KR20200063410A

KR20200063410A - 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법, 이에 의해 제조된 난황항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200063410A
Application number: KR1020180148782A
Authority: KR
Inventors: 정홍걸
Original assignee: 정홍걸
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-06-05
Also published as: KR102148503B1; CN111217906A

Abstract

본 발명은 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원을 이용하여 이종항체를 제조한 다음, 상기 항원 및 이종항체를 결합시킨 복합체를 산란계에 접종함으로써 난황항체를 제조하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법, 이에 의해 제조된 난황항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체의 제조방법은 항원-이종항체 복합체를 산란계에 주입함으로써 난황항체를 대량으로 제조 및 생산할 수 있으며, 이에 따라 제조된 난황항체의 경우, 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스에 대한 특이성 및 결합성이 높아 상기 균 및 바이러스의 성장을 효과적으로 억제함으로써 돼지 소화기성 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법, 이에 의해 제조된 난황항체 및 이의 용도{Manufacturing method of Immunoglobulin Y for preventing or treating pig digestive diseases, and Immunoglobulin Y thereby and the use thereof}

본 발명은 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법, 이에 의해 제조된 난황항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원을 이용하여 이종항체를 제조한 다음, 상기 항원 및 이종항체를 결합시킨 복합체를 산란계에 접종함으로써 난황항체를 제조하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법, 이에 의해 제조된 난황항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

항체(antibody)는 B림프구 또는 B세포에 의해 림프 조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 특이적인 면역인식에 관여하는 중요한 물질 중 한 가지이다. 항체는 서로 다른 두 가지의 기능을 갖고 있는데, 첫번째는 면역반응을 일으키는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식 및 결합하여 항원의 작용을 중화시키는 것이고, 두번째는 항체가 항원에 결합함으로써 항원을 제거하기 위한 여러 가지 물질과 면역 세포들을 끌어 모으는 역할이다. 예컨대, 항체가 독소와 결합하여 독소의 단순한 화학적 조성을 변화시켜 독성을 중화시킬 수도 있고, 침입한 미생물에 부착함으로써 미생물의 운동성을 없애고 체세포로 침입하는 것을 방해하기도 한다. 또한, 항체로 둘러싸인 항원은 보체와 화학적 연쇄반응을 일으켜 침입한 미생물의 직접적인 분해를 일으키거나 탐식세포를 유인한다. 이러한 항원 항체 반응의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 응용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 의약품이 출현하게 되었다(Jim E. Eyles et al., Vaccine, 25, pp73017306, 2007).

한편, 질병에 대한 방어기전으로서 사람뿐만 아니라 여러 포유류 및 조류도 감염성 질병으로부터 자신을 보호하거나 자손을 보호하기 위해 만들어내는 물질에 항체가 포함되어 있다. 포유류는 대부분 사람과 유사하게 약 150Kd의 IgG를 생산한다. 포유류는 IgG 이외에 그 구조나 기능이 조금씩 다른 IgA, IgD, IgE 및 IgM을 생산한다.

종래에는 여러 병원성 세균의 항체를 제조하기 위해 토끼, 소, 염소 등의 포유동물을 면역 처리하여 얻어진 혈청으로부터 병원성 세균 특이항체를 생산하는 방법이 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나 이러한 방법은 작은 포유동물의 적은 혈청으로부터 항체를 채취하여야 하는 단점이 있으며 항체 생산량도 극히 미량이다. 따라서 병원성 세균의 항체를 쉽게 생산하기 위한 방법으로는 현재 산란계를 면역 처리하여 생성된 항체가 산란계의 계란으로 이동됨을 이용하여 항체를 채취하는 방법이 각광받고 있다. 특히 산란계의 난황에 존재하는 특이항체를 난황 면역글로불린(Immunoglobulin Yolk, IgY) 또는 난황항체라고 하는데, 이는 산란계의 혈청에 존재하는 특이항체인 면역글로불린(IgG)이 계란의 난황으로 이동되어 생성되는 항체로서, 계란의 난황에 고농도로 축적된다. IgY는 쉽게 분리가 가능하기 때문에 다양한 분야에서 이용가능하며, 특히 가축질병들에 대한 예방 및 치료효과를 가진 IgY의 개발 및 사료첨가제로서의 활용이 증가되고 있는 추세이다.

병원성 세균을 항원으로 하여 산란계의 계란으로부터 난황항체를 수득하는 방법 및 이를 포함하는 조성물 또는 식품 등의 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 항원-항체 복합체를 이용한 백신의 제조 또는 다양한 질병을 치료하기 위한 조성물의 개발 또한 활발히 이루어 지고 있다. 구체적으로, 한국공개특허 제2009-0088121호에는 항원-항체 복합체를 이용하여 백신의 어쥬반트로 이용할 경우 항원에 의한 면역반응을 증강시킬 수 있음이 기재되어 있고, 논문 Phase I trial of a murine antibody to MUC1 in patients with metastatic cancer에는 암세포를 치료하기 위하여 항원-이종항체 복합체를 이용할 경우, T 세포를 활성화시켜 암세포를 치료하는데 우수한 효과를 나타낼 수 있음이 알려져 있다(Ann Oncol. 2004 Dec;15(12):1825-33). 그러나, 난황항체를 대량으로 생산하기 위하여 항원-이종항체 복합체를 이용한 방법은 종래에 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원을 이용하여 이종항체를 제조한 다음, 상기 항원 및 이종항체를 결합시킨 복합체를 산란계에 접종함으로써 난황항체를 제조할 경우, 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원에 대한 면역반응이 증대된 난황항체를 대량 제조 및 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

KR

10-2009-0088121

A

J.S. de Bono JS et al., Annals of Oncology. 2004 Dec;15(12):1825-33

따라서, 본 발명의 주된 목적은 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원에 대한 면역반응이 증대된 난황항체를 대량 제조 및 생산할 수 있는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법 및 이에 의해 제조된 난황항체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법 및 이에 의해 제조된 난황항체를 이용한 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 백신 조성물 또는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 사료첨가제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스를 이용하여 항원을 제조하는 제1 단계, 상기 제1 단계의 항원을 닭과 이종의 동물에 접종하여 이종항체를 제조하는 제2 단계, 상기 제1 단계의 항원과 상기 제2 단계의 이종 항체를 결합시켜 항원-이종항체 복합체를 제조하는 제3 단계, 제1 단계의 항원 및 제3 단계의 복합체를 혼합한 혼합물을 산란계에 접종하는 제4 단계; 및 상기 제4 단계의 산란계 난(egg)으로부터 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스에 대한 난황항체를 분리하는 제5 단계를 포함하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법을 제공한다.

난황항체(Immunoglobulin Yolk, IgY)는 산란계의 혈청에 존재하는 특이항체인 면역글로불린(IgG)이 계란의 난황으로 이동되어 생성되는 항체로서, 계란의 난황에 고농도로 축적되고, 분리가 용이하기 때문에 다양한 분야에서 이용되고 있다. 이러한 난황항체를 대량제조 및 생산하기 위하여 연구노력한 결과, 항원-항체 결합체가 어쥬반트로 이용되며, 항체로서 이종항체를 이용할 경우 면역반응을 증대될 수 있는 사실로부터 착안하여 항원과 이종항체를 결합한 복합체를 이용하여 난황항체를 제조할 경우, 항원에 대한 면역반응이 증대된 난황항체를 대량 제조 및 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 제1 단계의 돼지 소화기성 질병 유발균은 종래에 돼지의 소화기성 질병을 유발하는 것으로 알려진 어떠한 균도 포함할 수 있으며, 바람직하게는 대장균(E.coli), 쥐티푸스(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 콜레라스위스(Salmonella choleraesuis), 클로스트리디움 퍼프린젠스 A(Clostridium perfringens A) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 C(Clostridium perfringens C)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유발균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균(E.coli)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 제1 단계의 돼지 소화기성 질병 유발 바이러스는 종래에 돼지의 소화기성 질병을 유발하는 것으로 알려진 어떠한 바이러스도 포함할 수 있으며, 바람직하게는 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus), 로타바이러스(Rotavirus), TGEV(Transmissible gastroenteritis coronavirus), 써코바이러스(circovirus) 및 게타바이러스(Getah virus)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 제2 단계에서 이종의 동물은 종래에 항체를 제조하기 위하여 이용된 어떠한 포유류도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 마우스 또는 토끼인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 제4 단계에서 항원 및 복합체의 혼합 비율은 1:0.5 ~ 1:0.1 인 것이 바람직하다. 복합체의 비율이 이보다 더 많은 경우에는 복합체에 대해서 과다한 면역세포의 인식으로 인한 문제가 있고, 더 적게 포함되는 경우에는 복합체 적용에 따른 충분한 효과를 발휘하기 어렵다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 제4 단계에서 혼합물은 어쥬반트(adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 어쥬반트로는 완전 프로인트 어쥬반트 (complete Freund's adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬반트, 리포펙틴(lipofectin), 피로탁시(lipotaxi), CaPO4, 25 내지 30% 슈크로스, DEAE 덱스트란, 폴리브렌(polybrene), 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 무기질 젤, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올스(pluronic polyols), 폴리음이온(polyanions), 펩티드(peptides), 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 디니트로페놀 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 실시예에서는 어쥬반트로서 ISA70 incomplete adjuvant를 사용하였다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 혼합물 및 어쥬반트(adjuvant)의 혼합비율은 2~3 : 7~9일 수 있으며, 바람직하게는 혼합비율이 3:7인 것을 특징으로 한다. 혼합물의 혼합비율이 높아질수록 유화제로서 어쥬반트의 기능이 저하되어 항원과의 혼합 시 수용성층과 지용성층의 분리 현상이 일어나는 문제점이 발생하므로, 상기 비율을 유지하는 것이 중요하다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 제4 단계에서 접종은 0.1ml 내지 3ml로 2회 내지 5회 접종할 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 1ml로 3회 접종하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 난황항체 제조방법에 있어서, 상기 난황항체 제조방법은 난황항체 생산수율을 증대시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명의 제조방법에 따른 난황항체의 생산수율을 확인한 결과, 항원만을 산란계에 주입하여 난황항체를 제조하는 것(비교예)보다 항원 및 항원-이종항체 복합체를 산란계에 주입하여 난황항체를 제조할 경우, 난황 내 항체 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 항체의 전체 생산량이 현저하게 증가하는 것은 어렵다는 사실을 감안하여 볼 때, 본 발명의 제조방법에서 난황항체의 생산 증가는 항원-이종항체 복합체가 항체생산의 어쥬반트로서 시너지 효과를 부여하여 난황항체를 대량 제조 및 생산할 수 있음을 시사한다(실험예 3 및 표 5 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 난황항체의 제조방법에 따라 제조된 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체를 제공한다.

본 발명의 난황항체에 있어서, 상기 난황항체는 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원에 대한 결합력이 증대되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명의 제조방법에 따라 생산된 난황항체의 항원 결합력을 확인한 결과, 항원만을 산란계에 주입하여 생상된 난황항체(비교예)보다 항원-이종항체 복합체를 산란계에 주입하여 생산된 난황항체(실시예)의 경우, 항원에 대한 결합력이 우수한 것을 확인 하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 제조방법에 따라 난황항체를 제조할 경우, 특정 항원에 대한 특이적인 난황항체의 생성을 증가시킬 수 있음을 보여주며, 결론적으로 항원에 대한 우수한 결합력은 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스 항원에 대한 면역반응응 증대시킬 수 있음을 시사한다. 또한, 상기 결합력은 산란계에 주입된 항원-이종항체 복합체를 최초 항원, 즉 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스를 항원으로 인식하여 사기 항원에 대한 IgY가 생성되었음을 시사한다(실험예 5, 표 6 및 도 6 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 난황항체를 유효성분으로 포함하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신은 약제학적으로 허용가능한 담체, 어쥬반트 또는 부형제와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 백신을 위한 담체는 수화된 단백질, 락토오즈 등의 하나이상의 안정화제를 포함한 생리학적으로 균형 맞춰진 배양배지를 사용할 수 있으며 0.01 내지 0.1 M의 인산완충액 또는 0.8%의 생리식염수를 사용할 수 있다. 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체는 용액 또는 비용액, 현탁액, 에멀젼의 형태를 사용할 수 있다. 배용액 용매의 예로 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스터가 있다. 용액성 담체는 물, 알콜용액, 에멀젼 또는 생리식염주 및 완충배양액 같은 현탁액을 사용할 수 있다.

본 발명의 백신을 위한 어쥬반트로는 완전 프로인트 어쥬반트 (complete Freund's adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬반트, 리포펙틴(lipofectin), 피로탁시(lipotaxi), CaPO4, 25 내지 30% 슈크로스, DEAE 덱스트란, 폴리브렌(polybrene), 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 무기질 젤, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올스(pluronic polyols), 폴리음이온(polyanions), 펩티드(peptides), 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 디니트로페놀 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 백신을 위한 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 백신은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 본 발명의 백신의 비경구 투여는 바람직한 순도하에 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 사용되는 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 백신의 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용할 수 있다. 상기 제형은 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 또는 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제할 수 있고, 주사용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 난황항체를 유효성분으로 포함하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 사료첨가제는 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 난황항체의 경우, 양성대조군 및 비교예 대비 세균의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 난황항체는 돼지 소화기성 질병을 예방 또는 치료하기 위한 백신 또는 사료첨가제로서 용이하게 이용될 수 있음을 시사한다(실험예 4 및 도 5 참조).

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체의 제조방법은 항원-이종항체 복합체를 산란계에 주입함으로써 난황항체를 대량으로 제조 및 생산할 수 있으며, 이에 따라 제조된 난황항체의 경우, 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스에 대한 특이성 및 결합성이 높아 상기 균 및 바이러스의 성장을 효과적으로 억제함으로써 돼지 소화기성 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1 및 도 2는 항체 역가 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 및 4 는 난황 항체를 확인한 결과를 나타내는 도면이다(도 3; SDS-PAGE(12% gel staining), 도 4; Western-blot, 1. Natural chicken-IgY protein(cat# ab119138), 2. IgY 10ug loading(비교예), 3. IgY 10ug loading(실시예))
도 5는 박테리아 성장 억제를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 항원 결합력을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

제조예 1: 항원의 생산

1) E.coli(09:K35,K99,F41) KVCC-BA0000540-020800491

Blood agar 배지를 사용하여 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 호기 배양하였다. 콜로니(Colony) 확인 후 BHI broth 1,000ml에 접종 후 24시간에서 36시간 진탕 배양하였다. 배양이 끝난 후 포르말린(Formalin) 0.3%로 48시간 실온에서 불활화 시켰다. 불활화 된 항원을 6,000rpm 원심 시행하여 수거하였다. 수거된 항원을 PBS(pH 7.2)로 푼 뒤 포르말린(Formalin) 0.1%를 첨가하여 1일간 실온에 방치 후 4℃ 냉장고 보관하였다. 제조된 항원을 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 410nm에서 OD 1.0이 되도록 항원 산정하여 농도를 맞추었다.

2) Porcine epidemic Diarrhea(PED SM98) virus

PED Virus는 vero-cell을 세포유지배지(α-MEM, antibiotics, yeast, FBS5%)로 배양하여 80% monolayer을 형성 하였을 때 비혈청 배지 α-MEM (alpha- Minimal Essential Medium, Trypisn(5㎍/ml)첨가한 배지를 사용하여 3회 washing해준 뒤 PED virus 희석액을 100 TCID50 ( Tissue culture infectious dose 50 ) 농도가 되도록 접종 해주었다. 90분 감작 후 5% FBS를 함유한 α-MEM를 첨가해주고 48시간 배양하였다. 48시간 경과 후 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)를 확인하고 virus를 수거하였다. 수거한 바이러스는 0.2M BEI (2-Bromoethylamine Hydrobromide)로 불활성화(inactivation) 시킨다.

제조예 2: 마우스 항체의 제조

상기 제조예 1에서 생산된 각 항원을 불활화 하여 독성을 억제 한 뒤 냉장 보관 하였다가 사용하였다. 마우스 항체 제작용 백신의 경우 complete adjuvant를 사용하여 백신을 제조하였다. 각각의 항원별 백신을 제조하여 통상적인 마우스 항체 제조 방법에 따라 항체를 제조하였다. 생산 완료 후 수거된 Serum에서 protein-A column을 이용하여 마우스 항체를 정제 하였다.

제조예 3: 양돈 항원과의 결합 샘플의 제조 (mAb complex)

상기 제조예 1에서 생산된 항원과 상기 제조 예 2에서 생성된 마우스 항체를 결합시키기 위하여 다음과 같이 시험을 진행하였다. 불활화 된 혼합 백신에 각 각의 항원에 대해서 생성된 마우스 항체를 100ug을 혼합하였고, 4℃에서 Overnight로 항원항체 결합을 유도 하였다. 결합을 완료 시킨 샘플은 원심분리하여 수거한 뒤 산란계 접종용 샘플로 이용하였다.

제조예 4: 산란계 접종용 양돈 혼합백신의 제조

양돈 혼합백신 제조를 위해 제조예 1에서 준비한 각각의 항원 및 mAb complex를 adjuvant와 3:7정도로 혼합한 후 Homogenizer를 이용하여 사독백신을 제조한 뒤 무균검사와 불활화 확인 시험을 거쳐 특이난황항체 생산을 위한 혼합백신을 준비하였다.

실시예 1: 산란계 접종용 양돈 혼합백신의 제조

산란계 접종은 제조된 백신을 25주령의 Hyine-brown 계열의 산란계를 이용하여 접종하였다. 접종은 가슴근육에 1ml씩 접종하였고, 3주 간격으로 3회 접종을 진행하였다. 접종 그룹은 하기 표 1과 같다.

그룹	접종 내용	백신 구성
대조군	백신접종 안함	-
비교예	양돈 혼합백신(제조예 1)	PEDV+E.coli
실시예	양돈 혼합백신(제조예 1) + 양돈 항원결합 항체 백신(제조예 4)	PEDV+E.coli+mAb complex

구체적으로, 접종그룹은 다음과 같이 구성되어 백신을 제조하였다. 비교예는 양돈 소화기성 질병을 일으키는 바이러스와 박테리아에 대해서 불활화한 항원(제조예 1)을 동량으로 준비하였다. 실시예는 비교예의 항원에 결합하는 mAb를 제조하여 항원과 항체가 결합된 복합체(제조예 4)를 추가로 백신에 혼합하여 준비하였고 그 구성은 하기 표 2와 같다.

그룹	백신 구성	비율
대조군	-
비교예	PEDV+E.coli	1:1
실시예	PEDV+E.coli + mAb-complex¹⁾	1:1:0.5

¹⁾: mAb complex =(PEDV + mouse anti-PEDV-IgG) 0.25 + (E. coli + mouse anti-E. coli-IgG) 0.25

실험예　1: 항체 역가 측정

1) ELISA 코팅 항원제조

제조예 1에서 생산된 항원을 8000rpm에서 50분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고 펠렛(pellet)을 HEPES buffer로 재부유(suspension)시킨 후 초음파 파쇄(sonication) 하여 용해(Lysis) 하였다. Lysis한 상층액을 8000rpm 4℃에서 30분간 원심하여 상층액을 수확하였다. 수확한 상층액에 1% N-Lauroly sarcosine(SIGMA, L-9150)을 최종 농도 0.01% 가 되도록 첨가한 후 실온에서 10분간 처리하였다. 처리 후 15,000rpm 4℃에서 50분간 원심 시행하여 N-Lauroly sarcosine(SIGMA, L-9150)을 제거하여 주고, HEPES buffer 50ml로 다시 부유시켜 15,000rpm 4℃에서 50분간 원심 분리하여 OMP를 수거하였다. 수거된 항원은 BCA법으로 단백질 정량 후 200ng/ml이 되도록 코팅하여 항체역가측정에 사용하였다.

2) ELISA를 이용한 항체역가 측정

난황 중의 특이난황항체의 역가는 Indirect ELISA method를 이용하였다. 먼저 항원을 코팅 버퍼(coating buffer)에 희석하여 각 well당 100ul씩 96 well polystyrene plate에 코팅하여 4℃에서 over night 시킨다(또는, 37℃에서 1시간 방치시킨다). PBS-T(phosphate buffer saline, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 세척 후 BSA가 함유된 PBS buffer로 1시간동안 37℃에서 blocking하며 상기와 같은 방법으로 세척하였다. 음성대조군, 양성대조군 및 샘플을 2X씩 희석하여 Well당 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 정치하였다. 1시간 후 3번 세척하고 2차 항체 (anti-chicken: Sigma, U.S.A)를 PBS에 적정량 희석하여 각 Well 에 100 ul 씩 분주한 후 37℃에 1시간 반응시킨다. 그 후 3번 세척을 하고 substrate(OPD, sigma)를 각 well에 100ul씩 분주한 다음 실온에서 약 10분간 반응 시키고 Stop solution 50ul을 분주하여 반응을 중지시켜 450 nm의 파장에서 ELISA reader로 각 well의 흡광도를 측정하여 ELISA value로 나타내었다. 측정된 결과에 음성의 값을 2배수 하여 처리된 난황의 측정값에 대입하여 분석 Data의 역가를 하기 표 3, 4 및 도 1, 2에 나타내었다.

접종차수	PEDV	대조군	비교예	실시예
접종차수	주차	대조군	비교예	실시예
1차	1	200	400	1600
	2	100	800	1600
	3	200	800	3200
2차	1	200	1600	3200
	2	100	1600	6400
	3	200	3200	12800
3차	1	100	6400	25600
	2	100	6400	12800
	3	200	12800	25600
	4	100	6400	12800
	5	200	12800	12800
	6	200	6400	12800
	7	100	6400	6400
	8	100	3200	6400

접종차수	*E. coli*	대조군	비교예	실시예
접종차수	주차	대조군	비교예	실시예
1차	1	400	800	1600
	2	400	1600	1600
	3	800	1600	3200
2차	1	400	3200	6400
	2	400	3200	6400
	3	200	6400	12800
3차	1	400	12800	25600
	2	200	12800	25600
	3	400	6400	51200
	4	400	12800	25600
	5	200	6400	12800
	6	400	3200	12800
	7	200	3200	12800
	8	200	1600	6400

그 결과, 상기 표 3, 4 및 도 1, 2에서 확인할 수 있듯이 전체적으로 이종항체를 항원과 결합하여 추가 항원과 함께 산란계에 접종한 실시예의 경우, 1,2차 접종에서 비교예에 비하여 역가가 높게 형성되어 3차 접종부터 항체의 역가의 최고치가 비교예에 비하여 상당히 높게 형성되었으며, 특히 바이러스의 항원에 대해서 난황항체의 역가 형성에 조금 더 도움을 주는 것으로 나타났다.

실험예 2: 난황 항체의 확인

접종한 난황에서 황산암모늄(Ammonium sulfate)를 이용하여 항체를 분리한 뒤 분리 순도를 확인하기 위하여 시험을 진행하였다.

구체적으로, 각 그룹별(대조군, 비교예 및 실시예)로 생산된 난황에서 가장 높은 항체 역가를 나타낸 2~3주차 계란을 모아서 난황에서 IgY 분리하였다. 난황과 난백을 분리하여 난황만 수집한 뒤 수거된 난황에 정제수(D.W)를 희석하여 30분간 교반하였다. D.W와 교반한 샘플은 냉동과 해동을 반복하여 지질을 분리하고, 수용성 단백질 샘플을 수거하였다. 수거된 샘플에 황산암모늄(Ammonium sulfate)을 첨가한 뒤 4℃ 냉장 보관한여 난황항체를 침전시킨다. 냉장에서 18시간 정도 침전시킨 샘플을 수거하여 4℃ 6000rpm에서 원심분리하여 수거한 뒤, 수거된 항체 샘플에 PBS로 재부유한 샘플을 PBS로 투석하여 최종샘플을 획득하였다. 획득된 샘플은 BCA 단백질 정량 kit로 정량 한 뒤 12% SDS-PAGE gel에서 분리 순도를 확인하였으며, 그 결과를 도 3, 4에 나타내었다.

그 결과, 도 3, 4에서 확인할 수 있듯이 시판되는 정제된 난황항체와 큰 차이 없이 분리 되었으며, Western-blot 시험을 통하여 확인한 결과 모두 항체 단백질이 맞는 것으로 보아 항체의 순부 분리는 잘 된 것으로 판단된다.

실험예　3: 산란계 접종에 따른 항체 함량의 측정

난황항체 정량시험은 HPLC를 이용하여 시험을 진행하였다. 정량을 위한 IgY 표준물질은 Abcam사의 normal chicken IgY를 이용하였다(Abcam Cat No ad119138). 표준용액인 normal IgY를 취하여 12,000rpm에서 20초간 원심분리하여 상등액을 사용하였다. 원심분리한 표준원액을 증류수로 5가지 농도로 희석하여 표준곡선을 만든다. 표준용액의 희석은 1, 0.5, 0.25 0.125, 0.0625mg/ml 로 희석하여 사용하였다. 난황액을 0.2mg/ml농도로 희석한 뒤 진탕기를 이용하여 5분간 녹였다. 상기용액을 3000rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 취하여 0.45um 실린지 필터로 여과한 것을 HPLC로 측정하였다. 표준용액을 농도별(1mg/mL, 0.5mg/mL, 0.25mg/mL, 0.125mg/mL, 0.0625mg/mL)로 HPLC에 측정하여 표준용액의 농도에 따른 선형그래프를 그려 나온 선형식을 구하고 HPLC에서 측정한 시험용액의 값을 도입하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

	IgY(mg/ml)
weeks	대조군	비교예	실시예
1-1	12.5	12.7	13.7
1-2	13.4	13.7	12.7
1-3	12.6	13.2	12.5
2-1	11.5	12.5	13.8
2-2	12.5	12.7	13.9
2-3	13.2	11.5	13.7
3-1	13.1	12.7	14.2
3-2	11.2	12.9	14.1
3-3	12.5	13.5	13.5
3-4	12.9	13.7	13.7
3-5	12.0	13.4	13.8
3-6	11.3	13.5	13.9
3-7	12.5	12.8	13.7
3-9	13.2	12.9	13.8
Mean	12.45	12.97	13.6

그 결과, 표 5에서 확인할 수 있듯이 그룹별 총 평균을 확인 했을 때 백신접종에 의하여 난황항체의 함량이 다소 증가되는 것으로 나타났으며, 비교예에 비하여 실시예가 난황 내 항체 함량이 다소 증가되는 것으로 나타났다.

실험예 4: 박테리아 성장억제 확인 시험

항원균으로 사용한 E. coli에 대한 성장억제 시험을 진행 하였다. 각 각의 균은 LB Broth에 1*10^7 cfu/ml 농도로 접종하여 준비하였고, 분리한 난황항체를 동일한 농도로 약 10mg/ml 농도로 일괄적으로 처리 하였다. 시험기간 동안 broth를 약 접종 후 12시간 까지는 1시간 간격으로 측정하고 이후 2시간 간격으로 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있듯이 시험결과 대장균의 경우 초기 4시간 까지 모든 군의 난황항체 모두 양성대조군에 비하여 크게 차이가 나지 않았다. 특히, 비교예의 난황항체의 경우 접종 후 5시간 이후부터는 양성대조군과 동일한 억제효과를 나타내었으나, 9시간 이후에는 세균의 성장이 급격하게 증가되어 억제효과가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 본 발명의 실시예의 경우 지속적으로 항원균의 성장을 억제 해주는 것을 확인하였다.

실험예 5: 항원 결합력 확인 시험

분리된 항체를 Flow cytometer를 이용하여 항원과의 결합력 및 항원 특이적 난황항체의 생성비율을 확인하였다. 항원으로 사용한 E. coli를 배양한 뒤 0.1% 포르말린 처리하여 불활화 처리한다. 수거된 항원은 OD 600nm에서 흡광도를 측정하여 1.0으로 희석하여 준비하고, 분리된 난황항체를 50mg/ml에서 500mg/ml 농도까지 준비한 뒤 항원과 혼합하여 4℃ 18시간 동안 항원과 결합 시킨다.

항원과 결합된 샘플은 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 상층액을 버려서 결합하지 않은 항체를 버린다. 이차항체로 Anti-chicken-IgG-PE 항체를 1:2000으로 희석하여 사용한 뒤 PBS로 2회 washing 한 뒤 Flow cytometer에서 결과를 확인하였으며, 그 결과를 표 6 및 도 6(1. E. coli + Anti-chicken-IgG-PE; 2. E. coli + G1-IgY + Anti-chicken-IgG-PE; 3. E. coli + G2-IgY + Anti-chicken-IgG-PE; 4. E. coli + G3-IgY + Anti-chicken-IgG-PE)에 확인하였다.

Group	Binding affinity(%)
대조군	17.5%
비교예	46.7%
실시예	79.5%

그 결과, 표 6 및 도 6에서 확인할 수 있듯이 항원균에 결합되는 항체의 비율이 대조군 17.5%, 비교예 46.7%, 실시예 79.5%로 나타났다. 대조군의 항원을 감작하지 않은 일반적인 IgY임에도 불구하고 17.5%의 결합력이 나타난 것은 기본적으로 E. coli에 대해서 모계가 가지고 있는 항체가 어느정도 존재하는 것으로 보이며, 3차 접종으로 결합력이 더욱 증가됨을 알 수 있으며, 본 발명의 실시예의 경우 66.5%의 비율로 결합한 것으로 보나 항체의 전체적인 양의 경우 산란계가 기본적으로 만들어 낼 수 있는 항체의 양이 있기 때문에 큰 증가가 되지 않지만 그 안에 항원에 대한 특이적인 난황항체의 생성이 증가되는 것으로 사료된다.

실험예 6:　중화항체 시험방법

난황으로부터 분리한 항체를 이진　희석하여(2배부터 1024배까지) 준비한 다음 PEDV를 200TCID50/50ul가 되도록 희석하여 동량으로 분주하였다. 37℃ 5% CO₂incubator에서 1시간 반응시킨 다음, Vero cell을 2X10⁵cells/100ul정도로 현탁하여 모든 well에 동량으로 분주한 후 37℃ 5% CO₂incubator에서 5~7일간 배양한 다음 CPE를 관찰하여 판정하였다. 바이러스가 첨가된 well에서 CPE가 100% 저해되고 해당 well의 monolayer가 형태적으로 대조군의 well과 비교하여 거의 일치할 때 해당되는 well의 최고 혈청 희석배수의 역수를 중화항체가로 표시하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

	PEDV SM98 100TCID	PEDV SM98 400TCID
대조군	2	2
비교예	16	16
실시예	64	64

그 결과, 상기 표 7에서 확인할 수 있듯이 대조군은 2, 비교예는 16, 실시예는 32로 나타났다. 비교예에 비하여 실시예의 경우 4배 높은 중화항체가를 나타냈으며, 중화항체가는 바이러스를 중화할 수 있는 지표로 항체가가 높을수록 효과적으로 바이러스를 중화 할 수 있는 것으로 알려져 있다.

Claims

돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스를 이용하여 항원을 제조하는 제1 단계;
상기 제1 단계의 항원을 닭과 이종의 동물에 접종하여 이종항체를 제조하는 제2 단계;
상기 제1 단계의 항원과 상기 제2 단계의 이종항체를 결합시켜 항원-이종항체 복합체를 제조하는 제3 단계;
제1 단계의 항원 및 제3 단계의 복합체를 혼합한 혼합물을 산란계에 접종하는 제4 단계; 및
상기 제4 단계의 산란계 난(egg)으로부터 돼지 소화기성 질병 유발균 또는 바이러스에 대한 난황항체를 분리하는 제5 단계;를 포함하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 단계의 돼지 소화기성 질병 유발균은 대장균(E.coli), 쥐티푸스(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 콜레라스위스(Salmonella choleraesuis), 클로스트리디움 퍼프린젠스 A(Clostridium perfringens A) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 C(Clostridium perfringens C)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유발균인 것을 특징으로 하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 단계의 돼지 소화기성 질병 유발 바이러스는 PEDV(porcine epidemic diarrhea virus), 로타바이러스(Rotavirus), TGEV(Transmissible gastroenteritis coronavirus), 써코바이러스(circovirus) 및 게타바이러스(Getah virus)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 단계에서 이종의 동물은 마우스 또는 토끼인 것을 특징으로 하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제4 단계에서 혼합물은 어쥬반트(adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 혼합물 및 어쥬반트(adjuvant)의 혼합비율은 2~3 : 7~9인 것을 특징으로 하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제4단계에서 접종은 0.1ml 내지 3ml로 2회 내지 5회 접종하는 것을 특징으로 하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체 제조방법.
제1항의 제조방법에 따라 제조된 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 난황항체.
제8항에 따른 난황항체를 유효성분으로 포함하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제8항에 따른 난황항체를 유효성분으로 포함하는 돼지 소화기성 질병의 예방 또는 치료용 사료첨가제.