CN117355328A

CN117355328A - 金黄色葡萄球菌疫苗组合物

Info

Publication number: CN117355328A
Application number: CN202280034397.9A
Authority: CN
Inventors: B·莫罗; S·康斯坦丁诺夫; J·戈尔特森; 罗金泉; S·索马尼; P·T·巴克利; V·J·托雷斯; J·T·普尔曼
Original assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc; New York University NYU
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc; New York University NYU
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2024-01-05

Abstract

本发明涉及用于诱导对象免疫应答以治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染的免疫原性组合物。本文公开的免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和金黄色葡萄球菌杀白细胞素A(LukA)和/或杀白细胞素B(LukB)变体多肽。本发明还涉及在对象中产生针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，其涉及施用所公开的免疫原性组合物。

Description

金黄色葡萄球菌疫苗组合物

本申请要求享有2021年4月2日提交的第63/170,089号美国临时专利申请和2021年9月28日提交的第63/249,452号美国临时专利申请的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及金黄色葡萄球菌免疫原性组合物，以及所述组合物在治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染的对象中诱导免疫应答的用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可引起广泛的侵袭性疾病，包括败血症、感染性心内膜炎和中毒性休克，以及较轻的皮肤和软组织感染(Tong等人，“Staphylococcus aureus Infections:Epidemiology,Pathophysiology,ClinicalManifestations,and Management,”Clin.Microbiol.Rev.28(3):603-661(2015))。目前，还没有疫苗被批准用于对抗金黄色葡萄球菌，并且治疗方案因新出现的抗生素耐药性而进一步受到限制(Sause等人，“Antibody-Based Biologics and Their Promise to CombatStaphylococcus aureus Infections,”Trends Pharmacol.Sci.37(3):231-241(2016))。金黄色葡萄球菌引起多种临床综合征的能力通常与基因组成分的重大变化有关(Copin等人，“After the Deluge:Mining Staphylococcus aureus Genomic Data for ClinicalAssociations and Host-Pathogen Interactions,”Curr.Opin.Microbiol.41:43-50(2018)和Recker等人，“Clonal Differences in Staphylococcus aureus Bacteraemia-Associated Mortality,”Nat.Microbiol.2(10):1381-1388(2017))。值得注意的是，所有的金黄色葡萄球菌分离株未共有大约40％的基因组(Bosi等人，“Comparative Genome-Scale Modelling of Staphylococcus aureus Strains Identifies Strain-SpecificMetabolic Capabilities Linked to Pathogenicity,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 113(26):E3801-3809(2016))，从而使疫苗和生物制剂生产中保守靶点的识别变得更加复杂。

本发明旨在克服本领域的这些和其他限制。

发明内容

本发明的第一方面涉及包含(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和(ii)金黄色葡萄球菌杀白细胞素A(LukA)变体多肽的免疫原性组合物。在替代方案中，本发明提供两种或两种以上组合物的组合，它们共同包含(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和(ii)金黄色葡萄球菌杀白细胞素A(LukA)变体多肽。

一方面，LukA变体多肽包含一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Lys83、Ser141、Val113和Val193。

本发明的其他方面涉及免疫原性组合物或两种或两种以上免疫原性组合物的组合，所述免疫原性组合物包含LukA变体多肽，所述LukA变体多肽包含一个或多个额外的对以上所述多肽的氨基酸取代、缺失和/或添加。

本发明的另一个方面涉及免疫原性组合物或两种或两种以上免疫原性组合物的组合，共同包含(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，(ii)金黄色葡萄球菌杀白细胞素A(LukA)变体多肽，以及(iii)金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽或其变体。

本发明的其他方面涉及免疫原性组合物或两种或两种以上免疫原性组合物的组合，包括一个或多个编码本文所述免疫原性组合物的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体、LukA变体多肽和LukB多肽或其变体的核酸分子。

本发明的另一方面涉及一种免疫原性组合物或两种或多种免疫原性组合物的组合，其包含一种或多种载体，所述载体包含编码本文所述免疫原性组合物的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体、LukA变体多肽、以及LukB多肽或其变体的一种或多种核酸分子。

本发明的另一方面涉及包含宿主细胞的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞包含本文所述的一个或多个核酸分子或载体。

本发明的另一方面涉及治疗或预防有需要的对象葡萄球菌感染的方法。所述方法涉及在有效治疗或预防所述对象葡萄球菌感染的条件下，向对象施用有效量的如本文所述免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

本发明的另一方面涉及一种在有需要的对象中引发对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法。所述方法涉及在有效引发所述对象对金黄色葡萄球菌产生免疫应答的条件下，向对象施用有效量的如本文所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

本发明的另一方面涉及一种在有需要的对象体内使葡萄球菌细菌去定植(decolonize)或防止其定植或再定植(recolonize)的方法。所述方法涉及在有效去定植或防止葡萄球菌细菌在对象中定植或再定植的条件下，向对象施用有效量的如本文所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

本发明的另一个方面涉及如本文所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合在对象中产生对金黄色葡萄球菌免疫应答的方法中的用途。

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是造成大量医院和小区获得性感染的原因。为了逃避免疫系统的清除，金黄色葡萄球菌采用多种策略。葡萄球菌蛋白A(SpA)是一种表面蛋白，是金黄色葡萄球菌的一个关键毒力因子，它至少具有两种促进感染相关的功能。首先，细菌表面的细胞壁锚定SpA与IgG的Fcγ-结构域结合，并使抗体丧失效应器功能。抗体被非特异性地“倒置”结合，从而保护葡萄球菌免受宿主免疫细胞的调理吞噬杀伤(opsonophagocytickilling，OPK)，并防止彻底(proper)清除。第二，SpA是一个关键的免疫逃逸决定因素，在金黄色葡萄球菌定植和感染期间阻止保护性免疫的形成。在定植和侵袭性疾病期间，释放的SpA交联VH3克隆B细胞受体，并触发非金黄色葡萄球菌特异性抗体分泌，这些抗体无法将葡萄球菌决定簇识别为抗原。这种B细胞超抗原活性(即释放的SpA的VH3结合活性)负责防止在定植或侵袭性疾病期间对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的形成。使用失去免疫球蛋白结合活性的SpA变体作为疫苗抗原，可诱导以下SpA特异性抗体：(1)通过Fcγ中和其结合IgG的能力，(2)通过VH3独特型重链对其结合IgG的能力进行中和，并使抗葡萄球菌免疫得以形成，(3)通过表面结合的SpA诱导调理吞噬清除。

葡萄球菌杀白细胞素A和B形成一种双组分毒素(LukAB)，在促进金黄色葡萄球菌感染方面具有不同的作用模式。LukAB是一种分泌毒素，与吞噬细胞结合后，聚集成孔，插入细胞膜，并溶解宿主细胞。这使得金黄色葡萄球菌能够逃脱中性粒细胞的攻击，并逃脱宿主的清除。通过LukA、LukB或LukAB类毒素免疫诱导的抗体会对LukAB毒素活性进行中和，从而使吞噬细胞存活下来，进而清除金黄色葡萄球菌。

包含这些抗原即SpA、LukA、LukB和LukAB的组合的免疫原性组合物会诱导对两种金黄色葡萄球菌毒力因子进行中和的抗体，并阻止金黄色葡萄球菌的两种独立关键逃逸机制，以使抗体介导的调理吞噬作用(opsonophagocytosis)生效。

附图简述

图1是15种不同的金黄色葡萄球菌LukA氨基酸序列的比对，包括克隆复合物(CC)8(SEQ ID NO:1)；CC45(SEQ ID NO:2)；CC30的HMPREF0772_044(TCH60)(SEQ ID NO:27)；CC30的SAR2108(MRSA252)(SEQ ID NO:36)；CC45的SALG_02329(A9635)(SEQ ID NO:34)；CC398的SAPIG2061(ST398)(SEQ ID NO:35)；CC10的SATG_01930(D139)(SEQ ID NO:37)；CC8的NEWMAN(SEQ ID NO:26)；CC151的SAB1876C(RF122)(SEQ ID NO:32)；CC5的SAV2005(Mu50)(SEQ ID NO:38)；CC5的SA1813(N315)(SEQ ID NO:31)；CC8的SACOL2006(SEQ IDNO:33)；CC7的HMPRE0776_0173USA300(TCH959)(SEQ ID NO:29)；CC72的HMPREF0774_2356TCH130(SEQ ID NO:28)；以及CC1的MW1942(MW2)(SEQ ID NO:30)的LukA。通过比较比对的序列后产生的多数LukA序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。本文所述氨基酸取代的位置也在每个LukA序列中被识别出来。

图2是14种不同的金黄色葡萄球菌LukB氨基酸序列的比对，包括LukB CC8(SEQ IDNO:15)；CC45(SEQ ID NO:16)；CC45的A9635(SEQ ID NO:40)；CC30的E1410(SEQ ID NO:43)；CC30的MRSA252(SEQ ID NO:45)；CC10的D139(SEQ ID NO:42)；CC5的Mu.50(SEQ IDNO:46)；CC239的JKD6008(SEQ ID NO:44)；CC8的COL(SEQ ID NO:41)；CC8的USA300_FPR3757(SEQ ID NO:115)；CC8的NEWMAN(SEQ ID NO:116)；CC151的RF122(SEQ ID NO:98)；CC1的MW2(SEQ ID NO:47)；以及CC72的TCH130(SEQ ID NO:99)的LukB。通过比较被比对的序列产生的多数LukB序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。本文所述氨基酸取代的位置也在每个LukB序列中被识别。

图3示出了用于免疫的不同LukAB变体的细胞毒性。用不同的LukAB变体滴定法对原代人类多形核白细胞(“PMN”)(n＝4)染毒1小时。用细胞滴度测定细胞活力。数据为4名捐赠者的平均值±SEM，在2个单独的实验中获得。

图4A–4B示出了在用不同LukAB变体免疫的小鼠中针对LukAB CC8或CC45的抗体滴度。Envigo Hsd:ND4(4周龄)小鼠(n＝5/抗原)皮下注射20μg LukAB和50μl 10％甘油1XTBS，并混合50μl佐剂Gold。一组5只小鼠也接受了模拟免疫，包括等量的10％甘油1X TBS和/>Gold。在对同一抗原-佐剂混合物进行两次加强(两次加强间隔为2周)后，通过心脏穿刺给小鼠放血并获得血清。将带有指定的免疫抗原的免疫小鼠的血清汇集并连续稀释，以测定CC8-LukAB(图4A)或CC45-LukAB(图4B)的抗体滴度。平板涂有2μg/ml CC8或CC45-LukAB。热图标出了重复测定的平均吸光度值。

图5提供了用不同的LukAB变体免疫的小鼠血清对各种LukAB毒素的中和情况。用0.156μg/ml(LD₉₀)的指定的LukAB变体对人PMN(n＝4)染毒(intoxication)1小时，在用指定的抗原进行免疫的小鼠的4-0.031％血清存在下进行。使用前，将带有指定的免疫抗原的免疫小鼠的血清汇集并热灭活。用细胞滴度测定细胞活力。热图标出了4名捐赠者的平均死亡细胞百分比，黑色代表没有细胞死亡，白色代表100％的细胞死亡。

图6A–6C是表格，其示出了在不存在或存在2％(图6A)、1％(图6B)和0.5％(图6C)小鼠血清的情况下，LukAB毒素序列变体LD₉₀染毒后死亡的人类多形核白细胞的百分比，这些小鼠血清来自用指定的抗原免疫的小鼠。数据以死亡细胞的百分比表示。没有阴影的细胞代表最低的细胞死亡，最深灰色阴影的细胞代表最高的细胞死亡。

图7A–7D示出了高浓度的LukAB RARPR-33染毒没有细胞毒性。从健康捐赠者(n＝4-6)新鲜分离的人PMN与不同浓度的LukAB变体孵育1小时。通过细胞滴度的吸光度测定细胞活力(图7A和7B)。通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对Triton X100处理的细胞进行标准化(设置为100％死亡)，计算死亡细胞的百分比。图中示出了平均值±SEM。将从健康捐赠者(n＝4-6)分离的人PMN与不同浓度的LukAB变体孵育2小时。LDH释放测定细胞活力(图7C和7D)。图中示出了平均值±SEM。

图8A–8D示出高浓度下LukAB RARPR-33和D39A/R23E类毒素染毒。从健康捐赠者(n＝5)新鲜分离的人PMN与不同浓度的LukAB变体孵育2小时。通过细胞滴度的吸光度测定细胞活力(图8A和8B)。通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对Triton X100处理的细胞进行标准化(设置为100％死亡)，计算死亡细胞的百分比。图中示出了平均值±SEM。从健康捐赠者(n＝5)分离的人PMN与不同浓度的LukAB变体孵育2小时。通过LDH释放测定细胞活力(图8C和8D)。图中示出了平均值±SEM。

图9示出了用两种不同的LukAB类毒素对各种LukAB毒素免疫的小鼠血清的中和情况。在用两种不同抗原免疫的小鼠的0.125％血清存在下，用0.156μg/ml(LD₉₀)的指定的LukAB毒素变体对人PMN(n＝4)染毒1小时。用这两种指定的免疫抗原免疫的小鼠血清在使用前被汇集并热灭活。用细胞滴度测定细胞活力。柱状图示出了4名不同捐赠者的平均值+SEM。采用非配对t检验确定统计显著性，P<0.05被认为是显著的*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。

图10是雄性哥廷根小型猪(Minipigs)免疫方案的示意图。哥根廷小型猪在3周内分别进行3次肌内免疫。在最终免疫后的三周，小型猪在SSI模型中接受金黄色葡萄球菌的攻毒(Challenge)。八天后，确定了细菌载量。图14B的表格提供了所测试实验组的概述。

图11A–11B示出了LukAB RARPR-33和Spa*+/-GLA-SE在小型猪SSI模型中的功效。小型猪在3周内分别进行3次肌内免疫。在最终免疫后的三周，小型猪在SSI模型中接受金黄色葡萄球菌的攻毒。八天后，确定了细菌载量。中层肌肉(图15A)和深层肌肉(图15B)中的细菌载量在金黄色葡萄球菌攻毒后八天显现。每个点代表一只小型猪，并示出几何平均值。虚线代表检测限。采用方差分析和Dunnett事后检验确定统计显著性，以校正多重比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图12是雄性哥廷根小型猪免疫方案的示意图。小型猪接受了三次肌肉内免疫，间隔3周。第三次免疫后的三周，在手术部位感染模型中，用10⁶CFU金黄色葡萄球菌对动物进行攻毒。攻毒后8天(第71天)在手术部位和脾脏中测定细菌载量。在几个时间点抽取血液并收集血清。该表示出了三个实验组的详细信息。

图13A–13C是示出LukAB RARPR-33和SpA*免疫原性的图表。用100μg LukABRARPR-33+100μg SpA*联合AS01b(25μg MPL和25μg QS-21)或10μg GLA-SE对哥廷根小型猪(n＝3)进行免疫。对照组接受抗原制剂缓冲液。每次免疫前和第三次免疫后的三周收集血清。通过ELISA测定对LukAB CC8(图13A)、LukAB CC45(图13B)或SpA*(图13C)的特异性。示出了EC₅₀滴度。每个点代表一只动物。各组的几何平均值±几何标准偏差被示出。虚线表示检测限，设置为30。低于此值的样本将被截尾(cencore)到30。在用LukAB RARPR-33+SpA*与AS01b或GLA-SE联合免疫的动物与缓冲液对照组之间进行三次免疫后，采用单向Tobit模型，通过Bonferroni校正进行多次比较，确定统计学意义，**P<0.01，***P<0.001，***<0.0001。

图14A–14D示出了疫苗诱导的抗体对LukAB进行了交叉中和。用100μg LukABRARPR-33+100μg SpA*联合AS01b(25μg MPL和25μg QS-21)或10μg GLA-SE对哥廷根小型猪(n＝3)进行免疫。对照组接受抗原制剂缓冲液。每次免疫前和第三次免疫后的三周收集血清。在免疫前后，在小型猪的连续稀释血清中，THP-1细胞与LukAB毒素的不同序列变体(CC8(图14A)、CC45(图14B)、CC22a(图14C)、CC398(图14D))一起孵育。代表血清样本和参考LukAB单克隆抗体之间IC₅₀滴度(观察到50％细胞毒性的血清稀释度)差异的相对效能滴度被示出。图示出了几何平均值±几何标准偏差。每个点代表一只动物。在用LukAB RARPR-33+SpA*与AS01b或GLA-SE联合免疫三次后，测定动物样本的统计显著性，并与缓冲液对照组进行比较。采用单因素方差分析和Dunnett事后检验对多重比较进行校正，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图15A–15C示出了用LukAB RARPR-33+SpA*与不同佐剂联合免疫并用金黄色葡萄球菌攻毒的动物的手术部位和脾脏的免疫反应的效力。用100μg LukAB RARPR-33和100μgSpA*免疫哥廷根小型猪(n＝3)，用AS01b(25μg MPL和25μg QS-21)或10μg GLA-SE佐剂。对照组只接受缓冲液。第三次免疫后的三周，在SSI模型中用10⁶CFU金黄色葡萄球菌CC398对动物进行攻毒。攻毒8天后，在手术部位的中层肌肉(图15A)、深层肌肉(图15B)和脾脏(图15C)测定细菌载量(Log10 CFU/g组织)。每个点代表一只动物。示出各组的几何平均值。采用方差分析和Dunnett事后检验确定统计显著性，以校正多重比较，*P<0.05，**P<0.01。

图16A是雄性哥廷根小型猪免疫方案的示意图。哥廷根小型猪在3周内分别进行3次肌内免疫。在最终免疫后的三周，小型猪在SSI模型中接受金黄色葡萄球菌的攻毒。八天后，确定了细菌载量。图16B的表格提供了所测试实验组的概述。

图16C–16D示出LukAB RARPR-33和Spa*在小型猪SSI模型中的功效。小型猪在3周内分别进行3次肌内免疫。在最终免疫后的三周，小型猪在SSI模型中接受金黄色葡萄球菌的攻毒。八天后，确定了细菌载量。金黄色葡萄球菌攻毒八天后的中层肌肉(图16C)和深层肌肉(图16D)中的细菌载量被示出。每个点代表一个小型猪，并示出几何平均值。虚线代表检测限。采用方差分析和Dunnett事后检验确定统计显著性，以校正多重比较，*P<0.05。

图17A是雄性哥廷根小型猪免疫方案的示意图。哥廷根小型猪在3周内分别进行3次肌内免疫。在最终免疫后的三周，小型猪在SSI模型中接受金黄色葡萄球菌的攻毒。八天后，确定了细菌载量。图17B的表格提供了所测试实验组的概述。

图17C–17D示出LukAB RARPR-33和SpA*在小型猪SSI模型中的效力。小型猪在3周内分别进行3次肌内免疫。在最终免疫后的三周，小型猪在SSI模型中接受金黄色葡萄球菌的攻毒。八天后，确定了细菌载量。金黄色葡萄球菌攻毒八天后的中层肌肉(图17C)和深层肌肉(图17D)中的细菌载量被示出。每个点代表一个小型猪，并示出几何平均值。虚线代表检测限。采用方差分析和Dunnett事后检验确定统计显著性，以校正多重比较，**P<0.01，**P<0.0001。

图18A-E示出了LukAB RARPR-33和SpA*与不同佐剂组合的免疫原性。实验设置如图18A所示，其中Swiss Webster小鼠在两周内分别接受3次皮下免疫，在指定的时间点采集血液。图18B所包含的组的概述。通过ELISA测定血清中对LukAB CC8(图18C)、LukAB CC45(图18D)或SpA*(图18E)的抗体特异性。示出了EC₅₀滴度。每个点代表一只动物。示出各组的几何平均值±几何标准偏差。虚线表示检测限，设置为30。低于此值的样本将被截尾(cencore)到30。

图19A和图19B分别示出了LukAB CC8和CC45毒素中和测定，所述测定是用来自第1-5组(如图18B所列)的5只小鼠的血清样本进行的，血清在最终免疫后的两周分离。代表血清样本和参考LukAB单克隆抗体之间IC₅₀滴度(观察到50％细胞毒性的血清稀释度)差异的相对效能滴度被示出。图示出了几何平均值±几何标准偏差。每个点代表一只动物。

发明详述

在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定组合物或方法，因为它们可能有所不同。还应理解，描述中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方案，并不旨在限制本文实施方案的范围，其将仅受所附申请专利范围的限制。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料可以用于本文实施方案的实施或测试中，但是现描述优选的方法、装置和材料。本文提及的所有出版物均以引用方式全部并入。本文中的任何内容均不得解释为承认本文中的实施方案已被先前的发明提前披露。

必须注意，如本文和所附申请专利范围中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。

除非另有说明，否则任何数值，如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述数值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则数字范围的使用明确包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括该范围内的整数和数值的分数。

除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员将仅使用常规实验来识别或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。此类等效物旨在包含于本发明中。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”“有(has)”、“有(having)”、“含(contains)”或“含(containing)”或其任何其他变体将被理解为包含所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，且旨在非排他或开放式。例如，包含元素列表的组合物、混合物、工艺、方法、物品或装置不一定仅限于这些元素，而是可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或装置固有的其他元素。此外，除非另有明确相反规定，“或”指的是包容性的“或”，而不是排他性的“或”。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)，B为假(或不存在)，A为假(或不存在)，B为真(或存在)，A和B均为真(或存在)。如本文所使用的，多个所述元素之间的连词“和/或”被理解为包含单个和组合选项。例如，当两个元素由“和/或”连接时，第一个选项指的是第一个元素的适用性，而不是第二个元素。第二个选项指的是第二个元素在没有第一个元素的情况下的适用性。第三种选择是指第一和第二种元素同时适用。这些选项中的任何一个都被理解为在含义范围内，因此满足本文所用术语“和/或”的要求。多个选项的同时适用性也被理解为在含义范围内，因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，本说明书和申请专利范围中使用的术语“由...组成(consists of)”或变体，如“由...组成(consist of)”或“由...组成(consisting of)”表示包含任何列举的整数或整数组，但不能向指定的方法、结构或组合中添加额外的整数或整数组。

如本文所用，术语“基本上由...组成(consists essentially of)”或在整个说明书和申请专利范围中使用的“基本上由...组成(consist essentially of)”或“基本上由...组成(consisting essentially of)”等变体表示包含任何列举的整数或整数组，以及可选地包含任何陈述的整数或整数组，这些整数或整数组不会实质性地改变指定方法、结构或组合的基本或新颖属性。

如本文所用，“对象”指任何动物，优选哺乳动物，最优选人类。本文使用的术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人类等，更优选人类。

还应理解，当提及优选发明的组件的尺寸或特征时，此处使用的术语“约”、“大约”、“一般”、“实质上”和类似术语，表示所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，并且不排除功能相同或类似的微小变化，应为本领域普通技术人员所理解。至少，包括数字参数的此类参考将包括使用本领域公认的数学和工业原理(例如，舍入、测定或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字。

在两个或多个核酸或多肽序列(例如，金黄色葡萄球菌LukA、LukB、SpA多肽和编码它们的多核苷酸)的上下文中，术语“相同”或百分比“相同性”指的是两个或多个相同的序列或子序列，或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行测定时，进行比较和比对以获得最大对应。

对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。

可以进行用于比较的最佳序列比对，通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过计算机实现这些算法(威斯康辛遗传学软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(一般见Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人，(Current Protocols,(1995Supplement))。

适用于确定百分比序列相同性和序列相似性的算法示例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获取。

除了计算序列相同性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见Karlin&Altschul，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性度量是最小和概率(P(N))，它指示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本相同的另一个表现是，由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽在免疫上发生交叉反应，如下所述。因此，一种多肽通常与第二种多肽基本相同，例如，两种多肽仅因保守取代而不同。两个核酸序列基本相同的另一个表现是，这两个分子在严格条件下相互杂交。

如本文所用，术语“多核苷酸”同义称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”，指任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、由单链和双链区域、单链和双链RNA混合而成的DNA，以及由单链和双链区域混合而成的RNA、由DNA和RNA组成的杂交分子，可以是单链，或者更典型地，双链或单链和双链区域的混合物。此外，“多核苷酸”指由RNA或DNA或RNA和DNA组成的三链区域。多核苷酸一词还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及为稳定性或其他原因而具有修饰的骨架的DNA或RNA。例如，“修饰的”碱基包括三酰化碱基和不常用碱基，如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括自然界中常见的化学、酶或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包含相对较短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

如本文所用，术语“载体”指的是，例如，任何数量的可插入所需序列的核酸，例如，限制和连接，用于在遗传环境之间传输或在宿主细胞中表达。核酸载体可以是DNA或RNA。载体包括但不限于质粒、噬菌体、噬菌体、细菌基因组、病毒基因组、自扩增RNA、复制子。

如本文所用，术语“宿主细胞”指包含本发明核酸分子的细胞。“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养中的细胞或细胞系中的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染或转导的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类转染或转导细胞的后代或潜在后代。细胞的子代可能与母细胞相同，也可能与母细胞不同，例如，由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响，或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

本文使用的术语“表达”指基因产物的生物合成。该术语包括将基因转录成RNA。该术语还包括将RNA翻译成一种或多种多肽，并进一步包括所有自然发生的转录后和翻译后修饰。表达的多肽可以位于宿主细胞的细胞质内，进入细胞外环境，如细胞培养的生长介质，或锚定在细胞膜上。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可指由氨基酸组成的分子，且本领域技术人员可将其识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用，以指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含改性氨基酸，并且可以被非氨基酸打断。这些术语还包括一种氨基酸聚合物，所述聚合物已通过自然或干预进行了修饰；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的缀合。定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。

本文所述的多肽序列是根据通常的惯例编写的，其中肽的N端区域位于左侧，C端区域位于右侧。尽管已知氨基酸的异构形式，但除非另有明确说明，否则代表的是氨基酸的L型。

术语“分离”可指基本上不含细胞材料、细菌材料、病毒材料或其来源的培养基(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其他化学品(化学合成时)的核酸或多肽。此外，分离的多肽是指可以作为分离的多肽给对象施用的多肽；换句话说，如果多肽粘附在柱上或嵌入凝胶中，则不能简单地认为它是“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不以片段形式自然产生的核酸或蛋白质片段和/或通常不处于功能状态的核酸或蛋白质片段。

如本文所用，短语“免疫反应”或其等效表达“免疫学反应”是指在受体对象中对本发明的蛋白质、肽、碳水化合物或多肽产生的体液(抗体介导的)、细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)或体液和细胞反应。这种反应可以是由免疫原诱导的主动反应，也可以是由抗体、含抗体材料或primed T细胞诱导的被动反应。通过呈递与I类或II类MHC分子相关的多肽表位，激活抗原特异性CD4(+)辅助性T细胞和/或CD8(+)细胞毒性T细胞，引发细胞免疫反应。这种反应还可能涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或其他先天免疫成分的激活。如本文所用，“主动免疫”指通过施用抗原而赋予对象的任何免疫。

本发明涉及适于引发对金黄色葡萄球菌免疫应答的免疫原性组合物。如本文所述，在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽和金黄色葡萄球菌杀白细胞素A(LukA)变体多肽。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽或其变体多肽。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌SpA蛋白和金黄色葡萄球菌LukB变体多肽。本发明进一步涉及在治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染中使用免疫原性组合物的用途和方法。

因此，在广义方面，本发明提供了一种组合物，其包括：

(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，和

(ii)金黄色葡萄球菌LukA变体多肽，所述LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Lys83、Ser141、Val113和Val193的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸取代。

在某些实施方案中，所述组合物进一步包含(iii)金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽或其变体。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含(iv)佐剂。

所述组合物的组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)可配制为单一产品，即作为单一组合物。或者，组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)可分别在单个组合物中或在包含两种或两种以上组分组合的组合物中配制。因此，在另一方面，本发明提供了两种或两种以上组合物的组合，其共同包括：

(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，和

在某些实施方案中，两种或两种以上组合物的组合进一步包含(iii)金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽或其变体。在某些实施方案中，所述两种或两种以上组合物的组合还包括(iv)佐剂。

在某些实施方案中，组合物的组合可在使用前组合成单个组合物。在其他实施方案中，所述组合物的组合用作将相互组合施用的单独组合物。

免疫原性组合物的金黄色葡萄球菌杀白细胞素A(LukA)多肽

一方面，本发明的免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌LukA变体多肽。合适的LukA变体多肽包含一个或多个氨基酸残基插入、取代和/或缺失，使含有这种LukA变体的LukAB双组分复合物无细胞毒性。LukA变体多肽还能使LukAB异二聚体稳定，提高熔融温度和/或增加异二聚体的溶解性。

在所有实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽可以是全长LukA蛋白的变体，其包含对应于全长成熟LukA蛋白序列的所有氨基酸残基。如本文所述，“成熟”杀白细胞素蛋白质序列是缺乏氨基末端分泌信号的杀白细胞素蛋白质序列，其通常包含氨基末端上的前27-28个氨基酸残基。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽可以是小于全长成熟LukA蛋白的变体。在任意实施方案中，变体LukA多肽的长度至少为100个氨基酸残基。在任意实施方案中，变体LukA多肽的长度为至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300个氨基酸残基。

尽管本文所述免疫原性组合物的示例性LukA变体蛋白质和多肽是克隆复合物CC8(SEQ ID NO:1)和CC45(SEQ ID NO:2)的变体LukA蛋白质(见下表1)，本领域技术人员将容易理解，在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的上下文中识别的LukA的氨基酸取代和/或缺失是在各种克隆复合物中保守的氨基酸残基，或在各种克隆复合物中高度保守的LukA区域内保守的氨基酸残基。事实上，来自15种不同金黄色葡萄球菌菌株的LukA蛋白序列的比对(见图1)表明，本文中鉴定为可以变异的氨基酸残基是在所有15种比对的LukA氨基酸序列中保守的残基。虽然已识别的变异残基在各个LukA序列之间的位置可能不同，但序列比对示出了这些位置之间的对应关系。为清楚起见，根据序列比对生成了具有SEQ ID NO:25氨基酸序列的LukA共有序列，并用于指定特定氨基酸变异的位置。例如，SEQ ID NO:25中第83位的赖氨酸残基的氨基酸取代对应于SEQ ID NO:1的LukA序列中80位的赖氨酸残基、SEQ ID NO:2的LukA序列中81位的赖氨酸残基以及SEQ ID NO:26–38的LukA序列中83位的赖氨酸残基。因此，本文所述的已识别氨基酸变体可普遍应用于现在或将来已知的任何LukA氨基酸序列的相应氨基酸残基。

根据本发明的这一方面，在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的残基Lys83、Ser141、Val113、Val193的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸残基插入、取代和/或缺失。在任意实施方案中，除了上述一个或多个氨基酸残基插入、取代和/或缺失之外，LukA变体多肽还包括对应于SEQ ID NO:25的Glu323的氨基酸残基处的氨基酸取代或缺失。在任意实施方案中，Glu323处的氨基酸取代或缺失包含SEQID NO:25的第323位处的谷氨酸到丙氨酸的取代(Glu323Ala)。

在任意实施方案中，LukA(以及本文所述的其他金黄色葡萄球菌蛋白质)的一个或多个鉴定位置处的氨基酸取代是保守取代。这种保守取代包括用一个氨基酸残基取代同一类别的另一个氨基酸残基，后者起到功能等效物的作用，造成静默改变。也就是说，相对于原生序列的变化不会明显削弱LukA的基本属性。这类氨基酸残基包括非极性(疏水)氨基酸(例如，丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸)；极性中性氨基酸(如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电的(碱性)氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电的(酸性)氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)。

在其他实施方案中，如本文所述的变体杀白细胞素或SpA多肽的一个或多个已鉴定位置处的氨基酸取代是非保守改变(即，破坏已识别区域的序列、结构、功能或活性的取代)。为了降低或减轻蛋白质的细胞毒性，这种替代可能是期望的。非保守取代是指将一个特定类别的氨基酸残基取代为另一类别的氨基酸残基。例如，用极性中性氨基酸取代非极性(疏水性)氨基酸残基，反之亦然。在另一个实施方案中，非保守取代涉及带正电(碱性)氨基酸残基与带负电(酸性)氨基酸残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)的取代，或反之亦然。这种分子改变可以通过本领域众所周知的方法实现，包括使用单链模板(Kunkel等人，Proc.Acad.Sci.,USA 82:488-492(1985)，通过引用将其全部并入本文)、双链DNA范本(Papworth等人，Strategies 9(3):3-4(1996)，通过引用将其全部内容并入本文)、和PCR克隆(Braman,J.(ed.),IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS,2nd ed.Humana Press,Totowa,N.J.(2002)，通过引用将其全部内容并入本文)。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukA变体多肽在与SEQ ID NO:25第83位赖氨酸对应的残基处包含赖氨酸到甲硫氨酸的取代(Lys83Met)。在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukA变体多肽在对应与SEQ ID NO:25第141位丝氨酸的残基处包含丝氨酸到丙氨酸的取代(Ser141Ala)。在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25第113位处的缬氨酸残基处包含缬氨酸到异亮氨酸的取代(Val113Ile)。在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25第193位处的缬氨酸残基处包含缬氨酸到异亮氨酸的取代(Val193Ile)。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽除了在任意实施方案中对应于SEQ ID NO:25的Lys83、Ser141、Val113和Val193的残基处的任何一个或多个取代之外，还在对应于SEQ ID NO:25的第323位谷氨酸残基的残基处包括谷氨酸到丙氨酸的取代(Glu323Ala)。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽包含一种蛋白质或其多肽，所述蛋白质或多肽在对应于SEQ ID NO:25的Lys83、Ser141、Val113和Val193的上述氨基酸残基处的两个具有氨基酸残基插入、取代和/或缺失。在任意实施方案中，LukA变体多肽包含在上述氨基酸残基的三个处的氨基酸残基插入、取代和/或缺失。在任意实施方案中，LukA变体多肽包含上述所有四个氨基酸残基处的氨基酸残基插入、取代和/或缺失。在任意实施方案中，LukA变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:25的Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile和Val193Ile的前述氨基酸残基处赖氨酸到甲硫氨酸、丝氨酸到丙氨酸、缬氨酸到异亮氨酸的氨基酸取代。在任意实施方案中，变体LukA蛋白质或其多肽进一步包含对应于SEQ ID NO:25的Glu323Ala的氨基酸取代，即变体LukA包含对应于SEQ ID NO:25的Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile和Glu323Ala的取代。

本文所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25中Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile和Glu323Ala的氨基酸取代。在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukA变体多肽为CC8 LukA变体，其包含选自SEQ ID NO:1中的Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile和Glu320Ala的任何一个或多个氨基酸取代。在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukA变体多肽为CC8 LukA变体，其包含对应于SEQID NO:1中Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile和Glu320Ala中每一个的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述LukA变体多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其包含与SEQ ID NO:2中的Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile和Glu321Ala相对应的任何一个或多个氨基酸取代。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:2中Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile和Glu321Ala中各个的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述LukA变体多肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。其他示例性变体LukA蛋白质包括SEQ ID NO:26–38的LukA蛋白质中的任何一种，其包含对应于SEQ ID NO:25中Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile和Glu323Ala的取代的氨基酸取代。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物的LukA变体多肽包含对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在一个实施方案中，上述一个或多个残基处的氨基酸取代引入能够形成二硫键的半胱氨酸残基，以稳定LukAB异二聚体结构的构象。例如，在一个实施方案中，本文所述的LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的Tyr74的氨基酸残基处包含酪氨酸到半胱氨酸的取代(Tyr74Cys)，并且在对应于SEQ ID NO:25的Asp140的氨基酸残基处包含天冬酰胺到半胱氨酸的取代(Asp140Cys)。第74和140位处的这些半胱氨酸残基形成二硫键，从而相对于野生型LukA或相对于本文所述的不包含能够形成二硫键的成对半胱氨酸残基的其他变体LukA蛋白质和多肽增加变体LukA的热稳定性。

在另一个实施方案中，本文所述的免疫原性组合物的LukA变体多肽在对应于SEQID NO:25的Gly149的氨基酸残基处包含甘氨酸到半胱氨酸的取代(Gly149Cys)，并且在对应于SEQ ID NO:25的Gly156的氨基酸残基处包含甘氨酸到半胱氨酸的取代(Gly156Cys)。这些在149和156位引入的半胱氨酸残基形成二硫键，从而提高变体LukA相对于野生型LukA或相对于本文所述的不含能够形成二硫键的成对半胱氨酸残基的其他变体LukA多肽的热稳定性。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的变体LukA多肽包含对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基处的每一个的氨基酸取代涉及如上所述引入半胱氨酸残基。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的变体LukA多肽包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基Tyr71、Asp137、Gly146和Gly153的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基中的每一个的氨基酸取代涉及如上所述引入半胱氨酸残基。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的变体LukA多肽包含对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基Tyr72、Asp138、Gly147和Gly154的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基中的每一个的氨基酸取代涉及如上所述引入半胱氨酸残基。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的变体LukA蛋白质或多肽包含对应于Lys83、Ser141、Val113、Val193和Glu323的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代，以及对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，变体LukA多肽包含对应于SEQ ID NO:25的残基Lys83、Ser141、Val113、Val193和Glu323以及残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156处的氨基酸残基的氨基酸取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC8 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的Lys80、Ser138、Val110、Val190、Glu320、Tyr71、Asp137、Gly146和Gly153中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukA变体多肽是CC8 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile、Glu320Ala、Tyr71Cys、Asp137Cys、Gly146Cys和Gly153Cys中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，所述CC8 LukA变体多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的Lys81、Ser139、Val111、Val191、Glu321、Tyr72、Asp138、Gly147和Gly154中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile、Glu321Ala、Tyr72Cys、Asp138Cys、Gly147Cys和Gly154Cys中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在一些实施方案中，所述CC45 LukA变体多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

所述免疫原性组合物的其他示例性LukA变体多肽包括SEQ ID NO:26–38的LukA蛋白质中的任何一种，其包含对应于SEQ ID NO:25的Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile、Glu323Ala、Tyr74Cys、Asp140Cys、Gly149Cys和Gly156Cys的氨基酸取代。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物的LukA变体多肽在对应于SEQID NO:25的氨基酸残基Thr249的氨基酸残基处包含氨基酸取代或缺失。在任意实施方案中，LukA变体包含对应于Thr249的残基处的取代，其中所述取代是该残基处的苏氨酸对缬氨酸的取代(Thr249Val)。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物的LukA变体蛋白质或多肽包括与SEQ ID NO:25的Thr249相对应的氨基酸残基处的氨基酸取代，以及本文所述的任何一种其他氨基酸残基取代，即与SEQ ID NO:25的Lys83、Ser141、Val113、Val193、Glu323 Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156相对应的残基处的取代。在任意实施方案中，本文所述的LukA变体蛋白质或多肽包含对应于SEQ ID NO:25的Thr249的氨基酸残基处的氨基酸取代，以及本文所述的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或所有九个其他氨基酸残基取代。在任意实施方案中，变体LukA蛋白质或多肽包含对应于SEQ IDNO:25的Lys83、Ser141、Val113、Val193、Glu323和Thr249的各个残基处的氨基酸取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC8 LukA变体多肽，其单独在残基Thr246处具有氨基酸取代，或在残基Thr246处具有氨基酸取代与对应于SEQ ID NO:1的Lys80、Ser138、Val110、Val190和Glu320中的每一个的任何一个或多个氨基酸取代组合。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC8LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的Lys80、Ser138、Val110、Val190、Glu320和Thr246中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukA变体多肽是CC8LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile、Glu320Ala和Thr246Val中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在一个实施方案中，示例性LukA变体多肽在对应于上述各个位置的残基处具有氨基酸取代，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其仅在残基Thr247处具有氨基酸取代，或在残基Thr247处具有氨基酸取代与对应于SEQ ID NO:2的Lys81、Ser139、Val111、Val191和Glu321中的每一个的任何一个或多个氨基酸取代组合。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC45LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的Lys81、Ser139、Val111、Val191、Glu321和Thr247中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukA变体多肽是CC45LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile、Glu321Ala和Thr247Val中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在一个实施方案中，在对应于上述各个位置的残基处具有氨基酸取代的示例性LukA变体多肽具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

所述免疫原性组合物的其他示例性变体LukA蛋白质包括SEQ ID No:26–38的LukA蛋白质中的任何一种，其在对应于SEQ ID NO:25的Lys83、Ser141、Val113、Val193、Glu323和Thr249的氨基酸残基处包含所述氨基酸取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的变体LukA蛋白质或多肽包含对应于SEQ ID NO:25的Lys83、Ser141、Val113、Val193、Glu323、Thr249、Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的各个残基处的氨基酸取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC8 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的Lys80、Ser138、Val110、Val190、Glu320、Tyr71、Asp137、Gly146、Gly153和Thr246中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukA变体多肽是CC8 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:1的Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile、Glu320Ala、Tyr71Cys、Asp137Cys、Gly146Cys、Gly153Cys和Thr246Val中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在一个实施方案中，示例性LukA变体多肽在对应于上述各个位置的残基处具有氨基酸取代，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的示例性LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的Lys81、Ser139、Val111、Val191、Glu321、Tyr72、Asp138、Gly147、Gly154和Thr247中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukA变体多肽是CC45 LukA变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:2的Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile、Glu321Ala、Tyr72Cys、Asp138Cys、Gly147Cys、Gly154Cys和Thr247Ala中的每一个的残基处具有氨基酸取代。在一个实施方案中，在对应于上述各个位置的残基处具有氨基酸取代的示例性LukA变体多肽具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

所述免疫原性组合物的其他示例性变体LukA蛋白质包括SEQ ID NO:26–38的LukA蛋白质中的任何一种，所述蛋白包含所述对应于SEQ ID NO:25的Lys83、Ser141、Val113、Val193、Glu323、Thr249、Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156残基的氨基酸取代。

下表1提供了本文所公开的免疫原性组合物的示例性变体LukA氨基酸序列。

表1.示例性LukA多肽氨基酸序列

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免疫原性组合物的金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽

在一些方面，本发明的免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)蛋白质或多肽。在任意实施方案中，所述金黄色葡萄球菌LukB蛋白质或多肽是野生型蛋白质或多肽。合适的LukB多肽包括本文公开的LukB多肽中的任何一种，例如，具有选自SEQ IDNO:15、16和39-51的任何氨基酸序列的多肽。在任意实施方案中，所述LukB多肽为CC8 LukB多肽。合适的CC8 LukB多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述LukB多肽为CC45 LukB多肽。一种合适的CC45 LukB多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

在任意实施方案中，本文公开的免疫原性组合物的LukB多肽包含LukB变体多肽。合适的LukB变体多肽包含一个或多个氨基酸残基插入、取代和/或缺失，其可提高LukB稳定性，从而有助于LukB类毒素稳定性。如本文所述，这些变体LukB蛋白质和多肽是理想的候选疫苗抗原，其可与SpA多肽单独或与杀白细胞素A(LukA)变体蛋白质或多肽组合包含在免疫原性组合物中。当所述免疫原性组合物包含LukB和LukA多肽的组合时，产生的类毒素模拟金黄色葡萄球菌LukAB毒素的结构，从而促进产生针对金黄色葡萄球菌最有效毒素之一的强大免疫应答。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukB变体多肽是全长LukB蛋白质的变体，包含对应于全长成熟LukB蛋白质序列的所有氨基酸残基。在任意实施方案中，所述LukB变体多肽是小于全长成熟LukB蛋白质的变体。在任意实施方案中，所述变体LukB多肽的长度至少为100个氨基酸残基。在任意实施方案中，所述变体LukB多肽的长度为至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300个氨基酸残基。

本文所述的示例性LukB变异蛋白质和多肽是克隆复合物CC8(SEQ ID NO:15)和CC45(SEQ ID NO:16)的变异LukB蛋白质(见下表2)，本领域技术人员将容易理解，在SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16的背景下鉴定的LukB的氨基酸取代和/或缺失是在各种克隆复合物中保守的氨基酸残基或在各种克隆复合物中高度保守的LukB区域内保守的氨基酸残基。来自14种不同金黄色葡萄球菌菌株的LukB蛋白质序列的比对(见图2)表明，本文中鉴定为进行变异的残基的氨基酸残基是在所有14种比对的LukB氨基酸序列中保守的残基。虽然已鉴定的变异残基的位置在各个LukB序列之间可能不同，但序列比对示出了这些位置之间的对应关系。为清楚起见，根据序列比对生成了具有SEQ ID NO:39氨基酸序列的LukB共有序列，并用于指定特定氨基酸变异的位置。例如，SEQ ID NO:39中谷氨酸残基109处的氨基酸取代对应于SEQ ID NO:15、42、44和46–51的LukB序列中109位的谷氨酸残基，SEQ ID NO:16、40、43和45的LukB序列中110位的谷氨酸残基，以及SEQ ID NO:41的LukB序列中60位的谷氨酸残基。因此，本文所述的已鉴定氨基酸变体可普遍应用于现在或将来已知的任何LukB氨基酸序列中的相应氨基酸残基。

在任意实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物的合适LukB变体多肽在对应于SEQ ID NO:39的氨基酸残基Val53的氨基酸残基处包含氨基酸取代或缺失。在任意实施方案中，Val53处的氨基酸取代包括缬氨酸到亮氨酸(Val53Leu)取代。在任意实施方案中，一种示例性LukB变体多肽包含对应于SEQ ID NO:39中Val53Leu取代的取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukB变体多肽为CC8 LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:15的第53位的氨基酸位置处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukB变体多肽是CC8 LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:15的第53位的位置处具有缬氨酸到亮氨酸氨基酸取代。在任意实施方案中，在第53位处具有缬氨酸到亮氨酸取代的示例性CC8 LukB序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性LukB变体多肽为CC45 LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:16的第53位的氨基酸位置处具有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性LukB变体多肽是CC45 LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:16的第53位的位置处具有缬氨酸到亮氨酸氨基酸取代。包含缬氨酸到亮氨酸取代的示例性LukB变体多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

其他示例性变体LukB蛋白质包括SEQ ID NO:40–51的任何一种LukB蛋白质，其包含对应于Val53Leu的氨基酸取代。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物的LukB变体多肽包含一个或多个对应于SEQ ID NO:39的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，在上述一个或多个残基处的氨基酸取代引入了能够形成二硫键以稳定LukAB异二聚体结构构象的半胱氨酸残基。例如，在一个实施方案中，本文所述的LukB变体蛋白质或多肽在对应于SEQ ID NO:39的Glu45的氨基酸残基处包含谷氨酸到半胱氨酸的取代(Glu45Cys)，并且在对应于SEQ ID NO:39的Thr121的氨基酸残基处包含苏氨酸到半胱氨酸的取代(Thr21Cys)。第45和121位处的这些半胱氨酸残基形成二硫键，从而提高变体LukB相对于野生型LukB或相对于本文所述的其他变体LukB蛋白质和多肽(不含能够形成二硫键的成对半胱氨酸残基)的热稳定性。

在任意实施方案中，本文所述免疫原性组合物的LukB变体蛋白质或多肽在对应于SEQ ID NO:39的Glu109的氨基酸残基处包含谷氨酸到半胱氨酸的取代(Glu109Cys)，并且在对应于SEQ ID NO:39的Arg154的氨基酸残基处包含精氨酸到半胱氨酸的取代(Arg154Cys)。这些在109和154位置引入的半胱氨酸残基形成二硫键，从而相对于野生型LukB或相对于本文所述的不包含能够形成二硫键的成对半胱氨酸残基的其他变体LukB蛋白质和多肽增加变体LukB的热稳定性。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukB变体多肽是CC8 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，免疫原性组合物的LukB变体多肽是CC8 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基中的每一个的氨基酸取代涉及如上所述引入半胱氨酸残基。在任意实施方案中，在对应于Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的残基处包含半胱氨酸氨基酸取代的示例性LukB变体多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物的LukB变体多肽包含一个或多个对应于SEQ ID NO:16氨基酸残基Glu45、Glu110、Thr122和Arg155的氨基酸残基的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukB变体多肽是CC45 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基Glu45、Glu110、Thr122和Arg155的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基中的每一个的氨基酸取代涉及如上所述引入半胱氨酸残基。在任意实施方案中，在对应于Glu45、Glu110、Thr122和Arg155的残基处包含半胱氨酸氨基酸取代的示例性LukB变体多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，如本文所公开的免疫原性组合物的LukB变体多肽包括与SEQID NO:39的Val53对应的氨基酸残基处的氨基酸取代，以及与SEQ ID NO:39的Glu45、Glu109、Thr121和Arg154对应的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述LukB变体多肽是CC8 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸残基Val53、Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述LukB变体多肽是CC8 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸残基Val53Leu、Glu45Cys、Glu109Cys、Thr121Cys和Arg154Cys的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性CC8 LukB变体多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的LukB变体多肽是CC45 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基Val53、Glu45、Glu110、Thr122和Arg155的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述LukB变体多肽是CC45 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基Val53Leu、Glu45Cys、Glu110Cys、Thr123Cys和Arg155Cys的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性CC45 LukB变体多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

免疫原性组合物的其他示例性LukB变体多肽包括SEQ ID NO:40–51的LukB蛋白质中的任何一种，其包含SEQ ID NO:39的对应于SEQ ID NO:39的Val53、Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的残基的所述的氨基酸取代。

下表2提供了本文所公开的免疫原性组合物的示例性变体LukB氨基酸序列。

表2.示例性LukB多肽氨基酸序列

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免疫原性组合物的葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽

本文所述的免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌蛋白A多肽。“蛋白A”或“SpA”在本文中互换使用，指金黄色葡萄球菌的细胞壁锚定表面蛋白，其功能是使细菌逃避受感染宿主的固有和适应性免疫反应。蛋白A可以在Fc部分结合免疫球蛋白，可以与B细胞受体的V_H3结构域相互作用，适当刺激B细胞增殖和凋亡，可以结合血管性血友病因数A1结构域以激活细胞内凝血，还可以结合TNF受体1以促进葡萄球菌肺炎的发病机制。

大多数金黄色葡萄球菌菌株表达蛋白A(SpA)的结构基因，该蛋白是一种具有良好特征的毒力因子，其细胞壁锚定表面蛋白产物(SpA)包含五个高度同源的免疫球蛋白结合结构域，分别命名为E、D、A、B和C。免疫球蛋白域在氨基酸水平上示出约80％的相同性，长度为56到61个残基，并被组织成串联重复。每个免疫球蛋白结合结构域都由反平行α螺旋组成，它们组装成一个三螺旋束，并结合免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域、IgM的V_H3重链(Fab)、A1结构域的血管性血友病因数和肿瘤坏死因数α(TNF-α)受体1(TNFR1)。

SpA通过结合IgG的Fc成分阻止中性粒细胞吞噬葡萄球菌。此外，SpA能够通过结合血管性血友病因数A1结构域激活血管内凝血。血浆蛋白，如纤维蛋白原和纤维连接蛋白，在葡萄球菌(ClfA和ClfB)和血小板整合素GPIIb/IIIa之间起桥梁作用，这种活性通过与vWFA1的SpA结合得到补充，使葡萄球菌能够通过GPIb-α血小板受体捕获血小板。SpA还结合TNFR1，这种相互作用有助于葡萄球菌肺炎的发病机制。SpA通过TNFR1介导的TRAF2、p38/c-Jun激酶、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Rel转录因子NF-κB激活促炎信号传导。SpA结合进一步诱导TNFR1脱落，这种活性似乎需要TNF转化酶(TACE)。每个公开的活性都通过五个IgG结合结构域介导，并且可以被相同的氨基酸取代所干扰，最初由其对蛋白质A和人类IgG1之间相互作用的需要来定义(Cedergren等人，(1993))。

SpA还通过捕获携带V_H3的IgM(B细胞受体)的Fab区，发挥B细胞超抗原的作用。静脉注射后，葡萄球菌SpA突变表现出器官组织中的葡萄球菌负荷减少，形成脓肿的能力显著降低。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA多肽为野生型(非变体)SpA多肽。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E IgG结构域。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含至少一个SpA A结构域。在任意实施方案中，所述SpA A结构域包含SEQ ID NO:55或48的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含至少一个SpA B结构域。在任意实施方案中，所述SpA B结构域包含SEQ ID NO:56或49的氨基酸序列。在任意实施方案中，SpA多肽包含至少一个SpA C结构域。在任意实施方案中，所述SpA C结构域包含SEQ ID NO:57或50的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含至少一个SpA D结构域。在任意实施方案中，所述SpA D结构域包含SEQ ID NO:58或51的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含至少一个SpA E结构域。在任意实施方案中，所述SpA E结构域包含SEQ ID NO:59或52的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含至少两个SpA IgG结构域、至少三个SpA IgG结构域、至少四个SpA IgG结构域或所有五个SpA IgG结构域。在任意实施方案中，所述SpA多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的序列。下面的表3提供了示例性SpA结构域和全长序列。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的SpA多肽为SpA变体多肽。如本文所述，术语“蛋白质A变体”、“SpA变体”、“蛋白质A变体多肽”和“SpA变体多肽”是指包括SpA IgG结构域的多肽，该结构域具有至少一个会破坏与Fc和VH3结合的氨基酸取代。在某些实施方案中，所述SpA变体多肽包括变体A结构域、变体B结构域、变体C结构域、变体D结构域和/或变体E结构域。合适的SpA变体多肽包括无毒且刺激对葡萄球菌细菌蛋白A和蛋白A样蛋白和/或表达这样的蛋白的细菌的免疫应答的那些变体及其片段。

本文描述的SpA变体多肽不与免疫球蛋白结合，因此是野生型SpA多肽的非细胞毒性变体。SpA变异多肽无毒，可刺激体液免疫反应，防止葡萄球菌感染和疾病。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽是包含至少一个变体E、D、A、B或C结构域的全长SpA变体。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含与SEQ ID NO:60或61的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含全长SpA多肽的片段。所述SpA变体多肽片段可包含1、2、3、4、5或更多个IgG结合结构域。例如，IgG结合结构域可以是1、2、3、4、5或更多个变体A、B、C、D和/或E结构域。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含1、2、3、4、5或更多个变体A结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含1、2、3、4、5或更多个变体B结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含1、2、3、4、5或更多个变体C结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含1、2、3、4、5或更多个变体D结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含1、2、3、4、5或更多个变体E结构域。

在任意实施方案中，例如，所述SpA变体多肽的变体A结构域包含SEQ ID NO:55或48的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸取代。例如，变体B结构域包含SEQ ID NO:56或49的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸取代。例如，变体C结构域包含SEQ ID NO:57或50的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸取代。例如，变体D结构域包含SEQ ID NO:58或51的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸取代。例如，变体E结构域包含SEQ ID NO:59或52的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸取代。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体E、D、A、B和/或C结构域，其包含分别与SEQ ID NO:59或52、SEQ ID NO:58或51、SEQ ID NO:55或48、SEQ IDNO:56或49以及SEQ ID NO:57或50具有75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含变体E结构域，该结构域包含SEQ IDNO:59的氨基酸第6、7、33和/或34位处的取代。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含变体D结构域，该结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸第9、10、36和/或37位处的取代。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体A结构域，该结构域包含SEQ IDNO:55的氨基酸第7、8、34和/或35位处的取代。在任意实施方案中所述，SpA变体多肽包含变体B结构域，该结构域包含SEQ ID NO:56的氨基酸第7、8、34和/或35位处的取代。在任意实施方案中，SpA变体多肽包含变体C结构域，该结构域包含SEQ ID NO:57的氨基酸第7、8、34和/或35位处的取代。变体E、D、A、B和/或C结构域中的氨基酸取代在WO2011/005341和WO2020232471中进行了描述，通过引用将其全部并入本文。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SpA结构域D的IgGFc结合子结构域中，和/或在其他IgG结构域中的相应氨基酸位置的一个或多个氨基酸取代。一个或多个氨基酸取代可破坏或减少SpA变体多肽与IgG Fc的结合。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽进一步包含SpA结构域D的V_H3结合子结构域，和/或在其他IgG结构域中的相应氨基酸位置的一个或多个氨基酸取代。一个或多个氨基酸取代可以破坏或减少与V_H3的结合。

上述SpA结构域D中的氨基酸取代(即IgG Fc亚结构域结合区或VH3结合亚结构域中的取代)可在SpA A、B、C和/或E结构域对应位置处并入各个结构域。通过SpA结构域D与SpA结构域A、B、C和/或E的比对来定义相应的位置，以确定SpA结构域A、B、C和/或E的哪些残基对应于变体SpA D残基。例如，SpA结构域D的SEQ ID NO:58中第9位处的谷氨酰胺残基的氨基酸取代对应于SpA结构域A的SEQ ID NO:55中第7位处的谷氨酰胺残基，SpA结构域B的SEQ ID NO:56中第7位处的谷氨酰胺残基，SpA结构域C的SEQ ID NO:57中第7位处的谷氨酰胺残基，以及SpA结构域E的SEQ ID NO:59中第6位处的谷氨酰胺残基。因此，本文所述的已识别氨基酸变体可普遍应用于现在或将来已知的任何SpA结构域氨基酸序列的相应氨基酸残基。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包括(a)SpA结构域D的IgG Fc结合子结构域，和/或在其他IgG结构域中的相应氨基酸位置的一个或多个氨基酸取代；和(b)SpA结构域D的V_H3结合子结构域，和/或其他IgG结构域中的相应氨基酸位置的一个或多个氨基酸取代。一个或多个氨基酸取代减少SpA变体多肽与IgG Fc和V_H3的结合，从而使SpA变体多肽降低或消除了宿主生物体中的毒性。

在任意实施方案中，对SEQ ID NO:58的SpA D结构域的IgG Fc结合子结构域的氨基酸残基F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35进行修饰或取代，以减少或消除与IgG Fc的结合。在任意实施方案中，相应的修饰被并入SpA、B、C和/或E域中。通过将SpA结构域D与SpA结构域A、B、C和/或E比对来定义相应的位置，以确定SpA结构域A、B、C和/或E中与SpA结构域D中感兴趣的残基相对应的残基。

在任意实施方案中，对SEQ ID NO:58的SpA D结构域的VH3结合子结构域的氨基酸残基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47进行修饰或取代，以减少或消除与VH3的结合。相应的修饰可并入SpA A、B、C和/或E域中。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个变体D结构域。变体D结构域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基取代或修饰。例如，氨基酸残基取代或修饰可以发生在SpA结构域D(SEQ ID NO:58)的IgGFc结合子结构域的氨基酸残基F5、Q9、Q10、S11、F13、Y14、L17、N28、I31和/或K35和/或SpA结构域D(SEQ ID NO:58)的V_H3结合子结构域的氨基酸残基Q26、G29、F30、S33、D36、D37、Q40、N43和/或E47处。在任意实施方案中，氨基酸残基取代或修饰位于SEQ ID NO:58的氨基酸残基Q9和Q10处。在任意实施方案中，氨基酸残基取代或修饰位于SEQ ID NO:58的氨基酸残基D36和D37处。WO2011/005341中描述了变体A、B、C、D和/或E结构域中的氨基酸取代，通过引用将其全部并入本文。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的SpA变体多肽包含一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:53或72具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(但不是100％)的序列相同性。在任意实施方案中，SpA变体多肽包含与SEQ ID NO:53或72具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:53或72的至少n个连续氨基酸的片段，其中n为至少7、至少8、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150，至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个或至少425个氨基酸。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽可包含从SEQ ID NO:72的羧基(C)末端缺失一个或多个氨基酸(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30或35个氨基酸)和/或从氨基酸(N)末端缺失一个或多个氨基酸(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30或35个氨基酸)。在任意实施方案中，缺失最后35个C端氨基酸。在某些实施方案中，缺失前36个N端氨基酸。在任意实施方案中，SpA变体多肽包含SEQ ID NO:72的第37至327位氨基酸残基。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含所有五个SpA IgG结合结构域，其从N端到C端排列，依次包含E结构域、D结构域、A结构域、B结构域和C结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽连续包含SpA的E、D、A、B和C结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含1、2、3、4或5个天然E、D、A、B和/或C结构域。在缺失1、2、3、4或5个天然结构域的实施方案中，所述SpA变体多肽可防止B细胞过度膨胀和凋亡(如果SpA作为B细胞超抗原发挥作用，则可发生过度膨胀和凋亡)。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽仅包含SpA E结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽仅包含SpA D结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽仅包含SpA A结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽仅包含SpAB结构域。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽仅包含SpA C结构域。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含相对于SEQ ID NO:72的十一(11)个二肽序列重复中的至少一个的突变(例如，QQ二肽重复和/或DD二肽重复)。举例来说，包含SEQ ID NO:73的SpA变体多肽氨基酸序列，其中在氨基酸第7和8、34和35、60和61、68和69、95和96、126和127、153和154、184和185、211和212、242和243、269和270位的XX二肽重复被取代以降低SpA变体多肽对免疫球蛋白的亲和力。Gln-Gln(QQ)二肽的有用二肽取代可包括但不限于Lys-Lys(KK)、Arg-Arg(RR)、Arg-Lys(RK)、Lys-Arg(KR)、Ala-Ala(AA)、Ser-Ser(SS)、Ser-Thr(ST)和Thr-Thr(TT)二肽。优选地，用KR二肽取代QQ二肽。Asp-Asp(DD)二肽的有用二肽取代可包括但不限于Ala-Ala(AA)、Lys-Lys(KK)、Arg-Arg(RR)、Lys-Arg(KR)、His-His(HH)和Val-Val(VV)二肽。例如，二肽取代可以降低SpA变体多肽对人IgG的Fc部分和含有V_H3的人B细胞受体的Fab部分的亲和力。

因此，在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽可包含SEQ ID NO:78，其中11个XX二肽重复序列中一个或多个，优选全部被不同于SEQ ID NO:72的对应二肽的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含SEQ ID NO:79，其中第60和61位处的氨基酸双链分别为Lys和Arg(K和R)。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含SEQ IDNO:80或SEQ ID NO:81。在某些实施方案中，所述SpA变体多肽包含SEQ ID NO:75，其中SEQID NO:75的优选示例为SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77(SEQ ID NO:77为带有N端甲硫氨酸的SEQ ID NO:76)。

在任意实施方案中，所述SpA变体多肽N端包含SEQ ID NO:72的前36个氨基酸的缺失，C端包含SEQ ID NO:72的最后35个氨基酸的缺失。包含SEQ ID NO:72的36个氨基酸的N端缺失和SEQ ID NO:72的35个氨基酸的C端缺失的SpA变体多肽可进一步包含第五Ig结合结构域的缺失(即，SEQ ID NO:72的Lys-327的下游)。所述SpA变体包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，其中XX二肽可被氨基酸取代，使得氨基酸不同于SEQ ID NO:72中的相应二肽序列。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽包含SEQ ID NO:74。

如上文所述，在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含1、2、3或4个天然A、B、C、D和/或E结构域。例如，所述SpA变体多肽可仅包含SpA E结构域，而不包含D、A、B或C结构域。因此，所述SpA变体多肽可包含变体SpA E结构域，其中SpA E结构域包含SEQ ID NO:83的至少一个氨基酸残基的取代。例如，所述取代可以位于SEQ ID NO:83的氨基酸第60和61位处。在任意实施方案中，SpA变体多肽可包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82。在任意实施方案中，所述SpA变体多肽可包含具有至少一个氨基酸取代的SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82。SpA变体多肽在WO2015/144653中有描述，通过引用将其全部并入本文。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SEQ ID NO:84的氨基酸43Q、44Q、96Q、97Q、162Q、163Q、220Q、221Q、278Q和279Q处的氨基酸取代。SEQ ID NO:84的氨基酸43Q、44Q、96Q、97Q、162Q、163Q、220Q、221Q、278Q和279Q处的氨基酸取代例如可以是赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代。在某些实施方案中，SpA变体多肽包含SEQ ID NO:84的氨基酸70D、71D、131D、132D、189D、190D、247D、248D、305D和306D处的氨基酸取代。例如，SEQ IDNO:84的氨基酸70D、71D、131D、132D、189D、190D、247D、248D、305D和306D处的氨基酸取代可以是丙氨酸(A)或缬氨酸(V)取代。在某些实施方案中，所述SpA变体多肽可选自SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:100。SpA变体多肽在US2016/0304566中进行了描述，通过引用将其全部并入本文。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体A结构域，例如，包含SEQ ID NO:62、67、88或93的氨基酸序列的变体A结构域，或与SEQ ID NO:62、67、88或93的任何一个氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体B结构域，例如，变体B结构域包含SEQ ID NO:63、68、89或94的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:63、68、89或94的任何一个氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体C结构域，例如，包含SEQ ID NO:64、69、90或95的氨基酸序列的变体C结构域，或与SEQ ID NO:64、69、90或95的任何一个氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体D结构域，例如，包含SEQ ID NO:66、71、91或96的氨基酸序列的变体D结构域，或与SEQ ID NO:66、71、91或96的任何一个氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体E结构域，例如，包含SEQ ID NO:65、70、92或97的氨基酸序列的变体E结构域，或与SEQID NO:65、70、92或97的任何一个氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，免疫原性组合物的SpA变体多肽的变体A结构域例如可包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。例如，变体B结构域可包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。例如，变体C结构域可包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。例如，变体D结构域可包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。例如，变体E结构域可包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽可包含变体A、B、C、D和E结构域，其可包含与SEQ ID NO:62或67、SEQ ID NO:63或68、SEQ ID NO:64或69，SEQ IDNO:66或71，SEQ ID NO:65或70具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽可包含变体A、B、C、D和E结构域，其可包含分别与SEQ ID NO:88或93、SEQ ID NO:89或94、SEQ ID NO:90或95、SEQID NO:91或96以及SEQ ID NO:92或97具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含变体D结构域，其中变体D结构域包含对应于SEQ ID NO:58的第9、10和/或33位的氨基酸位置处的取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包括(i)在对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第9和10位的氨基酸位置处的各个SpA A-E结构域中的赖氨酸对谷氨酰胺氨基酸残基的取代；和(ii)在与SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第33位相对应的氨基酸位置处的各个SpA A-E结构域中的谷氨酸对丝氨酸氨基酸残基的取代。与阴性对照相比，SpA变体多肽检测不到与血液中的IgG和IgE交联和/或激活嗜碱性粒细胞。通过在血液中未检测到交联IgG和IgE和/或激活嗜碱性粒细胞，SpA变体多肽不会对人类患者造成重大安全或毒性问题，和/或不会对人类患者造成过敏性休克的重大风险。

在任意实施方案中，与由对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第9和10位的各个SpA A-E结构域中的赖氨酸对谷氨酰胺残基的取代以及对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)第36和37位的各个SpA结构域A-E中的丙氨酸对天冬氨酸的取代组成的SpA变体多肽(SpA_KKAA)相比，本文所述的SpA变体多肽对来自人类IgG的V_H3的K_A结合亲和力降低。由结构域D(SEQ ID NO:58)第9位和第10位对应的氨基酸位置处的各个结构域A-E中的谷氨酰胺到赖氨酸的取代以及结构域D第36位和第37位对应的氨基酸位置处的各个结构域A-E中的天冬氨酸到丙氨酸的取代组成的SpA变体多肽用作比较物，并命名为SpA_KKAA。SpA_KKAA变体多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:54。在某些实施方案中，SpA变体多肽对来自人类IgG的V_H3具有K_A结合亲和力，与SpA_KKAA相比减少至少两倍(2倍)。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽对来自人类IgG的V_H3具有K_A结合亲和力，与SpA_KKAA相比，该亲和力降低至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.6、1.7、1.8、1.9、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3倍或更多或介于两者之间的任何值。在某些实施方案中，免疫原性组合物的SpA变体多肽对来自人类IgG的V_H3具有K_A结合亲和力，与SpA_KKAA相比，该亲和力降低至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、290、300％或以上，或两者之间的任何值。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽对来自人类IgG的V_H3具有小于约1×10⁵M^-1的K_A结合亲和力。在某些实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽对来自人类IgG的V_H3具有小于约3、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1×10⁵M^-1之间的任何值的K_A结合亲和力。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽在对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)第36和37位的任何SpA A-E结构域中均没有取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包括(i)在对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第9和10位处的各个SpA A-E结构域中的赖氨酸对谷氨酰胺氨基酸残基的取代；以及(ii)在对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第33位处的各个SpA A-E结构域中的谷氨酸对丝氨酸氨基酸残基的取代。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SpA E结构域，其具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:65具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SpA D结构域，其具有SEQ ID NO:66氨基酸序列或与SEQ ID NO:66具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SpA A结构域，该结构域具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:62具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SpA B结构域，该结构域具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:63具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SpA C结构域，该结构域具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:64具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或与SEQ ID NO:60具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任何实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含(i)在对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第9和10位的各个SpA A-E结构域中的赖氨酸对谷氨酰胺氨基酸残基的取代；以及(ii)在SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第33位对应的苏氨酸取代各个SpAA-E结构域中的丝氨酸氨基酸残基位置处。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含一个SpA E结构域，该结构域具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与SEQ IDNO:70具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含一个SpA D结构域，该结构域具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或与SEQID NO:71具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含一个SpA A结构域，该结构域具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:67具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含一个SpA B结构域，该结构域具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:68具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含一个SpA C结构域，该结构域具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:69具有至少为90％、至少为91％、至少为92％、至少为93％、至少为94％、至少为95％、至少为96％、至少为97％、至少为98％或至少为99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或与SEQ ID NO:61具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的SpA变体多肽包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。

与阴性对照相比，所述SpA变体多肽检测不到与血液中的IgG和IgE交联和/或激活嗜碱性粒细胞。由于在血液中未检测到交联IgG和IgE和/或激活嗜碱性粒细胞，SpA变体多肽不会对人类患者造成重大安全或毒性问题，也不会对人类患者造成过敏性休克的重大风险。适用于本文所公开的组合物和方法中使用的SpA变体多肽在WO2020232471中进行了描述，通过引用将其全部并入本文。

下表3提供了本文所公开的免疫原性组合物的示例性SpA多肽氨基酸序列。

表3.示例性SpA多肽氨基酸序列

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根据本文公开的所有方面，如本文所公开的免疫原性组合物的LukA变体多肽、LukB多肽和SpA多肽可进一步包含一个或多个异源氨基酸序列。合适的异源氨基酸序列包括但不限于标签序列、免疫原、信号序列等。合适的标签序列包括但不限于多组氨酸标签、多精氨酸标签、FLAG标签、Step-标签II、泛素标签、NusA标签、几丁质结合结构域、钙调素结合肽、纤维素结合结构域、Hat-标签、S-标签、SBP、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(见“Overview of Tag Protein Fusions:From Molecular and Biochemical Fundamentalsto Commercial Systems,”Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33(2003)，现通过引用并入)。合适的免疫原包括但不限于T细胞表位、B细胞表位。合适的信号序列包括但不限于PelB信号序列、Sec信号序列、Tat信号序列、AmyE信号序列(参见Freudl R.,“SignalPeptides for Recombinant Protein Secretion in Bacterial Expression Systems,”Microbial Cell Factories 17:52(2018)，现通过引用并入本文。在一些实施方案中，如本文所述的LukA、LukB和SpA多肽包含PelB序列(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA；SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，如本文所述的LukA、LukB和SpA多肽包含His标签(例如NSAHHHHHHGS；SEQ ID NO:24)。因此，在一些实施方案中，如本文所述的SpA、LukA和/或LukB多肽包含前述PelB序列和His标签。

金黄色葡萄球菌LukA、LukB和SpA多核苷酸和构建体

本发明的另一方面涉及编码如本文所述的LukA变体多肽、LukB多肽和SpA多肽的核酸分子，以及包含一个或多个这些核酸分子的免疫原性组合物。本文所述核酸分子包括分离的多核苷酸、重组多核苷酸序列、表达载体的部分或线性DNA序列的部分，包括用于体外或体内转录/翻译的线性DNA序列，以及与变体LukA、LukB的原核和真核细胞表达和分泌兼容的载体，以及本文所述的SpA多肽。本发明的多核苷酸可通过化学合成(例如在自动多核苷酸合成器上固相多核苷酸合成)产生，并组装成完整的单链或双链分子。或者，本发明的多核苷酸可以通过其他技术生产，例如PCR，然后进行常规克隆。生产或获得给定序列的多核苷酸的技术在本领域是众所周知的。

在任意实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含编码LukA变体多肽的多核苷酸。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码LukA变体，所述变体在与SEQ ID NO:25第83位处的赖氨酸对应的残基处包含赖氨酸到甲硫氨酸的取代(Lys83Met)。在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码变体LukA多肽，所述变体LukA多肽在与SEQ ID NO:25第141位处的丝氨酸对应的残基处包含丝氨酸到丙氨酸的取代(Ser141Ala)。在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码变体LukA多肽，所述变体LukA多肽在与SEQ ID NO:25的第113位处的缬氨酸对应的残基处包含缬氨酸到异亮氨酸的取代(Val113Ile)。在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码变体LukA多肽，该多肽在与SEQ ID NO:25第193位处的缬氨酸对应的残基处包含缬氨酸到异亮氨酸的取代(Val193Ile)。在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码其变体LukA多肽，该多肽在对应于前述氨基酸残基(即SEQ ID NO:25的Lys803Met、Ser141Ala、Val113Ile和Val193Ile)的残基处包含赖氨酸对甲硫氨酸、丝氨酸对丙氨酸、缬氨酸对异亮氨酸的氨基酸取代。在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码其变体LukA多肽，该多肽进一步包含对应于Glu323Ala的氨基酸取代，即，该多核苷酸编码变体LukA，所述变体LukA在对应于SEQ ID NO:25的Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile和Glu323Ala取代处包含取代。

在一个实施方案中，示例性核酸分子是编码CC8 LukA变体序列的核酸分子，例如，编码SEQ ID NO:1的变体，其包含对应于SEQ ID NO:1中Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile和Glu320Ala的氨基酸取代。本文提供了编码CC8 LukA的示例性核酸分子，其为SEQ ID NO:101。因此，在任意实施方案中，示例性核酸分子是SEQ ID NO:101的变体，其中所述变体包含与SEQ ID NO:101的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:3的LukA变体序列(LukA CC8 Glu320Ala、Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile)的核酸分子或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。编码所述LukA CC8变体的示例性核酸分子包含与SEQID NO:103具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。在任意实施方案中，编码所述LukA CC8变体的核酸分子包含SEQ ID NO:103的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，示例性核酸分子是编码CC45 LukA变体序列的核酸分子，例如，编码SEQ ID NO:2的变体，其包含对应于SEQ ID NO:2中Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile和Glu321Ala的氨基酸取代。本文提供了编码CC45-LukA的示例性核酸分子，在本文为SEQ ID NO:102。因此，在任意实施方案中，示例性核酸分子是SEQ ID NO:102的变体，其中所述变体包含与SEQ ID NO:102的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物的示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:4的LukA变体序列(LukA CC45 Glu321Ala、Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile)的核酸分子，或具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少99％的序列相似性。编码所述LukA CC45变体的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:104具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。在任意实施方案中，编码所述LukA CC8变体的核酸分子包含SEQ ID NO:104的核苷酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的一个或多个多核苷酸编码LukA变体蛋白质或多肽，其包含对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码LukA变体蛋白质或多肽，其在对应于SEQ ID NO:25的Tyr74的氨基酸残基处包含酪氨酸到半胱氨酸的取代(Tyr74Cys)，并且在对应于SEQ ID NO:25的Asp140(Asp140Cys)的氨基酸残基处包含天冬酰胺到半胱氨酸的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码LukA变体蛋白质或多肽，其在对应于SEQ ID NO:25的Gly149的氨基酸残基处包含甘氨酸到半胱氨酸的取代(Gly149Cys)，并且在对应于SEQ ID NO:25的Gly156(Gly156Cys)的氨基酸残基处包含甘氨酸到半胱氨酸的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码变体LukA蛋白质或多肽，其包含对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基中的每一个的氨基酸取代是如上所述的半胱氨酸残基。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码变体LukA蛋白质或多肽，其包含对应于Lys83、Ser141、Val113、Val193和Glu323的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代，以及对应于氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代，以及SEQ ID NO:25的Gly156。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码变体LukA蛋白质或多肽，其包含对应于残基Lys83、Ser141、Val113、Val193和Glu323的氨基酸残基处的氨基酸取代，以及SEQ ID NO:25的残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156。在任意实施方案中，示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:5的LukA变体序列(LukA CC8 Glu320Ala、Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile、Tyr71Cys、Asp137Cys、Gly146Cys、Gly153Cys)的核酸分子，或具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少99％的序列相似性。在任意实施方案中，本发明的示例性核酸分子是编码SEQID NO:6的LukA变体序列(LukA CC45Glu321Ala、Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile、Tyr72Cys、Asp138Cys、Gly147Cys、Gly154Cys)的核酸分子，或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％，或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的一个或多个多核苷酸编码LukA变体多肽，所述多肽在对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Thr249的氨基酸残基处包含氨基酸取代或缺失。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码LukA变体，所述变体在对应于SEQ ID NO:25的第249位的残基处包含苏氨酸到缬氨酸的取代。在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码LukA变体多肽，所述多肽包含对应于Thr249的位置处的氨基酸取代，以及对应于SEQ IDNO:25的Lys83、Ser141、Val113、Val193、Glu323、Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的残基处的任何一个或所有氨基酸取代。在任意实施方案中，示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:7的LukA变体序列(LukA CC8 Glu320Ala、Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile和Thr246Val)的核酸分子，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。在任意实施方案中，示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:8的LukA变体序列(LukA CC45Glu321Ala、Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile、Thr247Val)的核酸分子，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:9的LukA变体序列(LukACC8 Glu320Ala、Lys80Met、Ser138Ala、Val110Ile、Val190Ile、Thr246Val、Tyr71Cys、Asp137Cys、Gly146Cys和Gly153Cys)，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％的氨基酸序列，或至少99％的序列相似性的核酸分子。在任意实施方案中，编码该SEQ ID NO:9的LukA CC8变体的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:105具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。在任意实施方案中，编码所述LukA CC8变体的核酸分子包含SEQ ID NO:105的核苷酸序列。

在任意实施方案中，示例性核酸分子是编码SEQ ID NO:10的LukA变体序列(LukACC45 Glu321Ala、Lys81Met、Ser139Ala、Val111Ile、Val191Ile、Thr247Val、Tyr72Cys、Asp138Cys、Gly147Cys和Gly154Cys)，或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％的氨基酸序列，或至少99％的序列相似性的核酸分子。在任意实施方案中，编码该SEQ ID NO:10的LukA CC45变体的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:106具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。在任意实施方案中，编码所述LukA CC8变体的核酸分子包含SEQ ID NO:106的核苷酸序列。

在任意实施方案中，本文公开的免疫原性组合物的一个或多个多核苷酸进一步编码本文公开的LukB多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的LukB多肽。本文提供了编码CC8-LukB的示例性核酸分子，其名称为SEQ ID NO:107。因此，在任意实施方案中，示例性核酸分子是SEQ ID NO:107的变体，其中所述变体包含与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。

在任意实施方案中，多核苷酸编码包含SEQ ID NO:16氨基酸序列的LukB多肽。本文提供了编码CC45-LukB的示例性核酸分子，其名称为SEQ ID NO:108。因此，在任意实施方案中，示例性核酸分子是SEQ ID NO:108的变体，其中所述变体包含与SEQ ID NO:108的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。

在任意实施方案中，所述多核苷酸编码变体LukB多肽，所述变体LukB多肽包含对应于SEQ ID NO:39的氨基酸残基Val53的氨基酸残基处的氨基酸取代或缺失。在任意实施方案中，Val53处的氨基酸取代包括缬氨酸到亮氨酸取代(Val53Leu)。

在任意实施方案中，本发明的示例性多核苷酸编码SEQ ID NO:17的变体LukB蛋白质或多肽(LukB CC8V53L)，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。编码所述LukB CC8 V53L变体的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:109具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。在任意实施方案中，编码所述LukA CC8变体的核酸分子包含SEQ ID NO:109的核苷酸序列。

在任意实施方案中，本发明的示例性多核苷酸编码SEQ ID NO:18的变体LukB蛋白质或多肽(LukB CC45 V53L)，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。编码所述LukB CC45 V53L变体的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:110具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列。在任意实施方案中，编码所述LukA CC45变体的核酸分子包含SEQ ID NO:110的核苷酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码变体LukB蛋白质或多肽，其包含对应于SEQ ID NO:39的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，上述一个或多个残基处的氨基酸取代引入一个或多个能够形成二硫键以稳定LukAB异二聚体结构构象的半胱氨酸残基。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码LukB变体蛋白质或多肽，其在对应于SEQ ID NO:39的Glu45的氨基酸残基处包含谷氨酸到半胱氨酸的取代(Glu45Cys)，以及在对应于SEQ ID NO:39的Thr121的氨基酸残基处包含苏氨酸到半胱氨酸的取代(Thr21Cys)。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码LukB变体蛋白质或多肽，其在对应于SEQ ID NO:39的Glu109的氨基酸残基处包含谷氨酸对半胱氨酸的取代(Glu109Cys)，以及在对应于SEQ ID NO:39的Arg154的氨基酸残基处包含精氨酸到半胱氨酸的取代(Arg154Cys)。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码变体LukB蛋白质或多肽，其包含对应于SEQ ID NO:39的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，这些氨基酸残基中的每一个的氨基酸取代涉及如上所述引入半胱氨酸残基。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码变体LukB蛋白质或多肽，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列(LukB CC8 Glu45Cys、Glu109Cys、Thr21Cys和Arg154Cys)，或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码变体LukB蛋白质或多肽，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列(LukB CC45 Glu45Cys、Thr122Cys、Glu110Cys、Arg155Cys)，或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，本发明的多核苷酸编码变体LukB蛋白质或多肽，其包含对应于SEQ ID NO:39的Val53的氨基酸残基处的氨基酸取代，以及对应于SEQ ID NO:39的Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:19氨基酸序列的变体LukB蛋白质或多肽(LukBCC8 Val53Leu、Glu45Cys、Glu109Cys、Thr21Cys和Arg154Cys)，或与SEQ ID NO:19氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:20氨基酸序列的变体LukB蛋白质或多肽(LukB CC45 Val53Leu、Glu45Cys、Thr122Cys、Glu110Cys、Arg155Cys)，或与SEQ ID NO:20氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物的示例性核酸分子编码SEQ IDNO:4的CC45-LukA变体序列和SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列。编码所述LukAB异二聚体(RARPR-15)的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:104(CC45 LukA变体)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:108(CC45-LukB)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。编码所述LukAB异二聚体的示例性核酸分子包含SEQ ID NO:104的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:108的核苷酸序列可操作地连接。

在任意实施方案中，本发明的示例性核酸分子编码SEQ ID NO:4的CC45 LukA变体序列和SEQ ID NO:18的CC45 LukB变体序列。编码所述LukAB异二聚体(RARPR-30)的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:104(CC45 LukA变体)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:110(CC45 LukB变体)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。编码所述LukAB异二聚体的示例性核酸分子包含SEQ ID NO:104的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:110的核苷酸序列可操作地连接。

在任意实施方案中，本发明的示例性核酸分子编码SEQ ID NO:3的CC8 LukA变体序列和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列。编码所述LukAB异二聚体(RARPR-32)的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:103(CC8LukA变体)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:107(CC8 LukB)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％，或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。编码所述LukAB异二聚体的示例性核酸分子包含SEQID NO:103的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:107的核苷酸序列可操作地连接。

在任意实施方案中，本发明的示例性核酸分子编码SEQ ID NO:3的CC8 LukA变体序列和SEQ ID NO:18的CC45 LukB变体序列。编码所述LukAB异二聚体(RARPR-33)的示例性核酸分子包括与SEQ ID NO:103(CC8 LukA变体)的核苷酸序列到具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ IDNO:110(CC45 LukB变体)的核苷酸序列至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。编码所述LukAB异二聚体的示例性核酸分子包含SEQ IDNO:103的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:110的核苷酸序列可操作地连接。

在任意实施方案中，本发明的示例性核酸分子编码SEQ ID NO:3的CC8 LukA变体序列和SEQ ID NO:17的CC8 LukB变体序列。编码所述LukAB异二聚体(RARPR-34)的示例性核酸分子包含与SEQ ID NO:103(CC8LukA变体)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:109(CC8 LukB变体)的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。编码所述LukAB异二聚体的示例性核酸分子包含SEQID NO:103的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:109的核苷酸序列可操作地连接。

下表4提供了本发明的示例性LukA和LukB核酸分子序列。

表4.示例性LukA和LukB多核苷酸序列

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在任意实施方案中，本文公开的免疫原性组合物包含编码SpA多肽的多核苷酸。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码野生型或非变体SpA多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA A结构域，其包含SEQ ID NO:55或48的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA B结构域，其包含SEQ ID NO:56或49的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA C结构域，该结构域包含SEQ ID NO:57或50的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA D结构域，该结构域包含SEQ ID NO:58或51的氨基酸序列。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA E结构域，该结构域包含SEQ ID NO:59或52的氨基酸序列。在任意实施方案中，编码SpA多肽的多核苷酸包含至少两个SpA IgG结构域、至少三个SpA IgG结构域、至少四个SpA IgG结构域或所有五个SpA IgG结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA多肽，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与SEQ IDNO:53具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码变体E、D、A、B和/或C结构域，其分别包含与SEQ ID NO:55或48、SEQ ID NO:56或49、SEQ ID NO:57或50、SEQ IDNO:58或51以及SEQ ID NO:59或52具有75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。上文描述了示例性SpA变体E、D、A、B和C结构域。

在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有变体E结构域的SpA变体多肽，所述变体E结构域包含SEQ ID NO:59的氨基酸第6、7、33和/或34位处的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有变体D结构域的SpA变体多肽，所述变体D结构域包含SEQ ID NO:58的氨基酸第9、10、36和/或37位处的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有变体A结构域的SpA变体多肽，所述变体A结构域包含SEQ ID NO:55的氨基酸第7、8、34和/或35位处的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有变体B结构域的SpA变体多肽，所述变体B结构域包含SEQ ID NO:56的氨基酸第7、8、34和/或35位处的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有变体C结构域的SpA变体多肽，所述变体C结构域包含SEQ ID NO:57的氨基酸第7、8、34和/或35位处的取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码SpA变体多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:53或72具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％(但非100％)序列相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，SpA变体多肽包含与SEQ ID NO:53或72或其片段具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码SpA变体多肽，其包含SpA结构域D中的一个或多个氨基酸取代，或在其他SpA IgG结构域中的相应氨基酸位置的一个或多个氨基酸取代，其中一个或多个氨基酸取代破坏或减少SpA变体多肽与IgG Fc的结合。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA变体多肽，所述多肽进一步包含D结构域的VH3结合子结构域中的一个或多个氨基酸取代，或在其他IgG结构域中的相应氨基酸位置处的一个或多个氨基酸取代，其破坏或减少与VH3的结合。

在任意实施方案中，所述多核苷酸编码包含变体A结构域(例如，包含SEQ ID NO:62、67、88或93的氨基酸序列的变体A结构域)的SpA变体多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码包含变体B结构域(例如，包含SEQ ID NO:63、68、89或94氨基酸序列的变体B结构域)的SpA变体多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码包含变体C结构域(例如，包含SEQ ID NO:64、69、90或95氨基酸序列的变体C结构域)的SpA变体多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码包含变体D结构域(例如，包含SEQ ID NO:66、71、91或96的氨基酸序列的变体D结构域)的SpA变体多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码包含变体E结构域(例如，包含SEQ ID NO:65、70、92或97的氨基酸序列的变体E结构域)的SpA变体多肽。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码包含变体A、B、C、D和E结构域的SpA变体多肽，变体A、B、C、D和E结构域包含分别与SEQ ID NO:62或67、SEQ ID NO:63或68、SEQ ID NO:64或69、SEQ ID NO:66或71以及SEQ ID NO:65或70具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码包含变体A、B、C、D和E结构域的SpA变体多肽，所述变体A、B、C、D和E结构域包含与SEQ ID NO:88或93、SEQ ID NO:89或94、SEQ ID NO:90或95、SEQ ID NO:91或96以及SEQ ID NO:92或97具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同性的氨基酸序列。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码包含变体D结构域的SpA变体多肽，其中所述变体D结构域包含对应于SEQ ID NO:58的第9、10和/或33位氨基酸位置处的取代。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码SpA变体多肽，其包括(i)各个SpA A-E结构域中的赖氨酸对谷氨酰胺氨基酸残基(对应于SpA D结构域(SEQ IDNO:58)的第9和10位的氨基酸位置处)的取代；和(ii)各个SpA A-E结构域中的谷氨酸对丝氨酸氨基酸残基(与SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第33位相对应的氨基酸位置处)的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:65氨基酸序列的SpA E结构域。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:66氨基酸序列的SpA D结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:62氨基酸序列的SpAA结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:63氨基酸序列的SpA B结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:64氨基酸序列的SpA C结构域。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:60氨基酸序列的SpA变体多肽。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码SpA变体多肽，其包括(i)各个SpA A-E结构域中赖氨酸对谷氨酰胺氨基酸残基(对应于SpA D结构域(SEQ ID NO:58)的第9和10位的氨基酸位置处)的取代；以及(ii)各个SpA A-E结构域中的苏氨酸对丝氨酸氨基酸残基(SpA D结构域(SEQ ID NO:58)第33位对应的氨基酸位置处)的取代。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:70氨基酸序列的SpA E结构域。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:71氨基酸序列的SpA D结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:67氨基酸序列的SpA A结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:68氨基酸序列的SpA B结构域。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:69氨基酸序列的SpA C结构域。在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码具有SEQ ID NO:61氨基酸序列的SpA变体多肽。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物的多核苷酸编码包含变体A、B、C、D和/或E结构域的SpA变体多肽。在任意实施方案中，所述多核苷酸编码SpA变体多肽，其包含与SEQID NO:60或61的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。在任意实施方案中，多核苷酸编码SpA变体多肽，其包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码本文所述金黄色葡萄球菌多肽的核酸分子是优化用于在哺乳动物细胞(优选人类细胞)中表达的密码子。密码子优化的方法是已知的，并且已经在之前描述过(例如，国际专利申请公开WO1996/09378，通过引用将其全部并入本文)。如果与野生型序列相比，至少有一个非优选密码子被更优选的密码子取代，则该序列被视为密码子优化。在此，非优选密码子是指在生物体中使用频率低于编码相同氨基酸的另一密码子的密码子，而更优选密码子是指在生物体中使用频率高于非优选密码子的密码子。特定生物体的密码子使用频率可在本领域已知且可用的密码子频率表中找到。优选地，一个以上的非优选密码子，例如超过10％、40％、60％>、80％>的非优选密码子，优选地，大多数(例如至少90％)或所有非优选密码子被更优选的密码子取代。优选地，生物体中最常用的密码子以密码子优化序列使用。由优选密码子取代通常会导致更高的表达。

本发明的多核苷酸序列可使用常规分子生物学技术克隆，或通过DNA合成从头生成，可由在DNA合成和/或分子克隆领域有业务的服务公司(例如GeneArt、GenScript、Invitrogen、Eurofins)使用常规程序执行。

在一些实施方案中，将前述核酸分子插入载体中，例如用于本文所述免疫原性组合物的表达载体。或者，可将这些核酸分子插入表达载体中，所述表达载体被转化或转染到适当的宿主细胞中，以表达和分离本文所公开的编码SpA多肽、LukA变体多肽、LukB蛋白质或LukAB复合物(作为稳定的异二聚体)。

根据本发明的这一方面，编码本文所述金黄色葡萄球菌多肽的核酸分子可并入能够表达由核酸序列构建体编码的多肽的任何表达载体中。合适的表达载体包括控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽表达的核酸序列元件。这些元件可包括转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点和其他促进给定表达系统中编码多肽表达的位点。合适的载体包括但不限于DNA载体、质粒载体、线性核酸和病毒载体，例如腺病毒载体。

在一个实施方案中，所述表达载体是环形质粒(例如，参见Muthumni等人，“Optimized and Enhanced DNA Plas中层Vector Based In vivo Construction of aNeutralizing anti-HIV-1Envelope Glycoprotein Fab,”Hum.Vaccin.Immunother.9:2253-2262(2013)，现通过引用将其全部并入本文)。所述质粒可以通过整合到细胞基因组或存在于染色体外(例如，具有复制起源的自主复制质粒)而转化靶细胞。示例性质粒载体包括但不限于pCEP4、pREP4、pVAX、pcDNA3.0、provax或任何其他能够表达由重组核酸序列构建体编码的变体LukA和/或变体LukB蛋白质或多肽的质粒表达载体。

在另一个实施方案中，所述表达载体是线性表达盒(“LEC”)。LEC能够通过电穿孔有效地传递给对象，以表达本文所述重组核酸分子编码的SpA、LukA和/或LukB多肽。LEC可以是任何没有磷酸骨架的线性DNA。在一个实施方案中，所述LEC不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸盐骨架。在另一个实施方案中，所述LEC不包含与所需基因表达无关的其他核酸序列。

LEC可以从任何能够线性化的质粒中获得。所述质粒能够表达由本文所述重组核酸分子编码的多肽。示例性质粒包括但不限于pNP(Puerto Rico/34)、pM2(New Caledonia/99)、WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达重组核酸序列构建体编码的多肽的任何其他表达载体。

在另一个实施方案中，所述表达载体是病毒载体。能够表达多肽的合适病毒载体包括，例如，腺相关病毒(AAV)载体(参见Krause等人，“Delivery of Antigens by ViralVectors for Vaccination,”Ther.Deliv.2(1):51-70(2011)；Ura等人，“Developments inViral Vector-Based Vaccines,”Vaccines 2:624-641(2014)；Buning等人,"RecentDevelopments in Adeno-associated Virus Vector Technology,"J.Gene Med.10:717-733(2008)，每一个都通过引用整体并入本文)，慢病毒载体(参见，例如，Ura等人，“Developments in Viral Vector-Based Vaccines,”Vaccines 2:624-641(2014)；Hu等人，“Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and InfectionDiseases,”Immunol.Rev.239:45-61(2011)，全部通过引用并入)，逆转录病毒载体(例如，见Ura等人，“Developments in Viral Vector-Based Vaccines,”Vaccines 2:624-641(2014)，全部通过引用并入)，痘苗病毒，复制缺陷型腺病毒载体，以及无肠腺病毒载体(例如，参见美国专利No.5872005，通过引用将其全部并入本文)。本领域已知用于产生和分离适合用作载体的腺相关病毒(AAV)的方法(例如，参见Grieger&Samulski,"Adeno-associated Virus as a Gene Therapy Vector:Vector Development,Production andClinical Applications,"Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145(2005)；Buning等人，"Recent Developments in Adeno-associated Virus Vector Technology,"J.GeneMed.10:717-733(2008)，每一个都通过引用完整地并入本文)。

编码本文所述SpA、LukA和/或LukB多肽的多核苷酸通常与表达载体结构中的启动子、翻译起始、3′非翻译区、多聚腺苷酸化和转录终止序列结合，以实现最大表达。适用于驱动本文所述多肽表达的启动子序列包括但不限于延伸因子1-α(EF1a)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、巨细胞病毒增强子/鸡β肌动蛋白启动子(CAG)、四环素反应启动子(TRE)、转甲状腺素启动子(TTR)、猿猴病毒40启动子(SV40)和CK6启动子。本领域已知的适于在宿主细胞中驱动基因表达的其他启动子也适于并入本文公开的表达构建体中。

本发明的另一方面涉及包含编码本文所述金黄色葡萄球菌多肽的核酸分子的宿主细胞，或包含这些多核苷酸的载体。如本文所述，编码SpA、LukA和LukB蛋白质或多肽的表达构建体可被共转染、连续转染或单独转染到宿主细胞中。合适的宿主细胞包括但不限于原代细胞、细胞系细胞、混合细胞系细胞、永生化细胞群或永生化细胞克隆群，如本领域所知(例如，参见Ausubel等人，ed.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2^nd Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow and Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Colligan等人，eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，现将其全部内容通过引用并入本文)。这种宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古细菌细胞。

在一些实施方案中，本文所述金黄色葡萄球菌多核苷酸的合适宿主细胞为细菌细胞。合适的细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌(Escherichia)宿主细胞、假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞、葡萄球菌(Staphylococcus)宿主细胞、链霉菌(Streptomyces)宿主细胞、分枝杆菌(Mycobacterium)宿主细胞和芽孢杆菌(Bacillus)宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是金黄色葡萄球菌宿主细胞。

在一些实施方案中，本文所述金黄色葡萄球菌多核苷酸的合适宿主细胞为真核细胞。典型的真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、鸟类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生化细胞系，如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，如SP2/0(美国典型培养物中心(ATCC)，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州，CRL-1581)、NSO(欧洲细胞培养物中心(ECACC)，索尔兹伯里(Salisbury)，威尔特郡，英国、ECACC编号85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCCCRL-1580)小鼠细胞系。典型的人类骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他有用的细胞系包括来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，如CHO-K1SV(Lonza Biologics，Walkersville，Md)，CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。

本文所述的SpA、LukA和LukB多肽可通过使用上文所述的分离多核苷酸、载体和宿主细胞的多种技术中的任何一种来制备。一般来说，蛋白质是通过标准克隆和细胞培养技术产生的，通常用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化子、培养宿主细胞以及从培养基中回收蛋白质或多肽。可以使用通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如通过电穿孔、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染等来实施转染宿主细胞。

本文所述的多肽可通过诸如糖基化、异构化、脱糖基化或非自然发生的共价修饰(例如添加聚乙二醇(PEG)部分(聚乙二醇化)和脂质化等过程进行翻译后修饰。这种修饰可能发生在体内或体外。

在一些实施方案中，如本文所述的SpA、LukA和LukB多核苷酸和/或多肽优选为“分离的”多核苷酸和/或多肽。当用于描述本文公开的多核苷酸和多肽时，“分离的”是指已从其生产环境的组分中鉴定、分离和/或回收多核苷酸或多肽。优选地，分离的多核苷酸或多肽不与其生产环境中的其他组分结合。其生产环境中的污染成分，如重组转染细胞产生的污染成分，通常会干扰药物用途，可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化多核苷酸或多肽，包括但不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱法("HPLC")也可用于纯化。

免疫原性组合物的佐剂

如本文所用，术语“佐剂”是指当与本文所述免疫原性组合物一起施用或作为其一部分施用时，增大(augment)、增强(enhance)和/或加强(boost)对SpA多肽、LukA多肽、LukB多肽和/或编码它们的多核苷酸的免疫应答的化合物。然而，当单独施用佐剂化合物时，它不会对上述多肽或多核苷酸产生免疫反应。佐剂可通过多种机制增强免疫应答，包括淋巴细胞募集、刺激B细胞和/或T细胞以及刺激抗原呈递细胞。

本文所述的免疫原性组合物包含SpA、LukA和LukB多肽和/或编码它们的多核苷酸，包含佐剂或与佐剂组合施用。与本发明免疫原性组合物组合施用的佐剂可在施用免疫原性组合物之前、伴随施用或之后施用。

佐剂的具体示例包括但不限于铝盐(明矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和氧化铝，包括包含明矾或纳米明矾配方的纳米颗粒)、磷酸钙(例如Masson JD等人，Expert RevVaccines 16:289-299(2017)，现将其全文通过引用合并)，单磷酰脂质A(MPL)或3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(参见英国专利GB2220211、EP0971739、EP1194166、US6491919，通过引用将其整体并如本文)、AS01、AS02、AS03和AS04(参见例如EP1126876、US7357936、EP0671948、EP0761231、US5750110，AS02，其通过引用整体并入本文)，咪唑吡啶化合物(见WO2007/109812，其全部通过引用并入本文)、咪唑喹恶啉化合物(见WO2007/109813，其全部通过引用并入本文)、三角菊糖(delta-inulin，例如Petrovsky N和PD Cooper，疫苗33:5920-5926(2015)，其全部通过引用并入本文)，STING激活合成环二核苷酸(例如US20150056224，其全部通过引用并入本文)、卵磷脂和卡波姆均聚物的组合(例如US6676958)以及皂苷，例如Quil A和QS21(参见例如Zhu D和W Tuo2016,Nat Prod ChemRes 3:e113(doi:10.4172/2329-6836.1000e113)，其全部通过引用并入本文)，任选地与QS7联合使用(见Kensil等人Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell&Newman,Plenum Press,NY,1995)；US 5,057,540，通过引用将其全部并入本文)。在任意实施方案中，所述佐剂为弗氏佐剂(完全或不完全)。在任意实施方案中，所述佐剂包含Quil-A，例如可从Brenntag(现在的Croda)或Invivogen商业获得。QuilA包含从皂树(Quillaja saponaria Molina)树中提取的皂苷的水提部分。这些皂苷属于三萜皂苷类，具有共同的三萜骨架结构。已知皂苷可诱导对T依赖性和T非依赖性抗原的强烈佐剂反应，以及强烈的细胞毒性CD8+淋巴细胞反应，并增强对粘膜抗原的反应。它们还可以与胆固醇和磷脂结合，形成免疫刺激复合物(ISCOM)，其中QuilA佐剂可以激活抗体介导和细胞介导的免疫反应，以应对来自不同来源的多种抗原。在某些实施方案中，所述佐剂为AS01，例如AS01B。AS01是一种含有MPL(3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A)、QS21(皂树，组分21)和脂质体的佐剂系统。在某些实施方案中，AS01是商用的，或者可以按照WO 96/33739中的描述制造，通过引用将其全部并入本文。某些佐剂包含乳液，乳液是两种不互溶液体(例如油和水)的混合物，其中一种以小液滴的形式悬浮在另一种中，并由表面活性剂稳定。水包油乳液中的水形成连续相，包围着小油滴，而水包油乳液中的油形成连续相。某些水包油乳液包含角鲨烯(一种可代谢的油)。某些助剂包含嵌段共聚物，嵌段共聚物是两个单体聚集在一起形成重复单元嵌段时形成的共聚物。由嵌段共聚物、角鲨烯和微粒稳定剂组成的油包水乳液的一个例子是该乳液可从Sigma Aldrich获得。

任选地，乳剂可与进一步的免疫刺激成分(例如TLR4激动剂)结合或包含进一步的免疫刺激成分。在本文所公开的组合物中使用的佐剂组合的合适但非限制性实例包括也在MF59(参见例如EP0399843、US 6299884、US6451325)和AS03中使用的水包油乳液(例如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫兴奋剂组合，如一磷酸脂A和/或QS21，如AS02(见Stoute等人，1997,N.Engl.J.Med.336,86-91，通过引用将其全部并入本文)。佐剂另外的实例是含有免疫刺激物的脂质体，例如MPL和QS21，例如AS01E和AS01B(例如US 2011/0206758，通过引用将其全部并入本文)。佐剂的其他实例为CpG和咪唑喹啉(例如咪喹莫特和R848)(参见ReedG等人，2013，Nature Med，19:1597-1608，通过引用将其全部并入本文)。在根据本发明的某些优选实施方案中，所述佐剂为Th1佐剂。

在任意实施方案中，佐剂包含皂苷，优选从皂树中获得的皂苷的可水提部分。在某些实施方案中，佐剂包含QS-21。

在任意实施方案中，本文所公开的免疫原性组合物的佐剂单独含有toll样受体4(TLR4)激动剂或与另一佐剂组合。TLR4激动剂在本领域是众所周知的，参见例如Ireton GCand SG Reed,2013,Expert Rev Vaccines12:793-807，通过引用将其全部并入本文。在任意实施方案中，佐剂是包含脂质A或其类似物或衍生物的TLR4激动剂。

如本文所用，术语“脂质A”指LPS分子的疏水性脂质部分，其包含葡萄糖胺，并通过酮基键与LPS分子内核中的酮基脱氧戊四烯酸相连，酮基键将LPS分子锚定在革兰氏阴性菌外膜的外小叶中。本文中使用的脂质A包括天然存在的脂质A、混合物、类似物、衍生物及其前体。该术语包括单糖，例如称为脂质X的脂质A的前体；二糖脂质A；七酰基脂质A；六酰基脂质A；五酰基脂质A；四酰基脂质A，例如脂质A的四酰基前体，称为脂质IVA；去磷酸化脂质A；单磷酸脂A；二磷酸脂质A，如大肠杆菌(Escherichia coli)和球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)的脂质A。一些免疫激活脂质A结构包含6条酰基链。直接连接到氨基葡萄糖的四条主酰基链是3-羟基酰基链，长度通常在10到16个碳之间。另外两条酰基链通常连接到主酰基链的3-羟基上。例如，大肠杆菌脂质A通常有四条连接到糖上C14 3-羟基酰基链，分别连接到2'和3'号位的主酰基链的3-羟基上的一条C12和一条C14。

如本文所用，术语“脂质A类似物或衍生物”指类似于脂质A的结构和免疫活性，但不一定在自然界中自然出现的分子。脂质A类似物或衍生物可改性为缩短或缩合，和/或用另一胺糖残基(例如半乳糖胺残基)取代其氨基葡萄糖残基，以在还原端含有2-脱氧-2-氨基葡萄糖酸盐代替氨基葡萄糖-1-磷酸，在4'号位含有半乳糖醛酸部分而不是磷酸盐。脂质A类似物或衍生物可由从细菌中分离的脂质A制备，例如通过化学衍生，或通过化学合成，例如通过首先确定优选脂质A的结构并合成其类似物或衍生物。脂质A类似物或衍生物也可用作TLR4激动剂佐剂(例如，见Gregg KA等人，2017,MBio 8,eDD492-17,doi:10.1128/mBio.00492-17，通过引用将其全部并入本文)。

例如，脂质A类似物或衍生物可通过野生型脂质A分子的脱酰基(例如通过碱处理)获得。例如，脂质A类似物或衍生物可由从细菌中分离的脂质A制备。这种分子也可以通过化学方法合成。脂质A类似物或衍生物的另一个例子是从细菌细胞中分离出的脂质A分子，其含有参与脂质A生物合成和/或脂质A修饰的酶的突变、缺失或插入。

MPL和3D-MPL是脂质A类似物或衍生物，经过修饰以减轻脂质A毒性。脂质A、MPL和3D-MPL具有连接长脂肪酸链的糖主链，其中主链包含两个糖苷键中的6-碳糖，以及4号位的磷酰部分。通常，五到八个长链脂肪酸(通常为12-14个碳原子)附着在糖主链上。由于天然来源的衍生，MPL或3D-MPL可以以多种脂肪酸替代模式的复合物或混合物的形式存在，例如具有不同脂肪酸长度的七酰基、六酰基、五酰基等。这也适用于本文所述的一些其他脂质A类似物或衍生物，但是合成脂质A变体也可以定义为同质的。例如，MPL及其制造在US4436727中进行了描述，通过引用将其整体并入本文。例如，3D-MPL在US 4912094B1中进行了描述(通过引用将其全部并入本文)，其与MPL的不同之处在于选择性地去除3-羟基肉豆蔻酰残基，3-羟基肉豆蔻酰残基是与3号位的还原端葡萄糖胺相连的酯。适于包含在本文所述免疫原性组合物中的脂质A(类似物、衍生物)的实例包括MPL、3D-MPL、RC529(例如，EP1385541，通过引用将其全部并入本文)、PET脂质A、GLA(吡喃糖基糖脂佐剂，一种合成二糖糖脂；参见例如US20100310602和US8722064，通过引用将其全部合并)，SLA(参见例如Carter D等人，Clin.Transl.Immunology.5:e108(doi:10.1038/cti.2016.63)，其整体通过引用并入本文，其描述了优化人类疫苗用TLR4配体的结构-功能方法)、PHAD(磷酸化六酰基双糖；其结构与GLA相同)、3D-PHAD、3D-(6-酰基)-PHAD(3D(6A)-PHAD)(PHAD、3D-PHAD和3D(6A)PHAD是合成脂质A变体，还提供了这些分子的结构)、E6020(CAS号287180-63-6)、ONO4007、OM-174等。在某些优选实施方案中，TLR4激动剂佐剂包含脂质A类似物或选自3D-MPL、GLA或SLA的衍生物。在某些实施方案中，脂质A类似物或衍生物在脂质体中配制。

佐剂，优选包括TLR4激动剂，可以各种方式配制，例如在乳液中，例如油包水(w/o)乳液或水包油(o/w)乳液(示例为MF59、AS03)、稳定(纳米)乳液(SE)、脂质悬浮液、脂质体、(聚合)纳米颗粒、病毒体、明矾吸附、水性制剂(AF)等，代表佐剂和/或免疫原中免疫调节分子的各种递送系统(参见Reed等人，2013，见上文；以及Alving CR等人，2012,Curr OpinImmunol 24:310-315，通过引用将其全部并入本文)。

在任意实施方案中，所述免疫刺激性TLR4激动剂可任选地与其他免疫调节组分组合，例如角鲨烯水包油乳剂(例如MF59；AS03)；皂苷(如QuilA、QS7、QS21、Matrix M、Iscoms、Iscomatrix等)；铝盐；其他TLR的激活剂(例如咪唑喹啉、鞭毛蛋白、dsRNA类似物、TLR9激动剂，例如CpG等)；以及类似的(参见Reed等人，见上文)。

在任意实施方案中，本文公开的免疫原性组合物的佐剂是TLR4激动剂(例如GLA)的组合，其配制为稳定的乳液(即GLA-SE)。GLA-SE中使用的稳定乳液为水包油乳液，其中油为角鲨烯(参见例如WO2013/119856)。在任意实施方案中，本文公开的免疫原性组合物的佐剂是TLR4激动剂(例如GLA)与皂苷(例如GLA-QS21)的组合。在任意实施方案中，前述佐剂可配制为脂质体。因此，示例性佐剂还包括GLA-LSQ，其包含与皂苷(例如QS21)组合的合成TLR4激动剂(例如MPL[GLA])，配制为脂质体。

用于本文所述免疫原性组合物(包含脂质A类似物或衍生物)中的其他示例性佐剂包括SLA-SE(合成MPL[SLA]，角鲨烯油/水乳液)、SLA-纳米明矾(合成MPL[SLA]，铝盐)、GLA纳米明矾(合成MPL[GLA]，铝盐)、SLA-AF(合成MPL[SLA]，水悬浮液)、GLA-AF(合成MPL[GLA]，水悬浮液)、SLA明矾(合成MPL[SLA]，铝盐)、GLA明矾(合成MPL[GLA]，铝盐)、AS01(MPL，QS21，脂质体)、AS02(MPL，QS21，油/水乳液)、AS25(MPL，油/水乳液)、AS04(MPL，铝盐)和AS15(MPL，QS21，CpG，脂质体)。例如，见WO2008/153541；WO2010/141861；WO2013/119856；WO2019/051149；WO 2013/119856；WO 2006/116423；美国专利No.4987237；美国专利No.4436727；美国专利No.4877611；美国专利No.4866034；美国专利No.4912094；美国专利No.4987237；美国专利No.5191072；美国专利No.5593969；美国专利No.6759241；美国专利No.9017698；美国专利No.9149521；美国专利No.9149522；美国专利No.9415097；美国专利No.9415101；美国专利No.9504743；Reed G等人，2013，见上文；Johnson等人，1999,J MedChem,42:4640-4649，以及Ulrich和Myers，1995,Vaccine Design:The Subunit andAdjuvant Approach；Powell和Newman Eds.；Plenum:New York,495-524，通过引用将其全部并入本文。

金黄色葡萄球菌免疫原性组合物和使用方法

在一个方面，本文所公开的免疫原性组合物包括本文所述的SpA多肽和LukA变体多肽中的任何一种或多种，或编码本文所述多肽的一种或多种核酸分子。在另一方面，如本文所公开的免疫原性组合物包含如本文所述的SpA多肽和LukB变体多肽中的任何一种或多种，或编码如本文所述多肽的一种或多种核酸分子。在另一方面，如本文所述的免疫原性组合物包含如本文所述的SpA多肽、LukA变体多肽和LukB多肽中的任何一种或多种，或如本文所述的编码这些多肽的一种或多种核酸分子。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物包含一个或多个SpA多肽(变体或非变体)、CC45 LukA变体多肽、CC45 LukB多肽(变体或非变体)或编码它们的多核苷酸。例如，本发明的免疫原性组合物可包含如本文所述的SpA变体多肽、CC45-LukA变体多肽、CC45-LukB非变体多肽或编码其的多核苷酸。根据本实施方案的示例性免疫原性组合物含有包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中，所述至少一个结构域在对应于SEQ IDNO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45 LukA变体多肽，其包含在与SEQ IDNO:2的第81位对应的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代，以及在与SEQ ID NO:2的第139位对应的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代，在对应SEQ ID NO:2的第111和191位氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:2的第321位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在任意实施方案中，所述LukA变体多肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45 LukB多肽，例如SEQID NO:16的多肽，或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据前述实施方案的另一示例性免疫原性组合物包含SpA变体多肽、CC45-LukA变体多肽、CC45-LukB变体多肽或编码本文所述多肽的多核苷酸。一种示例性免疫原性组合物含有包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45 LukA变体多肽，其包含在与SEQ ID NO:2的第81位对应的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代，以及在与SEQID NO:2的第139位对应的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代，在对应SEQ ID NO:2第111和191位的氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:2的第321位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在一些实施方案中，所述LukA变体多肽具有SEQID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45LukB变体多肽，其包含与SEQ ID NO:16中的Val53Leu相对应的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述LukB变体多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据本实施方案的其他免疫原性组合物包含SpA变体多肽，其包含SEQ ID NO:60的序列或与SEQ ID NO:60具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列；SEQ ID NO:2的CC45 LukA变体；以及SEQ ID NO:16的CC45 LukB序列或与SEQ ID NO:16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的变体序列。在一些实施方案中，CC45 LukB变体序列包含选自SEQ ID NO:18、20和22的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ IDNO:4的CC45-LukA变体、以及SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列或与SEQ ID NO:16的CC45-LukB具有>85％序列相同性的变体序列(例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45-LukB变体序列)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ IDNO:6的CC45-LukA变体以及SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45-LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45-LukB变体序列)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ IDNO:8的CC45-LukA变体以及SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列、或与SEQ ID NO:16的CC45-LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45-LukB变体)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:10的CC45-LukA变体以及SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45-LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45-LukB变体)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:11的CC45-LukA变体以及SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45-LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45-LukB变体)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:12的CC45-LukA变体以及SEQ ID NO:16的CC45-LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45-LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45-LukB变体)。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的CC45LukA变体以及具有SEQ ID NO:16氨基酸序列的CC45 LukB。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:11氨基酸序列的CC45 LukA变体以及具有SEQ ID NO:16氨基酸序列的CC45 LukB。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:12氨基酸序列的CC45 LukA变体以及具有SEQ ID NO:16氨基酸序列的CC45 LukB。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:8氨基酸序列的CC45 LukA变体以及具有SEQ IDNO:16氨基酸序列的CC45 LukB。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的CC45 LukA变体以及具有SEQ ID NO:18氨基酸序列的CC45 LukB变体。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SpA多肽、CC8-LukA变体多肽和CC8-LukB多肽(变体或非变体)或编码本文公开的多肽的多核苷酸。例如，所述免疫原性组合物包含如本文所述的SpA变体多肽、CC8-LukA变体多肽和CC8-LukB多肽或编码它们的多核苷酸。一种示例性组合物包含含有至少一个SpA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC8 LukA变体多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的第80位的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代、在对应于SEQ ID NO:1的位置138的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代、在对应于SEQ ID NO:1第110和190位的氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代、以及在对应于SEQID NO:1的第320位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在任意实施方案中，所述LukA变体多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC8 LukB多肽，例如SEQ ID NO:15的多肽、或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据本实施方案的另一种免疫原性组合物包括本文所公开的SpA变体多肽、CC8-LukA变体多肽、CC8-LukB变体多肽或编码它们的多核苷酸。一种示例性免疫原性组合物含有包含至少一个SPA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中至少一个结构域在对应于SEQID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC8 LukA变体多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的第80位的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代、在对应于SEQ IDNO:1的第138位的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代、在对应于SEQ ID NO:1第110和190位的氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代、以及在对应于SEQ ID NO:1的第320位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在任意实施方案中，所述LukA变体多肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC8-LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:15第53位的氨基酸位置处包含缬氨酸到亮氨酸的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述LukB变体多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据本实施方案的其他免疫原性组合物包含SpA变体多肽，其包含SEQ ID NO:60的序列或与SEQ ID NO:60具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列；SEQ ID NO:1的CC8 LukA变体；以及SEQ ID NO:为15的CC8 LukB序列或与SEQ ID NO:为15具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的变体序列。在一些实施方案中，CC8 LukB序列变体序列包含选自SEQ ID No:17、19和21的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQID NO:3的CC8 LukA变体以及SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8LukB具有85％或更多序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的CC8 LukB变体序列)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ IDNO:5的CC8-LukA变体以及SEQ ID NO:15的CC8-LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8-LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的CC8-LukB变体序列)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:7的CC8 LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的CC8 LukB变体序列)。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:9的CC8 LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8 LukB具有>85％序列相同性的变体(例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的CC8 LukB变体序列)。

在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SpA多肽(变体或非变体)、CC8 LukA变体多肽和CC45LukB多肽(变体或非变体)或编码本文所述的多肽的多核苷酸。例如，所述组合物包含SpA变体多肽、CC8LukA变体多肽和CC45 LukB多肽或编码该多肽的多核苷酸。根据本实施方案的示例性免疫原性组合物含有包含至少一个SPA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC8LukA变体多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的第80位的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代，在对应于SEQ ID NO:1的第138位的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代，在对应于SEQ ID NO:1第110和190位的氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:1的第320位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在任意实施方案中，所述LukA变体多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45 LukB多肽，例如SEQ ID NO:16的多肽，或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据本实施方案的另一种免疫原性组合物包括SpA变体多肽、CC8 LukA变体多肽和CC45 LukB变体多肽或如本文所公开的编码其的多核苷酸。根据本实施方案的示例性免疫原性组合物含有包含至少一个SPA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC8 LukA变体多肽，其包含在对应于SEQ ID NO:1的第80位的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代，在对应于SEQ ID NO:1的第138位的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代，在对应于SEQ IDNO:1第110和190位的氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:1的第320位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在任意实施方案中，所述LukA变体多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45LukB变体多肽，其包含与SEQ ID NO:16中的Val53Leu相对应的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述LukB变体多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据本实施方案的其他免疫原性组合物包含SpA变体多肽，其包含SEQ ID NO:60的序列或与SEQ ID NO:1具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列，以及SEQ ID NO:16的CC45 LukB序列或与SEQ ID NO:16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的变体序列。在一些实施方案中，CC45 LukB变体序列包含选自SEQ ID NO:18、20和22的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:3的CC8 LukA变体和SEQ ID NO:16的CC45 LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45 LukB具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45 LukB变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:5的CC8 LukA变体和SEQ ID NO:16的CC45LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45 LukB具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQID NO:18、20和22的CC45 LukB变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:7的CC8 LukA变体和SEQ ID NO:16的CC45 LukB序列或其与SEQ ID NO:16的CC45 LukB具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45 LukB变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:9的CC8 LukA变体和SEQ ID NO:16的CC45 LukB序列或其与SEQID NO:16的CC45 LukB具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:18、20和22的CC45 LukB变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的CC8 LukA变体和具有SEQ ID NO:16氨基酸序列的CC45 LukB变体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的CC8 LukA变体和具有SEQ ID NO:20氨基酸序列的CC45LukB变体。

在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含SpA多肽(变体或非变体)、CC45-LukA变体多肽和CC8-LukB多肽(变体或非变体)或编码本文所述的多核苷酸。例如，本发明的免疫原性组合物可包含SpA变体多肽、CC45 LukA变体多肽和CC8 LukB多肽。一种示例性免疫原性组合物含有包含至少一个SPA A、B、C、D或E结构域的SpA变体多肽，其中至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。示例性SpA变体多肽包含SEQID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。所述组合物进一步包含CC45 LukA变体多肽，其包含在与SEQ ID NO:2的第81位对应的氨基酸位置处的赖氨酸到甲硫氨酸的取代，以及在与SEQ ID NO:2的第139位对应的氨基酸位置处的丝氨酸到丙氨酸的取代，在对应于SEQ ID NO:2第111和191位的氨基酸位置处的缬氨酸到异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:2的第321位的氨基酸位置处的谷氨酸到丙氨酸取代。在一些实施方案中，所述LukA变体多肽具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列相似性的氨基酸序列。所述组合物还包含CC8LukB多肽，例如SEQ ID NO:15的LukB多肽，或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。或者，所述组合物包含CC8-LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:15的第53位的氨基酸位置处包含缬氨酸到亮氨酸的氨基酸取代。在任意实施方案中，所述LukB变体多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的氨基酸序列。

根据本实施方案的其他免疫原性组合物包含SpA变体多肽，其包含SEQ ID NO:60的序列或与SEQ ID NO:60具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列；SEQ ID NO:2的CC45 LukA变体；以及SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或与SEQ ID NO:15具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的变体序列。在一些实施方案中，CC8 LukB变体序列包含选自SEQ ID NO:17、19和21的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:4的CC45 LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:6的CC45 LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:8的CC45LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ IDNO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:9的CC45 LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的变体序列。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:60的SpA变体多肽、SEQ ID NO:10的CC45 LukA变体和SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列或其与SEQ ID NO:15的CC8 LukB序列具有>85％序列相同性的变体，例如，选自SEQ ID NO:17、19和21的变体序列。

本发明的另一方面涉及一种免疫原性组合物，其包含如本文所述的SpA多肽和如本文所述的任何变体LukB蛋白质或多肽，或编码如本文所述的SpA和LukB变体的核酸分子。具体而言，免疫原性组合物的变体LukB蛋白质或多肽包含本文所述的一个或多个氨基酸残基插入、取代和/或缺失。在一些实施方案中，所述组合物包含SpA变体多肽和SEQ ID NO:15(CC8)的LukB变体，所述SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60序列、或与SEQ ID NO:60具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。示例性CC8 LukB变体包括但不限于SEQ ID NO.17、19和21的LukB变体。在一些实施方案中，所述组合物包含SpA变体多肽和SEQ ID NO:16的LukB变体(CC45)，所述SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60序列、或与SEQ ID NO:60具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。示例性CC45 LukB变体包括但不限于SEQ ID NO.18、20和22的LukB变体。

根据本实施方案的免疫原性组合物可进一步包含LukA蛋白或多肽。例如，如前段所述的包含SpA变体和LukB变体的组合物进一步包含SEQ ID NO:1的CC8 LukA序列或与SEQID NO:1的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的变体序列。或者，如前段所述包含SpA变体和LukB变体的免疫原性组合物进一步包含SEQ ID NO:2的CC45 LukA序列或与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的变体序列。

如本文所述的免疫原性组合物可进一步包括一种或多种额外的金黄色葡萄球菌抗原。合适的金黄色葡萄球菌抗原包括但不限于血清型336多糖抗原、聚集因子A、聚集因子B、纤维蛋白原结合蛋白、胶原结合蛋白、弹性蛋白结合蛋白、MHC类似物蛋白、多糖胞内粘附因子、β-溶血素、δ-溶血素、Panton-Valentine杀白细胞素、杀白细胞素M、剥脱毒素A、剥脱毒素B、V8蛋白酶、透明质酸裂解酶、脂肪酶、葡萄激酶、肠毒素、肠毒素超抗原SEA、肠毒素超抗原SAB、中毒性休克综合征毒素-1、聚N-琥珀酰β-1-6氨基葡萄糖、过氧化氢酶、β-内酰胺酶、磷壁酸、肽聚糖、青霉素结合蛋白、趋化抑制蛋白、补体抑制剂、Sbi、5型抗原、8型抗原和脂磷壁酸。包括在免疫原性组合物中的其他合适的金黄色葡萄球菌抗原包括但不限于CP5、CP8、Eap、Ebh、Emp、EsaB、ESC、EsxA、EsxB、EsxAB(融合)、IsdA、IsdB、IsdC、MntC、rTSST-1、rTSST-1v、TSST-1、SasF、vWbp、vWh-玻连蛋白结合蛋白、Aaa、Aap、Ant、自溶蛋白氨基葡萄糖苷酶、自溶蛋白酰胺酶、Can、胶原结合蛋白、Csa1A、EFB、弹性蛋白结合蛋白、EPB、FbpA、纤维蛋白原结合蛋白、纤维连接蛋白结合蛋白、FhuD、FhuD2、FnbA、FnbB、GehD、HarA、HBP、免疫显性ABC转运体、IsaA/PisA、层粘连蛋白受体、脂肪酶GehD、MAP、Mg2+转运体、MHC II类似物、MRPII、NPase、RNA III激活蛋白(RAP)、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、SBI、SEA外毒素、SEB外毒素、mSEB、SitC、Ni ABC转运体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、SsaA、SSP-1、SSP-2、Spa5、SpAKKAA、SpAkR、Sta006和Sta011。

本发明的免疫原性组合物是通过用医药上可接受的载体和任选地医药上可接受的赋形剂配制本文所述的SpA、LukA和/或LukB多肽来制备的。如本文所用，术语“医药上可接受的载体”和“医药上可接受的赋形剂”(例如，稀释剂、免疫刺激剂、佐剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂等添加剂)对以所用剂量和浓度施用组合物的对象无毒。医药上可接受的载体的实例包括水，例如用磷酸盐、柠檬酸盐和另一种有机酸缓冲的水。在本发明中可能有用的医药上可接受的赋形剂的代表性示例包括抗坏血酸等抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；形成盐的反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂。

本领域已知含有医药上可接受载体的医药活性成分的配方，例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(例如21版(2005)和任何更高版本)。额外的成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种医药上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物为液体制剂。液体制剂的优选实例是水性制剂，即，包含水的制剂。液体配方可包括溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等。水性配方通常包含至少50％w/w的水，或至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％w/w的水。

在任意实施方案中，所述免疫原性组合物可配制为可注射物，例如通过注射装置(例如注射器或输液泵)进行注射。例如，可以肌肉内、腹腔内、玻璃体内或静脉内进行注射。

本发明的免疫原性组合物可配制用于肠外施用。所述组合物的溶液、悬浮液或乳液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散体。示例性油是石油、动物、植物或合成油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般来说，水、生理盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液以及二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，尤其是对于注射溶液。在正常储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以防止微生物生长。

适合注射使用的药物免疫原性组合物包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所用形式必须是无菌的，并且必须是易于注射的流体。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适当混合物和植物油的溶剂或分散介质。

在任意实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物为固体制剂，例如冻干或喷雾干燥组合物，其可按原样使用，或医生或患者在使用前向其添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，例如压片和/或包衣片剂，以及胶囊(例如硬胶囊或软胶囊)。例如，免疫原性组合物还可以是小袋、糖衣丸、粉末、颗粒、锭剂或用于重组的粉末的形式。

免疫原性组合物的剂型可以是即释的，在这种情况下，它们可以包含水溶性或分散性载体，也可以是延迟释放、缓释或改性释放的，在这种情况下，它们可以包含水不溶性聚合物，调节剂型在胃肠道或皮肤下的溶解速率。

在其他实施方案中，所述免疫原性组合物可经鼻内、颊内或舌下递送。

免疫原性组合物水溶液中的pH值可以在pH 3至pH 10。在一个实施方案中，免疫原性组合物的pH值为约7.0至约9.5。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物的pH值为约3.0至约7.0。

本发明的另一方面涉及使用本文所述免疫原性组合物的方法。因此，一个方面涉及一种在有此需要的对象中治疗或预防葡萄球菌感染的方法，其涉及施用有效量的如本文所公开的免疫原性组合物。另一方面涉及一种用于在有此需要的对象中引发对葡萄球菌细菌的免疫应答的方法，其涉及施用有效量的如本文所公开的免疫原性组合物。另一方面涉及一种用于在有此需要的对象中去定植葡萄球菌细菌或防止葡萄球菌细菌定植或再定植的方法，其涉及施用有效量的如本文所公开的免疫原性组合物。根据这方面，本文所述的方法适合于在有此需要的对象中防止葡萄球菌细菌的短期和持久定植或再定植。

本发明的方法涉及施用上文所述的任何一种免疫原性组合物。根据本发明的这些方面，适合治疗的对象是有可能发展为金黄色葡萄球菌感染的对象、有可能暴露于金黄色葡萄球菌细菌的对象和/或暴露于金黄色葡萄球菌细菌的对象。

根据本发明的这一方面，向对象施用有效预防量的免疫原性组合物，以产生针对金黄色葡萄球菌感染的免疫应答。有效预防量是产生或引发体液(即抗体介导的)和细胞(T细胞)免疫应答所需的量。引发的体液应答足以预防或至少降低金黄色葡萄球菌感染的程度，否则在没有这种应答的情况下，金黄色葡萄球菌感染会发展。优选地，施用预防性有效量的本文所述免疫原性组合物可在对象中引发针对金黄色葡萄球菌的中和免疫应答。为了在对象中实现有效的免疫应答，所述组合物可进一步包含一种或多种额外的金黄色葡萄球菌抗原或佐剂，如上文所述。在替代实施方案中，在施用本发明组合物之前、之后或同时，将佐剂与组合物分开施用给对象。

就本发明的这一方面而言，目标“对象”包括任何动物，优选哺乳动物，更优选人类。在为预防、抑制或降低对象中金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌定植的严重程度而施用免疫原性组合物的情况下，目标对象包括任何有被金黄色葡萄球菌感染风险的对象。特别易感的对象包括免疫功能低下的婴儿、青少年、成年人和老年人。然而，任何有金黄色葡萄球菌感染风险的婴儿、少年、成人或老年人都可以按照本文所述的方法和免疫原性组合物进行治疗。特别适合的对象包括有感染耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)或对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)风险的人。其他合适的对象包括可能患有或有可能患上由金黄色葡萄球菌感染引起的疾病的对象，即与金黄色葡萄球菌相关的疾病，例如皮肤创伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤皮肤综合征、败血症、败血症性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征。

在一些实施方案中，对象至少或最多为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、67、68、70、71、72、74、75、76、77、78、79、80、85或90岁(或其中可衍生的任何范围)。在某些实施方案中，本文所述的对象或患者(例如人类对象)是儿科对象。儿科对象定义为18岁以下。在一些实施方案中，儿科对象t为2岁或以下。在一些实施方案中，儿科对象小于1岁。在一些实施方案中，儿科对象小于6月龄。在一些实施方案中，儿科对象为2月龄或更少。在一些实施方案中，人类患者为65岁或以上。在一些实施方案中，人类患者是保健工作者。在一些实施方案中，患者将接受外科手术。

在有效诱导强烈免疫应答的条件下施用免疫原性组合物时，也可考虑许多其他因素。这些因素包括，例如但不限于，组合物中活性剂的浓度、施用方式和频率，以及对象的详细信息，如年龄、体重、整体健康和免疫状况。例如，可以在International Conference onHarmonization和REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Company1990)的出版物中找到一般性指导，通过引用将其全部并入本文。临床医生可施用如本文所述的免疫原性组合物，直到达到提供所需或所需预防效果的剂量，例如所需抗体滴度。预防反应的进展可以很容易地通过常规检测进行监测。

在本发明的一个实施方案中，预防性地施用本文所述的免疫原性组合物，以防止、延迟或抑制有感染金黄色葡萄球菌风险或有发展相关疾病风险的对象发生金黄色葡萄球菌感染。在本发明的一些实施方案中，预防性施用免疫原性组合物可有效地完全预防个体中的金黄色葡萄球菌感染。在其他实施方案中，预防性施用有效地防止在没有这种施用的情况下会发展的全部感染程度，即基本上防止或抑制个体中的金黄色葡萄球菌感染。

在使用预防性组合物预防金黄色葡萄球菌感染的情况下，所述组合物的剂量足以产生能够中和金黄色葡萄球菌LukAB介导的细胞毒性和SpA介导的毒力活性的抗体滴度，并且能够减少许多症状，降低至少一种症状的严重程度，或者至少一种症状进一步进展的延迟，甚至感染的完全缓解。

本文所述免疫原性组合物的有效预防量将取决于是否联合施用佐剂，在没有佐剂的情况下需要更高剂量。SpA、LukA和LukB多肽和/或编码它们的多核苷酸的施用量可在每位患者1μg-500μg之间变化。在一些实施方案中，每次人体注射使用5、10、20、25、50或100μg。偶尔，每次注射使用1-50mg的更高剂量。在一些实施方案中，每次人体注射使用约10、20、30、40或50mg。注射的时间可能会有很大差异，从每年一次到十年一次。通常，可以通过从对象获得液体样本(通常是血清样本)并测定针对SpA、LukA、LukB或LukAB产生的抗体的滴度来监测有效剂量，使用本领域众所周知且易于适用于待测特定抗原的方法。理想情况下，在初次施用之前采集样本，然后在每次免疫后采集后续样本并进行滴度。一般来说，在血清稀释率为1:100的情况下，提供至少四倍于对照或“背景”水平的可检测滴度的剂量或施用方案是可取的，其中背景是相对于对照血清或相对于ELISA分析中的平板背景定义的。

本发明的免疫原性组合物可通过肠外、局部、静脉注射、口服、腹腔内、鼻内或肌肉注射的方式进行预防性治疗。

实施方案

实施方案本发明还提供以下非限制性实施方案。

实施方案1是一种免疫原性组合物，包括：

(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，以及

(ii)金黄色葡萄球菌LukA变体多肽，所述LukA变体多肽包含对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Lys83、Ser141、Val113和Val193的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。

实施方案2是两种或两种以上免疫原性组合物的组合，共同包含：

(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，以及

实施方案3是实施方案1的免疫原性组合物或实施方案2的免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的Glu323的氨基酸残基处包含氨基酸取代。

实施方案4是实施方案1-3中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Lys83、Ser141、Val113、Val193和Glu323的各个氨基酸残基处的氨基酸取代。

实施方案5是实施方案4的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中氨基酸取代包括Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile和Glu323Ala。

实施方案6是实施方案1-5中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

实施方案7是实施方案1-6中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽进一步包括在对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。

实施方案8是实施方案7的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中氨基酸取代包括Tyr74Cys、Asp140Cys、Gly149Cys和Gly156Cys。

实施方案9是实施方案7或8的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

实施方案10是实施方案1-9中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述变体LukA蛋白质或多肽进一步包括对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Thr249的氨基酸残基处的氨基酸取代。

实施方案11是实施方案10的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列。

实施方案12是实施方案1-11中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA多肽是SpA变体多肽。

实施方案13是实施方案12的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽具有破坏Fc结合的至少一个氨基酸取代和破坏VH3结合的至少一个第二氨基酸取代。

实施方案14是实施方案12或13的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SpA D结构域，所述SpA D结构域包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案15是实施方案14的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽进一步包含SpA E、A、B和/或C结构域。

实施方案16是实施方案15的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpAE结构域包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA A结构域包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA B结构域包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列；SpA C结构域包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案17是实施方案12或13的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SpA E、D、A、B或C结构域，其中SpA E结构域包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，其中SpA D结构域包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA A结构域包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA B结构域包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列；SpA C结构域包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案18是实施方案12-17中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽连续包含SpA E、D、A、B和C结构域。

实施方案19是实施方案18的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽包含SpA E、D、A、B和C结构域，并且具有与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案20是实施方案12-17中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中各个SpA E、D、A、B和C结构域在对应于SEQ ID NO:58的氨基酸第9和10位的一个或两个氨基酸位置处具有氨基酸取代。

实施方案21是实施方案20的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中与SEQ ID NO:58的第9和10位相对应的一个或两个氨基酸位置处的氨基酸取代是谷氨酰胺残基到赖氨酸的取代。

实施方案22是实施方案21的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SpA E、D、A、B和C结构域，并且具有与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案23是实施方案12-22中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，并且其中所述至少一个结构域具有(i)对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的谷氨酰胺残基处的赖氨酸取代和(ii)对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处的谷氨酸取代。

实施方案24是实施方案23的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpAE结构域包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，其中SpA D结构域包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA A结构域包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA B结构域包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列；SpA C结构域包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案25是实施方案23的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpAE结构域包含与SEQ ID NO:92的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，其中SpA D结构域包含与SEQ ID NO:91的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA A结构域包含与SEQ ID NO:88的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA B结构域包含与SEQ ID NO:89的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列；SpA C结构域包含与SEQ ID NO:90的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案26是实施方案23的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案27是实施方案12-22中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，并且其中所述至少一个结构域具有(i)对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的谷氨酰胺残基处的赖氨酸取代和(ii)对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处的苏氨酸取代。

实施方案28是实施方案27的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpAE结构域包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，其中SpA D结构域包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA A结构域包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA B结构域包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列；SpA C结构域包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案29是实施方案27的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpAE结构域包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，其中SpA D结构域包含与SEQ ID NO:96的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA A结构域包含与SEQ ID NO:93的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA B结构域包含与SEQ ID NO:94的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列，SpA C结构域包含与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

实施方案30是实施方案27的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案31是实施方案12-22中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，并且其中，所述至少一个结构域具有(i)对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的谷氨酰胺残基处的赖氨酸取代和(ii)对应于SEQ ID NO:58的第29位的氨基酸位置处的氨基酸取代。

实施方案32是实施方案1-31中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物进一步包含金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽或其变体。

实施方案33是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB多肽是SEQ ID NO:15的LukB多肽或SEQ ID NO:SEQ ID NO:16的LukB多肽。

实施方案34是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB多肽是LukB变体多肽。

实施方案35是实施方案34的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％序列相似性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少85％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案36是实施方案35的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽在对应于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的第53位的氨基酸位置处包含氨基酸取代。

实施方案37是实施方案36的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中氨基酸取代是缬氨酸到亮氨酸的取代。

实施方案38是实施方案34-37中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽包含对应于SEQ ID NO:15的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。

实施方案38是实施方案34-37中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽包含对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基Glu45、Glu110、Thr122和Arg155的一个或多个氨基酸残基处的氨基酸取代。

实施方案40是实施方案34-39中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽包含与选自SEQ ID NO:17-22的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

实施方案41是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含LukA变体多肽和LukB多肽，所述LukA变体多肽氨基酸序列SEQ ID NO:4、或与SEQ ID NO:4具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，所述LukB多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:16具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

实施方案42是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含LukA变体多肽和LukB多肽，所述LukA变体多肽氨基酸序列SEQ ID NO:3、或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，所述LukB多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:15具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

实施方案43是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含LukA变体多肽和LukB多肽，所述LukA变体多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，所述LukB多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:18具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

实施方案44是实施方案41-43中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA多肽是SpA变体多肽。

实施方案45是实施方案44的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，并且其中所述至少一个结构域具有(i)对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的谷氨酰胺残基处的赖氨酸取代和(ii)对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处的谷氨酸取代。

实施方案46是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中(i)SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，其中，所述至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代；(ii)LukA变体多肽包含CC8 LukA变体多肽，其包含与SEQ ID NO:1的第80位对应的氨基酸位置处的甲硫氨酸取代、与SEQ ID NO:1的第138位对应的氨基酸位置处的丙氨酸取代、与SEQ ID NO:1的第110和190位对应的氨基酸位置处的异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:1的第320位的氨基酸位置处的丙氨酸取代；和(iii)所述LukB多肽是CC45 LukB变体多肽，其包含与SEQ ID NO:16的第53位相对应的氨基酸位置处的亮氨酸取代。

实施方案47是实施方案46的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukA变体多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukB变体多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案48是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中(i)SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，其中，所述至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代；(ii)LukA变体多肽包含CC8 LukA变体多肽，其包含与SEQ ID NO:1的第80位对应的氨基酸位置处的甲硫氨酸取代、与SEQ ID NO:1的第138位对应的氨基酸位置处的丙氨酸取代、与SEQ ID NO:1的第110和190位对应的氨基酸位置处的异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:1的第320位的氨基酸位置处的丙氨酸取代；以及(iii)所述LukB多肽是CC8 LukB变体多肽，其在对应于SEQ ID NO:15的第53位的氨基酸位置处包含亮氨酸取代。

实施方案49是实施方案48的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukA变体多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukB变体多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案50是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中(i)SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，其中，所述至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代；(ii)LukA变体多肽包含CC8 LukA变体多肽，其包含与SEQ ID NO:1的第80位对应的氨基酸位置处的甲硫氨酸取代、与SEQ ID NO:1的第138位对应的氨基酸位置处的丙氨酸取代、与SEQ ID NO:1的第110和190位对应的氨基酸位置处的异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:1的第320位的氨基酸位置处的丙氨酸取代；和(iii)LukB多肽是CC8 LukB多肽，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

实施方案51是实施方案50的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukA变体多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukB多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案52是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中(i)SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，其中，所述至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代；(ii)所述LukA变体多肽包含CC45 LukA变体多肽，所述CC45 LukA变体多肽包含对应于SEQ ID NO:2第81位的氨基酸位置处的甲硫氨酸取代、对应于SEQ ID NO:2第139位的氨基酸位置处的丙氨酸取代、对应于SEQ ID NO:2第111和191位的氨基酸位置处的异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:2的第321位的氨基酸位置处的丙氨酸取代；和(iii)所述LukB多肽是CC45 LukB变体多肽，其包含对应于SEQ IDNO:16的第53位的氨基酸位置处的亮氨酸取代。

实施方案53是实施方案52的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukA变体多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukB变体多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案54是实施方案32的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中(i)SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，其中，所述至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代；(ii)所述LukA变体多肽包含CC45 LukA变体多肽，所述CC45 LukA变体多肽包含对应于SEQ ID NO:2第81位的氨基酸位置处的甲硫氨酸取代、对应于SEQ ID NO:2第139位的氨基酸位置处的丙氨酸取代、对应于SEQ ID NO:2第111和191位的氨基酸位置处的异亮氨酸取代，以及在对应于SEQ ID NO:2的第321位的氨基酸位置处的丙氨酸取代；和(iii)所述LukB多肽为CC45 LukB多肽，包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

实施方案55是实施方案54的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中SpA变体多肽包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukA变体多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列；LukB多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

实施方案56是实施方案1至55中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，进一步包含佐剂。

实施方案57是实施方案56的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含铝盐，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和氧化铝。

实施方案58是实施方案56的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含氢氧化铝或磷酸铝。

实施方案59是实施方案56的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含稳定的水包油乳液。

实施方案60是实施方案56的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含皂苷。

实施方案61是实施方案60的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中皂苷为QS21。

实施方案62是实施方案56的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含TLR4激动剂。

实施方案63是实施方案62的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中TLR4激动剂是脂质A或其类似物或衍生物。

实施方案64是实施方案62的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中TLR4激动剂包含MPL、3D-MPL、RC529、GLA、SLA、E6020、PET脂质A、PHAD、3D-PHAD、3D-(6-酰基)-PHAD、ONO4007或OM-174。

实施方案65是实施方案62的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中TLR4激动剂是吡喃糖基脂佐剂(GLA)。

实施方案66是实施方案62的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含TLR4激动剂与稳定的水包油乳液的组合。

实施方案67是实施方案62的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含在稳定的水包油乳液中配制的TLR4激动剂。

实施方案68是实施方案65的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含GLA-SE。

实施方案69是实施方案62的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含TLR-4激动剂与皂苷的组合。

实施方案70是实施方案65的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中佐剂包含GLA-LSQ。

实施方案71是一种免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含一个或多个分离的核酸分子，编码实施方案1-55中任一实施方案的免疫原性组合物的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体、LukA变体多肽和LukB多肽或其变体。

实施方案72是实施方案71的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含编码金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体的一个或多个核酸分子和编码LukAB异二聚体(RARPR-15)的核酸分子，其中，编码所述LukAB异二聚体的核酸分子包含与SEQ ID NO:104的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列与与SEQ ID NO:108的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。

实施方案73是实施方案71的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物至少包含编码金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体的核酸分子和编码LukAB异二聚体(RARPR-30)的核酸分子，其中，编码所述LukAB异二聚体的核酸分子包含与SEQ IDNO:104的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:110的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。

实施方案74是实施方案71的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含编码金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体的一个或多个核酸分子和编码LukAB异二聚体(RARPR-32)的核酸分子，其中，编码所述LukAB异二聚体的核酸分子包含与SEQ ID NO:103的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:107的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。

实施方案75是实施方案71的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含编码金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体的一个或多个核酸分子和编码LukAB异二聚体(RARPR-33)的核酸分子，其中，编码所述LukAB异二聚体的核酸分子包含与SEQ ID NO:103的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:110的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％，或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。

实施方案76是实施方案71的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含编码金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体的一个或多个核酸分子和编码LukAB异二聚体(RARPR-34)的核酸分子，其中，编码所述LukAB异二聚体的核酸分子包含与SEQ ID NO:103的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列相似性的核苷酸序列，该核苷酸序列和与SEQ ID NO:109的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％，或至少99％的序列相似性的核苷酸序列可操作地连接。

实施方案77是实施方案71的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中一个或多个核酸分子包含在一个或多个载体中。

实施方案78是实施方案71或77的免疫原性组合物，其中所述组合物包含宿主细胞，所述宿主细胞包含所述一个或多个核酸分子或所述一个或多个载体。

实施方案79是一种在有此需要的对象中治疗或预防葡萄球菌感染的方法，该方法包括：向需要的对象施用有效量的根据权利要求1至78中任一项的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

实施方案80是一种在有此需要的对象中引发对葡萄球菌细菌的免疫应答的方法，该方法包括：向需要的对象施用有效量的根据权利要求1至78中任一项的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

实施方案81是一种用于在有此需要的对象中去定植葡萄球菌细菌或防止葡萄球菌细菌定植或再定植的方法，该方法包括：向需要的对象施用有效量的根据权利要求1至78中任一项的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

实施方案82是实施方案1-78中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其用于在对象中产生针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法。

实施方案83是实施方案1-78中任一实施方案的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其用作药物。

实施例

提供以下实施例是为了说明本发明的实施方案，但绝不是为了限制其范围。

实施例1：示例性LukA变体多肽、LukB变体多肽和稳定的LukAB异二聚体复合物

为了表达LukAB异二聚体蛋白，大肠杆菌BL21(DE3)细胞与克隆到pCDFDuet-1的LukA构建体和克隆到pETDuet-1的LukB构建体共转化。转化子在50μg/mL氨苄西林和50μg/mL大观霉素中培养，分别在37℃的Luria Bertani肉汤中选择pETDuet-1和pCDFDuet-1，并在190rpm的转速下振荡过夜。为了表达，新鲜的TB(Terrific Broth)培养基在37℃下接种1:50稀释的过夜培养物，以190rpm的转速摇动，直到培养物达到OD₆₀₀＝2。然后通过添加最终浓度为1mM的异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导表达，并在37℃下继续诱导5小时。在大肠杆菌Origami 2(DE3)细胞的细胞质中表达LukAB异二聚体，包括LukA和/或LukB中的成对半胱氨酸取代，以支持二硫键的形成。LukA单体在大肠杆菌BL21(DE3)的周质中的表达是通过在pD861 CH中转化LukA构建体来实现的，并使用最终浓度为4mM的鼠李糖在37℃下诱导4小时，在TB培养基(添加30μg/mL卡那霉素)中进行诱导。在诱导胞质和周质表达构建体后，通过在4℃下以4000rpm离心15分钟获得细胞，然后在裂解缓冲液中重新悬浮(94％Bugbuster[EMD Millipore]+6％5M NaCl+0.4％4M咪唑+蛋白酶抑制剂混合物[ProteaseRestart，G-Biosciences])。在室温下裂解20分钟后，将裂解产物在冰上孵育45分钟，然后在16100×g，4℃下离心35分钟。使用AKTA Pure 25M FPLC和HisTrap柱，通过LukA N端的6×His标签纯化蛋白质，并使用咪唑梯度(50-500mM咪唑溶于50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，200mM NaCl)洗脱。将含有SDS-PAGE测定的纯化蛋白质的组分汇集在一起，并在4℃条件下，在50mM磷酸钠缓冲液、pH 7.4、200mM NaCl、10％甘油中透析过夜。纯化的蛋白质通过双金鸡纳酸(BCA)蛋白质分析(PIERE)进行定量。

表5.本文所述研究中使用的示例性LukA、LukB和LukAB异二聚体复合物

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实施例2：野生型、LukA和LukAB类毒素的细胞毒性

LukAB类毒素蛋白(定义见表5)的细胞毒性是通过与野生型LukAB毒素进行比较来评估的，使用启动子细胞系THP-1或新鲜分离的原代人类多形核白细胞(hPMN)。

在测试细胞毒性之前，在佛波醇12肉豆蔻酸13醋酸盐存在下分化THP-1细胞。对于THP-1细胞毒性试验，将50L RPMI中的1×10⁵个细胞添加到96孔板的每个孔中。将LukAB毒素和类毒素蛋白调整至标准蛋白质浓度，在冰冷的RPMI培养基中连续稀释，并将50L体积的每种蛋白质添加到适当的孔中。除仅RPMI阴性对照外，将Triton X-100添加至最终浓度0.1％作为阳性对照。平板在37℃、5％CO₂下孵育2小时，然后使用CytoTox ONE分析(Promega)评估作为膜完整性标记的细胞质酶乳酸脱氢酶的释放。

下表6提供了LukA和LukAB类毒素对分化的THP-1细胞的细胞毒性。分化的THP-1细胞对野生型毒素敏感，因为CC8和CC45-LukAB野生型毒素在毒素浓度低至0.313μg/mL时杀死30％或更多的细胞群。缺失LukA(Δ10)C端的最后10个氨基酸残基可将CC8Δ10毒素的细胞毒性降低到40μg/mL时细胞死亡的5％以下，但不会降低CC45Δ10毒素对分化的THP-1细胞的细胞毒性。两种LukA单体均未显示出对分化的THP-1细胞的细胞毒性。这一结果是意料之中的，因为在没有LukB的情况下，LukA不应形成活性孔隙复合体。每种LukAB二聚体类毒素，包括RARPR-33、RARPR-34和RARPR-15，对分化的THP-1细胞的细胞毒性显著降低，在最高测试浓度(40μg/mL)下，每种测试的类毒素的细胞死亡率为1％或更低。

表6.LukA或LukAB蛋白对分化的THP-1细胞(一种单核细胞系)的细胞毒性，使用标准剂量的毒素。数据以死亡细胞的百分比表示。

对于hPMN，在染毒之前，将所有毒素标准化为2.5μg/mL(每个亚单位)，然后用移液管将20μL毒素移到96孔板的顶部孔中，并在10μL 1X PBS中连续稀释2倍。分离PMN，并将其标准化为每90μL RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)200000个细胞。然后用移液管将90μLPMN移入每个孔中，并将毒素-PMN混合物在37℃+5％CO₂培养箱中孵育1小时。为了评估毒性，向96孔板中加入10μL CellTiter 96Aqueous One溶液(CellTiter；Promega)，并在37℃的5％CO₂中孵育混合物1.5小时。使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器在492nm的吸光度下评估PMN的活性。

下表7提供了LukA单体和LukAB二聚体类毒素对人类原代PMN细胞的细胞毒性。在毒素浓度分别为0.313μg/mL和1.25μg/mL时，野生型CC8和CC45毒素对原代人PMN的杀伤率超过90％。相比之下，每种LukAB类毒素和LukA单体对这些细胞的细胞毒性都显著降低。缺失CC8-LukA中的10个C端残基基本上消除了对分化的THP-1细胞的细胞毒性，而这种毒素保留了对hPMN的细胞毒性，在浓度等于或高于5g/mL时观察到的杀伤率超过20％。CC8和CC45-LukA单体对hPMN的细胞毒性很小，正如预期的那样，类毒素缺乏对活性孔复合体的形成至关重要的LukB成分。与CC8和CC45野生型LukAB毒素相比，每种LukAB二聚体类毒素对hPMN细胞的细胞毒性都显著降低。RARPR-33LukAB类毒素以及相关类毒素RARPR-32和-34的细胞毒性低于CC8Δ10，在最高测试浓度(20μg/mL)下，RARPR-33仅杀死15％的细胞群。

表7.LukA或LukAB蛋白对人原代多形核白细胞的细胞毒性，使用标准剂量的毒素。数据以死亡细胞的百分比表示

实施例3：RARPR-33-LukAB类毒素和其他WT-LukAB毒素变体的细胞毒性

进行了额外的实验，以评估RARPR-33和不同的WT-LukAB毒素变体和LukA单体的细胞毒性和免疫原性。用小鼠进行免疫原性研究。

评估了LukAB毒素、类毒素和单体对人PMN的细胞毒性。染毒前，将所有毒素标准化为100μg/mL(每个亚单位)，然后用移液管将20μL毒素移到96孔板的顶部孔中，并在10μL 1XPBS中连续稀释2倍。从不同捐赠者中分离PMN，并将其标准化为每90μL RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)200000个细胞。将90μL PMN移液到每个孔中，将毒素-PMN混合物在37℃+5％CO₂培养箱中孵育1小时。为了评估毒性，向96孔板中加入10μL CellTiter 96Aqueous One溶液(CellTiter；Promega)，并在37℃的5％CO₂中孵育混合物1.5小时。使用PerkinlemerEnVision 2103多标签阅读器在492nm的吸光度下评估PMN的活性。通过减去背景(健康细胞+PBS)并通过相对Triton X100处理的细胞的标准化(设置为100％死亡)，计算死亡细胞的百分比。

图3示出了LukA单体和LukAB毒素对人类原代PMN细胞的细胞毒性。野生型LukABCC8和CC45毒素在毒素浓度分别为2.5μg/mL和5μg/mL时，对原代人PMN的杀伤率超过90％。LukAB杂合毒素CC8/CC45和CC45/CC8在2.5μg/mL时也观察到最大杀伤率。相比之下，LukAB类毒素和LukA单体对这些细胞的细胞毒性显著降低。CC8 LukA中10个C末端残基的缺失保留了对hPMN的细胞毒性，在浓度等于或高于5μg/mL时观察到超过20％的杀伤作用。CC8和CC45 LukA单体以及这些单体的组合对hPMN的细胞毒性很小。RARPR-33LukAB类毒素的细胞毒性低于CC8Δ10C，在最高测试浓度20μg/mL时，RARPR-33仅杀死15％的细胞群。

实施例4：小鼠中LukAB变体的免疫原性

为了确定不同LukAB变体的免疫原性，对Envigo Hsd:ND4(4周龄)小鼠(n＝5/抗原)皮下注射溶于50μl 10％甘油1X TBS混合50μl佐剂Gold的20μg LukAB。一组5只小鼠也接受了模拟免疫，包括等量的10％甘油1X TBS和/>Gold。在两次同一抗原-佐剂混合物后强化(间隔两周)后，通过心脏穿刺给小鼠放血，并获得血清。

为了测定抗LukAB抗体滴度，进行ELISA。将WT LukAB CC8或CC45在1X PBS中稀释至2μg/ml，并在96孔Immulon 2HB板(Thermo Fisher，分类号3455)中涂于100μl中，并在4℃下孵育过夜。然后用洗涤缓冲液(1X PBS+0.05％吐温)洗涤培养皿3次，然后用200μl封闭缓冲液(2.5％溶于1X PBS的牛奶)封闭培养皿1小时。从血清的1:500开始，在封闭缓冲液中产生五倍的连续稀释液，并允许在摇床上孵育1小时。然后将培养皿再次洗涤3次，加入在封闭缓冲液中稀释1:5000的小鼠IgG HRP(Biorad)抗体，并在室温下孵育1小时。未结合的二级抗体用洗涤缓冲液连续洗涤三次。将TMB(100μl)升至室温，添加到每个孔中，并覆盖孵育25分钟。反应完成后，向每个反应孔中加入等量的2N硫酸以停止反应。然后在Envision平板阅读器上读取450nm吸光度的平板。图4A和4B所示的热图示出了重复测定的平均吸光度值，黑色表示高吸光度和抗体与涂层抗原结合，白色表示低吸光度和无抗体结合。

RARPR-33诱导了强大的抗CC8和抗CC45 LukAB IgG抗体滴度(图4A和图4B)。与CC8WT毒素、CC8/CC45杂合毒素和CC8Δ10C类毒素免疫相比，RARPR-33免疫可产生类似的抗CC8IgG反应。单个CC8-LukA单体诱导的抗CC8-LukAB IgG滴度没有CC8-LukAB毒素或CC8/CC45杂合毒素、CC45/CC8杂合毒素和RARPR 33杂合抗原诱导的滴度高(图4A)。

RARPR-33免疫小鼠的抗-cc45 LukAb滴度高于cc8/cc45 WT杂合抗原诱导的抗体，与cc45 WT抗原引起的抗体水平一致。将CC8和CC45-LukA单体结合在一起，可产生针对CC8和CC45-LukAB的抗体滴度(图4B)。然而，由CC8和CC45-LukA组合单体诱导的这些抗CC8和抗CC45-LukAB滴度没有RARPR 33诱导的滴度高。单个CC45-LukA单体可诱导非常高的抗CC45-LukAB滴度—类似于CC45/CC8杂合所诱导的水平，仅略低于RARPR-33或CC45-WT毒素所诱导的水平。这些结果表明，在RARPR-33免疫后，针对LukAB CC8和CC45的抗体反应都被诱导，且程度很高。

实施例5：抗体介导的毒素细胞毒性中和

用从如上实施例4所述免疫的小鼠获得的血清评估抗体介导的毒素细胞毒性中和。热灭活的混合血清在PBS中标准化为40％的血清，然后用移液管将20μL血清移到96孔板的顶部孔中，并在10μL 1XPBS中连续稀释2倍。在室温下，将每个LukAB毒素克隆复合物序列变体的LD₉₀添加到平板(10μL/孔)中15分钟。然后将新分离的人原代多形核白细胞(hPMN)标准化为每80μL RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)20万个细胞，添加到血清-毒素混合物中，并在37℃+5％CO₂下孵育1小时。为了评估毒性，向96孔板中加入10μL CellTiter 96AqueousOne溶液(CellTiter；Promega)，并在37℃的5％CO₂中孵育混合物1.5小时。使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器在492nm的吸光度下评估PMN的活性。抗体中和数据如图5所示。

在所有抗原中，用RARPR-33免疫的小鼠血清表现出最强、广泛的LukAB中和能力(图5)。来自RARPR 33免疫小鼠的血清在低至0.25％的血清中强烈中和了所有11种LukAB变体的细胞毒性作用，并且对于大多数LukAB变体，在低至0.063-0.125％的血清中也提供了保护(图5)。使用单个CC8和CC45LukA单体进行免疫，产生具有高度偏好抗原骨架的LukAB中和能力的血清(图5)。在每次免疫接种中，以20μg每种单体(40μg总蛋白)施用CC8-LukA单体和CC45-LukA的组合产生具有广泛和有效的LukAB中和能力的血清，以低至0.5％的血清中和所有11种LukAB变体(图5)，然而，这低于用RARPR-33免疫小鼠的血清观察到的结果。

结合来看，实施例3-5中提供的数据示出，纳入RARPR-33的CC8/CC45-LukAB骨架的衰减和稳定突变提高了CC8/CC45-WT-LukAB杂合的广泛免疫原性效应(图4和5)，同时也使RARPR-33与CC8/CC45-WT-LukAB毒素相比高度减毒(图3)。

实施例6：抗血清毒素中和

抗体介导的毒素细胞毒性中和，使用从接种野生型LukAB、野生型LukAB杂合(即CC8-LukA/CC45-LukB和CC45-LukA/CC8-LukB)、LukA单体或LukAB类毒素的小鼠获得的血清进行评估。热灭活的混合血清在PBS中标准化为40％的血清，然后用移液管将20μL血清移到96孔板的顶孔中，并在10μL 1X PBS中连续稀释2倍。然后在室温下，将每个LukAB毒素克隆复合物序列变体的LD₉₀添加到含有2％、1％或0.5％血清的培养皿(10μL/孔)中15分钟。然后将从不同捐赠者新鲜分离的人原代多形核白细胞(hPMN)加入血清毒素混合物中，并在37℃+5％CO₂下孵育1小时，其标准化为每80μLRPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)20万个细胞。为了评估毒性，向96孔板中加入10μL CellTiter 96Aqueous One溶液(CellTiter；Promega)，并在37℃的5％CO₂中孵育混合物1.5小时。使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器在492nm的吸光度下评估PMN的活性。抗体中和数据如图6A(2％抗体血清)、图6B(1％抗体血清)和图6C(0.5％抗体血清)的表格所示。

用野生型CC8和CC45 LukAB进行免疫可产生抗体，以反映免疫抗原序列组成的模式对LukAB毒素的天然序列变体进行中和。由CC8-LukAB毒素诱导的抗体能有效中和来自CC8、CC1、CC5和其他金黄色葡萄球菌谱系的毒素，但不能完全中和来自CC30、CC45或ST22A金黄色葡萄球菌的毒素。同样，用CC45-LukAB毒素免疫可产生抗体，这些抗体可有效中和来自CC30、CC45或ST22A金黄色葡萄球菌谱系的毒素，但不能中和来自其他谱系的毒素。

用非天然杂合的LukAB(CC8-LukA与CC45-LukB组合或CC45-LukA与CC8-LukB组合)免疫小鼠，与自然产生的二聚体组合相比，产生的抗体展示出更广泛的LukAB序列变体中和。在非天然杂合二聚体中，CC8-LukA和CC45-LukB表现出比相反组合略好的中和特性，这种模式保留在LukA倒数第二个残基(E323A)中携带Glu-to-Ala取代的蛋白质中。正如针对野生型毒素诱导的抗体所观察到的，LukA单体诱导的抗体诱导了能表明其序列组成的中和模式。CC8-LukA和CC45-LukA单体的组合(RARPR-31+CC45-LukA W97)诱导的抗体显示出广泛的中和模式，但与二聚体抗原相比，中和效力降低，这从1％或0.5％血清的中和水平降低可以明显看出。

在二聚体类毒素中，RARPR-15、RARPR-33和RARPR-34对所有测试的LukAB序列变体展示出广泛的中和抗体反应。非天然野生型二聚体组合也表现出广泛的中和作用，尽管中和反应的效力不如在几种类毒素中观察到的效力。当在2％(图6A)和1％(图6B)血清中测试时，杂合野生型和类毒素抗原均展示出广泛的中和特性，但当在0.5％血清中测试时，对类毒素的反应的效力明显提高(图6C)。在这个最低测试浓度下，RARPR-15、RARPR-32、RARPR-33和RARPR-34均显示出广泛的中和反应。尤其是RARPR-33诱导的血清保留了广泛的中和反应，而杂合野生型抗原和E323A类毒素在0.5％的血清中未能诱导广泛的保护反应，CC45类毒素RARPR-15在最低测试浓度下诱导的中和模式反映了其序列组成，因为只有CC30、CC45和ST22ALukAB毒素的中和水平较高。杂合二聚体类毒素RARPR-33诱导了一种有效且广泛的中和免疫反应。

实施例7：高浓度RARPR-33的细胞毒性。

方法：

细胞毒性试验：为了评估每个LukAB蛋白复合物的细胞毒性，新鲜分离的原代人类多形核白细胞(PMN)染毒金黄色葡萄球菌毒素。从不同捐赠者分离PMN，并将其标准化为每50μl RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)200000个细胞。向细胞中添加溶于50μl PBS的毒素，并在37℃+5％CO₂培养箱中孵育毒素-PMN混合物1小时。为了评估毒性，向96孔板中添加10μlCellTiter 96水溶液(CellTiter；Promega)，并在37℃的5％CO₂中孵育混合物1.5小时。使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器在492nm的吸光度下评估PMN的存活率通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对TritonX处理的细胞进行标准化(设置为100％死亡)，计算死亡细胞。

LDH测定：为了评估每个LukAB蛋白复合物是否能引起细胞溶解，从不同捐赠者新鲜分离的原代人类多形核白细胞(PMN)被金黄色葡萄球菌LukAB毒素染毒，并测定LDH释放。将WT毒素在PBS中连续稀释2倍，并在5-0.0024μg/ml的浓度范围内进行测试。将LukAB类毒素在PBS中稀释，并在2.5、2、1、1.5和0.5mg/ml的浓度下进行测试。分离PMN，并将其标准化为每50μl RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)20万个细胞。然后用移液管将50μl PMN移到每个孔中，并在每个孔中添加50μl稀释毒素。将毒素-PMN混合物在37℃+5％CO₂培养箱中孵育2小时。为了评估LDH释放，以1500rpm的速度离心培养皿5min，然后从每个孔中取出25μl上清液，并转移至96孔黑色透明底板。将25μl CytoTox ONE均质膜完整性试剂(Promega)添加到黑色透明底部96孔板中，并在黑暗中在室温下孵育该混合物10min。通过记录激发波长为560nm、发射波长为590nm的荧光，使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器评估细胞裂解通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对TritonX处理的细胞进行标准化(设置为100％死亡)，计算死亡细胞。

结果：

在之前的实施例中，测定了浓度高达20μg/ml的LukAB类毒素RARPR-33对hPMN的细胞毒性。接下来，在RARPR-33浓度较高(高达2.5mg/ml)的情况下监测人PMN的细胞毒性。在用约0.156μg/ml毒素染毒1小时后，观察到WT-LukAB CC8、CC45和CC8/CC45毒素对人PMN(4-6名捐赠者)的最大细胞毒性(基于细胞滴度测定)(图7A)。对于RARPR-33和CC8 LukA单体，在浓度为0.5mg/ml时，用细胞滴度测定的死亡细胞百分比约为10％(图7B)。用浓度高达2.5mg/ml RARPR-33或CC8 LukA单体孵育孵育PMN不会进一步增加通过细胞滴度测定确定的死亡细胞百分比。

LD₁₅值表示诱导15％细胞死亡的抗原浓度。LD₁₅通过线性回归确定。对于CC8 WTLukAB，LD₁₅为0.013μg/ml；对于CC45 WT LukAB，LD₁₅为0.004μg/ml；对于CC8/CC45 LukAB杂合物，LD₁₅为0.002μg/ml。对于LukAB RARPR-33，LD₁₅为2.5mg/ml。通过将RARPR-33的LD₁₅浓度除以WT抗原的LD₁₅浓度来比较LD₁₅值。根据这些观察结果，LukAB RARPR-33的毒性比LukAB CC8 WT低192308倍以上，比LukAB CC45 WT低625000倍以上，比LukAB CC8/CC45杂合物低1250000倍以上。

此外，在与不同的WT毒素、CC8 LukA单体或RARPR-33孵育两小时后，进行LDH测定以评估质膜损伤。在暴露于WT毒素、CC8 WT、CC45 WT或CC8/CC45杂合毒素2小时后，诱导人PMN的细胞毒性(图7C)。在0.625μg/ml毒素浓度下观察到LDH测定的最大细胞死亡。相比之下，在暴露于浓度高达2.5mg/ml的RARPR-33或CC8 LukA单体两小时后，未观察到人PMN的质膜损伤(图7D)。这些数据表明，RARPR-33在浓度高达2.5mg/ml时是脱毒的，不能诱导人PMN的细胞死亡。与CC8/CC45-WT-LukAB毒素相比，RARPR-33的CC8/CC45-LukAB骨架中的突变高度减弱了细胞毒性。

实施例8：RARPR-33与D39A/R23E类毒素的比较

生产一种基于CC8主干的LukAB类毒素，其中所述LukA具有D39A突变，LukB具有R23E点突变。该“D39A/R23E类毒素”在Kailasan，S.等人“Rational Design of ToxoidVaccine Candidates for Staphylococcus aureus Leukocidin AB(LukAB),”Toxins 11(6):(2019)中进行了描述，通过引用将其全部并入本文。这种类毒素是在LukAB CC8骨架上产生的，与WT CC8 LukAB毒素相比，毒性减弱了36000倍以上。使用分化为PMN样的HL-60细胞系测定细胞毒性。在本实验中，对D39A/R23E类毒素和RARPR-33进行了比较。测定了人多形核白细胞(PMN)的细胞毒性，并评估了免疫后诱导广泛毒素中和抗体的能力。

方法：

细胞毒性试验：为了评估每个LukAB蛋白复合物的细胞毒性，从不同捐赠者新鲜分离的原代人类多形核白细胞(PMN)被金黄色葡萄球菌毒素染毒。分离PMN，并将其标准化为每50μl RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)200000个细胞。向细胞中添加50μl PBS中的毒素，并将毒素PMN混合物在37℃+5％CO₂培养箱中孵育2小时。为了评估毒性，向96孔板中添加10μlCellTiter 96Aqueous One溶液(CellTiter；Promega)，并在37℃的5％CO₂中孵育混合物1.5小时。使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器在492nm的吸光度下评估PMN的活性。通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对TritonX处理的细胞进行标准化(设置为100％死亡)，计算死亡细胞的百分比。

LDH测定：为了评估每个LukAB蛋白复合物是否引起细胞溶解，从不同捐赠者新鲜分离的原代人类多形核白细胞(PMN)被金黄色葡萄球菌LukAB毒素染毒，并测定LDH释放。将WT毒素在PBS中连续稀释2倍，并在0.5μg/ml–0.00024μg/ml的浓度范围内进行测试。将LukAB类毒素在PBS中稀释至1mg/ml–0.03125mg/ml的浓度范围内进行测试。分离PMN，并将其标准化为每50μl RPMI(10mM HEPES+0.1％HSA)200000个细胞。然后用移液管将PMN(50μl)移到每个孔中，并在每个孔中添加50μl稀释毒素。将毒素PMN混合物在37℃+5％CO₂培养箱中孵育2小时。为了评估LDH释放，以1500rpm的速度离心培养皿5分钟，然后从每个孔中取出25μl上清液，并转移至96孔黑色透明底板。将25μl CytoTox ONE均质膜完整性试剂(Promega)添加到黑色透明底部96孔板中，并在黑暗中在室温下孵育该混合物10分钟。通过记录激发波长为560nm、发射波长为590nm的荧光，使用Perkinlemer EnVision 2103多标签阅读器评估细胞裂解。通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对TritonX处理的细胞进行标准化(设定为100％死亡)，计算死亡细胞的百分比。

小鼠免疫。Envigo Hsd:ND4(4周龄)小鼠(n＝5/抗原)皮下注射溶于50μl 10％甘油1X TBS并混合50μl佐剂Gold的20μg LukAB。在两次相同抗原/佐剂混合物强化后，通过心脏穿刺将小鼠放血，并获取血清用于毒素中和研究。

毒素中和试验。从各组收集免疫小鼠的血清，并在55℃水浴中热灭活30min。然后用PBS将收集的热灭活血清稀释至40％。然后，在96孔板中，将40％的储备液在10μl PBS中连续稀释2倍，以进一步稀释血清。将毒素(10μl)以0.156μg/ml毒素(LD₉₀)的最终浓度添加到血清孔中。向每个孔中加入80μl浓度为200000个细胞的hPMN(RPMI+0.1％HSA+10mMHEPES)。然后在37℃+5％CO₂培养箱中孵育平板1小时。孵育后，将细胞滴度添加到染毒物中，并孵育1.5小时。孵育后，在平板读取器上以492nm吸光度读取平板。通过减去背景(健康细胞+PBS)并相对TritonX处理的细胞进行标准化(设定为100％死亡)，计算死亡细胞的百分比。

结果：

据报导，D39A/R23E类毒素的细胞毒性最高可达约12μg/ml。这里，RARPR-33和D39A/R23E类毒素在人PMN上的细胞毒性测定浓度为1mg/ml。此外，还对WT LukAB CC8、CC45和CC8/CC45进行了比较测试。根据细胞滴度测定，在用～0.02μg/ml WT-LukAB CC8/CC45、约0.03μg/ml-LukAB CC8和0.125μg/ml-LukAB CC45染毒1小时后，观察到人PMN的最大细胞毒性(图8A)。图中示出了5名捐赠者的均值。对于D39A/R23E类毒素，在1mg/ml浓度下孵育时观察到约22％的细胞毒性。对于RARPR-33，在1mg/ml浓度下，用细胞滴度测定的死亡细胞百分比约为3％(图8B)。

此外，在与不同的WT毒素D39A/R23E类毒素和RARPR-33孵育两小时后，进行LDH测定以评估质膜损伤。在暴露于WT毒素、CC8 WT、CC45 WT和CC8/CC45杂合毒素2小时后诱导人PMN的细胞毒性(图8C)。在0.25μg/ml毒素浓度下，观察到LDH测定的最大细胞死亡。当人PMN暴露于浓度高达1mg/ml的D39A/R23E类毒素2小时后，观察到约8％的细胞死亡。当用类似浓度的RARPR-33孵育人PMN时，未观察到质膜损伤，表明没有细胞死亡(图8D)。这些结果表明，RARPR-33在检测中衰减到低于检测限，并且比D39A/R23E类毒素更弱。

用RARPR-33或D39A/R23E类毒素免疫的小鼠血清进行毒素中和试验，以评估血清预防人PMN毒素诱导细胞死亡的能力。在从4名捐赠者分离的PMN上测试了对16种不同LukAB毒素的中和作用。

在RARPR 33免疫小鼠的0.125％血清存在下，所有16种LukAB变体的细胞毒性效应均被中和(图9)。在相似的血清浓度下，来自D39A/R23E类毒素免疫小鼠的血清仅与来自RARPR-33免疫小鼠的血清具有相同的保护作用，以抵抗LukAB CC8的细胞毒性作用。对于所有其他毒素，D39A/R23E类毒素免疫小鼠的血清未观察到保护作用或保护作用低得多。这些结果表明，RARPR-33免疫比D39A/R23E类毒素免疫诱导更广泛的毒素中和反应。

实施例9：LukAB类毒素的热稳定性

与野生型蛋白质相比，LukAB类毒素的稳定性通过热展开(thermal unfolding)实验进行评估，使用固有色氨酸或酪氨酸荧光来估计熔融温度(Tm)，对应于蛋白质从折叠到展开状态转变的中点。使用NanoTemper's PromethiusNT.Plex仪(NanoTemper Inc.，德国)评估热稳定性。对0.3至1mg/mL(20μL，缓冲液：50mM磷酸钠缓冲液，200mM NaCl，pH 7.4，10％甘油)的蛋白质样品进行热展开测定，每次重复两次。Prometheus NanoDSF用户接口(熔融扫描选项卡)用于设置运行的实验参数。以1.0℃/min的速率对典型样品进行热扫描，扫描范围为20℃至95℃。将用于样品的同一缓冲液中的标准mAb(CNTO5825或NIST)作为对照，重复进行。使用供货商软件PR.ThermControl分析热熔化曲线，以确定50％蛋白质展开的温度(Tm)。

表8A和8B示出了通过nanoDSF评估的LukA和LukAB类毒素蛋白质的热稳定性。给出了蛋白质展开开始温度(Tonset)和蛋白质展开转变中点(Tm1)，以及有无稳定性取代的可比结构之间Tm的差异(ΔTm)。

表8A.CC45遗传背景中的单取代和杂合CC8/CC45遗传背景中的组合取代。

^aΔTm代表与携带一个或多个取代的相应LukAB蛋白质相比，没有稳定取代和二硫键的CC45或CC8/CC45毒素的Tm值的差异。

LukA单体包含N端PelB信号序列，可直接表达到大肠杆菌的周质中，以支持二硫键的形成。

在大肠杆菌Origami 2(DE3)细胞的细胞质中表达了携带成对半胱氨酸取代以支持二硫键形成的LukAB二聚体。

表8B.CC8遗传背景中的单取代和杂合CC8/CC45遗传背景中的组合取代。

结果：热稳定性分析(表8A)示出，CC45 LukAE321A/CC45 LukB蛋白质的Tm值比CC8LukAE321A/CC45 LukB杂合蛋白质的Tm值高3℃。在CC45 LukA中单独取代，再加上CC45LukB^wt，导致Tm适度增加0至0.4℃。LukB中的Val53Leu取代导致Tm增加0.5℃。由于杂合LukAB类毒素包含CC8 LukA背景，因此在CC8 LukA中结合野生型CC45 LukB测试了单个氨基酸取代(表8B)。如CC45LukA所示，CC8 LukA中的单个取代也使Tm值高于野生型LukAB。LukA(RARPR-15)中的取代组合产生的Tm值比CC45 LukA^E321A/CC45 LukB蛋白质高1.6℃，CC8LukA取代与LukB^Val53Leu(RARPR-33)的组合产生的Tm值比CC8 LukA^E321A/CC45 LukB杂合物高4℃。在两个数据集中都观察到RARPR-33的热稳定性增加(表8A和8B)。尽管nanoDSF可能会对在低于50℃下展开的蛋白质产生一些变异，但使用每组中运行的对照测定的ΔTm在4.0和4.1℃的数据集上是一致的。LukA单体包括取代组合和成对的半胱氨酸取代，并且展示出较高的Tm值≥58℃，表明二硫键对提高热稳定性的进一步贡献。

实施例1-9的讨论：

本文所述的稳定的LukAB变体异二聚体类毒素具有若干特征，使其非常适合作为金黄色葡萄球菌疫苗抗原候选。

首先，与野生型毒素和其他已知类毒素(即CC8Δ10和CC45Δ10类毒素)相比，LukA单体和LukAB二聚体类毒素，包括RARPR-30、RARPR-31、RARPR-32、RARPR-33、RARPR-34和RARPR-15，对分化的人THP-1和人PMN的细胞毒性显著降低。即使在浓度高达2.5mg/ml时，RARPR-33仍然没有细胞毒性，表明其完全减毒。

其次，在LukA和LukB变体蛋白质中引入的取代的组合显著增强了异二聚体RARPR复合物相对于仅含有单一取代的相应类毒素的热稳定性。特别是，LukA(RARPR-15)中的取代组合产生的Tm值比CC45 LukAE^321A/CC45 LukB蛋白质高1.6℃，CC8 LukA取代与LukB^Val53Leu(RARPR-33)的组合产生的Tm值比CC8 LukA^E321A/CC45 LukB杂合物高4℃。

除了减弱的细胞毒性和增强的热稳定性外，本文所述的LukAB RARPR类毒素，尤其是RARPR-15、RARPR-33和RARPR-34，与野生型CC45和CC8毒素、野生型杂合毒素和类毒素(包括E323A类毒素和D39A/R23E类毒素)相比，诱导了类似或更广泛的毒素中和反应和更高的中和抗体滴度。

综上所述，细胞毒性减弱、热稳定性提高、免疫原性强和抗体广泛中和，使得本文所述的LukAB-RARPR类毒素成为理想的候选疫苗抗原。

实施例10:LukAB RARPR-33、SpA*和GLA-SE在外科伤口小型猪感染模型中的效力

该实验的目的是评估Spa变异抗原和RARPR-LukAB二聚体(含或不含吡喃葡糖基脂质佐剂(GLA)以及toll样受体4(TLR)激动剂)的组合是否能在哥廷根小型猪的金黄色葡萄球菌外科伤口感染模型中提供保护。测试的Spa变异抗原(Spa*)的氨基酸序列为SEQ IDNO:60。所测试的突变LukAB二聚体RARPR-33含有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的LukA变体多肽和包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的LukB变体多肽。GLA佐剂在稳定的乳液(SE)中配制，含有10μg GLA和2％的SE。

体内实验。按照图10所示的方案，对雄性哥廷根小型猪(每组3头猪)进行3次肌肉内免疫，每次间隔3周，免疫成分或组合如下：

1.缓冲液对照(无佐剂，无LukAb RARPR-33，无Spa*)

2.LukAB RARPR-33(100μg)+Spa*(100μg)+佐剂GLA-SE(10μg)

3.LukAB RARPR-33(100μg)+Spa*(100μg)，无佐剂

4.仅佐剂GLA-SE(10μg)

接种疫苗后，用临床相关的金黄色葡萄球菌菌株，即克隆复合物(CC)398对猪进行攻毒。在感染后第8天，对猪实施安乐死，并测定手术部位的细菌载量。

该研究的主要终点是在接种了LukAB+Spa变体(含或不含佐剂)的动物中，手术部位的细菌载量(cfu)减少。单独接种佐剂或单独接种配方缓冲液作为对照。

材料和方法：

小型猪外科伤口感染方法：将5至8个月大的雄性哥廷根小型猪(MarshallBiosciences，North Rose，纽约州)集体饲养，并在12小时的光/暗循环中自由饮水。手术当天上午，禁食的小型猪被镇静、插管，并在手术期间置于异氟醚麻醉下。在左大腿上进行手术，暴露肌肉层，并将一个5mm无刀片套管针(Xcel，Ethicon Endo Surgery，Guaynabo，波多黎各)推进到股骨深处。通过套管针(MILA International，Inc.，佛罗伦萨，肯塔基州)将20μl接种物(约6log₁₀ CFU/ml金黄色葡萄球菌)通过6英寸的MILA脊柱针(MILAInternational，Inc.，佛罗伦萨，肯塔基州)注入伤口(股骨顶部)，然后取出。施用细菌攻毒后，用单丝缝合线封闭肌肉，用可吸收PDS缝合线封闭皮肤。八天后，在镇静状态下，小猪被巴比妥类药物安乐死。一旦确认死亡，器官就被分别进行微生物学处理。使用Bead RuptorElite(Omni International，肯尼索，佐治亚州，美国)将样品在盐水中均质，然后将其稀释并用Autoplate5000螺旋接种仪(Spiral Biotech，诺伍德，马萨诸塞州，美国)置于TSA板上。培养皿在37℃下孵育18-24小时，然后在QCount菌落计数器(Spiral Biotech，诺伍德，马萨诸塞州，美国)上读取。

采用Dunnett多重比较检验进行单因素方差分析，以检验多组之间的统计显著性。ANOVA模型包含组和手术日期作为解释因素。所有动物研究均由Janssen Spring House机构动物护理和使用委员会审查和批准，并存放在AALAC认证的设施内。

结果：

在小型猪外科伤口感染模型中的效力。为了测试有和没有佐剂的疫苗的效力，在三次免疫和一株属于克隆复合物CC398的金黄色葡萄球菌菌株攻毒后，测定了中深层肌肉中的菌落形成单位(cfu)数量。

在中层肌肉中，与无佐剂的LukAB和Spa*免疫的组(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝6.03，P＝0.0018)相比或与仅使用佐剂的组(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝6.08，P＝0.0017)相比，使用LukAB、Spa*+佐剂(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝1.61)的组合免疫导致cfu显著减少(图11A)。将缓冲液对照组(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝5.77)与仅佐剂组(P＝0.8711)或LukAB RARPR-33+Spa*组(P＝0.9392)进行比较时，未发现cfu有显著差异。然而，在缓冲液对照组和接受LukAB RARPR-33、Spa*+佐剂的动物之间，发现cfu显著降低(P＝0.0006)。这些结果表明，佐剂本身并不能提供保护作用。

在深层肌肉中，不含佐剂的LukAB和Spa*联合免疫导致cfu减少(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝4.18，P＝0.1389)。使用LukAB RARPR-33、Spa*+佐剂联合免疫，与未使用佐剂的LukAB和Spa*免疫组相比，cfu的下降幅度更大(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝1.58)，与仅使用佐剂的组相比，cfu的显著下降(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝6.37，P＝0.0360)(图11B)。将缓冲液对照组(log₁₀cfu/g深肌的几何平均值＝6.14)与仅佐剂组(P＝0.9931)或LukAB RARPR-33+Spa*组(P＝0.3953)进行比较时，未发现cfu有显著差异。然而，在缓冲液对照组和接受LukAB RARPR-33、Spa*+佐剂的动物之间，发现cfu显著降低(P＝0.0137)。

这些结果表明，LukAB RARPR-33和Spa*组合可有效降低小型猪手术部位感染模型中的细菌载量，添加GLA-SE佐剂可进一步增强手术部位细菌载量的降低。

结论：为了测试疫苗组合物的效力，使用相关的金黄色葡萄球菌菌株测定了疫苗在小型猪外科伤口感染模型中减少细菌载量的能力。使用LukAB RARPR-33+Spa*组合疫苗组合物对小型猪进行免疫，在使用相关临床金黄色葡萄球菌菌株攻毒后，导致肌肉中菌落形成单位的数量减少。在疫苗组合中添加GLA-SE佐剂进一步降低了细菌载量。因此，在小型猪手术部位感染模型中，含有LukAB类毒素和Spa*突变体的金黄色葡萄球菌、以及GLA-SE佐剂的候选疫苗，有效地防止了深部金黄色葡萄球菌感染。

实施例11：外科伤口小型猪感染模型中免疫原性成分诱导的免疫反应

该实验的目的是评估Spa变异抗原和LukAB RARPR-33二聚体的组合与两种不同佐剂的进一步组合是否在哥廷根小型猪的金黄色葡萄球菌外科伤口感染模型中提供保护。测试的Spa变异抗原(Spa*)的氨基酸序列为SEQ ID NO:60。所测试的LukAB RARPR二聚体含有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的LukA多肽和包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的LukB多肽。在本实验的一个组中，对AS01b佐剂进行了测试，该佐剂是许可的Shingrix疫苗(Leroux等人，2016)的一部分，含有TLR4激动剂MPL和QS-21。在实验的另一部分中，对含有TLR4激动剂GLA的GLA-SE佐剂进行了测试，该佐剂是在稳定的乳液中配制的。稳定的乳液为水包油乳液，其中油为角鲨烯。

小型猪模型用于评估候选疫苗的免疫原性(与抗原特异性IgG的产生有关)和效力。小型猪由于其免疫系统、器官和皮肤结构与人类相似，在传染病研究中得到了广泛的应用。在这个模型中，在伤口感染金黄色葡萄球菌后，手术部位的肌肉和皮肤层会发生局部感染。还观察到感染传播到其他内脏器官，疾病的进展与人类非常相似。

LukAB对小型猪多形核中性粒细胞(PMN)的毒性与在人PMN中观察到的类似。这与在小鼠和兔PMN中观察到的高度降低的LukAB毒性形成对比，这是由于毒素靶点的物种特异性。此外，由于猪经常携带葡萄球菌，与成年人类(但不是实验室啮齿动物)类似的小型猪通常具有高水平的葡萄球菌抗原抗体(包括LukAB和其他金黄色葡萄球菌蛋白)。因此，与之前可用的啮齿动物模型相比，该模型可能是人类潜在疫苗保护的更可靠指标，尤其是对于含有LukAB和Spa变体的疫苗。

体内实验。根据图12所示的方案，雄性哥廷根小型猪(每组3头猪)以3周的间隔进行三次单独的肌肉内免疫，免疫成分或组合如下：

1.缓冲液对照(无佐剂、无LukAB-RARPR、无Spa变体)

2.LukAB RARPR-33(100μg)+SpA*(100μg)+佐剂AS01b(25μg MPL+25μg QS-21)

3.LukAB RARPR-33(100μg)+SpA*(100μg)+佐剂GLA-SE(10μg GLA)

接种疫苗后，用临床相关的金黄色葡萄球菌菌株克隆复合物(CC)398对猪进行攻毒。在感染后第8天，对猪实施安乐死，并测定手术部位和内脏的细菌载量。

如图12所示，在研究开始前和疫苗接种期间定期采集血样。进行血清分析以评估血清免疫球蛋白的数量和功能。

该研究的主要终点是在接种了LukAB+SpA*和不同佐剂的动物中，手术部位/器官的细菌载量(CFU)减少。只接种缓冲液作为对照。

材料和方法：

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定针对LukAB和SpA的抗体反应：为了测定针对LukAB CC8和LukAB CC45的IgG抗体水平，384孔Nunc板(Thermo Fisher Scientific)在PBS中涂上1.0μg/ml LukAB CC8或LukAB CC45，并在2-8℃下孵育1h。用PBS+0.05％吐温20洗涤后，用2.5％脱脂牛奶封闭板，从1:10开始，将稀释液缓冲液(2.5％(w/v)脱脂奶粉，1×PBS)中制备的洗涤和连续3倍稀释的血清添加到孔中。将培养皿在室温下孵育1小时，清洗并添加1:10000稀释的抗猪IgG HRP二级抗体(Sigma-Aldrich)。在室温下孵育1小时后，用TMB基质(Leinco Technologies)制备平板。通过添加1M硫酸停止反应。在450nm处读取吸光度。EC₅₀滴度(定义为最大有效浓度的一半)是根据重复的12步滴定曲线计算的，该曲线用4参数logistic(PL)非线性回归模型分析。EC₅₀滴度低于30的样品被截尾至30。在三次免疫后，使用潜在截尾值的Tobit模型来测试疫苗+佐剂组与仅缓冲液组之间的统计显著性。使用Bonferroni校正进行多重比较。为了测定抗SpA*的抗体，96孔maxisorp平板在PBS中涂上0.25μg/ml SpA*，并在2-8℃下孵育过夜。二级抗体是封闭缓冲液中1:10000稀释的抗猪IgGHRP。其他步骤与上述测定抗LukAB抗体反应的步骤类似。在三次免疫后，使用潜在截尾值的Tobit模型来测试疫苗+佐剂组与仅缓冲液组之间的统计显著性。使用Bonferroni校正进行多重比较。

LukAB毒素中和试验。CytoTox One试剂盒(Promega)用于测定膜受损细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)的情况。将THP-1细胞离心，并用RPMI重新悬浮至2×10⁶个细胞/mL的密度。将细胞(50μL)添加到96孔培养板中，该培养板含有连续3倍稀释的血清或3倍连续稀释的参考LukAB单克隆抗体，起始浓度为2500ng/mL。LukAB毒素CC8、CC45、CC22a，或将CC398添加到试验孔中，最终浓度为40ng/mL(CC8、CC22a、CC398)或20ng/mL(CC45)。将裂解溶液(Promega)添加到裂解对照孔中。培养皿在37℃、5％CO₂存在下孵育2小时。离心培养皿，将25μL上清液转移到新培养皿中，并添加25μLCytotoxOne试剂(Promega)。平板在室温下孵育15分钟，并向孔中加入终止溶液(Promega)。使用Biotek Synergy Neo 2阅读器以单色读取平板，激发波长为560，带宽为5nm，发射波长为590，带宽为10nm。增益设置为120-130。测定所有血清样本和LukAB单克隆参考抗体的IC₅₀滴度，代表观察到50％细胞毒性的浓度。相对效能滴度(代表血清样本和参考单克隆抗体之间IC₅₀滴度的差异)用作输出值。三次免疫后，比较疫苗组与缓冲组的相对效能滴度。采用Dunnett多重比较检验进行单因素方差分析，以检验疫苗组与缓冲组之间的统计显著性。

小型猪外科伤口感染方法：将5至8个月大的雄性哥廷根小型猪(MarshallBiosciences，North Rose，纽约州)集体饲养并维持12小时的光/暗循环，可自由饮水。手术当天上午，禁食的小型猪被镇静、插管，并在手术期间置于异氟醚麻醉下。在左大腿上进行手术，暴露肌肉层，并将一个5mm无刀片套管针(Xcel，Ethicon Endo Surgery，Guaynabo，波多黎各)推进至股骨深度。通过套管针(MILA International，Inc.，佛罗伦萨，肯塔基州)将20μL接种物(约6log₁₀ CFU/ml金黄色葡萄球菌)通过6英寸的MILA脊柱针(MILAInternational，Inc.，佛罗伦萨，肯塔基州)注入伤口(股骨顶部)，然后取出。施用细菌攻毒后，用单丝缝合线封闭肌肉，用可吸收PDS缝合线封闭皮肤。八天后，在镇静状态下，小猪被巴比妥类药物安乐死。一旦确认死亡，器官就被分别进行微生物学处理。使用Bead RuptorElite(Omni International，肯尼索，佐治亚州，美国)将样品在盐水中均质，然后将其稀释并用Autoplate5000螺旋接种仪(Spiral Biotech，诺伍德，马萨诸塞州，美国)置于TSA板上。培养皿在37℃下孵育18-24小时，然后在QCount菌落计数器(Spiral Biotech，诺伍德，马萨诸塞州，美国)上读取。

使用Dunnett的多重比较试验进行单因素方差分析，以检验缓冲液组和使用LukABRARPR-33+SpA*+不同佐剂免疫的组之间cfu的统计显著性。ANOVA模型包含组和手术日期作为解释因素。所有动物研究均由Janssen Spring House机构动物护理和使用委员会审查和批准，并存放在AALAC认证的设施内。

结果：

针对LukAB和SpA*诱导的抗体反应。上述几组小型猪用LukAB RARPR-33(100μg)和SpA*(100μg)+佐剂AS01b(25μg MPL和25μg QS-21)或GLA-SE(10μg GLA，稳定乳剂)的组合免疫三次，间隔三周。对照组的动物只接受缓冲液。第三次免疫后的三周，用金黄色葡萄球菌对动物攻毒。在每次免疫前和攻毒前采集血样(图12)，并通过ELISA分析针对LukAB和SpA*的抗体反应。在仅用缓冲液免疫的动物中，测定到低水平的抗LukAB CC8和CC45 IgG抗体，表明存在预先存在的LukAB抗体(图13A和13B)。在整个实验过程中，血清中的抗体水平没有随时间增加。三次免疫后，与对照组相比，佐剂为AS01b或GLA-SE的LukAB RARPR-33，SpA*免疫导致几何平均值(Geomean)更高的抗LukAB CC8和LukAB CC45 IgG滴度(图13A和13B，三次免疫后的IgG滴度几何平均值LukAB CC8：LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：64637；P＝0.0034LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：116357，P＝0.0003；缓冲液对照组：2931。三次免疫后IgG滴度几何平均值LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：19764，P<0.0001；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：11620，P<0.0001；缓冲液对照组：129)。

仅用缓冲液免疫的小型猪在任何时间点都没有可测定的SpA*抗体(图13C)。在三次免疫后，与对照组相比，使用佐剂为AS01b或GLA-SE的LukAB RARPR-33、SpA*免疫导致几何平均值(Geomean)抗SpA*IgG滴度更高。(图13C，三次免疫后的几何平均值IgG SpA*：LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：7013，P<0.0001；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：1770，P<0.0001；缓冲液对照组：30)。这些结果表明，LukAB+SpA*+佐剂疫苗可诱导SpA*特异性抗体。

LukAB毒素细胞毒性活性的中和。LukAB是一种毒素，与中性粒细胞上的受体结合，在膜上形成孔隙，导致细胞溶解。为了评估试验疫苗诱导的抗体的功能，测定了接种小型猪的血清抑制LukAB毒素诱导的THP-1细胞裂解的能力。检测中的野生型LukAB毒素来自克隆复合物CC8或CC45。LukAB RARPR-33中的LukA来源于克隆复合物CC8，LukAB RARPR-33中的LukB来源于克隆复合物CC45。试验中还使用了参考单克隆LukAB特异性抗体。测定血清样品和参考抗体之间IC₅₀滴度的差异，代表测定50％细胞毒性的稀释度，并绘制为相对效能滴度(RP滴度)。在实验开始时，在小型猪的血清中检测到针对LukAB CC8和LukAB CC45的中和抗体(免疫前缓冲液对照组LukAB CC8 RP滴度几何平均值：1126；LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：1483；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：896。LukAB CC45 RP滴度几何平均值，免疫前缓冲液对照组：616；LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：954；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：637)。在用缓冲液接种的动物中，只有RP滴度在实验过程中没有变化(三次免疫后，RP滴度几何平均值，LukAB CC8：1497；LukAB CC45：884)。在接种LukAB+SpA*+佐剂的动物中，三次免疫后，测量的血清中的RP滴度几何平均值显著升高(LukAB CC8 RP滴度几何平均值，LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：17095，P＝0.0007；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：10285，P＝0.0116。LukAB CC45 RP滴度几何平均值，LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：20019，P＝0.0022；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：16612，P＝0.0047)。这些结果如图14A和14B所示，表明疫苗(RARPR-33)中的LukAB诱导功能性抗体，阻断LukAB毒素的细胞毒性活性。

LukAB毒素细胞毒性活性的交叉中和。接下来，我们评估了小型猪接种LukABRARPR-33+SpA*和不同佐剂后诱导的抗体是否能够交叉中和LukAB序列变体的细胞毒性，该毒性在RARPR-33骨架中不存在。为此，使用了LukAB序列变异CC22a和CC398。通过评估血清抑制LukAB毒素诱导的THP-1细胞裂解的能力来测定交叉中和。试验中还使用了参考单克隆LukAB特异性抗体，并如上所述测定了相对效能。在实验开始时，小型猪血清中可检测到针对LukAB CC22a和LukAB CC398的交叉中和抗体(CC22a RP滴度几何平均值，免疫前缓冲液对照组：541；LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：846；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：436。LukABCC398RP滴度几何平均值，免疫缓冲液对照组：1061；LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：1090；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：608)。在用缓冲液接种的动物中，只有RP滴度在实验过程中没有变化(三次免疫后，RP滴度几何平均值，LukAB CC22a：761；LukAB CC398：1270)。在接种了LukAB+SpA*+佐剂(AS01b或GLA-SE)的动物中，三次免疫后，血清中的RP滴度几何平均值显著升高(LukAB CC22a RP滴度几何平均值，LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：7524，P＝0.0040；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：5025，P＝0.0312。LukAB CC398RP滴度几何平均值LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b：14396，P＝0.0005；LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE：8051，P＝0.0146)。这些结果如图14C和14D所示，表明疫苗(RARPR-33)中的LukAB诱导交叉中和抗体，阻断各种LukAB毒素序列变体的细胞毒性活性。

在小型猪外科伤口感染模型中的效力：为了测试疫苗效力，在三次免疫和来自克隆复合物CC398的金黄色葡萄球菌攻毒后，在肌肉(中层和深层)和脾脏的两个部位测定菌落形成单位(cfu)的数量。与仅使用佐剂的组(log₁₀ cfu/g肌肉(中层)的几何平均值＝5.99)相比，使用LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b佐剂进行免疫(log₁₀ cfu/g肌肉的几何平均值(中层)＝0.98，P＝0.0057)或LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE(log₁₀ cfu/g肌肉(中层)的几何平均值＝0.83，P＝0.0046)导致中肌的cfu显著降低(图15A)。与仅使用佐剂的组(log₁₀cfu/g肌肉(深层)的几何平均值＝6.10)相比，使用LukAB RARPR-33+SpA*+AS01b佐剂(log₁₀cfu/g肌肉(深层)的几何平均值＝0.58，P＝0.0024)或LukAB RARPR-33+SpA*+GLA-SE(log₁₀cfu/g肌肉(深层)的几何平均值＝0.76，P＝0.0031)进行免疫导致深层肌肉的cfu显著减少(图15B)。在脾脏中，与LukAB+SpA*+AS01b或LukAB+SpA*+GLA-SE免疫(分别地log₁₀ cfu/g脾的几何平均值＝0.51，P＝0.0138和0.45，P＝0.0120)相比，仅用佐剂免疫的对照组(log₁₀cfu/g脾的几何平均值＝2.20)的cfu水平更高(图15C)。这些结果如图15A–15C所示，表明试验疫苗组合在小型猪手术部位感染模型中有效。疫苗还可以减少细菌向脾脏等器官的传播。

结论：含有抗原LukAB RARPR-33和带有佐剂的SpA*的疫苗组合物在小型猪中显示出免疫原性，因为其诱导了针对LukAB CC8、LukAB CC45和SpA*的IgG抗体。抗LukAB IgG抗体的增加与LukAB毒素的细胞毒性活性的交叉中和增加有关，表明诱导的IgG抗体具有功能性。为了测试疫苗组合物的效力，使用相关的金黄色葡萄球菌菌株测定疫苗在小型猪外科伤口感染模型中降低细菌载量的能力。用LukAB RARPR-33+SpA*+佐剂疫苗组合物对小型猪进行免疫后，试验菌株攻毒后，肌肉中菌落形成单位的数量显著减少。疫苗成分还导致脾脏中的cfu显著减少。因此，在小型猪手术部位感染模型中，含有LukAB和SpA类毒素突变体的经测试金黄色葡萄球菌候选疫苗有效地防止了深部金黄色葡萄球菌感染和传播。

实施例12：LukAB RARPR-33和Spa*在外科伤口小型猪感染模型中对金黄色葡萄球菌USA300菌株的效力

实施例10中的结果表明，在小型猪外科部位感染模型中，LukAB RARPR-33和Spa*的组合(不含佐剂)对金黄色葡萄球菌的攻毒提供了一些保护。本实验的目的是评估在没有佐剂的情况下，Spa*与LukAB RARPR-33联合是否能在哥廷根小型猪的金黄色葡萄球菌外科伤口感染模型中针对不同的攻毒菌株提供保护。使用临床相关的USA300金黄色葡萄球菌菌株。

测试的Spa变异抗原(Spa*)的氨基酸序列为SEQ ID NO:60。所测试的突变LukAB二聚体RARPR-33含有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的LukA变体多肽和包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的LukB变体多肽。

体内实验。根据图16A所示的方案，雄性哥廷根小型猪(每组3头猪)以3周的间隔，以3次不同的时间进行肌肉内免疫，其成分或组合如下(图16B)：

1.缓冲液对照

2.LukAB RARPR-33(100μg)+Spa*(100μg)

接种疫苗后，用临床相关的金黄色葡萄球菌USA300菌株对猪进行攻毒。在感染后第8天，对猪实施安乐死，并测定手术部位的细菌载量。该研究的主要终点是在接种了LukAB和Spa变体的动物的手术部位减少细菌载量(cfu)。接种配方缓冲液作为对照。

材料和方法：

小型猪外科伤口感染方法：在小型猪外科伤口感染模型中，用金黄色葡萄球菌USA300菌株攻毒哥廷根小型猪。根据实施例10和11中的描述，进行攻毒和手术部位的细菌载量测定。

结果：

小型猪外科伤口感染模型的效力。为了测试疫苗抗原组合的效力，在三次免疫和金黄色葡萄球菌USA300菌株攻毒后，测定了中深层肌肉中的菌落形成单位(cfu)数量。

在中层肌肉中，与仅接受缓冲液的组(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝5.73，P＝0.2790)相比，LukAB RARPR-33和Spa*的联合免疫(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝2.15)导致cfu减少(图16C)。

在深层肌肉中，与缓冲液对照组(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝6.21，P＝0.0245)相比，LukAB RARPR-33，Spa*的联合免疫(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝3.65)导致cfu显著减少(图16D)。这些结果表明，在没有佐剂的情况下，在小型猪手术部位感染模型中，测试的疫苗组合对USA300菌株有效。

结论：为了测试疫苗抗原组合的效力，使用金黄色葡萄球菌USA300菌株测定了疫苗组合在小型猪外科伤口感染模型中降低细菌载量的能力。本研究中未使用佐剂。与缓冲液对照组相比，使用LukAB RARPR-33+Spa*对小型猪进行免疫后，试验菌株攻毒后，肌肉中的菌落形成单位数量减少。这些结果表明，在没有佐剂的情况下，LukAB RARPR-33和Spa*的组合可以在小型猪SSI模型中对金黄色葡萄球菌USA300菌株提供一定程度的保护。

实施例13:LukAB RARPR-33、SpA*和GLA-SE在外科创伤小型猪感染模型中对USA100金黄色葡萄球菌菌株的效力

本实验的目的是评估SpA变异抗原和RARPR-LukAB二聚体与葡糖吡喃脂质佐剂(GLA)、toll样受体4(TLR)激动剂的组合，可在哥廷根小型猪的外科伤口感染模型中提供保护，以抵抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)USA100菌株的攻毒。USA100菌株是造成大部分医疗相关MRSA感染的原因。测试的Spa变异抗原(Spa*)的氨基酸序列为SEQ ID NO:60。所测试的突变LukAB二聚体RARPR-33含有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的LukA变体多肽和包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的LukB变体多肽。GLA佐剂在稳定的乳液(SE)中配制，含有10μgGLA和2％的SE。

体内实验。根据图17A所示的方案，对雄性哥廷根小型猪(每组3头猪)进行3次肌肉内免疫，每次间隔3周，使用以下成分或成分组合(图17B)：

1.佐剂GLA-SE(10μg，2％SE)(不含LukAb RARPR-33，不含Spa*)

2.LukAB RARPR-33(100μg)+Spa*(100μg)+佐剂GLA-SE(10μg，2％SE)

在接种疫苗后，用临床相关的金黄色葡萄球菌USA100菌株(ST5)对猪进行攻毒。在感染后第8天，对猪实施安乐死，并测定手术部位的细菌载量。该研究的主要终点是，与单独接种GLA-SE的动物相比，接种LukAB+Spa变体组合和GLA-SE的动物在手术部位的细菌载量(cfu)减少。

材料和方法：

小型猪外科伤口感染方法：在小型猪外科伤口感染模型中，用金黄色葡萄球菌USA100菌株攻毒哥廷根小型猪。根据实施例10和11中的描述，进行攻毒和对手术部位的细菌载量测定。为了检验两组之间的统计显著性，采用了方差分析模型。

结果：

小型猪外科伤口感染模型的效力。为了测试疫苗组合的效力，在三次接种金黄色葡萄球菌USA100并攻毒后，测定中深层肌肉中的菌落形成单位(cfu)数量。

在中层肌肉中，与单独使用GLA-SE免疫的组(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝5.27，P＝0.0013)相比，使用LukAB RARPR-33、Spa*+GLA-SE的组合进行免疫(log₁₀ cfu/g中层肌肉的几何平均值＝0.88)可显著降低cfu(图17C)。同样在深层肌肉中，与单独使用GLA-SE免疫的组(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝5.37，P<0.0001)相比，使用LukABRARPR-33、Spa*+GLA-SE的组合(log₁₀ cfu/g深层肌肉的几何平均值＝0.30)进行免疫可显著降低cfu(图17D)。这些结果表明，在SSI模型中，LukAB RARPR-33、Spa*和GLA-SE的组合对金黄色葡萄球菌USA100菌株具有保护作用，并表明试验疫苗对小型猪有效。

结论：为了测试LukAB RARPR-33、Spa*和GLA-SE组合的效力，使用相关的金黄色葡萄球菌USA100菌株测定了疫苗在小型猪外科伤口感染模型中降低细菌载量的能力。用LukAB RARPR-33+Spa*+GLA-SE佐剂疫苗组合物对小型猪进行免疫后，在试验菌株攻毒后，肌肉中的菌落形成单位数量减少。结合前面实施例的结果，表明含有LukAB类毒素和Spa突变体的金黄色葡萄球菌疫苗组合可以有效地防止小型猪手术部位感染模型中各种临床相关金黄色葡萄球菌菌株引起的深层感染。

实施例14：LukAB-RARPR-33和Spa*与不同佐剂组合的免疫原性

本实验的目的是评估不同佐剂是否会提高Spa变体抗原和RARPR-LukAB二聚体组合的免疫原性。测试的Spa变异抗原(Spa*)的氨基酸序列为SEQ ID NO:60。所测试的突变LukAB二聚体RARPR-33含有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的LukA变体多肽和包含SEQ IDNO:18氨基酸序列的LukB变体多肽。测试了两种含有TLR4激动剂的佐剂；AS01b(含5μg MPL和5μg QS-21)和GLA以稳定的乳液(GLA-SE，含1μg GLA，2％SE)配制。此外，还包括两种基于明矾的佐剂：2％铝Alhydrogel佐剂(氢氧化铝凝胶)和佐剂磷佐剂(磷酸铝凝胶)

体内实验。按照图18A所示的方案，对雌性Swiss Webster小鼠(每组5-10只小鼠)进行3次不同的皮下免疫，每次间隔2周，并使用以下组合物或组合物组合(图18B)：

1.LukAB RARPR-33(5μg)+SpA*(5μg)+AS01b(5μgMPL+5μg QS-21)

2.LukAB RARPR-33(5μg)+SpA*(5μg)+GLA-SE(1μgGLA，2％SE)

3.LukAB RARPR-33(5μg)+SpA*(5μg)+Alhydrogel佐剂(50μl)

4.LukAB RARPR-33(5μg)+SpA*(5μg)+Adju-Phos佐剂(50μl)

5.LukAB RARPR-33(5μg)+SpA*(5μg)

6.缓冲液+AS01b(5μg MPL和5μg QS-21)

7.缓冲液+GLA-SE(1μgGLA，2％SE)

8.缓冲液+Alhydrogel佐剂(50μl)

9.缓冲液+佐剂磷(50μL)

10.缓冲液

如图18A所示，在研究开始之前以及第三次免疫后的2周采集血样。进行血清分析以评估血清免疫球蛋白的数量和功能。接种佐剂或不含疫苗抗原的配方缓冲液作为对照。

材料和方法：

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定针对LukAB和SpA的抗体反应：为了测定针对LukAB CC8和LukAB CC45的IgG抗体水平，384孔Nunc板(Thermo Fisher Scientific)在PBS中涂上1.0μg/ml LukAB CC8或LukAB CC45，并在2-8℃下孵育1h。用PBS+0.05％吐温20洗涤后，用2.5％脱脂牛奶封闭板，将稀释液缓冲液(1xPBS中2.5％(w/v)脱脂奶粉)中制备的洗涤和连续3倍稀释的血清从1:90稀释开始添加到孔中。将培养皿在室温下孵育1小时，清洗并添加1:2000稀释的抗小鼠IgG-HRP二级抗体(Sigma-Aldrich)。在室温下孵育1小时后，用TMB基质(Leinco Technologies)制备平板。通过添加1M硫酸停止反应。在450nm处读取吸光度。EC₅₀滴度(定义为最大有效浓度的一半)是根据重复的12步滴定曲线计算的，该曲线用4参数logistic(PL)非线性回归模型分析。EC₅₀滴度低于30的样品被审查至30。

为了测定针对SpA*的抗体，384孔maxisorp板在PBS中涂上0.25μg/ml SpA*并在2-8℃下孵育过夜。二级抗体是在封闭缓冲液中以1:2000稀释的抗小鼠IgG HRP。其他步骤与上述测定抗LukAB抗体反应的步骤类似。

LukAB毒素中和试验。CytoTox One试剂盒(Promega)用于测定膜受损细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)的情况。将THP-1细胞离心，并用RPMI重新悬浮至2×10⁶个细胞/mL的密度。将细胞(50μL)添加到96孔培养板中，该培养板含有连续3倍稀释的血清或连续3倍稀释的参考LukAB单克隆抗体，起始浓度为2500ng/mL。将LukAB毒素CC8和CC45添加到测试孔中，最终浓度分别为40ng/mL和20ng/mL。溶解将溶液(Promega)添加到裂解对照孔中。培养皿在37℃、5％CO₂存在下孵育2小时。离心培养皿，将25μL上清液转移到新培养皿中，并添加25μLCytotoxOne试剂(Promega)。平板在室温下孵育15分钟，并向孔中加入终止溶液(Promega)。使用Biotek Synergy Neo 2阅读器以单色读取平板，激发波长为560，带宽为5nm，发射波长为590，带宽为10nm。增益设置为120-130。测定所有血清样本和LukAB单克隆参考抗体的IC₅₀滴度，代表观察到50％细胞毒性的浓度。相对效能滴度(代表血清样本和参考单克隆抗体之间IC₅₀滴度的差异)用作输出值。

结果：

针对LukAB和SpA*诱导的抗体反应。上述几组小鼠分三次接种，每次间隔两周，使用LukAB RARPR-33(5μg)和SpA*(5μg)联合免疫，用或不用佐剂。作为对照，用佐剂和配方缓冲液或仅用配方缓冲液对动物进行免疫，这两种情况下均不含抗原。见图18B。

根据图18A采集血样，并通过ELISA分析血清对LukAB序列变异CC8和CC45以及SpA*的抗体反应。在免疫前，所有组均未检测到LukAB或SpA*特异性预先存在的抗体(图18C-E)。在仅用佐剂和/或配方缓冲液免疫的动物中，血清中的抗体水平在整个实验过程中没有随时间增加(图18C-E)，这表明佐剂本身不会诱导特异性抗体反应，并且需要抗原。

为了评估佐剂是否能增强LukAB-RARPR-33和SpA*的免疫原性，我们比较了用LukAB-RARPR-33+SpA*免疫的动物在有或没有佐剂的情况下对这些抗原的抗体IgG滴度。

与无佐剂的LukAB RARPR-33、SpA*免疫的动物(IgG LukAB CC8几何平均值：315；IgG LukAB CC45几何平均值：141；IgG Spa*几何平均值：282)相比，使用LukAB RARPR-33,SpA*联合AS01b使得对于LukAB CC8和CC45和SpA*的IgG滴度几何平均值(IgG LukAB CC8几何平均值：8079；IgG LukAB CC45几何平均值：5012；IgG SpA*几何平均值：31496)更高。

与用不含佐剂的LukAB RARPR-33、SpA*免疫的动物(IgG-LukAB CC8几何平均值：315；IgG-LukAB CC45几何平均值：141；IgG-SpA*几何平均值：282)相比，用LukAB RARPR-33、SpA*与GLA-SE联合免疫也导致LukAB CC8和CC45以及SpA*的IgG滴度几何平均值(IgGLukAB CC8几何平均值：1401；IgG LukAB CC45几何平均值：3757；IgG SpA*几何平均值：9012)更高。这些结果表明，含有TLR4激动剂的佐剂可提高LukAB RARPR-33和SpA*的免疫原性。

与无佐剂的LukAB RARPR-33、SpA*免疫的动物(IgG-LukAB CC8几何平均值:315；IgG-LukAB CC45几何平均值:141)相比，LukAB RARPR-33、SpA*联合Alhydrogel免疫使得对于LukAB CC8和CC45的IgG滴度几何平均值(IgG-LukAB CC8几何平均值:595；IgG-LukABCC45几何平均值:263)更高。对于SpA*特异性抗体应答，在用LukAB RARPR-33、SpA*和Alhydrogel免疫的动物组(IgG SpA*几何平均值：93318)中观察到最高的IgG滴度几何平均值。

与无佐剂的LukAB RARPR-33、Spa*免疫的动物(IgG LukAB CC8几何平均值：315；IgG LukAB CC45几何平均值：141)相比，LukAB RARPR-33、Spa*联合Adju-phos免疫使得对于LukAB CC8和CC45的几何平均滴度(IgG LukAB CC8几何平均值：645；IgG LukAB CC45几何平均值：593)更高。对于Spa*，与无佐剂的LukAB RARPR-33、Spa*免疫组相比(IgG Spa*几何平均值：282)，使用LukAB RARPR-33、Spa*和Adju-phos免疫的动物组(IgG Spa*几何平均值：11614)的IgG滴度几何平均值更高。

这些结果表明，基于明矾的佐剂对Spa特异性抗体反应的影响大于对LukAB特异性抗体反应的影响。这里测试的所有佐剂，无论是含有TLR4激动剂还是基于明矾的佐剂，都能提高LukAB RARPR-33和Spa*联合疫苗的免疫原性。

LukAB毒素的细胞毒性活性的中和。在毒素中和试验中评估了免疫小鼠血清保护THP-1细胞免受细胞毒性剂量的LukAB CC8和CC45造成的细胞死亡的能力。仅包括在第42天(每组5只小鼠)用LukAB RARPR-33+SpA*免疫的动物的血清样本，因为在这些组中，通过ELISA检测到LukAB CC8和CC45的特异性抗体(图18C-D)。

试验中包括一种参考单克隆LukAB特异性抗体。测定血清样本和参考抗体之间IC₅₀滴度的差异，代表测定50％细胞毒性的稀释度，并绘制为相对效能滴度(RP滴度)。

对于LukAB CC8，在用LukAB RARPR-33+SpA*加佐剂(AS01b:1281；GLA-SE:1502；Alhydrogel:476；Adju-Phos:425)免疫的组中，与用LukAB RARPR-33+SpA*不加佐剂(RP滴度几何平均值：122)免疫的组相比，在三次免疫后的血清中测得更高的RP滴度几何平均值(图19A)。

对于LukAB CC45，在使用带有佐剂的LukAB RARPR-33+SpA*免疫的组(AS01b:3392；GLA-SE:3470；Alhydrogel:365；Adju-Phos:298)中，与使用不含佐剂的LukAB RARPR-33+SpA*免疫的组(RP滴度几何平均值：131)相比，在三次免疫后的血清中测得更高的RP滴度几何平均值(图19B)。

这些结果如图19A-B所示，表明疫苗(RARPR-33)中的LukAB诱导功能性抗体，阻断LukAB毒素的细胞毒性活性，并且添加佐剂改善抗体的功能性，以中和LukAB毒性。

结论：测试不同类型的佐剂是否能提高由LukAB RARPR-33和SpA*组成的受试疫苗组合的免疫原性，在使用疫苗组合以及基于明矾的佐剂(氢氧化铝或磷酸铝)或含有TLR4激动剂(AS01b或GLA-SE)的佐剂免疫的小鼠的血清中测定抗体滴度和功能性。与不使用佐剂的免疫相比，向联合疫苗中添加这两种佐剂可提高疫苗特异性抗体滴度。此外，在佐剂存在下，LukAB特异性抗体具有更好的LukAB毒素中和能力。这些结果表明，使用不同的佐剂可以提高联合疫苗的免疫原性。

参考文献

以下参考文献在一定程度上提供了补充本文所述内容的示例性程序或其他细节，通过引用具体并入本文。

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尽管本文详细描述了优选实施方案，但对于相关领域的技术人员来说，显而易见的是，在不偏离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改、添加、替代等，因此，这些都被视为在申请专利范围中定义的本发明范围内。

Claims

1.一种免疫原性组合物，包括：

(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，以及

2.两种或更多种免疫原性组合物的组合，其共同包含：

(i)金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽，以及

3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物或根据权利要求2所述的免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的Glu323的氨基酸残基处包含氨基酸取代。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Lys83、Ser141、Val113、Val193和Glu323的各个氨基酸残基处包含氨基酸取代。

5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述氨基酸取代包含Lys83Met、Ser141Ala、Val113Ile、Val193Ile及Glu323Ala。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽在对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Tyr74、Asp140、Gly149和Gly156的一个或多个氨基酸残基处进一步包含氨基酸取代。

8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述氨基酸取代包含Tyr74Cys、Asp140Cys、Gly149Cys及Gly156Cys。

9.根据权利要求7或8所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述变体LukA蛋白质或多肽在对应于SEQ ID NO:25的氨基酸残基Thr249的氨基酸残基处进一步包含氨基酸取代。

11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukA变体多肽包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA多肽是SpA变体多肽。

13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽具有破坏Fc结合的至少一个氨基酸取代及破坏VH3结合的至少第二氨基酸取代。

14.根据权利要求12或13所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽包含SpAD结构域，所述SpA D结构域包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少90％相同性氨基酸序列。

15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的一个或两个氨基酸位置处具有氨基酸取代。

16.根据权利要求14或15所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽进一步包含SpAE、A、B或C结构域。

17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽包含SpAE、A、B及C结构域，且具有与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列。

18.根据权利要求16或17所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中各个SpA E、A、B和C结构域在对应于SEQ ID NO:58的氨基酸第9和10位的一个或两个氨基酸位置处具有氨基酸取代。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的一个或两个氨基酸位置处的氨基酸取代是赖氨酸残基对谷氨酰胺残基的取代。

20.根据权利要求12至19中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，并且其中所述至少一个结构域具有(i)对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的谷氨酰胺残基处的赖氨酸取代和(ii)对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处的谷氨酸取代。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物进一步包含金黄色葡萄球菌杀白细胞素B(LukB)多肽或其变体。

22.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB多肽是SEQ ID NO:15的LukB多肽或SEQ ID NO:16的LukB多肽。

23.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB多肽是LukB变体多肽。

24.根据权利要求23所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％序列相似性的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少85％序列相似性的氨基酸序列。

25.根据权利要求24所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽在对应于SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16的第53位的氨基酸位置处包含氨基酸取代。

26.根据权利要求25所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述氨基酸取代是缬氨酸到亮氨酸的取代。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽在对应于SEQ ID NO:15的氨基酸残基Glu45、Glu109、Thr121和Arg154的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸取代。

28.根据权利要求23至26中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽在对应于SEQ ID NO:16的氨基酸残基Glu45、Glu110、Thr122和Arg155的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸取代。

29.根据权利要求23至26中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述LukB变体多肽包含与选自SEQ ID NO:17-22的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

30.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含LukA变体多肽和LukB多肽，所述LukA多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:4、或与SEQ IDNO:4具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，所述LukB多肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:16具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

31.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含LukA变体多肽和LukB多肽，所述LukA变体多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，所述LukB多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:15具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

32.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含LukA变体多肽和LukB多肽，所述LukA变体多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，所述LukB多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:18具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA多肽是SpA变体多肽。

34.根据权利要求33所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽包含至少一个SpA A、B、C、D或E结构域，并且其中所述至少一个结构域具有(i)对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的谷氨酰胺残基处的赖氨酸取代和(ii)对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处的谷氨酸取代。

35.根据权利要求21所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中(i)所述SpA变体多肽包含至少一个SpAA、B、C、D或E结构域，并且其中所述至少一个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代；(ii)LukA变体多肽包含CC8LukA变体多肽，所述CC8 LukA变体多肽包含对应于SEQ ID NO:1第80位的氨基酸位置处的甲硫氨酸取代、对应于SEQ ID NO:1第138位氨基酸位置处的丙氨酸取代、对应于SEQ ID NO:1第110和190位的氨基酸位置处的异亮氨酸取代，以及对应于SEQ ID NO:1第320位的氨基酸位置处的丙氨酸取代；和(iii)所述LukB多肽是CC45 LukB变体多肽，所述CC45 LukB变体多肽包含对应于SEQ ID NO:16的第53位的氨基酸位置处的亮氨酸取代。

36.根据权利要求35所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述SpA变体多肽连续包含SpA E、D、A、B及C结构域，各个结构域在对应于SEQ ID NO:58的第9和10位的氨基酸位置处具有赖氨酸取代，并且在对应于SEQ ID NO:58的第33位的氨基酸位置处具有谷氨酸取代。

37.根据权利要求1至34中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其进一步包含佐剂。

38.根据权利要求37所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂是稳定的水包油型乳液。

39.根据权利要求37所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂包含皂苷。

40.根据权利要求39所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述皂苷是QS21。

41.根据权利要求37所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂包含TLR4激动剂。

42.根据权利要求41所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述TLR4激动剂是脂质A或其类似物或衍生物。

43.根据权利要求41所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述TLR4激动剂是吡喃糖基脂质佐剂(GLA)。

44.根据权利要求41所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂包含TLR-4激动剂与稳定的水包油型乳液的组合。

45.根据权利要求43所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂包含GLA-SE。

46.根据权利要求41所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂包含TLR-4激动剂与皂苷的组合。

47.根据权利要求43所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述佐剂包含GLA-LSQ。

48.一种免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含一个或多个核酸分子，其编码权利要求1至36中任一项的免疫原性组合物的金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)多肽或其变体、LukA变体多肽和LukB多肽或其变体。

49.根据权利要求48所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述一个或多个核酸分子被包含在一个或多个载体中。

50.根据权利要求48或49所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其中所述组合物包含宿主细胞，其中所述宿主细胞包含所述一个或多个核酸分子或所述一个或多个载体。

51.一种在有此需要的对象中治疗或预防葡萄球菌感染的方法，所述方法包括：

向有此需要的对象施用有效量的根据权利要求1至50中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合。

52.一种在有此需要的对象中引发对葡萄球菌细菌的免疫应答的方法，所述方法包括：

53.一种在有此需要的对象中去定植葡萄球菌细菌或防止葡萄球菌细菌定植或再定植的方法，所述方法包括：

54.根据权利要求1至50中任一项所述的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其用于在对象中产生针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法。

55.权利要求1至50中任一项的免疫原性组合物或免疫原性组合物的组合，其用作药物。