ES2870506T3 - Antígeno y anticuerpo del epítopo de las toxinas a y/o b de clostridium difficile, y sus usos farmacéuticos - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, dicha secuencia comprende un epítopo para anticuerpos anti-toxinas A y B de Clostridium difficile.

Description

DESCRIPCIÓN

Antígeno y anticuerpo del epítopo de las toxinas a y/o b de clostridium difficile, y sus usos farmacéuticos

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente solicitud de patente reivindica los beneficios de la prioridad de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm.62,118,450, cedida en forma mancomunada, titulada "C difficile antibodies directed thereto, and target for the treatment of humans and other animals intoxicated with at least one bacterial toxin A and/or B". y presentada en la Oficina de Marcas Registradas de Patentes de los Estados Unidos el 19 de febrero de 2015.

Campo técnico

La presente descripción se refiere generalmente a epítopos de toxinas A y/o B producidas por Clostridium difficile y anticuerpos que se unen específicamente a estos epítopos. La descripción también se refiere a composiciones farmacéuticas y vacunas para la prevención o tratamiento de la infección por Clostridium difficile que comprenden cualquiera de los epítopos o anticuerpos de los mismos.

Antecedentes de la Técnica

Clostridium difficile es un patógeno gastrointestinal Gram positivo, anaeróbico y formador de endosporas responsable de la enfermedad asociada a C-difficile (CDAD) en humanos y animales con síntomas que varían en severidad desde casos leves de diarrea asociada a antibióticos hasta colitis pseudomembranosa fatal (Rupnik y otros, 2009; Leffler y Lamont, 2009; Songer, 2004; Kelly y otros, 1994). Cada año en América del Norte, entre el 1-3 % de los pacientes hospitalizados que reciben antibióticos se infectan con C-difficile, lo que provoca miles de muertes y más de 1 billón de dólares en costos asociados para el sistema de atención de la salud (Wilkins y Lyerly, 2003; Kyne y otros, 2002; Kelly y otros, 1994). C-difficile produce dos factores primarios de virulencia, la toxina A (TcdA) y la toxina B (TcdB), que son exotoxinas grandes (308 kDa y 269 kDa, respectivamente) de una sola subunidad compuestas por un dominio catalítico, un dominio de translocación y un dominio de unión a un receptor celular (RBD) (Jank y Aktories, 2008; Jank y otros, 2007). Recientemente se sugirió que la TcdB es la única responsable de la virulencia de C-difficile (Lyras y otros, 2009), aunque estudios anteriores han demostrado que se requieren anticuerpos monoclonales (mAb) tanto anti-TcdA como anti-TcdB para la protección completa de hámsteres contra la CDAD (Babcock y otros, 2006; Kink y Williams, 1998) y que se requieren mAb anti-TcdA para la protección en ratones (Corthier y otros, 1991).

El enfoque actual para tratar la mayoría de las infecciones causadas por la CDAD implica la administración de antibióticos, más comúnmente metronidazol o vancomicina (Leffler y Lamont, 2009). El tratamiento con antibióticos ejerce una presión de selección sobre el organismo, puede provocar resistencia a los antibióticos y suprime o elimina los microbios comensales beneficiosos. Sin embargo, hay otros desafíos emergentes que justifican el desarrollo de terapias novedosas. Primero, no existe un tratamiento de la CDAD aguda dirigido a la TcdA y/o B. Estas toxinas son responsables de la pérdida de la función de barrera epitelial en el colon al interrumpir las uniones estrechas y aumentar la permeabilidad de la membrana, lo que causa diarrea y promueve una inflamación severa (Rupnik y otros, 2009; Jank y Aktories, 2008). Segundo, las cepas hipervirulentas de C-difficile, tal como el aislado NAP1/027, sobreexpresan las TcdA y TcdB (Warny y otros, 2005) y se han asociado con mayores tasas de mortalidad y gravedad de la enfermedad (O'Connor y otros, 2009; Pepin y otros, 2005). Tercero, se estima que entre el 20-25 % de los pacientes que padecen la DACD experimentan una recaída sintomática después de que desaparece la infección inicial, y el 45 % de estos pacientes es propenso a sufrir recaídas subsecuentes (Johnson, 2009). En conjunto, existe la necesidad de reactivos no basados en antibióticos que se dirijan e inhiban las TcdA y TcdB para la terapia contra la CDAD. Los individuos que son portadores asintomáticos de C-difficile y los pacientes que experimentan casos leves de la DACD tienden a poseer títulos altos de antitoxina A (Kyne y otros, 2001; Kyne y otros, 2000; Warny y otros, 1994; Viscidi y otros, 1983). Por el contrario, los pacientes susceptibles a una infección recurrente por C-difficile tienen títulos bajos de inmunoglobulina anti-TcdA, específicamente los isotipos IgM, lgG2 e lgG3 (Katchar y otros, 2007; Kyne y otros, 2001). También se cree que los anticuerpos de la IgA secretores neutralizantes de TcdA desempeñan un papel en la regulación de la gravedad de la CDAD (Johal y otros 2004; Kelly y otros 1992). Por tanto, la introducción de anticuerpos anti-toxina en pacientes que padecen una infección severa por C-difficile puede ser un enfoque terapéuticamente útil.

Un número limitado de estudios en animales y humanos han ilustrado la efectividad de los Ab anti-toxina para el tratamiento de la CDAD. Babcock y otros (2006) administraron por vía intravenosa mAb anti-TcdA y anti-TcdB a hámsteres y encontraron una reducción significativa en la mortalidad de hámsteres en modelos profilácticos, de enfermedad primaria y recaída cuando se administraron ambos mAb anti-toxina. Un ensayo clínico completado recientemente que involucra estos dos mAbs humanizados parece prometedor (Lowy y otros, 2010). En otro estudio, la administración intravenosa de los mAb anti-TcdA producidos contra el RBD seguida de un desafío oral con C-difficile dio como resultado la protección de los ratones (Corthier y otros, 1991). En otros lugares, una vacuna toxoide administrada por vía intraperitoneal a hámsteres confirió protección contra la exposición oral a C-difficile (Giannasca y otros, 1999) y los ratones vacunados con ADN que codifica el TcdA RBD dieron como resultado una protección total contra la exposición oral a la TcdA (Gardiner y otros, 2009). En humanos, varios estudios no controlados han informado que la terapia con inmunoglobulina intravenosa (IVIG) tiene éxito para el tratamiento de la CDAD severa (Juang y otros, 2007; Hassoun e Ibrahim, 2007; McPherson y otros, 2006; Wilcox, 2004; Salcedo y otros, 1997; Leung y otros, 1991). La IVIG implica la administración de altas concentraciones (150 - 400 mg/kg) de inmunoglobulinas humanas de donantes sanos que se cree que contienen anticuerpos anti-toxina neutralizantes, ya que se estima que el 60 % de los adultos sanos tienen anticuerpos IgG séricos específicos de las TcdA y TcdB detectables (Viscidi y otros, 983). Dado que las toxinas de C-difficile dependen de la unión a las células epiteliales para la entrada (Jank y Aktories, 2008; Jank y otros, 2007), neutralizar las toxinas dentro del tracto gastrointestinal inferior con anticuerpos puede bloquear la primera etapa en la patogénesis de la CDAD. En animales, el concentrado de inmunoglobulina bovina (BIC) administrado por vía oral que contiene IgG neutralizantes de las TcdA y TcdB pudo prevenir la mortalidad de los hámsteres cuando se usa como profiláctico (Lyerly y otros, 1991) y protege a las ratas de los efectos enterotóxicos de la TcdA in vivo (Kelly y otros, 1996). Se demostró que los anticuerpos IgY de pollo específicos para las toxinas RBD reducen la mortalidad de los hámsteres cuando se administran por vía oral a animales infectados (Kink y Williams, 1998). En humanos, ha habido informes limitados sobre la terapia contra la CDAD con los Ab administrados por vía oral. Tjellstrom y otros (1993) informaron el tratamiento exitoso de un niño de 3 años y medio que padecía de la CDAD severa con anticuerpos IgA por vía oral. Warny y otros (1999) y Kelly y otros (1997) examinaron el paso de la IgG bovina anti-toxina a través del tracto gastrointestinal humano y encontraron una reducción significativa en la actividad de la IgG, probablemente debido a la degradación proteolítica dentro del tracto gastrointestinal superior. El éxito limitado de la inmunoterapia con antitoxina tanto oral como sistémica en entornos clínicos probablemente se ha visto obstaculizado por los altos requisitos de dosis de inmunoglobulina (150 - 400 mg/kg), los costos asociados de estas dosis y la falta de datos clínicos publicados que muestren la eficacia de estos tratamientos.

A pesar de estos avances, se mantiene una necesidad en la técnica de un tratamiento seguro y efectivo para tratar la enfermedad asociada a C-difficile, así como también de reactivos sensibles y efectivos para la detección de las toxinas A y B, los factores responsables de la enfermedad asociada a C-difficile.

Resumen

La invención es como se define en las reivindicaciones.

Los objetivos mencionados anteriormente y otros de la presente descripción se logran al proporcionar generalmente toxinas A y/o B específicas de Clostridium difficile (C-difficile) como una diana para la terapia, que incluye la inmunoterapia pasiva, y particularmente la prevención de la intoxicación por toxinas A y/o B en humanos u otros animales.

Un aspecto de la presente descripción es proporcionar un polipéptido aislado que comprende una porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B es un epítopo para el anticuerpo anti-toxinas A y/o B, la porción comprende una secuencia que es la SEQ ID NO: 1, la SEQ iD n O: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Preferentemente, la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B puede comprender una combinación de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden usarse para inmunizar un animal contra la infección por Clostridium difficile.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar una composición farmacéutica para generar un anticuerpo neutralizante dirigido contra las toxinas A y/o B de Clostridium difficile y que comprende al menos dos polipéptidos diferentes, donde cada polipéptido comprende una porción de la secuencia de toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B es un epítopo para el anticuerpo anti-toxinas A y/o B, y la porción comprende una secuencia que es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Preferentemente, la composición farmacéutica puede comprender cuatro polipéptidos diferentes, en donde la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B comprende una combinación de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente pueden comprender además un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas pueden usarse para inmunizar un animal contra la infección por Clostridium difficile.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar una composición vacunal para la prevención o el tratamiento de una infección por Clostridium difficile que comprende al menos un polipéptido, el cual comprende una porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B es un epítopo para el anticuerpo anti-toxinas A y/o B, y la porción comprende una secuencia que es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Preferentemente, la composición vacunal mencionada anteriormente puede comprender la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B que comprende una combinación de la SEQ ID n O: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Las composiciones vacunales mencionadas anteriormente pueden comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar una composición vacunal de ácido nucleico o vacuna de ADN para la prevención o el tratamiento de una infección por Clostridium difficile que comprende ácidos nucleicos que codifican al menos un polipéptido, el cual comprende una porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B es un epítopo para el anticuerpo anti-toxinas A y/o B; la porción comprende una secuencia que es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID n O: 3, la SEQ ID n O: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Preferentemente, la composición vacunal de ácido nucleico mencionada anteriormente puede comprender la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B que comprende una combinación de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Las composiciones vacunales de ácido nucleico mencionadas anteriormente pueden comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar un método para generar un anticuerpo neutralizante dirigido contra las toxinas A y/o B de Clostridium difficile. El método comprende una primera etapa para administrar a un hospedero un polipéptido aislado que comprende una porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la porción comprende una secuencia que es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones, para generar anticuerpos en el hospedero. El método comprende además una segunda etapa para obtener los anticuerpos del hospedero. El hospedero puede ser un mamífero o un ave, que incluye los huevos de ave, tal como, pero sin limitarse a, huevos de gallina.

Preferentemente, en la primera etapa del método, la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile comprende una combinación de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar un anticuerpo purificado adaptado para unirse a un péptido de las toxinas A y/o B, donde el péptido comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

El anticuerpo mencionado anteriormente también puede ser un fragmento activo del mismo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo revestido, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo recombinante monocatenario basado en el mismo, así como también un anticuerpo policlonal de ave o un anticuerpo recombinante humanizado de ave.

El anticuerpo mencionado anteriormente puede usarse para detectar toxinas A y/o B puras o la presencia de toxinas A y/o B producidas por Clostridium difficile en cultivo celular.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar una composición de anticuerpos para la prevención o el tratamiento de la infección por Clostridium difficile, que comprende diferentes anticuerpos adaptados para unirse a al menos dos epítopos de las toxinas A y/o B, donde los al menos dos epítopos comprenden una secuencia de la SEQ ID NO: 1, la Se Q ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Preferentemente, la composición de anticuerpos mencionada anteriormente puede comprender diferentes anticuerpos adaptados para unirse a cuatro epítopos diferentes, donde los epítopos comprenden una combinación de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la intoxicación por las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la composición comprende un anticuerpo adaptado para unirse a al menos un epítopo de las toxinas A y/o B, donde el al menos un epítopo comprenden una secuencia de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID No : 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Preferentemente, la composición farmacéutica mencionada anteriormente puede comprender al menos un epítopo que comprende una combinación de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

Las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente pueden comprender además un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente pueden usarse para preparar un medicamento para prevenir o tratar la infección por Clostridium difficile.

Las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente también pueden usarse para la captura y neutralización de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, lo que permite una inmunoterapia pasiva de mamíferos, tales como humanos.

Las características de la presente descripción que se cree que son novedosas se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas.

Breve Descripción de los Dibujos

Los objetos, características y ventajas anteriores y otros de la divulgación se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción, haciendo referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 es una representación esquemática de la porción diana de los anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B.

La Figura 2 ilustra la porción de la secuencia diana de los anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B.

La Figura 3 es una fotografía de una transferencia Western que muestra el reconocimiento de las toxinas A y/o B por el anticuerpo del epítopo de las toxinas A y/o B IBSCD1, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 4 es una fotografía de una transferencia Western que muestra el reconocimiento de las toxinas A y/o B por el anticuerpo del epítopo de las toxinas A y/o B IBSCD2, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 5 es una fotografía de una transferencia Western que muestra el reconocimiento de las toxinas A y/o B por el anticuerpo del epítopo de las toxinas A y/o B IBSCD3, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 6 es una fotografía de una transferencia Western que muestra el reconocimiento de las toxinas A y/o B por el anticuerpo del epítopo de las toxinas A y/o B IBSCD4, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 7 es un conjunto de fotografías al microscopio que muestran el efecto de neutralización sobre el redondeo celular y la muerte de la línea celular intestinal Caco-2 por la formulación de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B en presencia del sobrenadante de la cepa hipervirulenta C-difficile NAP1/027, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 8 es un conjunto de fotografías al microscopio que muestran el efecto de neutralización sobre el redondeo celular y la muerte de la línea celular intestinal Caco-2 por la formulación de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B en presencia del sobrenadante de la cepa hipervirulenta C-difficile NAP1/027 y la toxina A y la toxina B purificadas, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 9 es un conjunto de fotografías al microscopio de epifluorescencia que muestran la mejora de la viabilidad de las células Caco-2 mediante los anticuerpos bloqueantes contra la toxina A y/o B de C-difficile, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 10 es un conjunto de gráficos que muestran la protección de la integridad monocapa de Caco-2 mediante los anticuerpos bloqueantes contra la toxina A y/o B de C-difficile, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 11 es un conjunto de gráficos que muestran la reducción de la infección por Clostridium difficile in vivo mediante los anticuerpos bloqueantes contra la toxina A y/o B de C-difficile, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

La Figura 12 es un conjunto de fotografías al microscopio que muestran la reducción del daño en la mucosa en el colon murino mediante los anticuerpos bloqueantes contra la toxina A y/o B de C-difficile, de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.

Descripción Detallada

A continuación se describirá una composición novedosa de anticuerpos anti-toxinas A y/o B y epítopos de toxinas A y/o B. Aunque la descripción se describe en términos de modalidad(es) ilustrativa(s) específica(s), debe entenderse que la(s) modalidad(es) descrita(s) en la presente descripción son solo a manera de ejemplo y que el alcance de la descripción no pretende estar limitado de esta manera.

En un aspecto amplio, la presente descripción proporciona un método que usa una combinación de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B, que incluyen pero no se limitan a los anticuerpos del epítopo de aves, para la captura y neutralización de las toxinas A y/o B de C-difficile, que permite una inmunoterapia pasiva de humanos u otros mamíferos. El método de neutralización tiene como objetivo tres porciones clave diferentes de las toxinas A y/o B entre los cuatro dominios de las toxinas de C-difficile, que son los oligopéptidos repetitivos combinados (CROP) del dominio C-terminal 10,el dominio de formación de poros de entrega20,el dominio de autoproteasa30,y el dominio glucosiltransferasa N-terminal40, como se ilustra en las Figuras 1 y 2. Estas diferentes porciones de las toxinas A y/o B incluyen cuatro epítopos diferentes adaptados para generar anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B en mamíferos o aves. Además, la Figura 2 muestra la ubicación de los cuatro epítopos dentro de las secuencias de aminoácidos de las toxinas A y B como parte de la presente invención.

De acuerdo con una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos: DSKKYYFNTNTAEAA (SEQ ID NO: 1). Este péptido en particular es un péptido del epítopo de las toxinas A y/o B que abarca los aminoácidos 2084-2098 de las toxinas A y/o B, que se ha identificado como un epítopo compartido de las toxinas A y/o B mediante el uso de los anticuerpos policlonales de pollo IBSCD1 (ver Figura 3) .

De acuerdo con una segunda modalidad de la presente invención, se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos: ANQYEVRINSEGR (SEQ ID NO: 2). Este péptido en particular es un péptido del epítopo de las toxinas A y/o B que abarca los aminoácidos 739-751 de las toxinas A y/o B, que se ha identificado como un epítopo compartido de las toxinas A y/o B mediante el uso de los anticuerpos policlonales de pollo IBSCD2 (ver Figura 4) .

De acuerdo con una tercera modalidad de la presente invención, se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos GHGKDEFNTDIFAG (SEQ ID NO: 3). Este péptido en particular es un péptido del epítopo de las toxinas A y/o B que abarca los aminoácidos 652-665 de las toxinas A y/o B, que se ha identificado como un epítopo compartido de las toxinas A y/o B mediante el uso de los anticuerpos policlonales de pollo IBSCD3 (ver Figura 5) .

De acuerdo con una cuarta modalidad de la presente invención, se proporciona un péptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos DEYNKLTTNNNENKYL (SEQ ID NO: 4). Este péptido en particular es un péptido del epítopo de las toxinas A y/o B que abarca los aminoácidos 31-46 de las toxinas A y/o B, que se ha identificado como un epítopo compartido de las toxinas A y/o B mediante el uso de los anticuerpos policlonales de pollo IBSCD4 (ver Figura 6).

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, los péptidos aislados, que incluyen combinaciones de uno o más de los mismos, están adaptados para generar anticuerpos que reconocen las toxinas A y/o B y tienen una actividad terapéutica o profiláctica neutralizante en la inmunización de animales, particularmente mamíferos, más particularmente humanos, que tienen una intoxicación por C-difficile.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una combinación de polipéptidos, que comprende toda la secuencia de aminoácidos antes mencionada de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Los polipéptidos antes mencionados pueden incluir un péptido inmunogénico, que comprende particularmente la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4, o un fragmento inmunogénico del mismo. Estos polipéptidos también pueden incluir un receptor inmunogénico de péptidos, en donde tales polipéptidos comprenden una combinación de al menos un péptido receptor inmunogénico que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4, o un fragmento de péptido inmunogénico del mismo.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para inmunizar animales, particularmente mamíferos o aves, que comprende administrar un péptido del epítopo de las toxinas A y/o B o un fragmento inmunogénico del mismo, de manera que el animal produce anticuerpos que son inmunorreactivos con el péptido del epítopo expuesto a las toxinas A y/o B de longitud total o parcial producidas por bacterias C-difficile. El método para inmunizar mamíferos o aves puede comprender administrar un péptido de las toxinas A y/o B que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 o un fragmento inmunogénico del mismo, de manera que el animal produce anticuerpos que son inmunorreactivos a las toxinas A y/o B de longitud completa producidas por la bacteria C-difficile. De acuerdo con una modalidad preferida, el método mencionado anteriormente comprende el uso de los cuatro péptidos de toxinas A y/o B diferentes con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para generar un anticuerpo neutralizante dirigido contra las toxinas A y/o B de Clostridium difficile, donde la composición farmacéutica comprende un péptido de las toxinas A y/o B, particularmente con secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 y un portador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende los cuatro péptidos de toxinas A y/o B diferentes con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporcionan unas vacunas o composiciones inmunogénicas que comprenden uno o más péptidos de las toxinas A y/o B, particularmente con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con una modalidad preferida, la composición vacunal comprende los cuatro péptidos de toxinas A y/o B diferentes con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la Se Q ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La vacuna también puede usarse para el tratamiento de un sujeto, tal como un mamífero, particularmente un sujeto humano, que padece una intoxicación por C-difficile. Tal vacuna puede comprender una cantidad inmunogénica de uno o más péptidos de las toxinas A y/o B, particularmente con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 o un fragmento inmunogénico del mismo, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los péptidos de las toxinas A y/o B mencionados anteriormente pueden conjugarse con un portador.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporcionan unas vacunas de ácido nucleico o vacunas de ADN que comprenden ácidos nucleicos que codifican péptidos inmunogénicos de las toxinas A y/o B, particularmente con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con una modalidad preferida, la composición vacunal de ácido nucleico comprende los ácidos nucleicos que codifican los cuatro péptidos de toxinas A y/o B diferentes con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La vacuna de ácido nucleico antes mencionada puede comprender además al menos otro polipéptido, particularmente un péptido de molécula inmunomoduladora derivado de C-difficile.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para el diagnóstico de la infección por Clostridium difficile que comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con al menos un fragmento peptídico de las toxinas A y/o B y detectar la formación del complejo antígeno-anticuerpo. Tal al menos un fragmento peptídico puede comprender un epítopo para el anticuerpo anti-toxinas A y/o B con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la Se Q ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un kit para el diagnóstico o detección de la infección por Clostridium difficile, donde el kit comprende al menos un fragmento peptídico de las toxinas A y/o B e instrucciones para diagnosticar o detectar el anticuerpo anti-toxina A y/o B. Dicho al menos un fragmento peptídico puede comprender un epítopo para el anticuerpo anti-toxina A y/o B con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, la Se Q ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la Se Q ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos de las toxinas A y/o B con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4 están adaptados para generar anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B en mamíferos o aves. Dichos anticuerpos reconocen las toxinas A y/o B y tienen un efecto neutralizante sobre la actividad de estas toxinas, de modo que los anticuerpos pueden usarse para un tratamiento terapéutico o profiláctico contra la intoxicación por C-difficile en humanos y animales.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para generar un anticuerpo neutralizante dirigido contra las toxinas A y/o B de Clostridium difficile. El método comprende una primera etapa para administrar a un hospedero un polipéptido aislado que comprende una porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile. Donde la porción comprende una secuencia que es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones, para generar anticuerpos en el hospedero. El método comprende una segunda etapa para obtener los anticuerpos del hospedero. El hospedero puede ser un mamífero o un ave, que incluye los huevos de ave, tal como, pero sin limitarse a, huevos de gallina.

El método mencionado anteriormente puede comprender además una primera etapa, en donde la porción de la secuencia de las toxinas A y/o B de Clostridium difficile comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.

En referencia a la Figura 3, un anticuerpo, denominado IBSCD1, está adaptado para unirse a un epítopo clave de las toxinas A y/o B clave, que abarca los aminoácidos 2084-2098 de la toxina A y/o B ubicados en el dominio C-terminal de los oligopéptidos repetitivos combinados (CROP) 10 de toxinas A y/o B. Este dominio juega un papel en la unión a células humanas o animales, como se ilustra en la Figura 1, etapa 1.

En referencia a las Figuras 4 y 5, dos anticuerpos, denominados IBSCD2 e IBSCD3, están adaptados para unirse a los epítopos de las toxinas A y/o B, que abarcan respectivamente los aminoácidos 739-751 y 652-665 de las toxinas A y/o B ubicadas en el dominio de formación de poros de entrega 20. Este dominio juega un papel en la formación de poros del endosoma de la célula infectada, como se ilustra en la Figura 1, etapa 3.

En referencia a la Figura 6, otro anticuerpo, denominado IBSCD4, se une al epítopo de las toxinas A y/o B que abarca los aminoácidos 31-46 de las toxinas A y/o B ubicadas en el dominio glucosiltransferasa 40. Este dominio juega un papel en la inactivación de pequeñas GTPasas en las células afectadas, como se ilustra en la Figura 1, etapa 4.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona una formulación novedosa que combina anticuerpos del epítopo clave de las toxinas A y/o B, localizados en tres dominios clave de las toxinas A y/o B, para la neutralización de las toxinas A y/o B, en cualquier etapa de intoxicación por toxinas A y/o B relacionada con la infección por C-difficile. Por lo tanto, la formulación novedosa de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B puede usarse en inmunoterapia, para la mediación terapéutica y/o profiláctica de la intoxicación por C-difficile.

De acuerdo con otra modalidad, se proporciona un anticuerpo purificado contra un péptido de la toxina A y/o B que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. Los anticuerpos descritos anteriormente pueden detectar específicamente las toxinas A y/o B puras o la presencia de estas toxinas producidas por C-difficile en cultivo.

El anticuerpo puede seleccionarse entre los anticuerpos IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3, IBSCD4 o fragmentos activos de los mismos. El anticuerpo puede incluir tanto anticuerpos policlonales como monoclonales preparados mediante técnicas genéticas conocidas, así como también anticuerpos biespecíficos y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que los hacen adecuados para uso diagnóstico o terapéutico. El anticuerpo puede consistir en anticuerpos policlonales de aves o recombinantes humanizados de aves. Además, el anticuerpo puede incluir, pero no se limita a, anticuerpos o fragmentos de los mismos obtenidos naturalmente y preparados de forma recombinante, que incluyen variantes monocatenarias y Fv. Los anticuerpos también pueden incluir anticuerpos quiméricos, anticuerpos recubiertos, anticuerpos humanizados, anticuerpos policlonales de pollo, anticuerpos humanizados recombinantes de pollo, anticuerpos de dominio, anticuerpos camelizados y anticuerpos recombinantes monocatenarios. Tales anticuerpos pueden usarse para inmunización pasiva para reducir la intoxicación por C-difficile, particularmente en humanos.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para prevenir o tratar la intoxicación por toxinas A y/o B de C-difficile. La composición farmacéutica puede comprender al menos un anticuerpo adaptado para unirse a al menos un epítopo de las toxinas A y/o B, y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal epítopo puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones. De acuerdo con una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende los anticuerpos adaptados para unirse a los cuatro péptidos de toxinas A y/o B diferentes con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la s Eq ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporcionan métodos terapéuticos basados en la actividad de un anticuerpo, o fragmentos activos del mismo, adaptados para unirse a un péptido de las toxinas A y/o B que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4. En particular, el método puede comprender anticuerpos, o fragmentos activos de los mismos, y anticuerpos quiméricos o sintéticos derivados de los mismos, y pueden prepararse en composiciones farmacéuticas, que incluye un vehículo, portador o diluyente adecuado, para su administración en casos en donde la terapia sea apropiada, como para tratar la infección por C-difficile. Tales métodos pueden incluir formulaciones orales de antitoxinas A y/o B de aves o mamíferos para la prevención de la intoxicación por toxinas A y/o B. Tales métodos también pueden incluir modular la vida media de los miembros de unión, anticuerpos o fragmentos mediante métodos conocidos en la técnica tal como la pegilación. Tales métodos pueden comprender además anticuerpos o agentes terapéuticos adicionales.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para el diagnóstico de la infección por Clostridium difficile que comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con al menos un anticuerpo anti-toxinas A y/o B adaptado para unirse a al menos un epítopo de las toxinas A y/o B y detectar la formación del complejo antígeno-anticuerpo. Dicho al menos un epítopo puede comprender una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona un kit para el diagnóstico o detección de la infección por Clostridium difficile, donde el kit comprende al menos un anticuerpo anti-toxinas A y/o B adaptado para unirse a al menos un epítopo de las toxinas A y/o B e instrucciones para diagnosticar o detectar el anticuerpo anti­ toxina A y/o B. Dicho al menos un epítopo puede ser una secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 1, la Se Q ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la s Eq ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.

Ejemplos:

La Figura 7 muestra el efecto de neutralización sobre el redondeo celular y la muerte de la línea celular intestinal Caco-2 por la formulación de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B en presencia del sobrenadante de la cepa hipervirulenta C-difficile NAP1/027. El panel A) muestra una monocapa intacta de células Caco-2 después de la incubación con 25 gl de agua (control negativo). El panel B) muestra una monocapa alterada y destruida de células Caco-2, con mucho redondeo celular y células muertas después de la incubación con 25 pl de sobrenadante de toxina A/B de la cepa C-difficile NAP1/027 sin diluir. El panel C) muestra la monocapa alterada de células Caco-2, con redondeo celular (flechas) y células muertas después de la incubación con 25 pl de dilución 1:1000 de sobrenadante de toxina A/B de la cepa C-difficile NAP1/027. El panel D) muestra la monocapa conservada de células Caco-2 después de la incubación con 25 pl de una dilución 1:1000 de sobrenadante de la toxina A/B de la cepa C-difficile NAP1/027 en presencia de una formulación que contiene 63 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A/B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4.

La Figura 8 muestra el efecto de neutralización sobre el redondeo celular y la muerte de la línea celular intestinal Caco-2 mediante la adición de la formulación de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B cuando está en presencia del sobrenadante de la cepa hipervirulenta C-difficile NAP1/027 y la toxina A y la toxina B purificadas. El panel A) muestra redondeo completo de células, pérdida de adhesión y muerte celular después de la incubación con 400 ng/ml de toxina A purificada. El panel B) muestra reducción del efecto citotóxico con disminución del redondeo y muerte celular, después de la incubación con 400 ng/ml de toxina A, preincubados con 63 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4. El panel C) muestra la monocapa alterada de células Caco-2, con redondeo celular y células muertas y sin formación de cúpula, después de la incubación con 25 pl de dilución 1:100 de sobrenadante de toxina A/B de la cepa C-difficile NAP1/027. El panel D) muestra la monocapa conservada de células Caco-2 después de la incubación con 25 pl de una dilución 1:100 de sobrenadante de la toxina A y/o B de la cepa C-difficile NAP1/027 en presencia de una formulación que contiene 125 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4. El panel E) muestra redondeo completo de células, pérdida de adhesión y muerte celular después de la incubación con 10 ng/ml de toxina B purificada. El panel F) muestra reducción del efecto citotóxico con disminución del redondeo y muerte celular después de la incubación con 40 ng/ml toxina B, preincubados con 125 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4.

La Figura 9 muestra la muerte celular inducida por la toxina A y B de C. difficile en células Caco-2, y la mejora de la viabilidad celular por los anticuerpos bloqueantes. Las células Caco-2 se sembraron en portaobjetos de cámara en 200 pl de medio de cultivo y se incubaron durante la noche a 37 °C en una incubadora de CO². Al día siguiente, se indujo la muerte celular con la toxina A y B y las células se incubaron durante 48 horas. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con Anexina V y Pi (1:10) durante 15 minutos. Los cubreobjetos se montaron con medio de montaje y DAPI. Las imágenes se tomaron por microscopía de epifluorescencia. El panel A) muestra poca o ninguna muerte celular en las células tratadas con agua. El panel B) muestra poca o ninguna muerte celular debido a un proceso normal de muerte celular en presencia de 125 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4. El panel C) muestra un aumento en el número de células verdes (o blancas) marcadas con anexina V que representan células apoptóticas, en presencia de 400 ng/ml de toxina A. El panel D) muestra una disminución en la muerte celular con 400 ng/ml de toxina A preincubada con 125 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4. El panel E) muestra un aumento en la muerte celular con 40 ng/ml de toxina B. El panel F) muestra disminución en la muerte celular con 40 ng/ml toxina B preincubada con 125 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A/B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4. Las toxinas A y B de C. difficile indujeron muerte celular programada e incluso necrosis (representada en blanco), mientras que la preincubación de toxinas con anticuerpos del epítopo de las toxinas A/B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4 disminuyó el número de células apoptóticas en todas las condiciones. En azul, las células marcadas con DAPI, representan células vivas.

La Figura 10 muestra la protección de la integridad de la monocapa de Caco-2 por los anticuerpos bloqueantes contra las toxinas A y B de C. difficile. El panel A) muestra la monocapa de Caco-2 post-confluente después de 7-10 días que se hizo crecer en insertos porosos de 4 pm. Sólo se usaron monocapas de celda polarizadas. A las 6 horas, la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de la monocapa de Caco-2 disminuyó rápidamente hasta el 67 % cuando las células se estimularon con 400 ng/ml de toxina A. Las células tratadas con toxina A preincubadas con anticuerpos bloqueantes IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4 aumentó la TEER hasta un 86 % en comparación con las células no estimuladas, que se informó a uno. El panel B) muestra la rápida disminución de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de la monocapa de Caco-2 hasta el 77 % cuando las células se estimularon con 40 ng/ml de toxina B en comparación con las células no estimuladas. El uso de 125 pg/ml de anticuerpos bloqueantes restauró la integridad epitelial hasta en un 93 %. El panel C) muestra que cuando las células se estimularon con el sobrenadante de la cepa C. difficile NAP1/027 (1:10), la TEER disminuyó al 61 % en comparación con las no estimuladas después de 6 horas. La preincubación de 125 pg/ml de anticuerpos del epítopo de las toxinas A y/o B de IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4 con sobrenadante restauró la integridad epitelial hasta en un 84 %. Los resultados representan la SEM media de tres experimentos independientes realizados por duplicado. El análisis estadístico se realizó con ANOVA de 2 vías.

La Figura 11 muestra la reducción de la infección por Clostridium difficile in vivo por los anticuerpos bloqueantes contra la toxina A y/o B de C-difficile. Se alojaron ratones hembra de 6-8 semanas en grupos de 4 en jaulas estériles equipadas con filtros HEPA y que contenían ropa de cama estéril. Tenían acceso a alimentos y agua esterilizados ad libitum. Los ratones son intrínsecamente resistentes a la CDI, por lo que se acondicionaron previamente durante tres días con 250 mg/l de clindamicina y 400 mg/l de estreptomicina en el agua de bebida, seguido de una inyección intraperitoneal (ip) de 1 mg de clindamicina/ratón para interrumpir su microbiota intestinal y hacerlos susceptibles a la CDI. Veinticuatro horas después, los ratones recibieron por sonda 10e+5 esporas de la cepa R20291 de la CD epidémica para iniciar la infección. A los ratones se les administró dos veces al día 1 mg de una preparación de anticuerpos epítopo A y/o B de las toxinas IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4 en tampón carbonato 0,1 M (pH 9,2) para neutralizar la acidez gástrica durante 5 días. Los grupos control consisten en ratones no infectados y ratones infectados pero no tratados. El panel A) muestra los resultados de los ratones que se observaron durante un total de 7-10 días y los síntomas clínicos se controlaron diariamente (diarrea, pérdida de peso, letargo, etc.). El panel B) muestra los resultados de muestras fecales frescas que se recogieron diariamente y se homogeneizaron en PBS prerreducido, y se enumeraron las CD en placas de agar. Los recuentos bacterianos finales de la puntuación clínica fueron mayores en los ratones no tratados en comparación con los ratones no infectados. Los ratones que recibieron anticuerpos del epítopo A y/o B de las toxinas Ib Sc D1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4 tenían una puntuación de CDI más baja que los ratones no tratados y unos recuentos bacterianos más bajos.

La Figura 12 muestra la reducción del daño de la mucosa en el colon murino por los anticuerpos bloqueantes contra la toxina A y/o B de C-difficile. Se alojaron ratones hembra de 6-8 semanas en grupos de 4 en jaulas estériles equipadas con filtros HEPA y que contenían ropa de cama estéril. Tenían acceso a alimentos y agua esterilizados ad libitum. Los ratones son intrínsecamente resistentes a la CDI, por lo que se acondicionaron previamente durante tres días con 250 mg/l de clindamicina y 400 mg/l de estreptomicina en el agua de bebida, seguido de una inyección intraperitoneal (ip) de 1 mg de clindamicina/ratón para interrumpir su microbiota intestinal y hacerlos susceptibles a la CDI. Veinticuatro horas después, los ratones recibieron por sonda 10e+5 esporas de la cepa R20291 de la CD epidémica para iniciar la infección. A los ratones se les administró dos veces al día 1 mg de una preparación de anticuerpos epítopo A y/o B de las toxinas IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4 en tampón carbonato 0,1 M (pH 9,2) para neutralizar la acidez gástrica durante 5 días. Los grupos control consisten en ratones no infectados y ratones infectados pero no tratados. En el día diez, se extrajeron los colones y se incrustaron en parafina. Se realizó tinción con Hematoxilina & Eosina (H&E). El panel A) muestra la tinción con H&E normal de ratones no infectados. Panel B) muestra la tinción con H&E de ratones infectados pero no tratados, que presentaban signos de inflamación leve. El panel C) muestra la tinción con H&E de ratones infectados tratados con anticuerpos del epítopo A y/o B de las toxinas IBSCD1, IBSCD2, IBSCD3 e IBSCD4, que presentaron daño en la mucosa menos severo que los ratones no tratados. Las flechas negras indican el grosor de la capa submucosa, la infiltración de células inmunitarias y la pérdida de la capa epitelial.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1, dicha secuencia comprende un epítopo para anticuerpos anti-toxinas A y B de Clostridium difficile.

2. Una combinación de péptidos que comprende el péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, y al menos uno de i) un péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, ii) un péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 3 y iii) un péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4.

3. La combinación de péptidos de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende el péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, el péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2, el péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 3 y el péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4.

4. La combinación de péptidos de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende el péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 y el péptido aislado que consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2.

5. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 o la combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el(los) péptido(s) aislado(s) está(n) conjugado(s) con un portador.

6. El péptido aislado o la combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso para inmunizar un animal contra la infección por Clostridium difficile.

7. Una composición farmacéutica para generar anticuerpos neutralizantes dirigidos contra las toxinas A y B de Clostridium difficile en un animal, dicha composición farmacéutica comprende el péptido aislado o la combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para su uso para inmunizar un animal contra la infección por Clostridium difficile.

9. Una composición vacunal que comprende el péptido aislado o la combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

10. El péptido aislado o la combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en la generación de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra las toxinas A y B de Clostridium difficile en un hospedero.

11. El péptido aislado o la combinación de péptidos para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el hospedero es un mamífero o un ave.

12. Un anticuerpo purificado que se une a las toxinas A y B de Clostridium difficile, el anticuerpo purificado que se une al péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1.

13. El anticuerpo purificado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal de ave o un anticuerpo recombinante humanizado de ave.

14. Uso del anticuerpo purificado de acuerdo con la reivindicación 12 o 13 para detectar (i) toxinas A y/o B puras de Clostridium difficile en cultivo celular, o (ii) una presencia de toxinas A y/o B producidas por Clostridium difficile en cultivo celular.

15. Una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la intoxicación por toxinas A y B de Clostridium difficile, dicha composición comprende

al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12; y

un portador farmacéuticamente aceptable.