉시켜 상기 분리된 폴리펩타이드를 또한 안정화시킬 수 있다. 첨가될 수 있는 다른 당은 단당류, 이당류, 당 알콜 및 이들의 혼합물(예를 들면, 글루코스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 락토스, 만니톨, 자일리톨)을 포함한다. 폴리올은 폴리펩타이드를 안정화시킬 수 있고 수혼화성 또는 수용성이다. 적합한 폴리올은 폴리하이드록시 알콜, 단당류 및 이당류, 예컨대 만니톨, 글라이세롤, 에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜, 트라이메틸 글라이콜, 비닐 피롤리돈, 글루코스, 프럭토스, 아라비노스, 만노스, 말토스, 수크로스 및 이들의 중합체일 수 있다. 다양한 부형제는 또한 폴리펩타이드, 예컨대 혈청 알부민, 아미노산, 헤파린, 지방산 및 인지질, 계면활성제, 금속, 폴리올, 환원제, 금속 킬레이트화제, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드롤라이즈드 젤라틴 및 황산암모늄을 안정화시킬 수 있다.
예로서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 제제는 부형제 또는 안정화제의 적합한 선택에 의해 수크로스, 트레할로스, 폴리(락트산)(PLA) 및 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드)(PLGA) 마이크로구 중에 안정화될 수 있다(Sanchez et al., 1999). 수크로스 또는 트레할로스는 비환원성 사카라이드이어서 단백질과 같은 아미노기를 보유하는 물질과 아미노카보닐 반응을 발생시키지 않으므로, 이를 첨가제로서 사용하는 유리할 수 있다. 수크로스 또는 트레할로스를 사카라이드와 같은 다른 안정화제와 배합할 수 있다.
추가로, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제는 마취제, 진통제, 소염제, 스테로이드제, 항생제, 항관절염제, 식욕감퇴제, 항히스타민제 및 항종양제 등과 같은 치료제를 포함할 수 있다. 이러한 치료제의 예로는 리도카인 및 비스테로이드성 소염 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug: NSAID)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료제는 항원 및 면역보강제이다. 또 다른 실시형태에서, 항원 및/또는 면역보강제를 포함하는 제제를 별도로 그러나 마취제, 진통제, 소염제, 스테로이드제, 항생제, 항관절염제, 식욕감퇴제, 항히스타민제 및 항종양제 등과 같은 다른 치료제와 함께 적용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항생제는 피닥소마이신, 메트로니다졸 또는 반코마이신이다.
근육내 등과 같은 다양한 투여 경로를 통해 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제를 전달할 수 있다.
중합체는 상기 제제에 첨가될 수 있고, 활성 성분의 부형제, 안정화제 및/또는 보존제로서 작용하고 활성 성분의 건조 형태를 용해시키도록 사용되는 용액을 포화시키는 활성 성분의 농도를 감소시키기 위해 작용할 수 있다. 중합체가 "빈" 공간을 채워 용액의 유효 용적을 감소시키므로 이러한 감소가 발생한다. 따라서, 포화된 용액의 양을 감소시키지 않고 항원/면역보강제의 분량이 보존될 수 있다. 중요한 열역학적 고려사항은 포화된 용액 중의 활성 성분이 더 낮은 농도의 영역으로 "구동"된다는 것이다. 용액에서, 중합체는 또한 상기 제제의 가용화된 성분의 항원/면역보강제 활성을 안정화시키고/시키거나 보존할 수 있다. 이러한 중합체는 에틸렌 또는 프로필렌 글라이콜, 비닐 피롤리돈 및 0-사이클로덱스트린 중합체 및 공중합체를 포함한다.
투여에 적합한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제의 단일 또는 단위 용량이 제공된다. 단위 용량 내의 면역보강제 및/또는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 양은 약 0.001㎍ 내지 약 10㎎의 광범위 내 어디서도 변할 수 있다. 이 범위는 약 0.1㎍ 내지 약 1㎎일 수 있고; 더 좁은 범위는 약 5㎍ 내지 약 500㎍이다. 다른 적합한 범위는 약 20㎍ 내지 약 200㎍, 예를 들면 약 20㎍, 약 75㎍ 또는 약 200㎍이다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 바람직한 용량은 약 20㎍ 또는 200㎍ 또는 그 이하이다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및 면역보강제 사이의 비율은 약 1:1 또는 약 1:1.25일 수 있지만, C-TAB 분리된 폴리펩타이드 대 면역보강제의 더 높은 비율(예를 들면, 약 1:10 이하)을 또한 사용할 수 있거나, 더 낮은 비율(예를 들면, 약 10:1 이상)를 또한 이용할 수 있다.
C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 항원으로서 사용할 수 있고, 면역 세포에 제시될 수 있고 항원 특이적 면역 반응이 유도된다. C. 디피실과 같은 병원균에 의한 감염 전에, 동안에 또는 후에 이것이 일어날 수 있다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드만이 필요할 수 있지만, 면역보강제 활성을 필요로 하지 않을 정도로 제제의 면역원성이 충분한 경우 추가의 면역보강제가 필요하지 않을 수 있다. 상기 제제의 적용이 복수의 항원(즉, 다가)에 대한 면역 반응을 유도하도록 상기 제제는 추가의 항원을 포함할 수 있다. 항원 특이적 림프구는 면역 반응에 참여할 수 있고, B 림프구에 의한 참여의 경우, 항원 특이적 항체는 면역 반응의 일부일 수 있다. 상기 기재된 제제는 당해 분야에 공지된 건조제, 부형제, 습윤제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다.
피험체(예를 들면, 질환의 예방, 감염의 효과로부터의 보호, CDAD와 같은 질환의 증상의 감소 또는 경감, 또는 이들의 조합과 같은 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물)를 치료하기 위해 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 하기 프로필을 갖는 피험체 등과 같은 CDAD의 위험이 있는 피험체를 치료하기 위해 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제를 사용할 수 있다: ⅰ) 노인 피험체(예를 들면, 65세보다 많은 피험체) 또는 2세보다 어린 피험체 등과 같은 면역계가 약한 피험체; ⅱ) AIDS를 앓고 있는 피험체 등과 같은 면역 손상 피험체; ⅲ) 면역억제 약물을 섭취하거나 섭취할 계획이 있는 피험체; ⅳ) 입원 계획이 있는 피험체 또는 입원 중인 피험체; ⅴ) 중환자실(ICU)에 있거나 중환자실로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅵ) 위장관 수술을 받거나 받을 계획이 있는 피험체; ⅶ) 요양원과 같은 장기간 치료시설에 있거나 이 치료시설로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅷ) 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 병존질환을 앓고 있는 피험체; ⅸ) 위장관 수술을 받을 계획이 있는 노인 피험체 등과 같은 상기 언급된 프로필 중 2개 이상에 속하는 피험체; ⅹ) 염증성 장 질환을 앓고 있는 피험체; 및/또는 xi) CDAD의 하나 이상의 에피소드를 경험한 피험체 등과 같은 재발성 CDAD를 앓고 있는 피험체.
치료는 병원균에 의한 감염 또는 이의 병원성 효과, 예컨대 독소 분비에 의해 야기되는 효과에 대비하여 피험체를 백신접종할 수 있다. 기존의 질환을 치료학적으로 치료하기 위해, 질환을 보호하여 예방하기 위해, 질환의 중증도 및/또는 기간을 감소시키기 위해, 질환의 증상을 경감시키기 위해 또는 이들의 조합을 위해 상기 제제를 사용할 수 있다.
경구, 피하, 피내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수내, 가슴내, 복강내, 뇌실내 및/또는 설하 경로(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 다양한 투여 경로로 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 제제를 전달할 수 있다.
상기 제제는 또한 1종 이상의 면역보강제 또는 면역보강제의 조합을 포함할 수 있다. 일반적으로, 면역보강제 및 상기 제제를 항원 제시 전에 혼합하지만, 대안적으로, 짧은 시간 간격 내에 이들은 별도로 존재할 수 있다.
면역보강제는, 예를 들면 유성 에멀션(예를 들면, 완전 또는 불완전 프로인트 면역보강제), ISA와 같은 몬타나이드 불완전 셉픽 면역보강제, 수중유 에멀션 면역보강제, 예컨대 리비 면역보강제 시스템, 무라밀 다이펩타이드를 포함하는 신택스 면역보강제 제제, 수산화알루미늄 또는 알루미늄염 면역보강제(ALUM), 적어도 2개의 LysLeuLys 모티브, 특히 KLKLLLLLKLK를 포함하는 다중양이온 중합체, 특히 다중양이온 펩타이드, 특히 폴리아르기닌 또는 펩타이드, 한정된 염기 상황에서 비메틸화 사이토신-구아닌 다이뉴클레오타이드(CpG)를 포함하는 면역자극 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)(예를 들면, WO 제96/02555호에 기재됨) 또는 이노신 및 사이티딘에 기초한 ODN(예를 들면, WO 제01/93903호에 기재됨), 또는 데옥시-이노신 및/또는 데옥시유리딘 잔기를 포함하는 데옥시핵산(WO 제01/93905호 및 WO 제02/095027호에 기재됨), 특히 올리고(dIdC)13(WO 제01/93903호 및 WO 제01/93905호에 기재됨), 신경활성 화합물, 특히 인간 성장 호르몬(WO 제01/24822호에 기재됨) 또는 이들의 조합, 케모카인(예를 들면, 디펜신 1 또는 2, RANTES, MIP1-α, MIP-2, 인터류킨-8 또는 사이토카인(예를 들면, 인터류킨-1β, -2, -6, -10 또는 -12; 인터페론-γ; 종양 괴사 인자-α; 또는 과립구-단핵구-콜로니 자극 인자)(문헌[Nohria and Rubin, 1994] 참조), 무라밀 다이펩타이드 변이체(예를 들면, 뮤라부타이드, 트레오닐-MDP 또는 무라밀 트라이펩타이드), MDP의 합성 변이체, 열 충격 단백질 또는 변이체, 레슈마니아 메이져 LeIF의 변이체(Skeiky et al., 1995), 트립신 절단 부위에서의 변이체를 비롯하여 박테리아 ADP-리보실화 외독소(bARE)의 비독성 변이체(Dickenson and Clements, 1995) 및/또는 영향을 미치는 ADP-리보실화(Douce et al., 1997) 또는 화학적으로 해독된 bARE(톡소이드), QS21, 퀼 A, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타밀-L-알라닌-2-[1,2-다이팔미토일-s-글라이세로-3-(하이드록시포스포릴옥시)]에틸아마이드(MTP-PE) 및 대사성 오일 및 유화제를 포함하는 조성물을 들 수 있고, 상기 오일 및 유화제는 실질적으로 직경이 모두 1마이크론 미만인 오일 액적을 갖는 수중유 에멀션 형태로 존재한다(예를 들면, EP 제0399843호 참조). 또한, 면역화에 유용한 다른 면역보강제에 대해 문헌[Richards et al. (1995)]을 참조한다.
항체 또는 세포내 이팩터, 특이적 항체 아이소타입(예를 들면, IgM, IgD, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4) 또는 특이적 T 세포 하위세트(예를 들면, CTL, Th1, Th2 및/또는 TDTH)를 우선적으로 유도하기 위해 면역보강제를 선택할 수 있다(예를 들면, 문헌[Munoz et al., 1990; Glenn et al., 1995] 참조).
비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 또는 모티브는 B 세포 및 거대세포를 활성화하는 것을 공지되어 있다(Stacey et al., 1996). DNA의 다른 형태를 면역보강제로서 사용할 수 있다. 박테리아 DNA는 후천성 면역 반응을 발생시키는 선천성 면역 반응을 자극하기 위해 면역계가 이의 병원성 기원을 인식하도록 하는 패턴을 갖는 구조의 일 유형 중 하나이다(Medzhitov and Janeway, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9(1): 4-9). 이 구조는 병원균 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern: PAMP)이라 칭하고, 리포폴리사카라이드, 테이코산, 비메틸화 CpG 모티브, 이중 가닥 RNA 및 만니스를 포함한다. PAMP는 염증 반응을 중재하는 내인성 신호를 유도하고, T 세포 기능의 동시 자극물질로서 작용하고 이팩터 기능을 조절한다. 이 반응을 유도하는 PAMP의 능력은 면역보강제로서의 이의 잠재력에서 역할을 하고 이의 표적은 APC, 예컨대 거대세포 및 수지상 세포이다. PAMP는 또한 상이한 동시 자극 분자를 유도하고 상이한 이팩터 기능을 조절하여 Th2로부터 Th1로의 반응과 같은 면역 반응을 지시하기 위해 다른 면역보강제와 함께 사용된다.
본 발명의 다른 형태는 백신접종물질로서의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 유효량의 항원을 사용할 수 있다. C. 디피실에 대한 후속 노출로부터 피험체에 보호를 부여하도록 피험체가 충분한 특이적 면역 반응을 생성하게 하는 항원의 양이 포함된다. 항원은 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드일 수 있다. 일 실시형태에서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 그 자체로 또는 면역보강제와 함께 투여하다.
본 발명의 다른 형태는 아단위 백신으로서의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 용도를 포함한다. 아단위 백신은 접종물질로서의 병원균의 단편의 용도에 관한 것이다. 당업자는 아단위 백신이 병원균의 특정한 부분 또는 영역에 항체를 생성하기 위한 수단을 제공한다는 것을 이해할 것이다.
당해 분야에서 공지된 방법에 의해 투여의 용량 스케줄 및 백신의 효율을 결정할 수 있다. 백신의 양 및 면역화 섭생은 사용되는 특정한 항원 및 면역보강제, 투여 방식 및 빈도, 및 원하는 효과(예를 들면, 보호 및/또는 치료)에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 1㎍ 내지 100㎎, 예를 들면 60㎍ 내지 600㎍ 범위의 양으로 본 발명의 백신을 투여할 수 있다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 백신의 단일 용량은 약 1㎍ 내지 약 1㎎, 바람직하게는 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 더 바람직하게는 약 20㎍ 내지 약 200㎍ 범위일 수 있다. C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드와 명반과 같은 면역보강제 사이의 비율은 약 1:1, 예를 들면 1:1.25일 수 있지만, 더 높은 비율(예를 들면, 약 1:10 이하)을 또한 사용할 수 있거나, 더 낮은 비율(예를 들면, 약 10:1 이상)을 또한 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 백신에서 면역보강제 수산화알루미늄은 최종 제제 중에 약 50㎍/㎖ 내지 약 200㎍/㎖ 범위, 바람직하게는 약 125㎍/㎖의 양으로 사용된다.
경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수내, 가슴내, 복강내, 뇌실내 및/또는 설하로 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 투여할 수 있다.
당해 분야에서 공지된 방법에 의해 면역화 섭생을 결정할 수 있다. 당해 분야의 당업자가 필요하다고 결정한 바대로 백신의 투여를 반복할 수 있다. 예를 들면, 프라이밍 용량 이후 주마다, 2주마다 또는 달마다의 간격의 1, 2, 3 이상의 부스터 용량이 따를 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 프라이밍 용량 이후 약 7일 내지 약 14일의 간격의, 예를 들면 제1 프라임 7일 및 21일 후의 1회 또는 2회의 부스터 투여가 따를 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 치료학적 유효량의 백신을 피험체에게 14일 +/- 1일, 2일 또는 3일(2주마다)의 간격으로 2회 또는 3회 투여하다. 본 발명의 일 실시형태에서, 치료학적 유효량의 백신을 1회 투여하다.
또 다른 형태는 본 발명에 따라 치료될 수 있는 집단에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 그 집단은 C. 디피실에 대한 노출의 위험을 갖는 건강한 개인, 특히 입원 예정이거나 치료시설에 주거하는 개인 및 병원, 요양원 및 다른 치료시설에 있는 개인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 그 집단은 항생제 치료의 중단 후 재발한 이전에 감염된 환자 또는 항생제 치료가 효과적이지 않은 환자를 포함한다.
본 발명의 일 이상의 실시형태에서, 그 집단은 적어도 18세보다 많은 개인을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 인간 피험체는 18세 내지 65세이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 인간 피험체는 65세보다 많은 노인 개인이다. 마지막 연령의 그룹이 C. 디피실 감염을 앓기에 가장 취약한 집단이다. 몇몇 더 많은 실시형태에서, 인간 피험체는 18세보다 어리다.
C-
TAB
.
G5
또는 C-
TAB
.
G5
.1 분리된
폴리펩타이드를
사용하는 방법
본 발명은 또한 분리된 폴리펩타이드를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, C. 디피실과 관련된 질환을 예방하거나 치료하기 위해 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 예의 방식으로, 피험체의 면역계에 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 도입하는 것은 분리된 폴리펩타이드를 겨냥한 항체를 생성하는 피험체를 포함하여 면역 반응을 유발할 수 있다. 이러한 항체는 C. 디피실을 인식하는 데 유용한다.
본 발명은 분리된 폴리펩타이드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에게 분리된 폴리펩타이드를 전달하는 방법을 제공한다. 액체 또는 고체로서 분리된 폴리펩타이드를 투여할 수 있다. 분리된 폴리펩타이드는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 면역 반응을 생성하기 위한 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 사용, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 대해 반응하여 생성된 항체를 정제하고 이후 이를 규명하는 단계를 포함하는 A 독소 및 또는 B 독소를 인식하여 이에 결합하는 항체의 가변 도메인을 동정하고 분리하는 방법을 제공한다. 동정된 에피토프는 추가의 항체 또는 이의 단편을 클로닝하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 형태는 부분적으로 C. 디피실의 치료, 예방 및 검출에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 동물과 같은 피험체는 C. 디피실의 치료 및/또는 예방 및/또는 검출을 받는다. 다른 실시형태에서, 동물은 인간이다. 예를 들면, 생체내 C. 디피실에 대한 항체를 기르기 위해 본 발명의 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 추가의 예의 방식으로, 피험체가 C. 디피실에 대한 항체를 생성하는지를 결정하기 위해 본 발명의 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체를 분리하기 위해 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 예의 방식으로, 폴리펩타이드는 친화도 매트릭스에 결합할 수 있다.
추가의 예의 방식으로, 세포를 형질전환하고/하거나 형질감염시켜 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 항체를 재조합으로 생성하기 위해 본 발명의 핵산을 사용할 수 있다. 예를 들면, 피험체가 C. 디피실로 감염되었는지를 결정하기 위해 본 발명의 핵산을 또한 사용할 수 있다. 예의 방식으로, 방사선 라벨링 하이브리드화의 방법을 이용하여 이를 수행할 수 있다.
추가의 예의 방식으로, C. 디피실에 의한 감염을 인식하기 위해 본 발명의 항체를 사용할 수 있다. 예의 방식으로, 상기 항체는 항원으로서 천연 A 독소 및/또는 B 독소를 인식할 수 있다. C. 디피실에 의한 감염과 싸우기 위해 본 발명의 항체를 또한 사용할 수 있다. 예의 방식으로, 인간화 항체 또는 항체 단편 또는 단일클론 항체는 C. 디피실 감염에 대한 피험체 자신의 면역 반응을 이용할 수 있다. 추가의 예의 방식으로, 감염을 치료하고 검출하는 것을 돕기 위해 사이토카인 또는 독소 또는 효소 또는 마커에 본 발명의 항체를 커플링할 수 있다.
본 발명의 추가의 형태는 진단학적 검정에 관한 것이다. 본 발명은 당해 분야에 공지된 많은 검정을 이용한다. 당업자는 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 및 항체에 대한 일련의 조사 기반 사용을 이해할 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드, 항체 및 핵산은 예를 들면 방사성, 화학발광성, 형광성 및/또는 염료 분자 등으로 라벨링할 수 있다. 본 발명의 항체, 핵산 및 폴리펩타이드는 DNA 검정(예컨대, 사우던 블로팅), RNA 검정(예컨대, 노던 블로팅), 단백질 검정(예컨대, 웨스턴 블로팅), 크로마토그래피 검정(예컨대, 가스, 액체, HPLC, 크기 배제), 면역검정(예컨대, ELISA) 및 구조 검정(예컨대, 결정학 및 NMR 분광학)과 같은 검정의 사용에 적용 가능하다. 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 및 핵산을 프로브로서 추가로 사용할 수 있다. 프로브로부터의 신호를 증폭하는 검정은 또한 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
키트
본 발명은 예의 방식으로 제한 없이 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및/또는 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서 및 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. C. 디피실을 검출하기 위한 면역검정을 비롯한 다양한 검정에서 본 발명의 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드 및/또는 항체를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드는 생물학적 샘플에서 항체를 검출할 목적으로 항원으로서 기능한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들면, 다용량 패키지) 또는 하위단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트는 적합한 패키징에 있다. 흡입기, 비강 투여 장치 또는 주입 장치와 같은 특정 장치와 같이 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 무균 접근 포트를 가질 수 있다. 용기는 또한 무균 접근 포트를 가질 수 있다. 키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 이해 가능한 정보를 제공할 수 있다.
C. 디피실의 존재를 검출하기 위해 또는 CDAD와 같은 C. 디피실과 관련된 질환을 검출하기 위해 키트를 사용할 수 있다. C. 디피실과 관련된 질환을 예방하거나 치료하기 위해 키트를 사용할 수 있다. C. 디피실과 관련된 질환의 증상을 경감시키기 위해 본 발명의 키트를 또한 사용할 수 있다.
추가의 설명 없이, 당해 분야의 당업자는, 상기 상세한 설명 및 하기 예시적인 실시예를 이용하여, 청구된 발명을 만들고 이용할 수 있다고 생각된다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 구체적으로 나타내고 임의의 방식으로 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 본원에 걸쳐 언급된 모든 논문, 공보, 특허 및 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
실시예
(실시예 1) C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 분리된 폴리펩타이드의 제제
이 실시예는 이. 콜라이 세포에서 발현하기 위한 C. 디피실 독소 A(CTA) 및 독소 B(CTB)의 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드의 제제를 기재한다. CTA 및 CTB를 포함하는 다양한 분리된 폴리펩타이드를 만들기 위해 하기 기재된 방법을 이용할 수 있다. 예로서, CTA의 C 말단 도메인의 부분 및 CTB의 C 말단 도메인의 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드가 기재되어 있다.
(실시예 1.1) C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 유전자 구성체의 클로닝
하기 프라이머를 사용하여 C. 디피실 균주 630(ATCC BAA-1382)의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 C 말단 도메인의 2026번 내지 2710번 아미노산을 코딩하는 CTA 유전자(수탁 번호 YP-001087137호)의 부분을 증폭하였다:
정방향: 5'-caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc-3'(서열 번호 9) 및
역방향: 5'-CTCGAGttagccatatatcccaggggc-3'(서열 번호 10).
정방향 프라이머에 의한 증폭은 SpeI 부위를 생성시키고 역방향 프라이머에 의한 증폭은 Xhol 부위를 생성시켰다.
하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 C 말단 도메인의 1850번 내지 2366번 아미노산을 코딩하는 CTB 유전자(수탁 번호 YP-00108735호)의 부분을 증폭하였다:
정방향: 5'-caccATGCATatgagtttagttaatagaaaacag-3'(서열 번호 11) 및
역방향: 5'-ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc-3'(서열 번호 12).
정방향 프라이머에 의한 증폭은 Nsil 부위를 생성시키고 역방향 프라이머에 의한 증폭은 Xhol 부위를 생성시켰다.
PCR 슈퍼 믹스(Super-Mix)(인비트로겐)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 사이클 조건은 2분 동안 95℃, 45초 동안 95℃, 50초 동안 55℃, 8분 동안 68℃(30회 사이클) 및 10분 동안 72℃였다. PCR 생성물을 퀵 유전자 추출 키트(Quick gene extraction kit)(인비트로겐)로 정제하고 PCR 2.1 토포(TOPO) 벡터(인비트로겐)에 결찰하였다. 열 충격에 의해 이. 콜라이 Mech-1 세포를 형질전환시키기 위해 결찰 혼합물을 사용하였다. 형질전환물을 임메디아 엠프 블루(ImMedia Amp Blue)(인비트로겐)의 플레이트에서 평판배양하였다. 화이트 콜로니를 채택하고 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 4㎖의 LB 배지를 갖는 15㎖ 관에서 배양하였다. 배양물을 37℃에서 밤새 항온처리하고 플라스미드를 퀵 플라스미드 미니프렙 키트(Quick plasmid miniprep kit)(인비트로겐)로 추출하였다.
PCR 2.1-토포/TA 벡터에서의 CTA 유전자 단편을 SpeI 및 XhoI로 분해하고, 이 단편을 T4 DNA 리가제(Ligase)를 사용하여 또한 SpeI 및 XhoI로 분해된 중간 벡터로 클로닝하였다. 이후, 하기 세트의 합성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 3개의 제한 부위(BgLII-NsiI-SacI)를 포함하는 링커를 CTA 유전자 단편의 3' 말단에 삽입하였다:
정방향: 5'-AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacgaaaggctcagc-3'
(서열 번호 13)
역방향: 5'-cggtccggggccatatatcccaggggcttttactcc-3'
(서열 번호 14).
PCR 2.1-토포/TB에서의 CTB 유전자 단편을 Nsil 및 Xhol로 분해하고, 분해된 CTB 유전자 단편을 또한 NsiI 및 XhoI로 분해된 링커 및 CTA 유전자를 포함하는 중간 벡터에 결찰하였다. CTB 유전자을 링커에 3'로 삽입하여 구성체 서열 5'-CTA-링커-CTB-3'을 생성하였다. 이 융합 구성체를 C-TAB.V1 중간 벡터라 칭한다.
하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 C-TAB.V1 중간 벡터로부터 C-TAB.G5 유전자를 증폭하였다:
정방향: 5'-caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagga(서열 번호 15)
역방향: 5'-CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg(서열 번호 16).
PCR 슈퍼 믹스(인비트로겐)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 사이클 조건은 2분 동안 95℃, 45초 동안 95℃, 50초 동안 55℃, 4분 동안 68℃ (30회 사이클) 및 10분 동안 72℃였다. PCR 생성물을 퀵 유전자 추출 키트(인비트로겐)로 정제하고 PCR2.1-토포 벡터(인비트로겐)에 결찰하엿다. 열 충격에 의해 이. 콜라이 Mech-1 세포를 형질전환시키기 위해 결찰 혼합물을 사용하였다. 형질전환물을 임메디아 엠프 블루(인비트로겐)의 플레이트에서 평판배양하였다. 화이트 콜로니를 채택하고 100㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 4㎖의 LB 배지를 갖는 15㎖ 관에서 배양하였다. 배양물을 37℃에서 밤새 항온처리하고 플라스미드를 퀵 플라스미드 미니프렙 키트(인비트로겐)로 추출하였다. PCR 2.1-토포타(TOPOTA) 벡터에서의 C-TAB.G5 융합 유전자를 NcoI 및 XhoI 제한 효소로 분해하였다. 이 C-TAB 단편을 동일한 제한 효소로 분해된 pET28 발현 벡터에 결찰하였다. 이 생성된 구성체는 1851번 내지 2366번 아미노산으로부터의 B 독소 C 말단 도메인에 융합된 2272번 내지 2710번 아미노산으로부터의 A 독소 C 말단 도메인을 코딩한다. 발현을 위해 pET28/C-TAB.G5 구성체를 이. 콜라이 BL21(DE3)로 형질전환하였다. 분석에 C-TAB.G5 융합 유전자를 포함하는 5개의 콜로니를 선택하였다.
이. 콜라이 숙주 세포 내에 발현 개선을 위해 코돈 최적화에 의해 C-TAB.G5.1 코딩 서열을 얻었다. 이. 콜라이 유전자의 코돈 바이어스에 코돈 출현을 조정하였다. 또한, mRNA 반감기를 연장하기 위해 GC 함량을 조정하였다; 매우 높거나(80% 초과) 매우 낮은(30% 미만) GC 함량의 영역을 피했다. 따라서, 최적화 유전자는 이. 콜라이에서 높고 안정한 발현율을 허용한다. 코돈 최적화된 C-TAB.G5.1 유전자를 인시츄로 합성하고 발현 벡터 pET-28b(+)로 서브클로닝하였다.
DNA 서열분석: d-로다민 염료에 의한 염료 종결자 사이클 서열분석 화학을 이용하여 플라스미드 DNA 서열은 확인하였다. 젤피쉬(Jellyfish) 소프트웨어를 이용하여 서열분석 데이터를 분석하였다.
(실시예 1.2) 이. 콜라이에서 재조합 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 융합 단백질의 발현
이. 콜라이에서의 발현을 위한 표준 절차를 이용하여 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 유전자 구성체를 발현시킬 수 있다.
재조합 C-TAB 융합 단백질의 발현을 위한 콜로니의 스크리닝: 스크리닝 목적을 위해, 콜로니를 채택하고 50㎍/㎖ 카나마이신을 갖는 4㎖의 LB 배지를 갖는 15㎖ 팔콘(Falcon) 관에서 성장시켰다. 이 관을 250rpm에서 혼합하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 초기 성장 단계 후, 각각의 관으로부터의 1㎖의 배양물을 24웰 조직 배양 플레이트에 옮기고, 30℃에서 3시간 동안 1mM 아이소프로필-β-D-1-티오갈락토-퓨라노사이드(IPTG)에 의해 발현을 유도하였다. 원심분리기에서 12,000g에서 1분 동안 원심분리에 의해 세포 펠렛을 수집하였다. 세포 펠렛 용해물을 준비하고, C-TAB 융합 단백질의 발현에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 수용성 분획을 평가하였다. 추가의 평가를 위해 양성 클론을 선택하였다.
C-TAB.G5 발현을 위한 뱃취 발효: 30㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 150㎖ 슈퍼 브로쓰(Super Broth) 배지를 각각 포함하는 5개의 500㎖ 진탕 플라스크 내에서 시드 배양물을 성장시켰다. OD600이 2 내지 2.5에 도달할 때까지 배양물을 275rpm에서 연속 교반하면서 28℃에서 12시간 동안 성장시켰다. 10ℓ 슈퍼 브로쓰를 포함하는 발효기를 접종하기 위해 진탕 플라스크를 사용하였다. 배양물을 37℃에서 약 4.5시간 OD600 = 3.5 내지 4로 성장시켰다. 생성물 발현의 유도를 위해, 0.1mM의 IPTG를 첨가하고 25℃에서 추가로 4시간 동안 계속해서 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 저장된 세포 페이스트를 -70℃에서 냉동시켰다. 이 발효 공정에서 성취된 통상적인 생성물 특이적 발현율은 약 200㎎/㎖였다.
C-TAB.G5.1 제제를 위한 유가 발효: 1ℓ 진탕 플라스크 내에서 시드 뱅크(-75℃에서 저장)의 500㎕의 글라이세롤 스톡의 분취량을 이용하여 30㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 100㎖ 예비배양 배지를 접종하였다. 예비배양물을 OD600 = 1.0 내지 2.0에 도달할 때까지 약 150rpm에서 일정한 교반 하에 37℃에서 약 7시간 동안 항온처리하였다. 25㎖의 예비배양물을 이용하여 공정 제어 시스템이 장착된 표준 산업 15ℓ 발효기에서 7ℓ 뱃취 발효 배지를 접종하여 유가 발효를 수행할 수 있다. 글루코스가 소비될 때까지 37℃(OD600 = 12 내지 15)에서 12시간 동안 7ℓ 뱃취 배양 단계를 수행하였다. 이후, μ = 0.25/시간의 비성장률 상수(specific growth rate constant)에서 37℃에서 6시간(OD600 = 40 내지 50) 동안 지수 공급 모드로 글루코스 공급 단계(바이오매스 생성)를 개시하였다. 일정한 공급 단계로 전환하고 1mM의 IPTG(생성물 생성)의 최종 농도에 의해 유도하기 전에, 온도를 30℃로 감소시켜 봉입체 형성의 위험을 낮췄다. 30℃(OD600 = 약 100)에서 일정한 공급으로 다른 5시간 동안 생성물 발현 단계를 계속하여, 23시간의 전체 발효 공정 시간 및 약 8.2ℓ의 최종 배양 용적을 생성시켰다. 약 1.2㎏의 습식 세포 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하고, -70℃ 이하에서 저장하였다. 이러한 유가 발효에 의해 도달한 통상적인 생성물 특이적 발현율은 1.3g/ℓ 이하였다.
(실시예 1.3) 재조합 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 융합 단백질의 정제
C-TAB.G5 분석용 샘플의 정제: 냉동된 세포 페이스트를 해동하고 10mM 시트르산/NaOH 완충제(pH 5.6) 중에 재현탁시키고 세포 슬러리를 550bar에서 균질기(GEA Niro Soavi 균질기)로 2회 통과시켰다. 현탁액을 2회 원심분리하였다: 13500rpm에서 30분 동안 1회 및 초원심분리기에서 18000rpm에서 제2회 1시간 동안. 상청액을 풀(pool)에 넣고 pH를 50mM 시트르산 완충제(pH 3)로 5.6으로 조정하였다. 10mM 시트르산/NaOH 완충제(pH 5.6)를 갖는 SP 신속 유동 컬럼 위로 청명한 세포 용해물을 통과시켰다. 20mM NaPi 중에 0 내지 500mM로 증가하는 염화나트륨의 선형 구배로 단백질을 용리하였다. C-TAB.G5를 포함하는 분획을 풀에 넣었다. 전도율을 증류된 H2O로 5mS/㎝ 아래로 조정하였다. 트리스(Tris)를 첨가하여 25mM 최종 농도를 만들었다. DEAE 신속 유동 컬럼 위로 풀에 있는 분획을 통과시켰다. 25mM 트리스 중에 50 내지 500mM로 증가하는 염화나트륨의 선형 구배로 단백질을 용리하였다. 다시, C-TAB.G5를 포함하는 분획을 풀에 넣고, 1.5M 시트르산Na(pH 7.5)을 0.4M의 최종 농도로 첨가하였다. 25mM 트리스, 0.4M 시트르산Na(pH 7.5)로 평형된 페놀 세파로스(Sepharose) HP 컬럼에 C-TAB.V1 풀을 로딩하였다. 5mM 트리스(pH 7.5) 중의 선형 구배로 감소하는 염 농도로 C-TAB.G5 융합 단백질을 용리하였다. 아크타 프라임(AKTA Prime) 크로마토그래피 시스템에 의해 모든 컬럼을 모니터링하였다. 50K 막을 사용하여 정제된 C-TAB 융합 단백질을 PBS로 완충제 교환하였다.
C-TAB.G5.1 벌크 제제의 정제: 바이오매스를 공정처리까지 -80℃에서 저장하였다. 450g의 냉동된 세포 페이스트(2.90ℓ 발효기에 상당함)를 용리 완충제(20mM 헤페스(Hepes), pH 7.5, 약 0.6mS/㎝)(예를 들면, 450g 페이스트 + 1800㎖ 완충제)의 4 용적으로 희석하고, 이러한 방식으로 기계적 교반 하에 약 1시간±0.5시간 동안 해동하였다. 울트라투락스(Ultraturrax)(예를 들면, 8000rpm에서 5분)를 사용하여 임의의 남은 무리를 재현탁할 수 있다. 니로 소아비 판다 고균질기(Niro Soavi Panda high homogenizer)(640±5bar, 3회 사이클)에서 세포 용리를 수행하였다. 열 교환기를 사용하여 용해물을 10℃ 아래로 냉각시키고 원심분리까지 이 온도에서 유지시켰다. 미정제 세포 용해물을 4℃에서 30분 동안 14000rpm(30000g)에서 조작된 뱃취 원심분리 단계(Beckmann Avanti JLA 60.25)에 놓았다. 상청액을 수집하고 풀에 넣었다. 펠렛의 반액체 부분을 역시 버려 여과 단계가 막힐 위험을 감소시켰다. 이후, 풀에 넣은 상청액을 슈퍼캡(Supercap) PDH4 100/5인치 폭 필터 캡슐(Pall)(250㎠의 유효 여과 면적)로 여과시켰다. 필터 하우징에서 남은 용해물을 용리 완충제로 플러슁하였다. 청명하게 한 후, 1M 트라이 스톡 용액(pH 7.5)의 분취량을 용해물에 첨가하여 25mM의 최종 농도를 만들었다. 최종 용해물의 완충제 조성은 20mM 헤페스, 25mM 트리스(pH 7.5, 전도율 약 6mS/㎝)였다. 용해물은 여과 후 여전히 약간 불투명하지만, 이것은 하기 포획 단계에 영향을 미치지 않는다. 하기 치수의 XK50/30 컬럼(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))에서 DEAE 세파로스 FF(GE 헬쓰케어)로 실온에서 포획 단계를 수행하였다: 직경 50㎜, 패킹된 베드 높이 20㎝, 패킹된 베드 용적 약 400㎖. 로딩 밀도는 약 0.8 내지 1.2g의 바이오매스/㎖(겔)이다. 아크타 익스플로러(Akta Explorer) 시스템(GE 헬쓰케어)에 의해 공정을 실행하고 280㎚에서 모니터링하였다. pH, 전도율 및 280㎚ 흡광율이 안정할 때까지 대략 5CV의 25mM 트리스, 20mM 헤페스, 25mM NaCl(pH 7.5, 전도율 약 5mS/㎝)로 100㎝/시간에서 평형을 수행하였다. 용해물을 75㎝/시간으로 컬럼에 로딩하고 통과액을 버렸다. 모든 여과된 용해물이 로딩될 때, 280㎚ 흡광율이 안정화될 때까지 대략 5CV의 평형 완충제로 유동을 재개하였다. 5CV의 25mM 트리스, 175mM NaCl(pH 7.5, 전도율 19mS/㎝)로 세척 단계 2 동안 컬럼으로부터 불순물을 제거하였다. 3CV의 25mM 트리스, 375mM NaCl(pH 7.5, 전도율 36mS/㎝)로 단계 용리에 의해 컬럼으로부터 C-TAB 단백질을 용리하였다. C-TAB 함유 분획의 수집은 280㎚ 흡광율이 증가하기 시작할 때(일반적으로 1CV 후) 시작하고, 약 0.5 내지 1.0CV 동안 지속되었다. C-TAB를 포함하는 풀에 있는 분획을 2℃ 내지 8℃에서 밤새 저장할 수 있다. 하기 치수를 갖는 XK50/30 컬럼(GE 헬쓰케어)에서 실온에서 SP-세파로스 FF(GE 헬쓰케어)로 중간 정제 단계를 수행하였다: 직경 50㎜, 패킹된 베드 높이 20㎝, 패킹된 베드 용적 약 400㎖. 최대 로딩 밀도는 약 4 내지 5㎎의 C-TAB/㎖(겔)이다. 아크타 익스플로러 시스템(GE 헬쓰케어)에 의해 공정을 실행하고 280㎚에서 모니터링하였다. 엄청난 배압(4bar 초과)이 막지 않는 한, 200㎝/시간(65㎖/분)의 최대 유속에서 평형, 세척 및 선형 구배 용리 단계를 수행하였다. pH, 전도율 및 280㎚ 흡광율이 안정할 때까지 200㎝/시간에서 대략 5 내지 10CV의 완충제 G로 평형을 수행하였다. 로딩 전에, SP-FF 수지가 C-TAB에 결합하도록 DEAE 풀을 조정해야 한다. DEAE 풀을 SP-FF 평형 완충제(10mM 시트르산, 2mM EDTA(pH 5.5±0.1, 전도율 약 2mS/㎝))로 25배 희석하여 3.5mS/㎝ 이하의 최종 전도율(pH 5.5±0.1)을 만들었다. 필요한 경우, 추가의 밀리큐(MilliQ) 물을 첨가하여 원하는 전도율을 성취하였다. SP-FF에 C-TAB를 결합시키는 데 낮은 전도율이 매우 중요하는 것에 유의한다. 샘플을 150㎝/시간으로 컬럼에 로딩하고, 통과액을 버렸다. 샘플을 로딩한 후, 280㎚ 흡광율이 안정화될 때까지 200㎝/시간으로 대략 5CV의 평형 완충제로 유동을 재개하였다. 100㎝/시간으로 10CV에 대해 0%의 평형 완충제 내지 30%의 20mM 인산나트륨, 500mM NaCl(pH 7.0)의 선형 구배로 용리를 수행하였다. 분획을 수집하고 280㎚ 흡광율에 의해 풀링을 수행하였다. 풀링은 피크 최대의 15%에서 시작하고 피크 최대의 15%에서 종료하였다. 1.5M 시트르산염 스톡 용액(pH 8.0)을 사용하여 풀을 즉시 400mM 시트르산염(최종 pH 7, 대략 49mS/㎝)으로 조정하였다. 조정된 SPFF 풀은 pH 7 및 대략 49mS/㎝이어야 하고, 2℃ 내지 8℃에서 밤새 저장하였다.
하기 치수를 갖는 XK50/30 컬럼(GE 헬쓰케어)에서 실온에서 페닐-세파로스 HP(GE 헬쓰케어)로 폴리싱 크로마토그래피 단계를 수행하였다: 직경 직경 50㎜, 패킹된 베드 높이 15㎝, 패킹된 베드 용적 약 300㎖. 로딩 밀도는 대략 4 내지 5㎎의 C-TAB/㎖(겔)였다. 아크타 익스플로러 시스템(GE 헬쓰케어)에 의해 공정을 실행하고 280㎚에서 모니터링하였다. 엄청난 배압(4bar 초과)이 막지 않는 한, 100㎝/h(33㎖/분)의 최대 유속에서 평형, 로딩, 세척 및 용리 단계를 수행하였다. 이런 경우, 유속은 감소해야 한다. pH, 전도율 및 280㎚ 흡광율이 안정할 때까지 100㎝/시간에서 대략 5 내지 10CV의 25mM 트리스, 400mM 시트르산나트륨(pH 7.5, 46mS/㎝)으로 평형을 수행하였다. 샘플을 100㎝/시간으로 컬럼에 로딩하고 통과액을 버렸다. 샘플을 로딩한 후, 280㎚ 흡광율이 안정할 때까지 100㎝/시간으로 대략 5CV의 평형 완충제로 유동을 재개하였다. 100㎝/시간으로 20CV에 대해 100%의 평형 완충제/0%의 5mM 트리스(pH 7.5, 0.5mS/㎝) 내지 100%의 5mM 트라스(pH 7.5, 0.5mS/㎝)의 선형 구배로 용리를 수행하였다. 분획을 수집하고 UV 280㎚ 흡광율에 의해 풀링을 수행하였다. 풀링은 피크 최대의 대략 10 내지 15%에서 시작하고 피크 최대의 대략 20%에서 종료하였다. 조정된 풀을 2℃ 내지 8℃에서 밤새 저장하였다. 실온에서 조작되는 30kDa 컷오프 접선 유동 여과(TFF, 펠리콘(Pellicon) 2 막, 밀리포어(Millipore))에 의해 최종 C-TAB 약물 물질 단백질 용액의 제조를 성취하였다. 투과액 pH가 6.5±0.2일 때까지 단백질 용액을 제제 완충제(20mM 히스티딘, 75mM NaCl, 5% 수크로스, 0.025% 트윈(등록상표)80, pH 6.5)에 대해 투석하였다.
C-TAB(단백질 농도 1㎎/㎖, 1㎝ 큐베트)에 대한 280㎚에서의 비흡광계수로서 1.566을 이용하여 280㎚에서의 UV 측정에 따라 최종 단백질 농도를 2㎎/㎖로 조정하였다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석: 전세포 용해물 및 정제된 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 융합 단백질을 베타-머캅토에탄올을 포함하는 Nu-Page 샘플 완충제 중에 재현탁하고 10분 동안 비등시켰다. 샘플(25㎕)을 3% 내지 8%의 트리스-아세테이트 겔에 로딩하였다. 전기영동(1시간 동안 150V) 후, 단백질을 단순한 블루 염색액으로 겔을 염색하여 가시화하거나 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
독소 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 특이적 발현을 결정하였다. 10% 메탄올 중의 1x 이동 완충제를 사용하여 PVDF 막에 23V에서 60분 동안 단백질을 옮겼다. 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 0.5% 카제인으로 실온에서 1시간 동안 막을 차단하였다. B 독소(진웨이(GenWay); 클론 B426M)에 대해 단일클론 항체 또는 A 독소(리스트 바이올로지컬 랩스(List Biological Labs))에 대해 인하우스 유래 기니아 피그 다중클론 항체 중 어느 하나와 실온에서 2시간 동안 이동 막을 항온처리하였다. 세척된 막을 겨자무과산화효소 접합 기니아 피그 항IgG 또는 마우스 항IgG와 항온처리하였다. 블롯을 세척하고 AEC 기질을 첨가하였다. 블롯을 5분 내지 10분 동안 온화하게 혼합하면서 항온처리하였다. 블롯을 물로 세정하여 색상 전개를 중지시켰다.
RBC 혈구응집반응: B 독소가 아닌 A 독소의 세포 결합 도메인은 래빗 적혈구(RBC)를 응집시킬 수 있는 것으로 나타났다. 응집 과정은 래빗 RBC에서 혈액 항원에 관찰된 글라이칸 서열에 대한 A 독소의 결합의 결과이다. 샘플(C-TAB.G5 및 천연 A 독소)을 PBS 중에 100㎍/㎖로 희석하였다. V 바닥 미량적정 플레이트에서, 각각의 웰에서 100㎍/㎖에서 시작하여 50㎕에서 종료하여 플레이트에 걸쳐 2배 연속 희석액을 2회 준비하였다. 50㎕의 0.75% 래빗 RBC/PBS 현탁액을 미량적정 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 혈구응집반응은 플레이트의 바닥에서 RBC의 펠렛이 형성되지 않음을 나타낸다. 샘플의 혈구응집반응 역가는 RBC 펠렛이 관찰되지 않는 가장 높은 샘플 희석으로 웰에 존재하는 단백질의 농도에 의해 표시되었다.
(실시예 2) 마우스에서 명반의 존재 및 부재 하에 재조합 C-TAB.G5 융합 단백질의 용량 적정
이 연구는 C-TAB 효능 검정으로서 명반 면역보강제와 함께 및 이것 없이 C-TAB.G5의 생체내 용량 적정의 타당성을 결정하는 것이다. 사용된 명반은 알리드라겔(Alydragel)(수산화명반, 브렌태그(Brenntag))이었다. 면역화에 8주령 및 9주령의 C57BL/6 암컷 마우스(챨스 리버 랩스.(Charles River Labs.))를 사용하였다. 모든 동물은 0일에 오른쪽 넓적다리 근육에 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 제1 면역화를 받았다. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 면역화를 수행하였다. 전체 72마리의 마우스를 하기와 같이 백신접종된 12개의 그룹으로 나눴다:
- 1 그룹: 오직 PBS
- 2 그룹: 100(154)ng의 C-TAB.G5
- 3 그룹: 300(462)ng의 C-TAB.G5
- 4 그룹: 1,000(1,540)ng의 C-TAB.G5
- 5 그룹: 3,000(4,620)ng의 C-TAB.G5
- 6 그룹: 10,000(15,400)ng의 C-TAB.G5
- 7 그룹: 50㎍의 명반과 함께 PBS
- 8 그룹: 50㎍의 명반 OH와 함께 10.0(15.4)ng의 C-TAB.G5
- 9 그룹: 50㎍의 명반 OH와 함께 30.0(46.2)ng의 C-TAB.G5
- 10 그룹: 50㎍의 명반 OH와 함께 100(154)ng의 C-TAB.G5
- 11 그룹: 50㎍의 명반 OH와 함께 300(462)ng의 C-TAB.G5
- 12 그룹: 50㎍의 명반 OH와 함께 1,000(1,540)ng의 C-TAB.G5
이 연구에서, 표준 프로토콜 퀵 스타트(Quick Start)(상표명) 브래드포드 단백질 검정(Bio-Rad)에 따라 단백질 농도를 처음에 결정하였다. 마지막에, 실시예 1.3에 기재된 절차에 따라 280㎚에서의 UV 측정에 의해 단백질 농도(괄호에 표시)를 재결정하였다. 모든 추적관찰 연구에서, UV 방법에 의해 단백질 농도를 측정하였다.
제1 면역화 2주(연구 14일) 후 및 제2 면역화 2주(연구 28일) 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다.
혈청 IgG ELISA: C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1을 발생시키는 혈청 항체(C-TAB라 칭함), A 독소 및 B 독소 또는 이의 톡소이드를 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에서 평가하였다. 간단히 말하면, 1.0㎍/㎖의 A 독소, B 독소 또는 C-TAB.G5 분리된 폴리펩타이드의 스톡 용액을 PBS 중에 준비하고, 100㎕를 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 항온처리한 후, 플레이트를 세척하고 0.5% 카제인 차단 완충제로 차단하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 시험 혈청의 연속 2배 희석액을 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 제2 항온처리한 후, 플레이트를 세척하고 퍼옥시다제 접합 항마우스 IgG(H + L)와 항온처리하였다. 실온에서 2시간 항온처리한 후, 플레이트를 다시 세척하고, 퍼옥시다제 기질(2,2'-아지노바이스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트)을 첨가하고, 색상이 실온에서 2시간 동안 진행하게 하였다. 50㎕의 2% SDS를 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 405㎚의 흡광도에서 ELISA 플레이트 판독기로 플레이트를 판독하였다. 혈청 희석(1.0의 OD 405㎚ 판독을 발생시킴)인 ELISA 단위의 기하 수단으로서 혈청 항체 역가를 기록하였다. 음성 대조군으로서, 항체 반응을 평가하기 위해 제1 면역화 전에 프리블리드 동물로부터 얻은 전면역 혈청의 풀 샘플을 사용하였다.
C-TAB.G5를 투여받은 동물은 항체 역가에서 용량 의존 증가를 나타냈고, 명반 면역보강제는 C-TAB.G5의 낮은 용량에서 유의적으로 개선된 항체 역가를 허용하였다. 도 3은 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 IgG에 대한 역가를 보여준다. 도 4는 명반의 존재 또는 부재 하에 항체 역가의 그래프 비교를 보여준다.
(실시예 3) 마우스에서 C-TAB.G5의 면역원성 및 보호 효율
이 연구는 C. 디피실 A 독소 또는 B 독소의 치사 항원공격을 투여받은 백신접종된 마우스에서 C-TAB.G5의 면역원성 및 보호 효율을 평가하는 것이다. 이 연구에 6주령 내지 7주령의 암컷 C57BL/6 마우스(챨스 리버 랩스.)를 사용하였다. 모든 동물은 0일에 오른쪽 넓적다리 근육으로 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 제1 백신접종을 투여받았다. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 백신접종을 수행하였다. 116마리의 마우스를 하기와 같이 백신접종된 그룹으로 나눴다:
1 그룹: 오직 PBS
2 그룹: 3㎍의 C-TAB.G5
3 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5
4 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5
5 그룹: 3㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
6 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
7 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
8 그룹: 오직 PBS
9 그룹: 3㎍의 C-TAB.G5
10 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5
11 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5
12 그룹: 3㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
13 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
14 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
제2 면역화 2주(연구 28일) 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. 이후, C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고 ELISA 단위(EU)로서 기록하였다.
도 5는 제2 면역화 2주(연구 28일) 후 평가된 마우스에서 C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 보여준다. 이 연구는 C-TAB.G5 융합 단백질이 마우스에서 고도로 면역원성이고 면역보강제를 첨가하지 않고서도 A 독소 및 B 독소 둘 다에 대해 강한 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 수산화명반과의 동시전달에 의해 C-TAB.G5 면역원성이 유의적으로 증대(1 로그 초과)할 수 있다. 명반과 함께 또는 명반 없이 C-TAB.G5를 투여받은 동물은 1 로그 용량 범위에 걸쳐 2배 증가한 항체 반응을 나타낸다.
항체 역가를 평가하는 것 이외에, 실험실내 독소 중화 검정(TNA)에서 천연 A 독소 및 B 독소를 중화시키는 능력에 대해 C-TAB.G5에 의한 면역화에 의해 생성된 항체를 평가하였다.
독소 중화 항체 검정(TNA). 실험실내 분석을 위해, 125㎕의 A 독소(5ng/㎖) 또는 B 독소(1ng/㎖)를 면역화된 마우스로부터 얻은 항혈청의 125㎕의 연속 희석액과 항온처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 독소:혈청 혼합물을 베로(Vero) 세포(원숭이 신장 세포)를 포함하는 미량적정 웰에 첨가하고 미량적정 플레이트를 18시간 동안 항온처리하였다. A 독소 또는 B 독소를 베로 세포와 항온처리하여 세포 형태가 변경되었고 비부착 세포의 제거 후 독소 처리된 세포의 천연 적색 염색에 의해 측정되는 세포 부착이 소실되었다. 혈청의 독소 중화 역가를 A 독소 활성을 50% 감소시키는 혈청 희석으로서 보고하였다.
TNA 검정의 결과가 도 6에 도시되어 있다. 데이터는 C-TAB.G5 단독에 의한 면역화 후 생성된 항체가 B 독소가 아니라 천연 A 독소의 독성 활성을 중화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. C-TAB.G5가 명반과 동시전달될 때, TNA 역가는 항-A 독소 TNA에서 대략 6배 증가 및 항-B 독소 TNA에서 오직 2배 더 낮은 역가로 증대되었다. 이 데이터는 C-TAB.G5 분리된 폴리펩타이드가 천연 독소에 존재하는 항체 인식 항원 에피토프를 보유할 뿐만 아니라, 기능적 독소 중화 항체의 생성에 필요한 중요한 항원 에피토프를 포함한다는 것을 나타낸다. 따라서, C-TAB.G5는 C. 디피실 A 독소 및 B 독소의 독성 효과를 중화하는 데 있어서 효과적이고, 따라서 백신접종에 유용하다.
항체 반응을 평가하는 것 이외에, 천연 독소의 치사 항원공격으로부터 마우스를 보호하기 위한 C-TAB.G5 면역화의 능력을 결정하였다. 제2 백신접종 3주(연구 35일) 후 백신접종 그룹 및 비백신접종 그룹(N=8)에서의 동물은 25ng의 A 독소 또는 50ng의 B 독소의 치사량을 복강내(IP) 투여받았다. 마우스의 생존율을 다음 9일에 걸쳐 모니터링하고 그 결과가 도 6에 도시되어 있다. 이 실험은 명반 면역보강제의 존재 하의 C-TAB.G5에 의한 마우스의 면역화가 천연 A 독소의 치사 항원공격에 대한 100% 보호 및 B 독소 항원공격에 대한 50% 보호를 부여할 수 있다는 것을 나타낸다. 명반에 의한 C-TAB.G5의 동시전달은 B 독소에 대한 보호 면역력을 100%까지의 보호로 증대시켰다. 이 데이터는 C-TAB.G5 백신접종이 치사 항원공격 모델에서 A 독소 및 B 독소 둘 다의 독성 효과로부터 마우스로부터 보호하기에 충분한 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다.
(실시예 4) 어린 마우스 및 늙은 마우스에서 C-TAB.G5의 면역원성 및 보호 효율의 평가
이 연구는 어린 마우스 및 늙은 마우스에서 C-TAB.G5에서 고정된 면역 반응을 비교하는 것이다. 이 연구에 6주령 내지 7주령 및 18월령의 암컷 C57BL/6 마우스(챨스 리버 랩스.)를 각각 사용하였다. 모든 동물은 0일에 오른쪽 넓적다리 근육으로 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 제1 백신접종을 투여받았다. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 백신접종을 수행하였다. 192마리의 마우스를 하기와 같이 백신접종된 그룹으로 나눴다:
- 1 그룹: 어린 마우스에 PBS
- 2 그룹: 늙은 마우스에 PBS
- 3 그룹: 어린 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5
- 4 그룹: 어린 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5
- 5 그룹: 늙은 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5
- 6 그룹: 늙은 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5
- 7 그룹: 어린 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
- 8 그룹: 어린 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
- 9 그룹: 늙은 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
- 10 그룹: 늙은 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍의 명반 OH
- 11 그룹: 어린 마우스에 PBS
- 12 그룹: 늙은 마우스에 PBS
- 13 그룹: 어린 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5
- 14 그룹: 어린 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5
- 15 그룹: 늙은 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5
- 16 그룹: 늙은 마우스에 30㎍의 C-TAB 5th
- 17 그룹: 어린 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍ 명반 OH
- 18 그룹: 어린 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍ 명반 OH
- 19 그룹: 늙은 마우스에 10㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍ 명반 OH
- 20 그룹: 늙은 마우스에 30㎍의 C-TAB.G5 + 50㎍ 명반 OH
제2 백신접종 3주(연구 35일) 후 백신접종 그룹 및 비백신접종 그룹(N=6)에서의 동물은 25ng의 A 독소 또는 50ng의 B 독소의 치사량을 복강내(IP) 주사로 투여받았다. 마우스의 생존율을 다음 9일에 걸쳐 모니터링하였다.
제1 면역화 2주(연구 14일) 후 및 제2 면역화 2주(연구 28일) 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. 이후, C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA 단위(EU)에 의해 결정하고 이것으로서 기록하였다. 재조합 A 독소 및 B 독소의 세포독성 양으로 처리된 베로 세포를 사용하여 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 결정하였다.
C-TAB.G5 백신을 투여받은 어린 동물은 늙은 동물과 비교하여 시험된 모든 항체의 유의적으로 더 높은 수준을 나타냈다. 수산화명반의 존재 하에 C-TAB.G5로 백신접종된 어린 마우스에서 특히 높은 항체 역가를 얻었다(도 7). B 독소 TNA 역가에서 특히 유의적인 개선이 성취되었다. 동시에, A 독소 및 B 독소 항원공격을 견디는 능력에 있어서 어린 마우스와 늙은 마우스 사이의 큰 차이가 없었다. 그러나, 그룹 둘 다 명반의 존재 하에 백신접종될 때 개선된 보호를 나타냈다. 도 7은 어린 마우스 대 늙은 마우스에서의 C-TAB.G5 면역원성 및 보호 효율의 비교를 보여준다. 도 8은 어린 마우스 및 늙은 마우스에서 항-C-TAB 항체 발생의 동역학을 보여준다.
(실시예 5) C-TAB.G5.1 및 A 및 B 톡소이드의 면역원성 및 보호 효율의 비교
이 연구는 C-TAB.G5.1 대 A/B 톡소이드의 면역원성 및 보호 효율을 비교하는 것이다. 사용된 A/B 톡소이드는 동일 파트(1:1)의 톡소이드 A(롯트 1009132호) 및 톡소이드 B(롯트 1009133호)의 혼합물이다. 톡소이드를 포르말린 고정에 의해 준비하고 테크랩(TechLab)에 의해 제공되었다. 이 연구에 6주령 내지 7주령의 암컷 C57BL/6 마우스(챨스 리버 랩스.)를 사용하였다. 모든 동물은 0일에 오른쪽 넓적다리 근육으로 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 제1 백신접종을 투여받았다. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 백신접종을 수행하였다. 180마리의 마우스를 하기와 같이 백신접종된 그룹으로 나눴다:
- 1 그룹: 오직 PBS
- 2 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1
- 3 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5.1
- 4 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1 + 50㎍의 명반 OH
- 5 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1 + 50㎍의 명반 OH
- 6 그룹: 30㎍의 A/B 톡소이드
- 7 그룹: 10㎍의 A/B 톡소이드
- 8 그룹: 30㎍의 A/B 톡소이드 + 50㎍의 명반 OH
- 9 그룹: 30㎍의 A/B 톡소이드 + 50㎍의 명반 OH
- 10 그룹: PBS
- 11 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1
- 12 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5.1
- 13 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1 + 50㎍의 명반 OH
- 14 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5.1 + 50㎍의 명반 OH
- 15 그룹: 10㎍의 A/B 톡소이드
- 16 그룹: 30㎍의 A/B 톡소이드
- 17 그룹: 10㎍의 A/B 톡소이드 + 50㎍의 명반 OH
- 18 그룹: 30㎍의 A/B 톡소이드 + 50㎍의 명반 OH
제2 백신접종 3주(연구 35일) 후 백신접종 그룹 및 비백신접종 그룹(N=6)에서의 동물은 28ng의 A 독소 또는 50ng의 B 독소를 갖는 복강내(IP) 주사에 의해 치사 항원공격을 투여받았다. 마우스의 생존율을 다음 9일에 걸쳐 모니터링하였다.
제1 면역화 2주(연구 14일) 후 및 제2 면역화 2주(연구 28일) 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. 이후, C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고 ELISA 단위(EU)로서 기록하였다. 재조합 A 독소 및 B 독소의 세포독성 양으로 처리된 베로 세포를 사용하여 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 결정하였다.
이 연구는 2회 백신접종 후 마우스에서 C-TAB.G5.1 및 A/B 톡소이드의 면역원성 및 보호 효율을 보여준다. C-TAB.G5.1을 투여받은 동물은 A/B 톡소이드를 투여받은 동물과 비교하여 더 낮지만 상당한 항-C-TAB 항체 역가를 나타냈다. 또한, 명반의 동시전달은 모든 시험된 항체 반응을 크게 증대시켰다. 결과로서, 명반의 존재 하에 C-TAB.G5.1 또는 A/B 톡소이드로 면역화된 동물에서 성취된 항-C-TAB 및 항-A 독소 항체의 수준이 유사하였다. A/B 톡소이드로 면역화된 마우스와 비교하여 마우스가 C-TAB.G5.1로 면역화될 때 항-B 독소 항체에 대해 오직 더 낮은 항체 역가가 관찰되었다. 주목할 만하게, 독소 분자의 C 말단 부분에서 C-TAB.G5.1 인식 에피토프에 대해 생성된 항체와 달리, 톡소이드 면역화에 의해 유도된 항체는 독소 분자의 N 말단 부분에 특이적이고, 이는 항독소 ELISA에서 판독되었다. 따라서, C-TAB.G5.1 및 A/B 톡소이드로 면역화된 마우스에서 생성된 항-A 독소 및 항-B 독소 항체는 상이한 특이성의 항체이고, 따라서 직접 비교될 수 없다. 그러나, 데이터는 C-TAB.G5.1 면역화에 대한 항체 반응이 톡소이드에 의한 면역화의 경우처럼 유의적으로 높다는 것을 나타낸다. 또한, 독소 항원공격 연구는 치사 항원공격으로부터 마우스를 보호하는 C-TAB.G5.1 면역화의 능력은 A 및 B 톡소이드의 보호 효율에 필적한다는 것을 나타낸다. 도 9는 C-TAB.G5.1 및 A/B 톡소이드의 면역원성의 비교를 보여준다. 도 10은 A/B 톡소이드로 면역화된 마우스와 비교하여 C-TAB.G5.1로 면역화된 마우스에 대한 독소 중화 및 보호 데이터를 보여준다.
(실시예 5.1) 상이한 면역화 섭생에서 C-TAB.G5.1의 항체 역가 및 보호 효율의 비교
이 연구는 상이한 면역화 섭생에서 백신의 3의 용량을 투여받은 마우스에서 C-TAB.G5.1의 면역원성 및 보호 효율을 비교하는 것이다. 이 연구에 6주령 내지 7주령의 암컷 C57BL/6 마우스(챨스 리버 랩스.)를 사용하였다. 135마리의 마우스를 14개의 그룹으로 나눴다. 2번 내지 13번 그룹의 모든 동물은 하기 기재된 날짜에 오른쪽 넓적다리 근육 또는 왼쪽 넓적다리 근육으로 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 3회 백신접종을 투여받았다. 1 그룹 및 8 그룹에서의 마우스는 백신접종을 투여받지 않았다; 이들은 음성 대조군으로 작용하였다. 면역화를 하기와 같이 수행하였다:
연구 0일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일에 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고 ELISA 단위(EU)로 기록하였다. 재조합 A 독소 및 B 독소의 세포독성 양으로 치료된 베로 세포를 사용하여 연구 42일에 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 결정하였다.
마지막 백신접종 3주(연구 49일) 후 백신접종 그룹 및 비백신접종 그룹(N=8)에서의 동물은 28ng의 A 독소 또는 50ng의 B 독소에 의한 복강내(IP) 주사에 의해 치사 항원공격을 투여받았다. 마우스의 생존율을 다음 9일에 걸쳐 모니터링하였다.
이 연구는 제3 백신접종 3주 후 또는 연구 35일 및 42일에 측정된 모든 항체 역가는 모든 면역화 섭생에서 필적하였지만, 0/14/28의 면역화 섭생이 최고의 항체 반응을 나타낸다는 것을 보여준다. 제2 백신접종 2주 후 측정된 항체 역가를 비교하는 경우, 0/14/28의 면역화 섭생은 0/7/21의 면역화 섭생보다 우수하고 0/3/14의 면역화 섭생보다 더 우수하였다. 이 연구는 항원이 수산화알루미늄(데이터 비도시)와 동시 주사될 때 항-A 독소/B 항체 역가가 유의적으로 증대된다는 것을 확인시켜 준다. 이 연구는 또한 2주 간격으로 투여되는 백신과 명반의 2의 용량에서도 3의 용량 백신접종 후 얻은 수준과 비교하여 높은 항체 수준을 발생시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
A 독소/B 중화 항체의 수준은 0/3/14의 면역화 섭생에서보다 0/7/21 및 0/14/28의 면역화 섭생에서 더 높았다.
A 독소의 항원공격에 대한 완전한 보호는 0/3/14에서가 아니라 0/7/21 및 0/14/28의 면역화 섭생에서 명반을 필요로 하지 않았다. 명반과의 0/14/28의 면역화 섭생은 B 독소 항원공격에 대해 가장 높은 수준의 보호(87.5%)를 유도하지만, 0/7/21의 면역화 섭생은 37.5%의 보호를 제공하고 0/3/14는 28.6%의 보호를 제공한다. 이 연구의 결과가 도 20에 도시되어 있다.
(실시예 6) 햄스터에서 재조합 C-TAB.G5.1 융합 단백질의 면역원성 및 보호 효율의 평가
이 연구는 상이한 동물 모델에서 면역보강제와 함께 또는 면역보강제 없이 투여된 재조합 융합 단백질 C-TAB.G5.1의 면역원성을 추가로 평가하는 것이다.
이 연구에 7주령이 넘고 체중이 80g 내지 90g인 암컷 햄스터(Harlan)를 사용하였다. 모든 동물은 0일에 오른쪽 넓적다리 근육으로 볼루스(50㎕) 근육내(IM) 주사에 의해 제1 백신접종을 투여받았다. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 백신접종하고, 28일에 IM 주사에 의해 제3 백신접종하였다. 햄스터를 그룹(N=6)으로 나누고 하기와 같이 백신접종하였다:
- 1 그룹: 오직 제제 완충제
- 2 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1
- 3 그룹: 10㎍의 C-TAB.G5.1 + 100㎍의 명반 OH
- 4 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5.1
- 5 그룹: 30㎍의 C-TAB.G5.1 + 100㎍의 명반 OH
- 6 그룹: 100㎍의 C-TAB.G5.1
- 7 그룹: 100㎍의 C-TAB.G5.1 + 100㎍의 명반 OH
- 10 그룹: 오직 제제 완충제
- 11 그룹. 10㎍의 C-TAB.G5.1
- 12 그룹. 10㎍의 C-TAB.G5.1 + 100㎍의 명반 OH
- 13 그룹. 30㎍의 C-TAB.G5.1
- 14 그룹. 30㎍의 C-TAB.G5.1 + 100㎍의 명반 OH
- 15 그룹. 100㎍의 C-TAB.G5.1
- 16 그룹. 100㎍의 C-TAB.G5.1 + 100㎍의 명반 OH
제3 백신접종 2주(연구 42일) 후 백신접종 그룹 및 비백신접종 그룹(N=6)에서의 동물은 75ng의 A 독소 또는 125ng의 B 독소에 의한 복강내(IP) 주사에 의해 치사 항원공격을 투여받았다. 44일에 A 독소 또는 B 독소 항원공격의 용량 적정을 위해 추가의 12마리의 햄스터를 사용하였다. 햄스터의 생존율을 다음 8일에 걸쳐 모니터링하였다.
제1 면역화(연구 14일), 제2 면역화(연구 28일) 후 및 제3 면역화(연구 35일) 2주 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. 이후, C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고 ELISA 단위(EU)로 기록하였다. 재조합 A 독소 및 B 독소의 세포독성 양으로 치료된 베로 세포를 사용하여 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 결정하였다.
이 연구는 마우스와 유사하게 햄스터가 C-TAB.G5.1 백신접종에 양성으로 반응할 수 있다는 것을 보여준다. C-TAB.G5.1을 투여받은 동물은 모든 시험된 항체 역가에서 용량 의존 증가를 나타내고, 명반 면역보강제는 C-TAB.G5의 모든 용량에서 항체 역가를 유의적으로 개선하였다. 제2 주사 2주(연구 28일) 후 가장 높은 항체 역가가 관찰되었다. 도 11(A-C)은 면역화된 햄스터의 각각의 그룹에 대한 항체 역가를 보여준다. 도 12는 수산화명반의 존재 또는 부재 하에 C-TAB.G5로 면역화된 햄스터에서 항-C-TAB 항체 발생의 동역학을 보여준다.
TNA 검정의 결과가 도 13에 도시되어 있다. 이 결과는 마우스에서 얻은 것과 유사하고, 햄스터에서 C-TAB.G5.1 융합 단백질에 대해 생성된 항체는 C. 디피실 A 독소 및 B 독소의 독성 효과를 중화시키는 데 있어서 효과적이라는 것을 나타낸다.
도 13은 또한 치사 독소 항원공격 후 C-TAB.G5.1로 면역화된 햄스터에 대한 보호 데이터를 보여준다. 면역보강제의 부재 하에 C-TAB.G5.1에 의한 백신접종에 의해서도 높은 보호가 성취되었다. 명반을 백신에 첨가하여 보호 수준이 100%로 개선되었다.
(실시예 7) 클린다마이신 치료된 햄스터에서 C. 디피실 포자 항원공격에 대한 C-TAB.G5.1 융합 단백질의 보호 효율
항생제 치료 후, C. 디피실은 소화관에 콜리니화할 수 있고, 독소발생하는 경우 항생제 관련 설사를 야기할 수 있다. 일반적으로 독소발생 균주의 시딩 후 수일 내 동물이 콜로니화, 설사 및 사망에 걸리기 쉽도록 클린다마이신을 사용하는 햄스터에서 인간의 C. 디피실 관련 질환(CDAD)을 모델링하였다. C-TAB.G5.1 백신의 효율을 평가하기 위해, 백신접종 및 비백신접종 햄스터를 클린다마이신 및 C. 디피실 균주 630로 항원공격하였다. 100㎍의 C-TAB.G5.1을 125㎍의 수산화명반 면역보강제와 혼합하였다. 체중이 약 100g인 암컷 성숙 햄스터는 0일, 14일 및 28일에 근육내(IM) 주사에 의해 3회 백신접종을 투여받았다. 위약은 PBS였다. 48마리의 햄스터를 하기한 바대로 백신접종된 8개의 그룹으로 나눴다:
1 그룹: 오직 PBS + 102 포자 항원공격
2 그룹: C-TAB.G5.1 + 102 포자 항원공격
3 그룹: 오직 PBS + 103 포자 항원공격
4 그룹: C-TAB.G5.1 + 102 포자 항원공격
5 그룹: 오직 PBS + 104 포자 항원공격
6 그룹: C-TAB.G5.1 + 104 포자 항원공격
42일에 모든 그룹에서 모든 동물은 체중 1㎏당 10㎎의 인산클린다마이신의 경구 용량을 투여받았다. 43일에, 세척된 C. 디피실 균주 630의 포자로 위관영양법에 의해 모든 그룹에서 모든 동물을 투약하였다. 3 수준의 포자 항원공격(약 102, 103 및 104)을 사용하였다. 54일까지 계속 관찰하였지만 치료하지는 않았다. 연구 종료 시, 모든 생존한 동물은 5일 이상 동안 질환이 없었다.
0일, 14일, 28일, 42일 및 54일(연구 종료)에 혈청학적 연구를 위해 혈청을 얻기 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 1일 및 42일에 대변을 햄스터의 항문으로부터 직접 수집하거나 필요한 경우 잠자리 장소에서 수집하였다.
햄스터에서 포자 항원공격 후 생존율 곡선을 나타내는 도 14에 결과가 도시되어 있다. 생존율 데이터를 카플란-마이어 생존율 맞춤 곡선으로 좌표화하고 로그 랭크 분석을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 포자 용량에서, 백신접종된 그룹에서 햄스터의 100% 생존율이 관찰되었고 생존율이 위약 그룹과 비교하여 유의적으로 증대되었다: 102 포자에서 p=0.0245, 103 포자에서 p=0.0006, 104 포자에서 p<0.0001.
(실시예 8) 원숭이에서 C-TAB.G5.1의 면역원성 및 보호 효율
이 연구는 사이노몰거스 원숭이에서 C-TAB.G5.1의 면역원성 및 보호를 평가하는 것이다. 이 연구에 4년령 내지 6년령이고 체중이 2 및 4㎏인 6마리의 암컷 사이노몰거스 원숭이를 사용하였다. 3마리의 원숭이의 2개의 그룹을 200㎍의 C-TAB.G5.1을 투여받은 제1 그룹(1 그룹) 및 200㎍의 C-TAB.G5.1 및 250㎍의 명반을 투여받은 제2 그룹(2 그룹)으로 배치하였다. 명반 면역보강제 레하이드라겔(Rehydragel)(Reheis, 롯트 534401호, PBS 중의 2㎎/㎖로 희석됨)을 사용하였다. 혈액 수집 또는 면역화 전에, (필요한 경우) 동물을 면도하였다.
제1 면역화(연구 0일) 및 제3 면역화(연구 28일)를 왼쪽 팔(삼각근)에서 주사하고, 제2 면역화(연구 14일)를 오른쪽 팔(삼각근)에 주사하였다. 1 그룹은 IM 주사에 의해 0.5㎖의 1xPBS 중의 200㎍의 C-TAB.G5.1을 단독 투여받았고 2 그룹은 IM 주사에 의해 0.5㎖의 1xPBS 중의 200㎍의 C-TAB.G5.1과 함께 250㎍의 명반을 투여받았다.
확립된 시점(연구 0일, 14일, 28일 및 42일)에, 혈청 세퍼레이터 관으로 표준 방법에 의해 2㎖ 내지 3㎖의 전혈을 얻었다. 혈청 샘플을 대략 -20℃에서 냉동시켰다. 이후, ELISA 방법을 이용하여 항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소 IgG 역가를 평가하였다. 항체 역가는 ELISA 단위(EU)로 제시된다.
도 15는 C-TAB.G5.1의 용량 증가가 모든 3종의 단백질을 인식하는 항체 생성을 증가시키고, 명반의 존재가 항체 수준을 유의적으로 개선한다는 것을 보여준다. 42일에 2회 백신접종에 의해 가장 높은 항체 역가가 관찰되었다. 이 데이터는 이를 필요로 하는 피험체 백신접종에 대한 재조합 C-TAB.G5 또는 C-TAB.G5.1 융합 단백질을 사용하는 타당성을 명확히 보여준다.
(실시예 9) C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1의 면역원성의 비교
이 연구는 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1의 면역원성 및 C-TAB가 전달된 2종의 상이한 완충제의 효과를 비교하는 것이다. 면역화에 8주령 내지 9주령의 C57BL/6 암컷 마우스(챨스 리버 랩스.)를 사용하였다. 모든 동물은 0일에 오른쪽 넓적다리 근육으로 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 제1 면역화를 투여받았다. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 면역화를 수행하였다. 전체 72마리의 마우스를 하기와 같이 백신접종된 12개의 그룹으로 나눴다:
1 그룹: PBS 중의 1㎍의 C-TAB.G5
2 그룹: PBS 중의 3㎍의 C-TAB.G5
3 그룹: PBS 중의 10㎍의 C-TAB.G5
4 그룹: PBS 중의 30㎍의 C-TAB.G5
5 그룹: 히스티딘 완충제 중의 1㎍의 C-TAB.G5
6 그룹: 히스티딘 완충제 중의 3㎍의 C-TAB.G5
7 그룹: 히스티딘 완충제 중의 10㎍의 C-TAB.G5
8 그룹: 히스티딘 완충제 중의 30㎍의 C-TAB.G5
9 그룹: 히스티딘 완충제 중의 1㎍의 C-TAB.G5.1
10 그룹: 히스티딘 완충제 중의 3㎍의 C-TAB.G5.1
11 그룹: 히스티딘 완충제 중의 10㎍의 C-TAB.G5.1
12 그룹: 히스티딘 완충제 중의 30㎍의 C-TAB.G5.1
제2 면역화 2주(연구 28일) 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고 ELISA 단위(EU)로 기록하였다.
도 16은 3종의 백신 제제에 대해 모든 항체 역가(항-C-TAB, 항-A 독소 및 항-B 독소)가 1㎍ 내지 30㎍의 용량 범위에 걸쳐 유의적으로 다르지 않다(T 시험 분석에 의해 밝혀짐)는 것을 나타낸다. PBS와 비교하여 히스티딘 완충제 중의 C-TAB.G5 제제로 약간 더 높은 항체 생성을 성취하였다. C-TAB.G5와 C-TAB.G5.1 히스티딘 제제에 의한 면역화 사이에 유의차가 관찰되지 않았다. 따라서, 이 연구는 C-TAB.G5 및 C-TAB.G5.1 구성체의 동일한 면역원성을 나타낸다.
(실시예 10) 대안적인 C-TABNCTB 및 C-TADCTB 융합 단백질의 제제 및 평가
이 실시예는 C. 디피실 VPI-10463 균주 유래의 CTA의 C 말단 도메인의 1 부분 및 CTB의 C 말단 도메인의 2 부분을 포함하는 2종의 다른 융합 단백질의 제제를 기술한다. C-TABNCTB 융합 단백질(서열 번호 18)은, C-TAB.G5와 같이, CTA의 19개의 반복 단위(2272번 내지 2710번 아미노산), CTB의 23개의 반복 단위(1850번 내지 2366번 아미노산) 및 CTB의 C 말단에 융합된 CTB의 추가의 10개의 반복부(1834번 내지 2057번 아미노산)을 포함한다. C-TADCTB 융합 단백질(서열 번호 20)은 C-TAB.G5 서열(CTA의 19개의 반복부 및 CTB의 23개의 반복부) 및 C-TAB.G5의 C 말단에 융합된 CTB의 추가의 24개의 반복 단위(1834번 내지 2366번 아미노산)를 포함한다. 따라서, C-TADCTB는 CTB의 반복 단위의 이중 부분을 포함한다. C-TABNCTB 및 C-TADCTB 유전자 구성체의 클로닝을 실시예 1.1에 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다. 재조합 융합 단백질을 이. 콜라이 세포에서 발현시키고 실시예 1.2에 기재된 표준 절차를 이용하여 정제하였다. 동물에서 면역원성 및 보호 연구에서 분리된 폴리펩타이드를 평가하였다.
(실시예 10.1) 마우스에서 C-TAB.G5, C-TABNCTB 및 C-TADCTB의 면역원성 및 보호 효율의 비교
이 연구는 2 로그 범위에 걸쳐 5의 항원 용량으로 백신접종된 마우스에서 C-TAB.G5, C-TABNCTB 및 C-TADCTB의 면역원성 및 보호 효율을 비교하는 것이다. 이 연구에 6주령 내지 7주령의 암컷 C57BL/6 마우스(챨스 리버 랩스.)를 사용하였다. 모든 동물은 2회 백신접종을 투여받았다: 오른쪽 넓적다리 근육으로 근육내(IM) 주사(50㎕)에 의해 제1 백신접종. 14일에 왼쪽 넓적다리 근육에 IM 주사에 의해 제2 백신접종을 수행하였다. 명반의 부재 하에 모든 면역화를 수행하였다. 제2 면역화 2주(연구 28일) 후 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 분석까지 -20℃에서 혈청을 저장하였다. C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고 도 17에 도시된 ELISA 단위(EU)로 기록하였다.
이 연구는 대안적인 융합 단백질 C-TADCTB 및 C-TABNCTB 및 C-TAB.G5가 면역보강제를 첨가하지 않아도 고도로 면역원성이고 A 독소 및 B 독소 둘 다에 대해 강한 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
항체 반응을 평가하는 것 이외에, 천연 B 독소의 치사 항원공격으로부터 마우스를 보호하기 위한 C-TADCTB 및 C-TABNCTB 면역화를 결정하였다. 제2 백신접종 3주(연구 35일) 후 백신접종 그룹 및 비백신접종 그룹(N=6)에서의 동물은 50ng의 치사량의 B 독소를 복강내(IP) 투여받았다. 다음 9일에 걸쳐 마우스의 생존율을 모니터링하고 그 결과가 도 18에 도시되어 있다. 이 실험은 명반의 부재 하에 33㎍의 C-TADCTB에 의한 마우스의 면역화가 천연 B 독소의 치사 항원공격에 대한 100% 보호를 부여하지만, 동일한 용량의 C-TAB.G5 및 C-TABNCTB가 오직 부분 보호를 유도한다는 것을 나타낸다. 이 데이터는, C-TAB.G5와 유사하게, 2종의 다른 융합 단백질 C-TADCTB 및 C-TABNCTB가 천연 독소의 치사 항원공격에 대해 보호적일 수 있다는 것을 나타낸다.
(실시예 10.2) 햄스터에서 C-TAB.G5.1 및 C-TADCTB의 면역원성 및 보호 효율의 비교
이 연구는 상이한 동물 모델에서 명반 면역보강제와 함께 또는 명반 면역보강제와 없이 투여된 대안적인 융합 단백질 C-TADCTB의 면역원성을 추가로 평가하는 것이다.
실시예 6에 기재된 바대로 이 연구를 설계하였다: 100㎍의 수산화명반의 존재 또는 부재 하에 IM 주사(연구 0일, 14일 및 28일)에 의해 암컷 햄스터를 3회 백신접종하였다. 제3 백신접종 2주(연구 42일) 후 모든 동물은 75ng의 A 독소 또는 125ng의 B 독소에 의한 복강내(IP) 주사에 의해 치사 항원공격을 투여받았다. 연구 14일, 28일 및 35일에 혈액 샘플을 수집하고, C-TAB, A 독소 및 B 독소에 대한 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 35일 혈청에서 A 독소 및 B 독소 중화 항체(TNA)를 측정하였다. 햄스터의 생존율을 모니터링하고 보호율(%)로서 기록하였다.
이 연구는 마우스와 유사하게 햄스터에서 융합 단백질 C-TADCTB가 항독소 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 명반 면역보강제는 모든 시험된 항체 역가를 유의적으로 개선하였다. 도 19에 도시된 TNA 검정의 결과는 C-TADCTB에 대해 생성된 항체가 C. 디피실 A 독소 및 B 독소의 독성 효과를 중화시키는 데 있어서 효과적이라는 것을 나타낸다. 도 19는 또한 C-TAB.G5.1 또는 C-TADCTB로 면역화된 햄스터에 대한 보호 데이터의 비교를 나타낸다. 재조합 융합 단백질 둘 다에 의한 백신접종에 의해 높은 보호가 성취되었다.
(실시예 11) C-TAB.G5.1을 포함하는 약제학적 조성물의 안정성, 면역원성 및 용량 반응을 평가하는 오픈 라벨 1상 연구
C-TAB.G5.1, 절두된 클로스트리디윰 디피실(C. 디피실) A 독소 및 B 독소로 이루어진 재조합 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물: 근육내(IM) 주사에 의해 각각 0일, 7일 및 21일에 Al(OH)3과 함께 20㎍, Al(OH)3(명반)과 함께 또는 이것 없이 75 및 200㎍의 3회 백신접종의 3의 상이한 용량으로 투여하다.
연구 목적
1차:
백신접종후 6개월까지 C-TAB.G5.1을 포함하는 약제학적 조성물의 안정성 및 관용성을 조사하는 것.
2차:
최적 용량 및 제제의 제1 적응증을 얻기 위해 제1 백신접종 0일, 7일, 14일, 21일, 28일, 113일, 201일 후 3의 상이한 용량 및 2종의 제제에 대한 백신 항원 C-TAB.G5.1 및 C. 디피실의 천연 A 독소 및 B 독소에 대해 측정된 면역 반응.
실험실내 C. 디피실 A 독소 및 B 독소를 중화하는 C-TAB.G5.1 백신 유도 IgG 항체의 능력을 조사하는 것.
연구 설계
이는 18세 내지 65세의 건강한 성인에서의 A 부분 및 65세가 넘는 건강한 노인에서의 B 부분으로 이루어진 오픈 라벨, 부분 무작위, 용량 증가 1상 연구이고, 후자 연령의 그룹이 C. 디피실 감염을 앓기에 가장 취약한 집단이다. A 부분을 12명의 건강한 성인 피험체의 5개의 치료 그룹에서 0일, 7일 및 21일에 백신접종 스케줄로 수행하여 각각 연구 면역보강제와 함께 20㎍의 C-TAB.G5.1 백신 및 면역보강제와 함께 또는 면역보강제 없이 75㎍ 및 200㎍의 C-TAB.G5.1 백신에 대한 안정성 및 용량 반응을 연구한다. A 부분의 모든 성인 피험체가 제3 백신접종을 투여받은 후 안정성 및 면역원성을 분석하고, B 부분으로부터 피험체의 등록 전에 데이터 안정성 모니터링 위원회(Data Safety Monitoring Board: DSMB)가 모든 안정성 데이터를 검토한다. 중간 분석 동안 안전하지 않거나 무의미한 치료 그룹(즉, 상당한 IgG 반응을 유도하지 않는 용량)이 확인된 경우, 이 치료 그룹은 탈락되고 B 부분으로 이송되지 않는다.
연구의 B 부분은 노인 집단에서 용량 확인을 추구한다. 따라서, 그룹마다 20명의 건강한 노인 피험체의 5개의 치료 그룹에서 B 부분을 수행한다. 백신접종 스케줄 0일, 7일 및 21일을 적용한다. 이 연구 설계는 성인 및 노인 둘 다에서 용량 반응을 비교하도록 한다. 후자 연령 그룹은 C. 디피실 백신에 대한 주요 표적 집단으로, 연령 기반 또는 연령 위험 기반 보호성 백신접종 접근법에서 C. 디피실 백신의 개발 경로에서 2가지 표적 적응증, 즉 재발성 C. 디피실 설사의 예방 및 원발성 C. 디피실 감염의 예방에 대한 가장 취약한 집단을 나타낸다. 그러나, 노인 피험체는 청장년층에서보다 백신접종에 덜 반응성이어서; 노인 발생 단계로부터 노인 표적 집단에서 용량 확인이 필요하다. A 부분으로부터의 모든 성인이 백신접종된 후의 중간 분석은 성인에서 상당한 IgG 반응을 유도하지 않는 안전하지 않은 용량/제제를 낮추어 노인 그룹에서 백신의 잠재적으로 안전하지 않거나 무의미한 용량(예를 들면, 가장 낮은 용량) 및/또는 제제(예를 들면, 면역보강제 비첨가 제제)에 대해 피험체를 노출시키는 위험을 완화시킨다.
C-TAB.G5.1 백신은 표준 방법에 의해 제조된 20mM L-히스티딘, 75mM NaCl, 5% 수크로스, 0.025% 트윈(등록상표)80(pH 6.5) 중의 C-TAB.G5.1의 수용액이다.
바람직한 형태:
바람직한 폴리펩타이드 및 이의 용도:
1. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드.
2. 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드.
3. 1 형태 또는 2 형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 클로스트리디윰 디피실의 A 독소의 C 말단 도메인 유래의 19개의 반복 단위를 포함하고, 클로스트리디윰 디피실의 B 독소의 C 말단 도메인 유래의 23개의 반복 단위를 포함하는 것인, 분리된 폴리펩타이드.
4. 1 형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 분리된 폴리펩타이드.
5. 1 형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인, 분리된 폴리펩타이드.
6. 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
7. 6 형태에 있어서, 상기 분리된 폴리펩타이드로 백신접종된 햄스터는 모든 포자 용량(102, 103 및 104)에서 치사량의 C. 디피실 포자의 위내 투여를 견뎌 내는 것인 폴리펩타이드.
8. 6 형태 또는 7 형태에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 클로스트리디윰 디피실의 A 독소의 C 말단 도메인 유래의 19개의 반복 단위를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
9. 6 형태 내지 8 형태 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 클로스트리디윰 디피실의 B 독소의 C 말단 도메인 유래의 23개, 33개 또는 47개의 반복 단위를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
10. 6 형태 내지 9 형태 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 18, 서열 번호 20 및 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 18 또는 서열 번호 20 중 어느 하나와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리펩타이드.
11. 6 형태 내지 10 형태 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 분리된 것인 폴리펩타이드.
12. 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나에 있어서, 의약(medicine)에서 사용하기 위한 것인 폴리펩타이드.
13. 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나에 있어서, CDAD의 예방 및 치료를 위한 것인 폴리펩타이드.
14. 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나에 있어서, CDAD의 위험이 있는 피험체에서 CDAD의 예방을 위한 것인 폴리펩타이드.
15. 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나에 있어서, CDAD의 위험이 있는 피험체에서 CDAD의 예방을 위한 것이고, 상기 CDAD의 위험이 있는 피험체는 ⅰ) 65세보다 많은 피험체 또는 2세보다 어린 피험체; ⅱ) AIDS를 앓고 있는 피험체; ⅲ) 면역억제 약물을 섭취하거나 섭취할 계획이 있는 피험체; ⅳ) 입원 계획이 있는 피험체 또는 입원 중인 피험체; ⅴ) 중환자실에 있거나 중환자실로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅵ) 위장관 수술을 받거나 받을 계획이 있는 피험체; ⅶ) 요양원과 같은 장기간 치료시설에 있거나 이 치료시설로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅷ) 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 병존질환을 앓고 있는 피험체; 또는 ⅸ) 재발성 CDAD를 앓고 있는 피험체인 것인 폴리펩타이드.
16. 의약에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 용도.
17. CDAD의 예방 및 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의, 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 용도.
18. CDAD의 위험이 있는 피험체에서 CDAD의 예방을 위한 약제의 제조에 있어서의, 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 용도.
19. CDAD의 위험이 있는 피험체에서 CDAD의 예방을 위한 것이고, 상기 CDAD의 위험이 있는 피험체는 ⅰ) 65세보다 많은 피험체 또는 2세보다 어린 피험체; ⅱ) AIDS를 앓고 있는 피험체; ⅲ) 면역억제 약물을 섭취하거나 섭취할 계획이 있는 피험체; ⅳ) 입원 계획이 있는 피험체 또는 입원 중인 피험체; ⅴ) 중환자실에 있거나 중환자실로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅵ) 위장관 수술을 받거나 받을 계획이 있는 피험체; ⅶ) 요양원과 같은 장기간 치료시설에 있거나 이 치료시설로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅷ) 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 병존질환을 앓고 있는 피험체; 또는 ⅸ) 재발성 CDAD를 앓고 있는 피험체인 것인, 6 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드의 용도.
20. 피험체에서 C. 디피실 감염을 검출하기 위한, 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 진단 키트.
바람직한 핵산:
1a. 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
2a. 1a 형태에 있어서, 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 실질적으로 이루어진 것인, 핵산.
3a. 1a 형태 또는 2a 형태에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 17 및 서열 번호 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 핵산.
4a. 1a 형태 또는 2a 형태에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 17 및 서열 번호 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 핵산.
바람직한 약제학적 조성물:
1c. 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드 또는 1a 형태 내지 4a 형태 중 어느 하나의 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
2c. 1c 형태에 있어서, 상기 조성물은 C. 디피실 A 독소 및 B 독소 둘 다를 중화하는 항체를 생성시키는 것인 약제학적 조성물.
3c. 1c 형태 또는 2c 형태에 있어서, 상기 조성물은 C. 디피실 A 독소 및 B 독소에 대해 피험체에서 보호 면역 반응을 생성시키는 것인 약제학적 조성물.
4c. 1c 형태 내지 3c 형태에 있어서, 면역보강제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
5c. 4c 형태에 있어서, 상기 면역보강제는 명반을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
6c. 1c 형태 내지 5c 형태 중 어느 하나에 있어서, 추가의 항원 또는 약물을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
바람직한 항체: 1d. 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 겨냥하지만, C. 디피실 A 독소(서열 번호 6) 및 B 독소(서열 번호 8) 중 어느 하나 또는 둘 다를 인식하지 않는 항체.
바람직한 방법:
1e. 1 형태 내지 10 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 단계, 상기 폴리펩타이드가 발현되게 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
2e. 1e 형태에 있어서, 상기 숙주 세포는 이. 콜라이인 것인 방법.
3e. 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 분리된 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 C. 디피실 관련 질환(CDAD)을 치료하고/하거나 예방하는 방법.
4e. 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 또는 1c 형태 내지 6c 형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 C. 디피실의 A 독소 및 B 독소에 대해 특이적 면역 반응을 유도하는 방법.
5e. 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 또는 1c 형태 내지 6c 형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 C. 디피실 감염에 의해 야기된 원발성 질환을 예방하는 방법.
6e. C. 디피실 관련 질환(CDAD)의 위험이 있는 피험체에서 C. 디피실 감염에 의해 야기된 원발성 질환을 예방하는 방법으로서, 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드 또는 1c 형태 내지 6c 형태 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 CDAD의 위험이 있는 피험체는 ⅰ) 65세보다 많은 피험체 또는 2세보다 어린 피험체; ⅱ) AIDS를 앓고 있는 피험체; ⅲ) 면역억제 약물을 섭취하거나 섭취할 계획이 있는 피험체; ⅳ) 입원 계획이 있는 피험체 또는 입원 중인 피험체; ⅴ) 중환자실에 있거나 중환자실로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅵ) 위장관 수술을 받거나 받을 계획이 있는 피험체; ⅶ) 요양원과 같은 장기간 치료시설에 있거나 이 치료시설로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅷ) 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 병존질환을 앓고 있는 피험체; 또는 ⅸ) 재발성 CDAD를 앓고 있는 피험체인 것인 방법.
7e. 1e 형태 내지 6e 형태 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 피험체에게 근육내, 피내, 피하, 경구, 비강 또는 직장, 바람직하게는 근육내 투여하는 것인 방법.
8e. 1e 형태 내지 7e 형태 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 단기간 간격으로(주마다 또는 2주마다) 적어도 2의 용량 내에 피험체에게 투여하는 것인 방법.
9e. 생물학적 샘플을 1 형태 내지 11 형태 중 어느 하나의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계 및 상기 생물학적 샘플에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 C. 디피실을 검출하는 방법으로서, 상기 폴리펩타이드의 결합은 상기 생물학적 샘플에서 C. 디피실의 존재를 나타내는 것인 방법.
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ggcaaaaaat attattttga taatgactca aaagcagtta ctggatggca aaccattgat 180
ggtaaaaaat attactttaa tcttaacact gctgaagcag ctactggatg gcaaactatt 240
gatggtaaaa aatattactt taatcttaac actgctgaag cagctactgg atggcaaact 300
attgatggta aaaaatatta ctttaatact aacactttca tagcctcaac tggttataca 360
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ggtcaagcta tactttacca aaataaattc ttaactttga atggtaaaaa atattacttt 540
ggtagtgact caaaagcagt taccggattg cgaactattg atggtaaaaa atattacttt 600
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tattttaata ctgatggtat tatgcagata ggagtgttta aaggacctga tggatttgaa 780
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<213> artificial
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<213> artificial
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755 760 765
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770 775 780
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Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn
900 905 910
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915 920 925
Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr
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<211> 8133
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<213> Clostridium difficile strain 630
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gaatcatata gaacaaattc tttgagaaaa ataaatagta atcatgggat agatatcagg 720
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tctagaccta gctctattgg actagaccgt tgggaaatga taaaattaga ggctattatg 960
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aaattagaaa atttaaatgt atctgatctt gaaattaaaa tagctttcgc tttaggcagt 1140
gttataaatc aagccttgat atcaaaacaa ggttcatatc ttactaacct agtaatagaa 1200
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tctaaaaatc ctaaaaatag tattattata caacgaaata tgaatgaaag tgcaaaaagc 1860
tactttttaa gtgatgatgg agaatctatt ttagaattaa ataaatatag gatacctgaa 1920
agattaaaaa ataaggaaaa agtaaaagta acctttattg gacatggtaa agatgaattc 1980
aacacaagcg aatttgctag attaagtgta gattcacttt ccaatgagat aagttcattt 2040
ttagatacca taaaattaga tatatcacct aaaaatgtag aagtaaactt acttggatgt 2100
aatatgttta gttatgattt taatgttgaa gaaacttatc ctgggaagtt gctattaagt 2160
attatggaca aaattacttc cactttacct gatgtaaata aaaattctat tactatagga 2220
gcaaatcaat atgaagtaag aattaatagt gagggaagaa aagaacttct ggctcactca 2280
ggtaaatgga taaataaaga agaagctatt atgagcgatt tatctagtaa agaatacatt 2340
ttttttgatt ctatagataa taagctaaaa gcaaagtcca agaatattcc aggattagca 2400
tcaatatcag aagatataaa aacattatta cttgatgcaa gtgttagtcc tgatacaaaa 2460
tttattttaa ataatcttaa gcttaatatt gaatcttcta ttggtgatta catttattat 2520
gaaaaattag agcctgttaa aaatataatt cacaattcta tagatgattt aatagatgag 2580
ttcaatctac ttgaaaatgt atctgatgaa ttatatgaat taaaaaaatt aaataatcta 2640
gatgagaagt atttaatatc ttttgaagat atctcaaaaa ataattcaac ttactctgta 2700
agatttatta acaaaagtaa tggtgagtca gtttatgtag aaacagaaaa agaaattttt 2760
tcaaaatata gcgaacatat tacaaaagaa ataagtacta taaagaatag tataattaca 2820
gatgttaatg gtaatttatt ggataatata cagttagatc atacttctca agttaataca 2880
ttaaacgcag cattctttat tcaatcatta atagattata gtagcaataa agatgtactg 2940
aatgatttaa gtacctcagt taaggttcaa ctttatgctc aactatttag tacaggttta 3000
aatactatat atgactctat ccaattagta aatttaatat caaatgcagt aaatgatact 3060
ataaatgtac tacctacaat aacagagggg atacctattg tatctactat attagacgga 3120
ataaacttag gtgcagcaat taaggaatta ctagacgaac atgacccatt actaaaaaaa 3180
gaattagaag ctaaggtggg tgttttagca ataaatatgt cattatctat agctgcaact 3240
gtagcttcaa ttgttggaat aggtgctgaa gttactattt tcttattacc tatagctggt 3300
atatctgcag gaataccttc attagttaat aatgaattaa tattgcatga taaggcaact 3360
tcagtggtaa actattttaa tcatttgtct gaatctaaaa aatatggccc tcttaaaaca 3420
gaagatgata aaattttagt tcctattgat gatttagtaa tatcagaaat agattttaat 3480
aataattcga taaaactagg aacatgtaat atattagcaa tggagggggg atcaggacac 3540
acagtgactg gtaatataga tcactttttc tcatctccat ctataagttc tcatattcct 3600
tcattatcaa tttattctgc aataggtata gaaacagaaa atctagattt ttcaaaaaaa 3660
ataatgatgt tacctaatgc tccttcaaga gtgttttggt gggaaactgg agcagttcca 3720
ggtttaagat cattggaaaa tgacggaact agattacttg attcaataag agatttatac 3780
ccaggtaaat tttactggag attctatgct tttttcgatt atgcaataac tacattaaaa 3840
ccagtttatg aagacactaa tattaaaatt aaactagata aagatactag aaacttcata 3900
atgccaacta taactactaa cgaaattaga aacaaattat cttattcatt tgatggagca 3960
ggaggaactt actctttatt attatcttca tatccaatat caacgaatat aaatttatct 4020
aaagatgatt tatggatatt taatattgat aatgaagtaa gagaaatatc tatagaaaat 4080
ggtactatta aaaaaggaaa gttaataaaa gatgttttaa gtaaaattga tataaataaa 4140
aataaactta ttataggcaa tcaaacaata gatttttcag gcgatataga taataaagat 4200
agatatatat tcttgacttg tgagttagat gataaaatta gtttaataat agaaataaat 4260
cttgttgcaa aatcttatag tttgttattg tctggggata aaaattattt gatatccaat 4320
ttatctaata ttattgagaa aatcaatact ttaggcctag atagtaaaaa tatagcgtac 4380
aattacactg atgaatctaa taataaatat tttggagcta tatctaaaac aagtcaaaaa 4440
agcataatac attataaaaa agacagtaaa aatatattag aattttataa tgacagtaca 4500
ttagaattta acagtaaaga ttttattgct gaagatataa atgtatttat gaaagatgat 4560
attaatacta taacaggaaa atactatgtt gataataata ctgataaaag tatagatttc 4620
tctatttctt tagttagtaa aaatcaagta aaagtaaatg gattatattt aaatgaatcc 4680
gtatactcat cttaccttga ttttgtgaaa aattcagatg gacaccataa tacttctaat 4740
tttatgaatt tatttttgga caatataagt ttctggaaat tgtttgggtt tgaaaatata 4800
aattttgtaa tcgataaata ctttaccctt gttggtaaaa ctaatcttgg atatgtagaa 4860
tttatttgtg acaataataa aaatatagat atatattttg gtgaatggaa aacatcgtca 4920
tctaaaagca ctatatttag cggaaatggt agaaatgttg tagtagagcc tatatataat 4980
cctgatacgg gtgaagatat atctacttca ctagattttt cctatgaacc tctctatgga 5040
atagatagat atatcaataa agtattgata gcacctgatt tatatacaag tttaataaat 5100
attaatacca attattattc aaatgagtac taccctgaga ttatagttct taacccaaat 5160
acattccaca aaaaagtaaa tataaattta gatagttctt cttttgagta taaatggtct 5220
acagaaggaa gtgactttat tttagttaga tacttagaag aaagtaataa aaaaatatta 5280
caaaaaataa gaatcaaagg tatcttatct aatactcaat catttaataa aatgagtata 5340
gattttaaag atattaaaaa actatcatta ggatatataa tgagtaattt taaatcattt 5400
aattctgaaa atgaattaga tagagatcat ttaggattta aaataataga taataaaact 5460
tattactatg atgaagatag taaattagtt aaaggattaa tcaatataaa taattcatta 5520
ttctattttg atcctataga atttaactta gtaactggat ggcaaactat caatggtaaa 5580
aaatattatt ttgatataaa tactggagca gctttaatta gttataaaat tattaatggt 5640
aaacactttt attttaataa tgatggtgtg atgcagttgg gagtatttaa aggacctgat 5700
ggatttgaat attttgcacc tgccaatact caaaataata acatagaagg tcaggctata 5760
gtttatcaaa gtaaattctt aactttgaat ggcaaaaaat attattttga taatgactca 5820
aaagcagtca ctggatggag aattattaac aatgagaaat attactttaa tcctaataat 5880
gctattgctg cagtcggatt gcaagtaatt gacaataata agtattattt caatcctgac 5940
actgctatca tctcaaaagg ttggcagact gttaatggta gtagatacta ctttgatact 6000
gataccgcta ttgcctttaa tggttataaa actattgatg gtaaacactt ttattttgat 6060
agtgattgtg tagtgaaaat aggtgtgttt agtacctcta atggatttga atattttgca 6120
cctgctaata cttataataa taacatagaa ggtcaggcta tagtttatca aagtaaattc 6180
ttaactttga atggtaaaaa atattacttt gataataact caaaagcagt taccggatgg 6240
caaactattg atagtaaaaa atattacttt aatactaaca ctgctgaagc agctactgga 6300
tggcaaacta ttgatggtaa aaaatattac tttaatacta acactgctga agcagctact 6360
ggatggcaaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tatagcttca 6420
actggttata caattattaa tggtaaacat ttttatttta atactgatgg tattatgcag 6480
ataggagtgt ttaaaggacc taatggattt gaatattttg cacctgctaa tacggatgct 6540
aacaacatag aaggtcaagc tatactttac caaaatgaat tcttaacttt gaatggtaaa 6600
aaatattact ttggtagtga ctcaaaagca gttactggat ggagaattat taacaataag 6660
aaatattact ttaatcctaa taatgctatt gctgcaattc atctatgcac tataaataat 6720
gacaagtatt actttagtta tgatggaatt cttcaaaatg gatatattac tattgaaaga 6780
aataatttct attttgatgc taataatgaa tctaaaatgg taacaggagt atttaaagga 6840
cctaatggat ttgagtattt tgcacctgct aatactcaca ataataacat agaaggtcag 6900
gctatagttt accagaacaa attcttaact ttgaatggca aaaaatatta ttttgataat 6960
gactcaaaag cagttactgg atggcaaacc attgatggta aaaaatatta ctttaatctt 7020
aacactgctg aagcagctac tggatggcaa actattgatg gtaaaaaata ttactttaat 7080
cttaacactg ctgaagcagc tactggatgg caaactattg atggtaaaaa atattacttt 7140
aatactaaca ctttcatagc ctcaactggt tatacaagta ttaatggtaa acatttttat 7200
tttaatactg atggtattat gcagatagga gtgtttaaag gacctaatgg atttgaatac 7260
tttgcacctg ctaatactca taataataac atagaaggtc aagctatact ttaccaaaat 7320
aaattcttaa ctttgaatgg taaaaaatat tactttggta gtgactcaaa agcagttacc 7380
ggattgcgaa ctattgatgg taaaaaatat tactttaata ctaacactgc tgttgcagtt 7440
actggatggc aaactattaa tggtaaaaaa tactacttta atactaacac ttctatagct 7500
tcaactggtt atacaattat tagtggtaaa catttttatt ttaatactga tggtattatg 7560
cagataggag tgtttaaagg acctgatgga tttgaatact ttgcacctgc taatacagat 7620
gctaacaata tagaaggtca agctatacgt tatcaaaata gattcctata tttacatgac 7680
aatatatatt attttggtaa taattcaaaa gcagctactg gttgggtaac tattgatggt 7740
aatagatatt acttcgagcc taatacagct atgggtgcga atggttataa aactattgat 7800
aataaaaatt tttactttag aaatggttta cctcagatag gagtgtttaa agggtctaat 7860
ggatttgaat actttgcacc tgctaatacg gatgctaaca atatagaagg tcaagctata 7920
cgttatcaaa atagattcct acatttactt ggaaaaatat attactttgg taataattca 7980
aaagcagtta ctggatggca aactattaat ggtaaagtat attactttat gcctgatact 8040
gctatggctg cagctggtgg acttttcgag attgatggtg ttatatattt ctttggtgtt 8100
gatggagtaa aagcccctgg gatatatggc taa 8133
<210> 6
<211> 2710
<212> PRT
<213> Clostridium difficile strain 630
<400> 6
Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile
1 5 10 15
Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu
20 25 30
Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr
50 55 60
Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys
65 70 75 80
Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn
85 90 95
Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu
100 105 110
Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu
115 120 125
Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile
130 135 140
Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile
145 150 155 160
Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu
165 170 175
Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln
180 185 190
Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His
195 200 205
Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg
210 215 220
Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg
225 230 235 240
Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln
245 250 255
Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg
260 265 270
Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp Met
275 280 285
Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser
290 295 300
Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met
305 310 315 320
Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys
325 330 335
Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys
340 345 350
Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser
355 360 365
Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln
370 375 380
Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu
385 390 395 400
Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala
405 410 415
Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp
420 425 430
Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys
435 440 445
Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr
450 455 460
Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe
465 470 475 480
Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp
485 490 495
Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu
500 505 510
Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr
515 520 525
Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu
530 535 540
Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr
545 550 555 560
Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser
565 570 575
Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser
580 585 590
Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile
595 600 605
Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser
610 615 620
Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu
625 630 635 640
Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly
645 650 655
Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser
660 665 670
Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile
675 680 685
Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser
690 695 700
Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser
705 710 715 720
Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser
725 730 735
Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly
740 745 750
Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu
755 760 765
Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser
770 775 780
Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala
785 790 795 800
Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser
805 810 815
Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser
820 825 830
Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn
835 840 845
Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu
850 855 860
Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu
865 870 875 880
Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser
885 890 895
Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr
900 905 910
Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr
915 920 925
Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly
930 935 940
Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr
945 950 955 960
Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn
965 970 975
Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr
980 985 990
Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln
995 1000 1005
Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val
1010 1015 1020
Leu Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu
1025 1030 1035
Asp Gly Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu
1040 1045 1050
His Asp Pro Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val
1055 1060 1065
Leu Ala Ile Asn Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser
1070 1075 1080
Ile Val Gly Ile Gly Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu
1100 1105 1110
Ile Leu His Asp Lys Ala Thr Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His
1115 1120 1125
Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp
1130 1135 1140
Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp
1145 1150 1155
Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr Cys Asn Ile Leu Ala
1160 1165 1170
Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly Asn Ile Asp His
1175 1180 1185
Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro Ser Leu Ser
1190 1195 1200
Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp Phe Ser
1205 1210 1215
Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe Trp
1220 1225 1230
Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp
1235 1240 1245
Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys
1250 1255 1260
Phe Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr
1265 1270 1275
Leu Lys Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp
1280 1285 1290
Lys Asp Thr Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu
1295 1300 1305
Ile Arg Asn Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr
1310 1315 1320
Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn
1325 1330 1335
Leu Ser Lys Asp Asp Leu Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val
1340 1345 1350
Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu
1355 1360 1365
Ile Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu
1370 1375 1380
Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe Ser Gly Asp Ile Asp Asn
1385 1390 1395
Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu Leu Asp Asp Lys Ile
1400 1405 1410
Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys Ser Tyr Ser Leu
1415 1420 1425
Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn Leu Ser Asn
1430 1435 1440
Ile Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys Asn Ile
1445 1450 1455
Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly Ala
1460 1465 1470
Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp
1475 1480 1485
Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe
1490 1495 1500
Asn Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys
1505 1510 1515
Asp Asp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn
1520 1525 1530
Thr Asp Lys Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn
1535 1540 1545
Gln Val Lys Val Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser
1550 1555 1560
Ser Tyr Leu Asp Phe Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr
1565 1570 1575
Ser Asn Phe Met Asn Leu Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys
1580 1585 1590
Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe
1595 1600 1605
Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys
1610 1615 1620
Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr Phe Gly Glu Trp Lys Thr
1625 1630 1635
Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly Asn Gly Arg Asn Val
1640 1645 1650
Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly Glu Asp Ile Ser
1655 1660 1665
Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly Ile Asp Arg
1670 1675 1680
Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr Ser Leu
1685 1690 1695
Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro Glu
1700 1705 1710
Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile
1715 1720 1725
Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly
1730 1735 1740
Ser Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys
1745 1750 1755
Ile Leu Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln
1760 1765 1770
Ser Phe Asn Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu
1775 1780 1785
Ser Leu Gly Tyr Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu
1790 1795 1800
Asn Glu Leu Asp Arg Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn
1805 1810 1815
Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu
1820 1825 1830
Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe
1835 1840 1845
Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr
1850 1855 1860
Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu Ile Ser Tyr Lys Ile Ile
1865 1870 1875
Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp Gly Val Met Gln Leu
1880 1885 1890
Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala
1895 1900 1905
Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln
1910 1915 1920
Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn
1925 1930 1935
Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu Lys
1940 1945 1950
Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln
1955 1960 1965
Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile
1970 1975 1980
Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe
1985 1990 1995
Asp Thr Asp Thr Ala Ile Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp
2000 2005 2010
Gly Lys His Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys Ile Gly
2015 2020 2025
Val Phe Ser Thr Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn
2030 2035 2040
Thr Tyr Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Ser
2045 2050 2055
Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn
2060 2065 2070
Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Ser Lys Lys Tyr
2075 2080 2085
Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr
2090 2095 2100
Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu Ala
2105 2110 2115
Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn
2120 2125 2130
Thr Asn Thr Ala Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Asn Gly
2135 2140 2145
Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val
2150 2155 2160
Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr
2165 2170 2175
Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Glu
2180 2185 2190
Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser
2195 2200 2205
Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr
2210 2215 2220
Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Ile His Leu Cys Thr Ile
2225 2230 2235
Asn Asn Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Gln Asn
2240 2245 2250
Gly Tyr Ile Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn
2255 2260 2265
Asn Glu Ser Lys Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly
2270 2275 2280
Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu
2285 2290 2295
Gly Gln Ala Ile Val Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly
2300 2305 2310
Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp
2315 2320 2325
Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala
2330 2335 2340
Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr
2345 2350 2355
Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gln Thr Ile
2360 2365 2370
Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Phe Ile Ala Ser
2375 2380 2385
Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr
2390 2395 2400
Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe
2405 2410 2415
Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly
2420 2425 2430
Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys
2435 2440 2445
Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg
2450 2455 2460
Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val
2465 2470 2475
Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe
2480 2485 2490
Asn Thr Asn Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser
2495 2500 2505
Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly
2510 2515 2520
Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn
2525 2530 2535
Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln Asn
2540 2545 2550
Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn
2555 2560 2565
Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr
2570 2575 2580
Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly Ala Asn Gly Tyr Lys Thr
2585 2590 2595
Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn Gly Leu Pro Gln Ile
2600 2605 2610
Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala
2615 2620 2625
Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Arg Tyr Gln
2630 2635 2640
Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn
2645 2650 2655
Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Val
2660 2665 2670
Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu
2675 2680 2685
Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val
2690 2695 2700
Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly
2705 2710
<210> 7
<211> 7101
<212> DNA
<213> Clostridium difficile strain 630
<400> 7
atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtactcaa 60
gaagatgaat atgttgcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120
actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180
gatacatata aaaaatctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atatctagtt 240
acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300
gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360
gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420
ttgaaaaaaa ctgtagtaga atcagcaata aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480
ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttcttcagaa aacgtatgga aataatttat 540
gataaacaga aaaatttcat aaactactat aaagctcaaa gagaagaaaa tcctgaactt 600
ataattgatg atattgtaaa gacatatctt tcaaatgagt attcaaagga gatagatgaa 660
cttaatacct atattgaaga atccttaaat aaaattacac agaatagtgg aaatgatgtt 720
agaaactttg aagaatttaa aaatggagag tcattcaact tatatgaaca agagttggta 780
gaaaggtgga atttagctgc tgcttctgac atattaagaa tatctgcatt aaaagaaatt 840
ggtggtatgt atttagatgt tgatatgtta ccaggaatac aaccagactt atttgagtct 900
atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tgacaaagtt agaagctata 960
atgaaataca aagaatatat accagaatat acctcagaac attttgacat gttagacgaa 1020
gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataaatc agaaatattc 1080
tcatcacttg gtgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaag 1140
ggtattataa atcaagggct aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200
aaacaaatcg agaatagata taaaatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260
gataatgatt ttaatactac aacgaatacc tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320
gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380
gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagcat atgcggcagc ttatcaagat 1440
ttattaatgt ttaaagaagg cagtatgaat atccatttga tagaagctga tttaagaaac 1500
tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc tagcttatgg 1560
tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat ataaaaggaa ttattttgaa 1620
ggttctcttg gtgaagatga taatcttgat ttttctcaaa atatagtagt tgacaaggag 1680
tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740
attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800
actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860
tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920
tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980
gatatatttg caggttttga tgtagattca ttatccacag aaatagaagc agcaatagat 2040
ttagctaaag aggatatttc tcctaagtca atagaaataa atttattagg atgtaatatg 2100
tttagctact ctatcaacgt agaggagact tatcctggaa aattattact taaagttaaa 2160
gataaaatat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220
caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280
tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340
aatcctaaag aaaataaaat tacagtaaaa tctaaaaatt tacctgagct atctacatta 2400
ttacaagaaa ttagaaataa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460
ttaacagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cgcaaattgt tgaggaaagg 2520
attgaagaag ctaagaattt aacttctgac tctattaatt atataaaaga tgaatttaaa 2580
ctaatagaat ctatttctga tgcactatgt gacttaaaac aacagaatga attagaagat 2640
tctcatttta tatcttttga ggacatatca gagactgatg agggatttag tataagattt 2700
attaataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaaacaat attctctgaa 2760
tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820
aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatactacac acgaagtaaa tactttaaat 2880
gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940
ttaagtgtag caatgaaagt ccaagtttac gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000
attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagac 3060
ttacttccta cattatctga aggattacct ataattgcaa ctattataga tggtgtaagt 3120
ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acgagtgacc cattattaag acaagaaata 3180
gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacaacag ctacaactgc aatcattact 3240
tcatctttgg ggatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300
gcaggtatac caagcttagt aaacaatgaa cttgtacttc gagataaggc aacaaaggtt 3360
gtagattatt ttaaacatgt ttcattagtt gaaactgaag gagtatttac tttattagat 3420
gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtgatatcag aaatagattt taataataat 3480
tcaatagttt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggttcagg tcatactgta 3540
actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600
tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660
gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720
agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780
gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840
agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ttttatagtt 3900
ccaataataa ctacagaata tataagagaa aaattatcat attctttcta tggttcagga 3960
ggaacttatg cattgtctct ttctcaatat aatatgggta taaatataga attaagtgaa 4020
agtgatgttt ggattataga tgttgataat gttgtgagag atgtaactat agaatctgat 4080
aaaattaaaa aaggtgattt aatagaaggt attttatcta cactaagtat tgaagagaat 4140
aaaattatct taaatagcca tgagattaat ttttctggtg aggtaaatgg aagtaatgga 4200
tttgtttctt taacattttc aattttagaa ggaataaatg caattataga agttgattta 4260
ttatctaaat catataaatt acttatttct ggcgaattaa aaatattgat gttaaattca 4320
aatcatattc aacagaaaat agattatata ggattcaata gcgaattaca gaaaaatata 4380
ccatatagct ttgtagatag tgaaggaaaa gagaatggtt ttattaatgg ttcaacaaaa 4440
gaaggtttat ttgtatctga attacctgat gtagttctta taagtaaggt ttatatggat 4500
gatagtaagc cttcatttgg atattatagt aataatttga aagatgtcaa agttataact 4560
aaagataatg ttaatatatt aacaggttat tatcttaagg atgatataaa aatctctctt 4620
tctttgactc tacaagatga aaaaactata aagttaaata gtgtgcattt agatgaaagt 4680
ggagtagctg agattttgaa gttcatgaat agaaaaggta atacaaatac ttcagattct 4740
ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcgttaattt cttacaatct 4800
aatattaagt ttatattaga tgctaatttt ataataagtg gtactacttc tattggccaa 4860
tttgagttta tttgtgatga aaatgataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920
ctagaaacta attatacttt atatgtagga aatagacaaa atatgatagt ggaaccaaat 4980
tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtta tcaatttctc tcaaaagtat 5040
ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttgtaattt caccaaatat ttatacagat 5100
gaaataaata taacgcctgt atatgaaaca aataatactt atccagaagt tattgtatta 5160
gatgcaaatt atataaatga aaaaataaat gttaatatca atgatctatc tatacgatat 5220
gtatggagta atgatggtaa tgattttatt cttatgtcaa ctagtgaaga aaataaggtg 5280
tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt tttaaagata agactttggc aaataagcta 5340
tcttttaact ttagtgataa acaagatgta cctgtaagtg aaataatctt atcatttaca 5400
ccttcatatt atgaggatgg attgattggc tatgatttgg gtctagtttc tttatataat 5460
gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtatctg gattaatata tattaatgat 5520
tcattatatt attttaaacc accagtaaat aatttgataa ctggatttgt gactgtaggc 5580
gatgataaat actactttaa tccaattaat ggtggagctg cttcaattgg agagacaata 5640
attgatgaca aaaattatta tttcaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700
acagaagatg gatttaaata ttttgcccca gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga 5760
gaagcaattg attttactgg aaaattaatt attgacgaaa atatttatta ttttgatgat 5820
aattatagag gagctgtaga atggaaagaa ttagatggtg aaatgcacta ttttagccca 5880
gaaacaggta aagcttttaa aggtctaaat caaataggtg attataaata ctatttcaat 5940
tctgatggag ttatgcaaaa aggatttgtt agtataaatg ataataaaca ctattttgat 6000
gattctggtg ttatgaaagt aggttacact gaaatagatg gcaagcattt ctactttgct 6060
gaaaacggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagaag atggatttaa atattttgct 6120
catcataatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagaaa tctcatattc tggtatatta 6180
aatttcaata ataaaattta ctattttgat gattcattta cagctgtagt tggatggaaa 6240
gatttagagg atggttcaaa gtattatttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300
ttgtcattaa taaatgatgg tcaatattat tttaatgatg atggaattat gcaagttgga 6360
tttgtcacta taaatgataa agtcttctac ttctctgact ctggaattat agaatctgga 6420
gtacaaaaca tagatgacaa ttatttctat atagatgata atggtatagt tcaaattggt 6480
gtatttgata cttcagatgg atataaatat tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat 6540
atttacggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggtgaaga tgtatattat 6600
tttggagaaa catatacaat tgagactgga tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660
aaatattatt tcaatccaga aactaaaaaa gcatgcaaag gtattaattt aattgatgat 6720
ataaaatatt attttgatga gaagggcata atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat 6780
aataattatt actttaatga gaatggtgaa atgcaatttg gttatataaa tatagaagat 6840
aagatgttct attttggtga agatggtgtc atgcagattg gagtatttaa tacaccagat 6900
ggatttaaat actttgcaca tcaaaatact ttggatgaga attttgaggg agaatcaata 6960
aactatactg gttggttaga tttagatgaa aagagatatt attttacaga tgaatatatt 7020
gcagcaactg gttcagttat tattgatggt gaggagtatt attttgatcc tgatacagct 7080
caattagtga ttagtgaata g 7101
<210> 8
<211> 2366
<212> PRT
<213> Clostridium difficile strain 630
<400> 8
Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg
1 5 10 15
Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu
20 25 30
Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys
35 40 45
Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys
50 55 60
Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val
65 70 75 80
Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys
85 90 95
Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn
115 120 125
Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr
130 135 140
Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met
165 170 175
Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala
180 185 190
Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr
195 200 205
Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr
210 215 220
Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val
225 230 235 240
Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu
245 250 255
Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu
260 265 270
Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Asp Val Asp
275 280 285
Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro
290 295 300
Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile
305 310 315 320
Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp
325 330 335
Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser
340 345 350
Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala
355 360 365
Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn
370 375 380
Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val
385 390 395 400
Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro
405 410 415
Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile
420 425 430
Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met
435 440 445
Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr
450 455 460
Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp
465 470 475 480
Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala
485 490 495
Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr
500 505 510
Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys
515 520 525
Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly
530 535 540
Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly
565 570 575
Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu
580 585 590
Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe
595 600 605
Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly
610 615 620
Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile
625 630 635 640
Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp
645 650 655
Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser
660 665 670
Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro
675 680 685
Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr Ser
690 695 700
Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys
705 710 715 720
Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile
725 730 735
Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg
740 745 750
Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile
755 760 765
Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu
770 775 780
Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu
785 790 795 800
Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu
805 810 815
Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile
820 825 830
Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr
835 840 845
Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser
850 855 860
Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp
865 870 875 880
Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe
885 890 895
Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu
900 905 910
Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu
915 920 925
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu
930 935 940
Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn
945 950 955 960
Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu
965 970 975
Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln
980 985 990
Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val
995 1000 1005
Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro
1010 1015 1020
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly
1025 1030 1035
Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp
1040 1045 1050
Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala
1055 1060 1065
Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu
1070 1075 1080
Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly
1085 1090 1095
Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu
1100 1105 1110
Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser
1115 1120 1125
Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile
1130 1135 1140
Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn
1145 1150 1155
Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu
1160 1165 1170
Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe
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Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr
1190 1195 1200
Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp
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Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu
1220 1225 1230
Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr
1235 1240 1245
Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr
1250 1255 1260
Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu
1265 1270 1275
Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser
1280 1285 1290
Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile
1295 1300 1305
Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr
1310 1315 1320
Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu
1325 1330 1335
Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg
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Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile
1355 1360 1365
Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile
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1385 1390 1395
Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn
1400 1405 1410
Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu
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Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser Asn His Ile
1430 1435 1440
Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys
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Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly
1460 1465 1470
Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu
1475 1480 1485
Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys
1490 1495 1500
Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val
1505 1510 1515
Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys
1520 1525 1530
Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys
1535 1540 1545
Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala
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Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser
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Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile
1580 1585 1590
Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala
1595 1600 1605
Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe
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Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe
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Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln
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Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp
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Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr
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Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn
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<213> artificial
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atggtaacag gagtatttaa aggacctaat ggatttgagt attttgcacc tgctaatact 60
cacaataata acatagaagg tcaggctata gtttaccaga acaaattctt aactttgaat 120
ggcaaaaaat attattttga taatgactca aaagcagtta ctggatggca aaccattgat 180
ggtaaaaaat attactttaa tcttaacact gctgaagcag ctactggatg gcaaactatt 240
gatggtaaaa aatattactt taatcttaac actgctgaag cagctactgg atggcaaact 300
attgatggta aaaaatatta ctttaatact aacactttca tagcctcaac tggttataca 360
agtattaatg gtaaacattt ttattttaat actgatggta ttatgcagat aggagtgttt 420
aaaggaccta atggatttga atactttgca cctgctaata cggatgctaa caacatagaa 480
ggtcaagcta tactttacca aaataaattc ttaactttga atggtaaaaa atattacttt 540
ggtagtgact caaaagcagt taccggactg cgaactattg atggtaaaaa atattacttt 600
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tttaatacta acacttctat agcttcaact ggttatacaa ttattagtgg taaacatttt 720
tattttaata ctgatggtat tatgcagata ggagtgttta aaggacctga tggatttgaa 780
tactttgcac ctgctaatac agatgctaac aatatagaag gtcaagctat acgttatcaa 840
aatagattcc tatatttaca tgacaatata tattattttg gtaataattc aaaagcggct 900
actggttggg taactattga tggtaataga tattacttcg agcctaatac agctatgggt 960
gcgaatggtt ataaaactat tgataataaa aatttttact ttagaaatgg tttacctcag 1020
ataggagtgt ttaaagggtc taatggattt gaatactttg cacctgctaa tacggatgct 1080
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atatattact ttggtaataa ttcaaaagca gttactggat ggcaaactat taatggtaaa 1200
gtatattact ttatgcctga tactgctatg gctgcagctg gtggactttt cgagattgat 1260
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atgcataatt tgataactgg atttgtgact gtaggcgatg ataaatacta ctttaatcca 1380
attaatggtg gagctgcttc aattggagag acaataattg atgacaaaaa ttattatttc 1440
aaccaaagtg gagtgttaca aacaggtgta tttagtacag aagatggatt taaatatttt 1500
gccccagcta atacacttga tgaaaaccta gaaggagaag caattgattt tactggaaaa 1560
ttaattattg acgaaaatat ttattatttt gatgataatt atagaggagc tgtagaatgg 1620
aaagaattag atggtgaaat gcactatttt agcccagaaa caggtaaagc ttttaaaggt 1680
ctaaatcaaa taggtgatta taaatactat ttcaattctg atggagttat gcaaaaagga 1740
tttgttagta taaatgataa taaacactat tttgatgatt ctggtgttat gaaagtaggt 1800
tacactgaaa tagatggcaa gcatttctac tttgctgaaa acggagaaat gcaaatagga 1860
gtatttaata cagaagatgg atttaaatat tttgctcatc ataatgaaga tttaggaaat 1920
gaagaaggtg aagaaatctc atattctggt atattaaatt tcaataataa aatttactat 1980
tttgatgatt catttacagc tgtagttgga tggaaagatt tagaggatgg ttcaaagtat 2040
tattttgatg aagatacagc agaagcatat ataggtttgt cattaataaa tgatggtcaa 2100
tattatttta atgatgatgg aattatgcaa gttggatttg tcactataaa tgataaagtc 2160
ttctacttct ctgactctgg aattatagaa tctggagtac aaaacataga tgacaattat 2220
ttctatatag atgataatgg tatagttcaa attggtgtat ttgatacttc agatggatat 2280
aaatattttg cacctgctaa tactgtaaat gataatattt acggacaagc agttgaatat 2340
agtggtttag ttagagttgg ggaagatgta tattattttg gagaaacata tacaattgag 2400
actggatgga tatatgatat ggaaaatgaa agtgataaat attatttcaa tccagaaact 2460
aaaaaagcat gcaaaggtat taatttaatt gatgatataa aatattattt tgatgagaag 2520
ggcataatga gaacgggtct tatatcattt gaaaataata attattactt taatgagaat 2580
ggtgaaatgc aatttggtta tataaatata gaagataaga tgttctattt tggtgaagat 2640
ggtgtcatgc agattggagt atttaataca ccagatggat ttaaatactt tgcacatcaa 2700
aatactttgg atgagaattt tgagggagaa tcaataaact atactggttg gttagattta 2760
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acagcagaag catatatagg tttgtcatta ataaatgatg gtcaatatta ttttaatgat 3720
gatggaatta tgcaagttgg atttgtcact ataaatgata aagtcttcta cttctctgac 3780
tctggaatta tagaatctgg agtacaaaac atagatgaca attatttcta tatagatgat 3840
aatggtatag ttcaaattgg tgtatttgat acttcagatg gatataaata ttttgcacct 3900
gctaatactg taaatgataa tatttacgga caagcagttg aatatagtgg tttagttaga 3960
gttggggaag atgtatatta ttttggagaa acatatacaa ttgagactgg atggatatat 4020
gatatggaaa atgaaagtga taaatattat ttcaatccag aaactaaaaa agcatgcaaa 4080
ggtattaatt taattgatga tataaaatat tattttgatg agaagggcat aatgagaacg 4140
ggtcttatat catttgaaaa taataattat tactttaatg agaatggtga aatgcaattt 4200
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<212> PRT
<213> artificial
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Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala
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Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile Val Tyr
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Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr
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Gly Trp Gln Thr Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr
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Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr
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Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn
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Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu
145 150 155 160
Gly Gln Ala Ile Leu Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys
165 170 175
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Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val
195 200 205
Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn
210 215 220
Thr Ser Ile Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ile Ser Gly Lys His Phe
225 230 235 240
Tyr Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val
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Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly
305 310 315 320
Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Ile Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn
325 330 335
Gly Leu Pro Gln Ile Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr
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Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile
355 360 365
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370 375 380
Gly Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn Gly Lys
385 390 395 400
Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu
405 410 415
Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys
420 425 430
Ala Pro Gly Ile Tyr Gly Arg Ser Met His Asn Leu Ile Thr Gly Phe
435 440 445
Val Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly
450 455 460
Ala Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe
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Asn Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp
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Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp
1220 1225 1230
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1385 1390 1395
Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly
1400 1405 1410
Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly
1415 1420 1425
Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu
1430 1435 1440
Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys
1445 1450 1455
Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val
1460 1465 1470
Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln
1475 1480 1485
Leu Val Ile Ser Glu
1490
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<212> DNA
<213> artificial
<400> 19
atggtaacag gagtatttaa aggacctaat ggatttgagt attttgcacc tgctaatact 60
cacaataata acatagaagg tcaggctata gtttaccaga acaaattctt aactttgaat 120
ggcaaaaaat attattttga taatgactca aaagcagtta ctggatggca aaccattgat 180
ggtaaaaaat attactttaa tcttaacact gctgaagcag ctactggatg gcaaactatt 240
gatggtaaaa aatattactt taatcttaac actgctgaag cagctactgg atggcaaact 300
attgatggta aaaaatatta ctttaatact aacactttca tagcctcaac tggttataca 360
agtattaatg gtaaacattt ttattttaat actgatggta ttatgcagat aggagtgttt 420
aaaggaccta atggatttga atactttgca cctgctaata cggatgctaa caacatagaa 480
ggtcaagcta tactttacca aaataaattc ttaactttga atggtaaaaa atattacttt 540
ggtagtgact caaaagcagt taccggactg cgaactattg atggtaaaaa atattacttt 600
aatactaaca ctgctgttgc agttactgga tggcaaacta ttaatggtaa aaaatactac 660
tttaatacta acacttctat agcttcaact ggttatacaa ttattagtgg taaacatttt 720
tattttaata ctgatggtat tatgcagata ggagtgttta aaggacctga tggatttgaa 780
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aatagattcc tatatttaca tgacaatata tattattttg gtaataattc aaaagcggct 900
actggttggg taactattga tggtaataga tattacttcg agcctaatac agctatgggt 960
gcgaatggtt ataaaactat tgataataaa aatttttact ttagaaatgg tttacctcag 1020
ataggagtgt ttaaagggtc taatggattt gaatactttg cacctgctaa tacggatgct 1080
aacaatatag aaggtcaagc tatacgttat caaaatagat tcctacattt acttggaaaa 1140
atatattact ttggtaataa ttcaaaagca gttactggat ggcaaactat taatggtaaa 1200
gtatattact ttatgcctga tactgctatg gctgcagctg gtggactttt cgagattgat 1260
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1 5 10 15
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Asn Ile Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val
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Thr Ile Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly
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675 680 685
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1175 1180
71/168
Claims (24)
- 삭제
- 삭제
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- 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열로 구성된 분리된 폴리펩타이드와 약제학적으로 허용될 수 있는 담체 또는 부형제를 포함하는 면역원성 백신 조성물.
- 삭제
- 제 14항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩타이드는 분리된 폴리펩타이드로 백신접종된 햄스터가 102, 103 및 104 도즈의 C. 디피실 포자 치사용량 위장관 투여에도 100% 생존함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩타이드는 클로스트리디윰 디피실의 A 독소의 C-말단 도메인 유래의 19개의 반복 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩타이드는 클로스트리디윰 디피실의 B 독소의 C-말단 도메인 유래의 23개의 반복 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 분리된 폴리펩타이드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 조성물은 애쥬번트를 더욱 포함함을 특징으로 하는 조성물.
- 제 20항에 있어서, 상기 애쥬번트는 알루미늄염(alum)임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 조성물은 클로스트리디윰 디피실(Clostridium difficile) 관련 질환의 예방 및 치료용임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 조성물은 클로스트리디윰 디피실 관련 질환(CDAD)의 위험성이 있는 피험체에게 CDAD 예방을 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 CDAD의 위험성이 있는 피험체는 ⅰ) 65세보다 많은 피험체 또는 2세보다 어린 피험체; ⅱ) AIDS를 앓고 있는 피험체; ⅲ) 면역억제 약물을 섭취하거나 섭취할 계획이 있는 피험체; ⅳ) 입원 계획이 있는 피험체 또는 입원 중인 피험체; ⅴ) 중환자실에 있거나 중환자실로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅵ) 위장관 수술을 받거나 받을 계획이 있는 피험체; ⅶ) 요양원과 같은 장기간 치료시설에 있거나 이 치료시설로 이송될 것으로 예상되는 피험체; ⅷ) 빈번한 및/또는 장기간 항생제 사용을 요하는 병증질환을 앓고 있는 피험체; 또는 ⅸ) 재발성 CDAD 환자인 피험체임을 특징으로 하는 조성물.
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